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Espectroscopa por Resonancia Magntica Nuclear

INTRODUCCIN La Espectroscopia por resonancia magntica (MRS) es una tcnica diagnostica que ofrece una valoracin bioqumica, metablica y funcional seriadas en enfermedades del sistema nervioso central que complementan los estudios convencionales. Desde el descubrimiento del fenmeno fsico de la resonancia magntica por el grupo Bloch y Purcell numerosos equipos de investigacin trabajaron en el estudio de las variaciones de la frecuencia de resonancia en funcin del tipo de ncleo observado (Hidrgeno-1,fsforo-31,carbono-13,sodio-23,etc.)Y considerando un tipo de ncleo en funcin de la molcula en la que esta integrado, todo ello fue el inicio de la ESPECTROSCOPIA por resonancia magntica nuclear, bsicamente imanes ms potentes y con una estabilidad mayor, cada vez fue posible estudiar molculas de mayor peso molecular, en 1957, se publico el primer estudio mediante RM sobre la estructura de una macromolcula, la ribonucleasa. Posteriormente se aplico en procesos metablicos de rganos prefundidos y en la actualidad, se obtienen espectros de rganos in vivo. Paralelamente, en 1973 se inicio el desarrollo de la MRI como tcnica tomogrfica debido a la idea de P. Lauterbur logrando la primera imagen, utilizando gradientes magnticos y anlisis de frecuencia. La oportunidad de obtener espectros con suficiente resolucin y sensibilidad, mediante imanes de 1.5 Tesla (T), junto con la posibilidad de estudiar en forma directa algunos procesos metablicos sin interferir en ellos ni utilizar para ello tcnicas agresivas, hace de la MRS una herramienta de trabajo con grandes posibilidades en l diagnostico mdico.

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FUNDAMENTOS FSICOS DE LA ESPECTROSCOPIA DE RMN La espectroscopia de RMN fue desarrollada a finales de los aos cuarenta para estudiar los ncleos atmicos. En 1951, los qumicos descubrieron que poda ser utilizada para determinar las estructuras de los compuestos orgnicos. Esta tcnica espectroscpica puede utilizarse slo para estudiar ncleos atmicos con un nmero impar de protones o neutrones (o de ambos). Esta situacin se da en los tomos de 1H, 13C, 19F y 31P. Este tipo de ncleos son magnticamente activos, es decir poseen espn, igual que los electrones. En ausencia de campo magntico, los espines nucleares se orientan al azar. Sin embargo cuando una muestra se coloca en un campo magntico (Figura 1), los ncleos con espn positivo se orientan en la misma direccin del campo, en un estado de mnima energa denominado estado de espn , mientras que los ncleos con espn negativo se orientan en direccin opuesta a la del campo magntico, en un estado de mayor energa denominado estado de espn .

Figura 1. Estados de espn

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Existen ms ncleos en el estado de espn que en estado de espn pero aunque la diferencia de poblacin no es enorme s que es suficiente para establecer las bases de la espectroscopia de RMN.

Figura 2. Representacin del aumento de la diferencia energtica entre los estados de espn con el aumento de la fuerza del campo magntico.

Como se observa en la figura 2, la diferencia de energa entre los dos estados de espn , depende de la fuerza del campo magntico aplicado H0. Cuanto mayor sea el

campo magntico, mayor diferencia energtica habr entre los dos estados de espn.

ESPECTRO DE RMN Cuando una muestra que contiene un compuesto orgnico es irradiada brevemente por un pulso intenso de radiacin, los ncleos en el estado de espn son promovidos al estado de espn . Esta radiacin se encuentra en la regin de las radiofrecuencias (rf) del espectro electromagntico por eso se le denomina radiacin rf. Cuando los ncleos vuelven a su estado inicial emiten seales cuya frecuencia depende de la diferencia de energa (E) entre los estados de espn y . El espectrmetro de RMN detecta estas seales y las registra como una grfica de frecuencias frente a intensidad, que es el llamado espectro de RMN.

