Experimento de Meselson- Stahl: ADN es replicado semiconservativamente La estructura de Watson- Crick tambin sugiere como el ADN puede dirigir

su propia replicacin. Cada hebra polinucleotdica puede actuar como molde para la formacin de su hebra complementaria mediante interacciones de apareamiento de bases. Las dos hebras de la molcula original deben por lo tanto separarse para que la hebra hija complementaria pueda ser enzimticamente sintetizada en la superficie de cada hebra progenitora. Esto resulta en dos molculas bicatenarias (dplex) de ADN, cada una consistente en una hebra polinucleotdica de la molcula original y una nueva hebra sintetizada. Este modo de replicacin se conoce como semiconservativo en contraste con la replicacin conservativa, la cual, si ocurriera, resultara en un nuevo dplex sintetizado a partir del ADN original, sin que el ADN parental sufra alteraciones o reemplazos. La naturaleza semiconservativa del ADN fue elegantemente demostrado en 1958 por Matthew Meselson yt Franklin Stahl. La densidad del ADN fue aumentada marcndola con 15N, un istopo pesado del N. Esto se logr cultivando E. coli por 14 generaciones en un medio conteniendo 15NH4Cl como nica fuente de nitrgeno. Las bacterias marcadas eran abruptamente transferidas a un medio conteniente 14N y la densidad de su ADN fue monitoreada como funcin del crecimiento bacterial por ultracentrifugacin de equilibrio de gradientes de densidad. Los resultados de Meselson- Stahl reflejaron que despus de una generacin, todo el ADN tena una densidad de exactamente la mitad entre las densidades del ADN completamente marcado con 15N, y el ADN sin marcar. Este ADN debe entonces contener cantidades iguales de 14N y 15N como se esperara despus de una generacin de replicacin semiconservativa. El ADN conservativo, en contraste, resultara en la preservacin del ADN parental en las nuevas generaciones, de manera que se mantuviera su densidad original. Despus de dos generaciones, la mitad de las molculas de ADN estaban sin marcar y el resto eran hbridos 14N-15N. esto tambin concuerda con las predicciones del modelo de semiconservacin y no con las del modelo conservativo. En generaciones sucesivas, las cantidades de ADN sin marcar aument respecto al ADN hbrido aunque este ADN hbrido nunca desapareci totalmente. Estos resultados confirman una vez ms la teora de la semiconservacin, desautorizando a la replicacin conservativa, la cual precide que los ADN parentales totalmente marcados siempre estarn presentes, y que el hbrido de ADN nunca se formar. Meselson y Stahl tambin demostraron con este experimento que el ADN es bicatenario. Los ADN de bacterias E. coli marcados con 15N que fueron cultivadas por una generacin en un medio 14N fueron calentados hasta desnaturalizacin a 100C (causando la separacin de las hebras), y luego sujetos a centrifugacin de gradiente de densidad. Se observaron entonces dos bandas, una a la densidad del ADN totalmente marcado con 15N y otra a la densidad del ADN sin marcar. Por otra parte, las masas moleculares del ADN en estas bandas, como se estima por la

