Tcnica que se ocupa para obtener copias de un fragmento. DNA.

De esta forma se amplifica un fragmento de ADN, esto es til para identificar con mayor probabilidad el virus o bacteria causante de una enfermedad, identificar cadveres, entre otros. Con el uso de un termociclador ( el cual aplica corriente elctrica) se logra producir grandes cambios de temperatura, altas y bajas, para asi con una misma DNA polimerasa, replicar reiteradas veces la misma hebra. Problemas iniciales: Al principio las polimerasas ocupadas se desnaturalizaban con los altas temperaturas y sus bruscos cambios (95C). Para combatir este problema, se ocupan DNA polimerasas extraidas de microorganismos capaces de sobrevivir a esas temperaturas, microorganismos generalmente arqueas como: Thermus aquaticus, pyrococcus furiosus, thermococcys litoralis y thermus termophilus. Aplicaciones: Por lo general, la PCR es una tcnica comn y normalmente indispensable en laboratorios de investigacin mdica y biolgica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonacin de ADN para la secuenciacin, la filogenia(estudios de los orgenes de los organismos) basada en ADN, el anlisis funcional de genes, el diagnstico de trastornos hereditarios, la identificacin de huellas genticas (usada en tcnicas forenses y test de paternidad) y la deteccin y diagnstico de enfermedades infecciosas. Reactivos Para realizar la tcnica se necesitan:
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Los 4 desoxirribonucletidos (A-G-C-T) Dos cebadores o iniciadores (en ingls, primers), que son secuentas de ribonucletidos que le permiten a la DNA pol III, agregar los desoxiribonucleotidos complementarios a la hebra molde. Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), esto es en el caso de que se quiera mutar el DNA, este elementos incrementa la tasa de error en la replicacin del DNA. Iones monovalentes, como el potasio. Una solucin tampn (mezcla entre un acido dbil t su base conjugada) que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa. ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura ptima alrededor de 70 C. ADN molde. Termociclador.

Ciclo de amplificacin Inicio Este paso consiste en llevar la reaccin hasta una temperatura de 94-96 C durante 1-9 minutos. Esto slo es necesario para ADN polimerasas que requieran activacin por calor. Desnaturalizacin En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales est constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-

95 C) (ms habitual). La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalizacin depende de la proporcin de G+C que tenga la hebra, como tambin del largo de la misma. Otros mtodos, raramente empleados son la adicin de sales o agentes qumicos capaces de realizar la desnaturalizacin. Alineamiento o unin del cebador A continuacin se producir la hibridacin del cebador (unin de este a su secuencia complementaria en el ADN molde). Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 C durante 20-40 segundos, permitiendo as el alineamiento. La polimerasa une el hbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarn como lmites de la regin de la molcula que va a ser amplificada. Extensin o elongacin de la cadena Acta la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la sntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde aadiendo los direccin 5' 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende de la ADN polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de mxima actividad est en 75-80 C (comnmente 72 C). El tiempo de extensin depende tanto de la ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. Hay una regla comnmente usada: en su temperatura ptima, la polimerasa de ADN polimerizar mil bases en un minuto. Elongacin final Etapa nica que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 C durante 5-15 minutos tras el ltimo ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado. Conservacin Este paso se lleva a cabo a 4-15 C durante un tiempo indefinido para conservar la reaccin a corto plazo.