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El trmino resonancia magntica nuclear procede del hecho de que los ncleos estn en resonancia con la radiofrecuencia o la radiacin rf. Es decir, los ncleos pasan de un estado de espn a otro como respuesta a la radiacin rf a la que son sometidos. Si el espectrmetro de RMN posee un imn potente, ste debe trabajar a una mayor frecuencia puesto que el campo magntico es proporcional a dicha frecuencia. Hoy en da los espectrmetros de RMN trabajan a 200, 300, 400, 500 y 600 MHz.

EL ESPECTRMETRO DE RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR

Figura 3. Equipo para medidas de Resonancia Magntica Nuclear

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Componentes de un equipo para medidas de resonancia magntica nuclear: 1. Un imn estable, con un controlador que produce un campo magntico preciso. 2. Un transmisor de radiofrecuencias, capaz de emitir frecuencias precisas. 3. Un detector para medir la absorcin de energa de radiofrecuencia de la muestra. 4. Un ordenador y un registrador para realizar las grficas que constituyen el espectro de RMN.

Para obtener un espectro de RMN: Se coloca una pequea cantidad del compuesto orgnico disuelto en medio mililitro de disolvente en un tubo de vidrio largo que se sita dentro del campo magntico del aparato. El tubo con la muestra se hace girar alrededor de su eje vertical. En los aparatos modernos, el campo magntico se mantiene constante mientras un breve pulso de radiacin rf excita a todos los ncleos simultneamente. Como el corto pulso de radiofrecuencia cubre un amplio rango de frecuencias los protones individualmente absorben la radiacin de frecuencia necesaria para entrar en resonancia (cambiar de estado de espn). A medida que dichos ncleos vuelven a su posicin inicial emiten una radiacin de frecuencia igual a la diferencia de energa entre estados de espn. La intensidad de esta frecuencia disminuye con el tiempo a medida que todos los ncleos vuelven a su estado inicial. Un ordenador recoge la intensidad respecto al tiempo y convierte dichos datos en intensidad respecto a frecuencia, esto es lo que se conoce con el nombre de transformada de Fourier (FT-RMN). Un espectro FT-RMN puede registrarse en 2 segundos utilizando menos de 5 mg de muestra.

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APANTALLAMIENTO O PROTECCIN ELECTRONES

MAGNTICA POR MEDIO DE

El concepto de resonancia de un ncleo determinado debe entenderse no como un fenmeno aislado, sino ms bien, como una interaccin del mismo con sus electrones circundantes. Estos electrones protegen parcialmente a su ncleo del campo magntico externo al que son sometidos; dicho de otra manera, los electrones se mueven generando un pequeo campo magntico inducido que se opone al campo magntico externo. Se debe entender que a nivel atmico todas las molculas poseen una nube electrnica circundante en constante movimiento que genera una corriente inducida que se opone al campo magntico externo. Como resultado de este fenmeno tenemos que el campo magntico que realmente llega al ncleo es menor que el campo magntico externo, por tanto, se dice que el ncleo est apantallado. Desde el punto de vista experimental este concepto cobra real importancia pues el campo magntico efectivo (Hef) que siente un protn dentro de una molcula es siempre menor al campo magntico externo, por tanto, para que el ncleo entre en resonancia, el campo externo debe ser mayor. Es importante recalcar que los protones, al estar en entornos distintos, se encuentran apantallados de forma particular y nica; las caractersticas de su ambiente electrnico le brindan un apantallado caracterstico.

