46

Zamorano
Carrera de Ciencia y Produccin Agropecuaria Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Micropropagacin

Mdulo de Biotecnologa Aplicada Cultivo de Tejidos Vegetales y Propagacin in vitro

5.2 Organognesis a partir de Puntos Directos de Crecimiento
Explante: Material Vegetal: Yemas Epipremnum aureum (Scindapsus aureum)

Introduccin
La aplicacin de tcnicas de micropropagacin ha tenido un impacto significativo en la produccin rpida de plantas ornamentales de follaje libres de patgenos en una forma similar al progreso que se ha hecho en la produccin de orqudeas in vitro. Entre los mejores ejemplos esta el de la micropropagacin de Epipremnum aureum (Scindapsus aureum). Esta popular planta de follaje es propagada convencionalmente por medio de esquejes, pero de esta manera no ramifica bien y es infectada sistmicamente por varios tipos de bacterias incluyendo Erwinia chrysanthemi que es la causa de la enfermedad conocida como mancha bacterial de la hoja. Miller y Murashige describieron un procedimieto de micropropagacin para Scindapsus que ha resultado en la produccin de plantas vigorosas, con buena ramificacin y libres de patgenos. Ha sido estimado que 100,000 plantas de Scindapsus por ao se pueden producir de un solo explante. El propsito de esta prctica de laboratorio es familiarizar a los estudiantes con los procedimientos de extraccin, esterilizacin, y establecimiento in vitro de explantes de Scindapsus aureum.

Materiales y Mtodos
1. Tallos de Scindapsus 2. Material establecido in vitro en etapas II III (para las prcticas de multiplicacin y/o enraizamiento) 3. Microscopio estereoscpico 4. Platos Petri estriles 5. Pinzas y bistures No. 11 6. Solucin de 70% Ethanol 7. Solucin antioxidante preparada con 100 mg/l de cido ascrbico y 150 mg/l de cido ctrico. 8. Solucin desinfectante preparada con 10% Chlorox (v/v) ms 2 gotas de Tween 80 por cada 100 ml de solucin.

47 9. Agua destilada estril para los enjuages 10. 10 tubos 18 x 150 / estudiante conteniendo medio lquido con puente para establecimiento (Etapa I) 11. 10 tubos 25 x 150 / estudiante conteniendo medio slido para multiplicacin/enraizamiento (Etapas II y III) 12. Bandejas de celdas mltiples para la aclimatacin de vitroplantas (Etapa IV) 13. Macetas para la transferencia a contenedores individuales

Procedimientos
1. Obtenga 1-2 tallos de Scindapsus. Remueva las hojas de manera que las yemas axilares queden expuestas. 2. Corte los tallos ya defoliados en segmentos de aproximadamente 1 cm. y conteniendo una yema cada uno. 3. Coloque los segmentos en un beaker, cubra con gasa y ajuste con una banda. 4. Remueva las partculas superficiales de polvo y rastros de suelo poniendo el beaker con los segmentos directamente bajo el chorro de agua de la llave durante 15 min. (usar agua fra). 5. Limpie la cmara de flujo laminar y el espacio donde va a trabajar con 70% ethanol. 6. Limpie el microscopio estereoscpico tambin con 70% ethanol. 7. Luego del enjuage bajo el agua de la llave, manipule los segmentos solamente con las pinzas, no con las manos, y colquelos en un plato Petri. Usando el estereoscopio y el bistur, muy cuidadosamente remueva el tejido exterior obscuro que cubre las yemas. 8. Disecte cada yema y vaya colocndolas en una bolsa de gasa segn demostracin. Coloque la bolsita de gasa con las yemas en la solucin antioxidante. Cada explante debe de consistir ahora de una yema adherida a aproximadamente 1-1.5 mm de tejido. Enjuage los explante en la solucin antioxidante durante 10 min. con agitacin frecuente. 9. Transfiera la bolsita con los explante a la solucin desinfectante. Debe haber suficiente solucin desinfectante de manera que cubra los explantes en su totalidad. Cubra y enjuage durante 12 min. con agitacin frecuente. 10. Transfiera el recipiente con la bolsa de gasa y los explantes en la solucin desinfectante a la cmara de flujo laminar. Transfiera la bolsita a un recipiente conteniendo agua destilada estril y enjugelas por 5 min. 11. Luego del primer enjuage en agua destilada estril realice un segundo enjuage de 5 min. 12. Una vez realizados los enjuages coloque la bolsa de gasa con los explantes en un plato Petri estril, abra la bolsa con la ayuda de pinzas estriles y saque las yemas. 13. Coloque una de las yemas esterilizadas en un tubo con medio. Repita para los otros tubos provistos. 14. Sellar los tubos con parafilm y anotar la fecha y el nombre segn instrucciones. 15. Colocar los cultivos en el cuarto de crecimiento (16 horas luz; 25oC)

48 Epipremnum aureum ( Scindapsus) Philodendron scandens oxycardium ( Filodendron) Spathyphyllum spp. (Garza) Etapa I (Establecimiento) Componente 1 Litro Macroelementos MS 100 ml (Solucin Madre 10x) EDTAFeNa 50 mg (5 ml de Solucin madre 200x) Microelementos MS 1 ml (Solucin madre 1000x) NaH2PO4 . H2O 170 mg Sulfato de Adenina 160 mg Inositol 100 mg Tiamina 0.4 mg 2iP 3.0 mg AIA 3.0 mg Sacarosa 30 g Phytagel 3.75 g pH = 5.7 Etapa II (Multiplicacin) Componente 1 Litro Macroelementos MS 100 ml (Solucin Madre 10x) EDTAFeNa 50 mg (5 ml de Solucin madre 200x) Microelementos MS 1 ml (Solucin madre 1000x) NaH2PO4 . H2O 170 mg Sulfato de Adenina 160 mg Inositol 100 mg Tiamina 0.4 mg 2iP 10.0 mg Sacarosa 30 g Phytagel 3.75 g pH = 5.7 Etapa III (Enraizamiento/Pre-trasplante) Componente 1 Litro Macroelementos MS 100 ml (Solucin Madre 10x) EDTAFeNa 50 mg (5 ml de Solucin madre 200x) Microelementos MS 1 ml (Solucin madre 1000x) Inositol 100 mg Tiamina 0.4 mg AIA 10.0 mg Sacarosa 30 g Phytagel 3.75 g pH = 5.7
Referencia: Carolina Biological Supply Catalog