A1.

SUBCLONAGEM DE DNA
1. PREPARO DO VETOR 1.1. Digesto do Vetor com endonuclease de restrio
Digerir o vetor de interesse (5g) num volume de 20L. Consultar o catlogo do fabricante para verificar as condies da reao para cada enzima, como temperatura, adio ou no de BSA, tampo ideal e condies de inativao. Se no for necessria a adio de BSA, adicionar o mesmo volume em gua. Tempo mmimo para reao de digesto de 2 horas. Obs: Em paralelo, deve-se realizar um controle negativo utilizando uma alquota do mesmo vetor. Neste caso, em lugar da endonuclease de restrio, adicionar o mesmo volume em gua. controle negativo ___L (0,5g) 2L 1L 10L

DNA Enzima BSA 10X Tampo 10 X H2O Milli-Q q.s.p.

___L (5g) 2L 2L 2L 20L

Incubao a 37 C por 2 horas Obs.: No utilizar concentrao de glicerol maior de 5% Evitar a utilizao de mais de 10 unidades de endonuclease de restrio por g de DNA

Em caso de digeto do vetor com duas enzimas diferentes, consultar o catlogo do fabricante para verificar as condies da reao para cada enzima e se existe a possibilidade de se realizar a digesto dupla. Quando no for possvel a digesto dupla: a) Digerir o vetor com uma das endonucleases segundo as condies especificadas no catlogo do fabricante, para a endonuclease em questo. Inativar termicamente a endonuclease, purificar o vetor digerido por precipitao com etanol, em gel de agarose ou em coluna para purificao de produto de PCR (ver protocolo QIAGEN). Consultar o catlogo do fabricante para verificar as condies de inativao de cada endonuclease. Proceder a digesto com a segunda endonuclease segundo as condies especificadas no catlogo do fabricante. Purificar o vetor digerido em gel de agarose. b) Outra possibilidade iniciar a digesto com a endonuclease que requer tampo com menor concentrao de sais. Aps a primeira digesto, aumentar o volume da reao (dobrar) adicionar o tampo apropriado e incubar com a segunda endonuclease de restrio (Obs.: verificar a proporo de glicerol na reao, <1:10). Obs.: Checar a capacidade da endonuclease de restrio digerir extremidades. Iniciar a digesto com a endonuclease de menor capacidade de digerir extremidades.

1.2. Eletroforese Analtica

Protocolos Sandro R. Valentini

A1.2

Retirar 3L da digesto e adicionar 5L de TE e 2L de tampo de amostra. Em paralelo adicionar 2L de tampo de amostra no tubo controle. Aplicar as amostras em gel de agarose 0,8%, juntamente com uma aliquota de 5L (0,5g) de padro de tamanho molecular (DNA Ladder-1kb) e submeter eletroforese em gel de agarose (vide protocolo de eletroforese em gel de agarose).

5L DNA Ladder

10L controle negativo 2L tampo de amostra

3L da digesto 5L H2O 2L tampo de amostra

Eletroforese em gel De agarose 0,8%

1.3. Desfosforilao do Vetor (quando necessrio)

Para desfosforilao do vetor aps a reao de digesto, proceder da seguinte forma: Diluir dez vezes a CIP (Concentrao estoque =10U/L) em tampo apropriado. Adicionar 0,5 unidade de CIP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) por micrograma de DNA e incubar a 37 por 60 minutos. C Aps incubao, inativar a enzima com EDTA (Estoque 0,5M) para uma concentrao final de 10mM a 70 C por 10 minutos. Purificar em coluna para purificao de produto de PCR.
o

Obs.: Caso a CIP utilizada seja da New England Biolabs, dar utilizar preferencialmente o Nebuffer 3.

Protocolos Sandro R. Valentini

A1.3 1.4. Preenchimento com Klenow (Fill-in) (quando necessrio)

Para o preenchimento de extremidades aps digesto do plasmdeo em 20L (5g), proceder da seguinte forma: Adicionar 1 L da mistura de dNTPs 0,5mM cada ( 22,7M cada) e 1L de Klenow (5U/L). Incubar a 30 por 15 minutos. Interromper a reao adicionan do 1L de EDTA 0,5mM e aquecer a 75 por 10 C C minutos. Purificar o vetor digerido em gel de agarose.

1.5. Desgaste com T4DNA Polimerase (quando necessrio)

Para o desgaste de extremidades coesivas aps digesto do plasmdeo em 20L (5g), adicionar 6L de uma mistura de dNTPs 0,5mM cada (100M cada) e 3L (5U/L) de T4 DNA polimerase por. Incubar a 11 por 20 minutos. Interromper a reao pelo aq uecimento a 75 por 10 minutos. C C

1.6. Eletroforese Preparativa

Aplicar toda a amostra do vetor digerido e modificado (quando necessrio) em gel de agarose 0,8% e submeter eletroforese (vide Eletroforese em Gel de Agarose)

1.7. Purificao a partir do Gel de Agarose

Aps a eletroforese preparativa, o vetor obtido dever ser purificado a partir do gel. Utilizando a lmpada de luz ultravioleta manual no comprimento de onda longo, o vetor dever ser retirado do gel de agarose, com o auxlio de uma lmina cortante ou um bisturi. Proceder como descrito no protocolo de extrao de DNA do gel (QIAGEN).

2. PREPARO DO INSERTO

2.1. Digesto para remoo do inserto

Digerir a construo plasmidial contendo o inserto de interesse (5-10g para fragmentos maiores de 1kb, 10-15g para fragmentos menores) num volume de 20L. Consultar o catlogo do fabricante para verificar as condies da reao para cada endonuclease, como temperatura, adio ou no de BSA, tampo ideal e condies de inativao . Tempo mmimo para reao de digesto de 2 horas. Neste caso, pode-se proceder a digesto utilizando-se, na mesma reao, duas endonucleases de restrio (Consultar o catlogo do fabricante para verificar a possibilidade de digesto dupla com as endunucleases em questo, bem como temperatura, adio ou no de BSA e tampo recomentado)

2.2. Eletroforese Analtica

Proceder como descrito no item 1.2.

Protocolos Sandro R. Valentini

A1.4 2.3. Preenchimento com Klenow (Fill-in) (Opional)

Se necessrio preenchimento aps a reao de digesto, proceder como descrito no item 1.4

2.4. Eletroforese Preparativa

Proceder como no item 1.6

2.5. Purificao a partir do gel

Proceder como descrito no item 1.7.

3. LIGAO 3.1. Eletroforese analtica do vetor e inserto

Aps purificao, analisar 1-2L dos fragmentos a serem recombinados (vetor e inserto) por eletroforese em gel de agarose 0,8% (vide protocolo de eletroforese em Gel de Agarose) para avaliar a pureza e estimar a concentrao dos mesmos.

3.2. Reao de Ligao

Para um volume final de 20L de reao, adicionar 2L de tampo da enzima T4 DNA ligase, um excesso de inserto em relao ao vetor (usualmente 10 vezes) e 1L de T4 DNA ligase (400U/mL). Incubar a reao por 12 a 16 horas a 16 C.

4. TRANSFORMAO BACTERIANA
Transformar o volume total da reao ou a metade (vide protocolo de Transformao Bacteriana).

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