Figura 4. Esquema del fenmeno de Apantallamiento de una molcula de metanol

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A modo de ejemplo, consideremos el caso de la molcula de metanol; un alcohol simple compuesto de tres especies inicas distintas: Hidrgeno, Oxgeno y Carbono. De la imagen a la izquierda observamos que la molcula es asimtrica en su disposicin atmica dada la naturaleza distinta de sus radicales. En particular, en el grupo hidroxilo (OH), el oxgeno retira densidad electrnica del entorno que rodea al protn del OH. De este modo, ese tomo de hidrgeno est menos apantallado que sus homlogos del grupo metilo (CH3) dando como consecuencia que el protn del hidroxilo resuene a un campo magntico menor que en los del grupo metilo. Dado que el apantallamiento de cada protn es diferente entre molculas de distinto origen, acorde a la configuracin de su nube electrnica, tendremos distintas frecuencias de emisin. El resultado de esto es un espectro de diversas frecuencias donde cada conjunto de ncleos especficos origina una seal nica de RMN. As pues, el espectro de RMN es una grfica de la intensidad de seal en funcin de la frecuencia de la energa electromagntica que liberan los ncleos de una muestra. Estas variaciones de frecuencia de absorcin de resonancia, debidas al apantallamiento, reciben el nombre de desplazamientos qumicos, medidos en unidades o ppm. En la prctica es muy difcil medir el campo magntico al que un protn absorbe con exactitud para distinguir protones individuales pues las absorciones varan en slo unas pocas milsimas, por lo tanto, el mtodo ms exacto para determinar los desplazamientos qumicos es determinar el valor respecto a un compuesto estandarizado de referencia que se aade a la muestra, tal como sigue:

El compuesto de referencia estandarizado ms utilizado en RMN es el tetrametilsilano que corresponde a un tomo de silicio con cuatro radicales metilo [Si(CH3) 4] . Por ser el silicio menos electronegativos que los radicales de la molcula, los

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grupos metilo poseen mayor densidad electrnica lo que hace que sus protones estn fuertemente apantallados. Consecuencia de esto, los protones absorben a una intensidad de campo mayor que el resto de los protones enlazado al carbono o a otros elementos, de manera que casi la totalidad de seales de resonancia magntica aparecen a campos ms bajos. En base a esto se ha configurado una escala referencial, llamada escala delta o en donde la absorcin del tetrametilsilano (TMS) se define como 0,00 . Como la mayora de los protones absorben a campos menores que el TMS , la escala aumenta hacia los campos menores. Por ejemplo, las seales de los protones varan entre 0 y 12 mientras que las seales de carbono varan desde 0 hasta 250 . Otro aspecto de importancia a considerar es que tanto los dobles enlaces como los anillos aromticos producen efectos desprotectores en sus protones vinlicos o aromticos respectivamente; por ejemplo, para el caso de los aromticos tenemos que el campo magntico externo induce una corriente en el anillo aromtico que se opone a dicho campo, no obstante ello, las lneas de campo se curvan dando como resultado que en la parte exterior del anillo se potencie el campo y no se disminuya.

Figura 5. Si bien es cierto, los anillos aromticos se oponen al campo magntico externo en una primera instancia, al llegar a las puntas del anillo el campo inducido se curva y se suma al campo magntico externo. Como resultado, tenemos la diminucin del apantallamiento.

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ESPECTRO DE RMN DE 1H La interpretacin de un espectro de RMN se realiza en base al anlisis de las curvas de integracin, el desacoplamiento spin-spin y las constantes de acoplamiento.

Figura 6: Espectro de resonancia magntica nuclear de 1-bromo-2,2-dimetilpropano

1) Curvas de Integracin: Corresponde a la curva superpuesta a las seales de un espectro, como lo apreciable en la figura 6, donde la altura del escaln permite calcular el nmero de tomos de hidrgeno que dan origen a cada seal. Por ejemplo: En la figura anterior la altura para cada escaln es de 7.0 cm y 1.6 cm. Luego para calcular el numero de tomos de hidrgeno se deben sumar las dos integraciones (7.0cm + 1,6cm = 8.6cm) y dividir por el nmero total de hidrgenos de la estructura (11H) lo que dara como resultado 1,28H/cm. Y por ltimo para saber el nmero de H de cada seal se multiplica por su valor anterior con lo que se obtienen 9H (9 protones) para la seal ms intensa (tres metilos de la estructura) y 2(H) para la de menor magnitud (metileno).