Qu es y para que sirve?: la electroforesis es un mtodo moderno de laboratorio que se utiliza para separar biomoleculas (DNA, protenas), a travs de una corriente elctrica. Cmo funciona?: la electroforesis se puede dar a cabo en distintas superficies, la ms comn en un gel de agarosa (polisacarido formado por galactosa de algunas algas), pero tambin hay otras en papel o acetato de celulosa y en una disolucin. El gel acta como una red tridimensional La de papel sirve principalmente para sustancias de bajo peso molecular, y adems es ms rpida que en la de gel. En el gel se introducen las muestras de protenas o DNA, se le agrega un sds o detergente y se le hace pasar corriente elctrica a desde un polo positivo a uno negativo. Las protenas no estn cargadas por lo cual no avanzan, por eso se utiliza un detergente para desnaturalizarlas, haciendo que pierdan su estructura, y para cargarlas negativamente (Mientras mas grande mas detergente se une a ella), haciendo que su movimiento dependa solo de su masa. El gel, al actuar de red tridimensional, evita que las ms grandes se muevan rpido quedando estas en el principio del gel, y las ms chicas avanzan mas. En cambio el DNA ya esta negativo por lo que avanza hacia el polo positivo. Este se va a detener cuando este extendido completamente, de esta manera se puede determinar la cantidad de nucletidos o tamao de una molcula de DNA. Para poder visualizar los resultados se debe teir la protena o DNA en un proceso de fijacin y tincin. La mas comn es la tincin fluorescente. El gel se pone debajo de una luz especial y se pueden ver las marcas del resultado. Aplicaciones: se puede utilizar para determinar la paternidad, comparar sangre, determinar el autor de un crimen, o simplemente para determinar el tamao de un gen Ensayo por inmunoabsorcin ligado a enzimas (Elisa): Es una tcnica de inmunoensayo en la cual un antgeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algn otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antgeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparicin de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometra el antgeno en la muestra. El procedimiento involucra a un gran nmero de variables, tales como selecin de reactivo, temperatura, medicin de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba.

Este test es utilizado para determinar si un paciente tiene una infeccin o una enfermedad autoinmune. Un resultado positivo indica que el anticuerpo est en la sangre e implica que la persona ha contraido una determinada enfermedad. Dispositivos empleados en ELISA Los lectores ELISA son espectrofotmetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotmetro convencional, con capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que slo permiten la lectura de una o pocas longitudes de onda. Son la que se corresponden con las necesarias para determinar la densidad ptica de los cromgenos ms comnmente utilizados. Tipos de ensayos ELISA Se han desarrollado mltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificacin de un antgeno en solucin, la deteccin de un anticuerpo en una solucin o la determinacin de la subclase de un anticuerpo.
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ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antgeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antgeno en la solucin analizada. Es necesario incluir controles negativos que sern muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antgeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antgeno buscado). ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de deteccin emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antgeno y uno secundario marcado contra el primario. La deteccin tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificacin de seal debida a la unin de dos o ms anticuerpos secundarios por cada primario En general, el ELISA indirecto permite detectar anticuerpos sricos contra VIH desde las primeras seis semanas de una infeccin. ELISA sndwich. Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antgeno. Despus de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antgeno, que ser retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Despus de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solucin con un segundo anticuerpo antiantgeno marcado. As pues cada molcula de antgeno estar unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificacin de seal que permite el segundo anticuerpo.

Fases de un ensayo ELISA 1. Conjugacion del anticuerpo o del antgeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antgeno marcado se emplea en ensayos de competicin de antgeno. Dicha unin anticuerpo-enzima o antgeno-enzima ha de producirse

durante un determinado periodo de tiempo en aras de producir una solucin coloreada y que pueda ser valorada visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotmetro (normalmente a una longitud de onda de 414 nm). Si no transcurre el tiempo adecuado para que se de la reaccin, no se evidenciar ningn color, interpretndose este resultado como un falso negativo, disminuyendo la sensibilidad de la tcnica. 2. Unin del antgeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unin de anticuerpos o antgenos se realiza con facilidad a la superficie de plsticos tratados que tienen gran afinidad por protenas. As, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe realizarse cuidadosamente. Si se usa poco antgeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el contrario, si se usa demasiado antgeno, el exceso dar lugar a una reaccin falsa negativa. 3. Formacin de una o ms capas de inmunocomplejos. En el caso del antgeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antgeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antgeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo mtodo permite la amplificacin de la seal al poderse unir uno o ms anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antgeno y antgeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antgeno fro frente a una cantidad fija de antgeno marcado. Es el ensayo de competicin del antgeno. 4. Revelado de la reaccin enzimtica. Despus de un lavado para eliminar todas las molculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se aade el sustrato enzimtico en solucin. Se deja reaccionar y se lee la densidad ptica mediante espectrofotometra.