forma de sus picos, era la mitad del ADN sin desnaturalizar. El ADN nativo debe entonces sin duda estar compuesto por hebras de igual tamao que se separan al alcanzar la temperatura de desnaturalizacin. Aadido de la clase: La adicin de 15N (marcado) es en un pequeo porcentaje, no todo el ADN queda marcado con este istopo, pero s una gran proporcin respecto al ADN original. El porcentaje de ADN marcado depende del tiempo de vida medio del 15N, debido a que este se descompone en 14N. El cambio de medio se realiza centrifugando, y colocando el pellet (pptado) resultante en otro recipiente al que se le aade 14N. Se trata de un experimento difcil porque requiere la coordinacin de los ciclos celulares de la poblacin del cultivo celular, para que todas las bacterias se repliquen a la vez. Experimento Avery- McLeod-McCarty En 1944 encontraron que el ADN extrado de una cepa virulenta de la bacteria Streptococus Pneumoniae, conocida tambin como neumococo, era capaz de transformar genticamente una cepa no virulenta a virulenta. El experimento consista en la inyeccin en un ratn de distintas cepas de bacterias. La inyeccin de bacterias virulentas encapsuladas vivas resultaba letal, mientras que las de la cepa no encapsulada vivas era inocua, al igual que las bacterias virulentas encapsuladas muertas por accin de calor. Investigaciones anteriores del bacterilogo F. Griffith haban demostrado que la adicin de bacterias encapsuladas muertas por el calor a una cepa de bacterias no encapsuladas vivas transformaba permanentemente esta ltima , convirtindola en virulenta y letal, y encapsulada. Avery y sus colaboradores identificaron el factor transformante como el ADN. Extrajeron ADN de neumococos virulentos muertos por el calor, eliminando la mayor cantidad de residuos proteicos presentes, y lo aadieron a la cepa no virulenta, observndose la conversin de la misma en virulenta y letal, y encapsulada. Era evidente que el ADN de la cepa virulenta penetraba en la no virulenta y que los genes que transmitan la virulencia tambin dirigan la formacin de la cpsula que acompaaba a la cepa virulenta. Las generaciones posteriores, a su vez, eran todas virulentas, letales y encapsuladas. Avery y sus colaboradores llegaron a la conclusin de que el ADN extraido de la cepa virulenta contena la informacin gentica hereditaria responsable de la virulencia. Existieron mltiples rechazos a esta conclusin, ya que algunas trazas de naturaleza proteica podan, a juicio de los detractores, ser las verdaderas responsables de la transmisin de

informacin. Esta hiptesis fue rpidamente desechada al observar que al tratarse el ADN con enzimas proteolticas antes de la adicin del ADN virulento a la cepa no virulenta la transmisin de informacin no se vea alterada, mientras que s lo haca con desoxirribonucleasas. Experimento de Hershey-Chase En 1952, Alfred Hershey y Martha Chase utilizaron el marcaje con fsforo radiactivo 32P y con azufre radiactivo 35S para demostrar que cuando el virus bacteriano (fago) T2 acta en su husped (E. coli) es el ADN que contiene fsforo de la partcula vrica, y no la protena que contiene azufre de la cpside del virus, el componente que realmente penetra en la clula del husped y provee la informacin gentica para la replicacin vrica. El experimento consisti en la preparacin de dos muestras de partculas de bacterifago marcadas isotpicamente, una con 32P en los grupos PO4-2 y otra con 35S en los residuos aminocidos de las protenas de la cpside. Luego se aadieron ambas preparaciones a dos suspensiones diferentes de E. coli no marcadsa. Se agit cada una de las suspensiones infectadas por los fagos en un homogeneizador para deshacer la unin entre las cpsides vricas y las bacterias, separando luego las cpsides vricas vacas y las bacterias por centrifugacin. Las bacterias infectadas por el fago marcado con 32P contenan 32P, lo que indicaba que el ADN vrico penetraba al husped. Las bacterias infectadas por el fago marcado con 35S no contenan marca radiactiva luego del tratamiento, mientras que los fantasmas (cpsides vacas) vricos s los contenan, demostrando que las cpsides vacas no tenan actividad en las clulas de los huspedes. Al cabo de cierto tiempo despus de la eliminacin de las cpsides, se observaba sin embargo progenie vrica en ambas cepas, demostrando que el mensaje gentico para la replicacin de los virus deba haber sido introducido por el ADN de los mismos en ambas cepas. Procedimiento de Sanger: determinacin de secuencias de aminocidos de t-ARN Background Information La secuenciacin de ADN nos permite realizar un exhaustivo anlisis del ADN porque nos provee de la informacin ms bsica de todas: la secuencia de nucletidos. Con este conocimiento, por ejemplo, podemos localizar secuencias regulatorias y de genes, hacer comparaciones entre genes homlogos entre especies e identificar mutaciones. Los cientficos reconocieron que esto podra potencialmente ser una poderosa herramienta, y se produjo entonces competencia por la creacin de un mtodo de secuenciacin de ADN. En 1974, dos mtodos fueron independientemente desarrollados por dos grupos, uno norteamericano y otro ingls. El grupo norteamericano, liderado por Maxam y Gilbert, usaba un protocolo de clivaje qumico, mientras que el grupo ingls, dirigido por Sanger, dise un procedimiento similar al proceso natural de replicacin del ADN. Si bien ambos equipos