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2) Desacoplamiento spin-spin:

Figura 7= Espectro de 1,1 dicloroetano

Un protn en RMN est expuesto a un campo magntico externo y a un campo inducido por los electrones que lo rodean (apantallantes). Si hay otros protones cercanos, a su pequeo campo magntico se le ver afectada la frecuencia de absorcin de los protones. Entonces protones vecinos interactan sobre el spin de otro protn, produciendo desdoblamiento (cabe mencionar que cuando esta interaccin ocurre se dice que los protones se encuentran acoplados magnticamente) de la seal. Por ejemplo para el caso de la figura 7(C2H4Cl2) la seal ms pequea (Ha) se debe al protn del carbono unido a los dos tomos de cloro (CH3CHCl2), aparece a =5.85 (producto del desapantallamiento provocado por 2 tomos adyacentes de cloro) y est formada por un conjunto de cuatro seales (cuadruplete= 4 picos). Mientras que la seal de mayor intensidad aparece a =2,1 y est formada por dos lneas (dobletes) correspondiente a los tres tomos de hidrgeno del grupo metilo. En resumen (por ejemplo) si un vecino a 2 H produce una seal triplete, un H vecino a un H una seal doblete (regla N + 1).

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3) Constantes de acoplamiento:

Figura 8 = Constantes de acoplamiento de 1,1 dicloroetano

Las distancias entre los picos de multipletes (o protones acoplados) pueden dar informacin estructural permitiendo por ejemplo poder distinguir entre los posibles ismeros que posee un compuesto. La unidad de esta medicin es Hertzios (Hz) y se simboliza como Jab (en el caso de medir la distancia de acoplamiento entre Ha y Hb).

INTERPRETACIN DE LOS ESPECTROS DE RMN DE 1H : La interpretacin correcta de los espectros de resonancia magntica nuclear (RMN) requiere de mucha prctica y de los siguientes pasos a seguir: 1. A partir de la frmula molecular: a. Calcular el nmero de insaturaciones que posee el compuesto, este nmero de instauraciones puede indicar la presencia de anillos, dobles o triples enlaces. El nmero de instauraciones se calcula segn la siguiente expresin:

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g = N tomos de C +1- (n tomos H + n tomos halgeno - n tomos N)/2

b. Relacionar las reas de integracin de los peaks con el nmero total de protones de la estructura para obtener el nmero de protones que representa cada peak individual. 2. La presencia de un singulete ancho (nmero de H) en el espectro podra deberse a protones de NH o OH. Si el singulete ancho se encuentra ms all de 10 ppm es probable que se trate de un OH de cido. 3. Las seales entre 10 y 9 son indicativas de la presencia de un aldehdo. 4. Las seales que aparecen entre 8 y 7 indican la presencia de un anillo aromtico. 5. Las seales entre 6 y 5 indican la presencia de protones olefnicos. Mediante el valor de la constante de acoplamiento se puede deducir si la olefina es cis o trans. 6. Las seales entre 4 y 3 indican que hay protones en un carbono unido a un grupo electronegativo como es el oxgeno o un halgeno. 7. La presencia de una seal alrededor de 2.5 se debe al protn de un alquino terminal. 8. Las seales que aparecen entre 2.5 y 2.1 pueden indicar la presencia de protones adyacentes a un grupo carbonilo.