compartieron en 1980 el Premio Nobel, el mtodo de Sanger se convirti en el estndar por su practicidad. Este mtodo, al que tambin se designa como secuenciacin dideoxy o terminacin de cadena, est basado en el uso de dideoxinucletidos (ddNTP s) en adicin a los nuclotides normales (NTP s) hallados en el ADN. Los ddNTP s son esencialmente lo mismo que los nucletides exceptuando que contienen un grupo hidrgeno en el carbono 3 en lugar de un grupo OH. Estos nucletidos modificados, al ser integrados en una secuencia, previenen la adicin de otros nucletidos. Esto ocurre debido a que el enlace fosfodister no puede formarse entre ddNTP s y el siguiente nucletido a aadir, y as la cadena de ADN es terminada. El Mtodo Antes de que el ADN pueda ser secuenciado, debe ser desnaturalizado en monohebras mediante calor. Luego, un cebador es templado a una de las cadenas templadas. Este cebador es especficamente construido de manera que su extremo 3 est ubicado a continuacin de la secuencia de ADN de inters. Este u otro de los nucletidos debe estar marcado radioactiva o fluorescentemente de modo que el producto final pueda ser detectado en un gel. Una vez que el cebador est adjunto al ADN, la solucin es dividida en cuatro tuvos etiquetados "G", "A", "T" y "C". Luego los reactivos son aadidos a estas muestras como sigue: "G" tubo: los cuatro dNTP's, ddGTP y DNA polimerasa "A" tubo: los cuatro dNTP's, ddATP y DNA polimerasa "T" tubo: los cuatro dNTP's, ddTTP y DNA polimerasa "C" tubo: los cuatro dNTP's, ddCTP y DNA polimerasa Como se ve a continuacin, todos los tubos contienen diferentes ddNTP presentes, y cada uno a aproximadamente 100 veces la concentracin del precursor normal A medida que el ADN es sintetizado, los nucletidos son aadidos a la cadena creciente por la ADN polimerasa. Sin embargo, en ocasiones un dideoxynucletido es incorporado a la cadena en lugar de un nucletido normal, lo cual resulta en una terminacin de la cadena. Por ejemplo, al analizar nicamente el tubo G, veramos lo siguiente:

Figure 1:Un ejemplo de los potenciales fragmentos que podran producirse en el tubo G. Los fragmentos son todos de diferentes longitudes debido a la integracin aleatoria de los ddGTP's La clave de este mtodo, es que todas las reacciones empiezan por el mismo nucletido y terminan en una base especfica. As, en una solucin donde la misma cadena de ADN est siendo sintetizada una y otra vez, la nueva cadena terminar en todas las posiciones donde el nucletido tiene la posibilidad de ser aadido por la integracin de los dideoxinucletidos. De este modo, se obtienen bandas de diferentes longitudes. Una vez que estas reacciones se han completado, el ADN es una vez ms desnaturalizado en una preparacin para electroforesis, o en gradiente de CsCl. Los contenidos de los cuatro tubos se corren en carriles separados en un gel de poliacrilamida, con el objetivo de separar las bandas de diferentes tamaos entre s. Despus de correr los contenidos a travs del gel, ste es expuesto bien a luz UV o a rayos X, dependiendo del mtodo utilizado para marcar el ADN previamente.

Figure 2: Este es un gel de poliacrilamida con las reacciones en el tubo G (fig 1). Los fragmentos ms largos viajan menos distancias que los ms cortos por su mayor peso molecular. La seccin azul indica el cebador, la negra la nueva hebra sintetizada y la roja marca ddGTP, con la que termina la cadena.

Como se ve en la figura 2, los fragmentos ms pequeos se producen cuando el ddNTP es aadido cerca del cebador, porque las cadenas son ms pequeas y migran ms rpido a travs del gel. Si todas las reacciones de los cuatro tubos se combinan en gel, la secuencia actual de ADN en la direccin 5 - 3 puede ser determinada leyendo el patrn de bandas desde la parte inferior a la superior del gel. Es importante recordar sin embargo que esta secuencia es la complementaria a la hebra inicial.

Figure 3: Esto es un autoradiograma de un gel de secuenciacin dideoxy. Las letras en los carriles indican cual nucletido fue usado en la muestra representada en ese carril.