ESPECTROSCOPA DE RMN DE 13C Como se mencion anteriormente, la espectroscopia por RMN de 1H se utiliza para deducir la estructura del esqueleto carbonado observando los entornos magnticos de los tomos de hidrgeno. La espectroscopia de RMN de 13C determina el entorno magntico de los tomos de carbono, es por esto que la espectroscopia de
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C es complementaria a la de

H. La gran mayora de los tomos de carbono en una muestra natural (aprox. 99%) son

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C. este istopo posee un nmero par de protones y neutrones, por lo tanto, no tiene

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espn magntico y no puede generar seales de RMN. El istopo de

C, menos abundante,

no tiene un nmero par de neutrones, por lo que tiene un espn magntico de 172, igual al del protn. Esto hace que sea menos sensible que la espectroscopia de 1H, ya que solo un 1% de los tomos de carbono tiene espn y adems la frecuencia de resonancia del 13C es la cuarta parte de la frecuencia de RMN de 1H. Los desplazamientos qumicos del carbono son de 15 a 20 veces mayores que los del hidrgeno debido a que el carbono est directamente unido a los tomos que resultan ser bien apantallantes o desapantallantes. Por ejemplo, el protn de un aldehdo absorbe a 9.4 ppm en el espectro de 1H mientras que el carbono de carbonilo absorbe a 180 ppm en el espectro de 13 C. Adems, las seales en el espectro de
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C son lneas verticales, es decir, no hay

desdoblamientos de espn-espn. Esto se debe a que slo el 1% de los tomos de carbono entran en resonancia, y por tanto, existe una probabilidad muy pequea de que un ncleo de
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C est adyacente a otro ncleo de

C. A continuacin se da una tabla de valores

aproximados de desplazamientos qumicos en un espectro de resonancia magntica nuclear de 13C:

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APLICACIONES Referente a las distintas aplicaciones en patologas clnicas que se puede obtener de la espectroscopa por resonancia magntica se destaca: Tumores cerebrales:

Hoy en da la resonancia magntica convencional permite detectar tumores gracias a la mejora de la sensibilidad, el factor que no le favorece es que su aumento en sensibilidad no es acompaado por un aumento de de la especificidad Con la espectroscopia se hace posible evaluar el espectro metablico de la lesin lo que posibilita discernir con gran especificidad si se trata de una lesin tumoral o no. En los tumores se aparece una cada del NAA, porque el tumor no se compone de neuronas (que son las nicas que contienen NAA), tambin porque el crecimiento del tumor provoca la destruccin del parnquima cerebral y de neuronas en zonas cercanas. Se podra decir que una de las detecciones ms tiles con esta tcnica, es el aumento de la colina detectado, producto del incremento de la proliferacin celular (tumor) que genera un recambio de la membrana celular donde la colina se encuentra como fosfatidilcolina. En algunos tumores aparece un aumento del lactato, esto puede ser generado por una necrosis, o tambin, por un crecimiento tan acelerado que sobrepasa la va oxidativa y el cerebro debe recurrir a la gliclisis anaerbica, cuyo producto final es el lactato, para satisfacer la excesiva demanda de energa que se produce (Figura 9).

Figura 9: Ubicacin del voxel en la lesin. Aumento de colina, con disminucin de NAA y pico de lactato, caractersticos de proceso tumoral

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Infarto Cerebral

Aunque el cerebro puede metabolizar glucosa en forma anaerbica por breves periodos de tiempo, esto lo hace a expensas de acumular lactato. Este lactato o la acidosis que se asocia al mismo pueden exacerbar el dao neuronal. El NAA puede utilizarse par evaluar la extensin del dao neuronal, tanto de manera inmediata como en los estadios posteriores que siguen al evento isqumico agudo. En el infarto se observa una disminucin NAA y de la relacin NAA/Cr, sin aumento de la colina, se observa adems un pico de lactato bastante elevado', debido a que la falta de oxigenacin en los tejidos, producida por la isquemia hace que se utilice la gliclisis anaerbica para el metabolismo de la glucosa, con la consiguiente acumulacin de lactato. Se produce adems necrosis que tambin origina un aumento de este metabolito. Epilepsia

La epilepsia en lbulo temporal es la forma ms comn de crisis epilpticas parciales y es resistente al tratamiento en aproximadamente 40% de los pacientes. Muchos de estos pacientes pueden ser ayudados con una remocin quirrgica del foco epileptgeno, con la condicin de que: Todas o la mayora de las crisis se origen en el lbulo temporal. El lbulo temporal restante pueda compensar la funcin del lado extirpado.

La lateralizacin de las crisis se ha basado generalmente en la informacin clnica y electroencefalogrfica, este enfoque tradicional ha sido modificado por las tcnicas de neuroimgenes: tanto la RM convencional como y el PET se han usado con algn xito para la lateralizacin del foco epileptgeno, pero sus resultados pueden ser muy variables. En espectroscopia la deteccin de una disminucin de NAA en uno o ambos lbulos temporales se compara muy ventajosamente con las tcnicas descritas y es el mtodo ms sensible y especfico de lateralizacin de epilepsia del lbulo temporal. En aquellos pacientes que no han tenido convulsiones por al menos seis meses despus de una

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operacin al lbulo temporal anterior, la disminucin del NAA en la parte media y posterior, tiende a normalizarse. Esto debe de significar que la disminucin regional interictal del N-acetilaspartato que se detecta, refleja una disfuncin neuronal asociada con el estado epilptico, en lugar de una prdida neuronal irreversible, asociada con esclerosis del hipocampo. Otro hallazgo a mencionar es la presencia de glutamina, que se encuentra mucho ms elevada en el lado afectado" y ayuda tambin en la lateralizacin de la crisis epilpticas (Figuras 10 y 11).

Figura 10. Ubicacin del vxel en ambos hipocampos.

Figura 11. Leve disminucin de NAA, aumento de glutamina y leve disminucin de NAA

Esclerosis mltiple

La espectroscopia muestra que el NAA est substancialmente reducido en las lesiones agudas, esta reduccin muestra una recuperacin parcial a travs del tiempo. Tanto la disminucin como la recuperacin del NAA tienen una estrecha correlacin con las alteraciones neurolgicas observadas en pacientes con esclerosis mltiple (EM). Estos resultados refuerzan la hiptesis de que la disfuncin axonal est asociada con la disfuncin neurolgica y su subsiguiente recuperacin en la fase aguda de la EM. En la fase aguda tambin se observa un gran incremento de la Colina debido en gran parte a un movimiento de fosfolpidos de la membrana celular (Figuras 12 y 13). Tambin puede observarse un moderado incremento del lactato. En la fase crnica de la EM, puede observarse una disminucin del NAA no solo en las placas sino tambin en zonas adyacentes de apariencia normal. De hecho, esta reduccin

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del NAA en las zonas aparentemente no afectadas guarda gran correlacin con la gravedad de la incapacidad en pacientes con EM crnica.

Figura 12: Ubicacin del voxel en la lesin. Aumento de colina con disminucin del NAA caractersticos de esclerosis mltiple

Figura 13. A: T1 sagital mostrando las lesiones pericallosas de esclerosis mltiples, conocidos com los dedos de Dawson'. B: Estudio multivoxel mostrando aumento de la relacin colina/ creatina en la regin periventricular y pericallosa donde se encontraron las lesiones descritas.

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CONCLUSIONES

Finalmente podemos concluir que la Espectroscopia por Resonancia Magntica Es una tcnica de exploracin no invasiva que no implica exposicin a la radiacin ionizante. Puede ayudar a los mdicos a evaluar tanto la estructura de un rgano como su funcionamiento. Hace posible descubrir anormalidades que pueden quedar ocultas por los huesos con otros mtodos de exploracin. Permite la deteccin de anomalas cerebrales, as como la evaluacin de la anatoma funcional normal del cerebro, que no puede lograrse con otras tcnicas de diagnstico por imgenes. Tambin se debe considerar que al realizar una RMN existe un leve riesgo de que se produzcan reacciones alrgicas al inyectar el material de contraste. Dichas reacciones por lo general son benignas y de fcil control mediante la medicacin. Otro posible complicacin se puede producir en los pacientes con severa disfuncin renal por la inyeccin de material de contraste.

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