ESTUDO DA ACTIVAO DE NEUTRFILOS

HUMANOS PELO NITRATO DE NQUEL

Marisa Andreia Carvalho de Freitas

Orientadora: Professora Doutora Eduarda das Graas Rodrigues Fernandes Co-orientador: Professor Doutor Jos Lus Fontes da Costa Lima

Dissertao apresentada Faculdade de Farmcia da Universidade do Porto para a obteno do grau de Mestre em Qumica Analtica Ambiental

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AGRADECIMENTOS

Na apresentao deste trabalho gostaria de exprimir o meu sincero agradecimento: Professora Doutora Eduarda Fernandes, pela extraordinria ajuda na estruturao e planeamento do trabalho, pelos preciosos conselhos e sugestes dados ao longo de todo este trabalho, pela cuidada reviso do texto, pela cedncia de bibliografia, pela pacincia e disponibilidade sempre presentes a cada pedido de ajuda e acima de tudo, pela amizade demonstrada. Ao Professor Doutor Jos Lus Fontes da Costa Lima, coordenador do Mestrado Europeu em Qumica Analtica Ambiental, pelos valiosos conhecimentos e orientaes transmitidos ao longo do Mestrado, pela ajuda prestada na reviso do presente trabalho, pela bibliografia facultada e pelo apoio, incentivo e confiana sempre demonstrados. Ao Laboratrio de Qumica-Fsica da Faculdade de Farmcia da Universidade do Porto, na pessoa do Professor Doutor Jos Lus Fontes da Costa Lima, por ter proporcionado as condies necessrias realizao deste trabalho. Ao Laboratrio de Toxicologia da Faculdade de Farmcia da Universidade do Porto, na pessoa da Professora Doutora Maria de Lourdes Bastos, pelo acolhimento e pelas condies disponibilizadas para a concretizao deste trabalho. Prof. Doutora Beatriz Porto do Hospital Geral de Santo Antnio, pela sua disponibilidade e preciosa contribuio para a realizao deste trabalho. Ao David Costa e Ana Gomes, a quem manifesto a maior gratido, pela amizade, esprito de camaradagem, incentivo e ajuda prestados durante a elaborao deste trabalho. Aos restantes colegas dos Laboratrios de Qumica-Fsica e Toxicologia da Faculdade de Farmcia do Porto pela forma paciente e simptica com que me acolheram, bem como, pelo bom ambiente de trabalho que proporcionaram, tornando a realizao deste trabalho muito mais gratificante; Aos meus pais e ao David por estarem sempre presentes, pelo carinho, compreenso e confiana em mim tantas vezes depositados;

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Por ltimo, a todos aqueles que com a sua ddiva de sangue, contriburam para a realizao deste trabalho.

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ABREVIATURAS

ABAH- cido 4-aminobenzico hidrazida ADP- Adenosina difosfato ATP- Adenosina trifosfato ATSDR- Agency for Toxic Substances and Disease Registry cNOS- xido ntrico sintetases constitutivas CO3.--Anio radical carbonato DAG- Diacilglicerol DNA- cido desoxirribonucleico DPI- Cloreto de difenilenoiodnio ECF-A- Factor quimiotctico eosinofilico da anafilaxia EDTA- cido etilenodiamino tetra-actico EGTA- Etileno glicol-bis -aminoetil ter H2O2- Perxido de hidrognio HO.- Radical hidroxilo HO2.- Radical hidroperoxilo HOCl- cido hipocloroso HO--Io hidroxilo IARC- International Agency for Research on Cancr IFN- - Interferon

IgA- Imunoglobina A IgE- Imunoglobina E IgG- Imunoglobina G IL-1 - Interleucina-1 KDa- Quilodalton iNOS- xido ntrico sintetases indutveis
.

NO- xido ntrico

NOS- xido ntrico sintetase IP3 - Inositol 1,4,5-trifosfato L-NAME- Cloridrato do ster metlico da N-nitro-L-arginina MPO- Mieloperoxidase NADPH- Nicotinamida adenina dinucletido fosfato (forma reduzida)
1

O2- Oxignio singuleto

O2-.- Anio radical superxido ONOO-- Anio peroxinitrito ONOOCO2- Anio nitrosoperoxicarbonato ONOOH- cido peroxinitroso PBS- Soluo salina de tampo fosfato isotnica PKC- Protena quinase C PMA- Acetato de miristato de forbol PMN- Neutrfilos

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RCHO- Aldedo RNS- Espcies reactivas de azoto ROS- Espcies reactivas de oxignio RPE- Ressonncia paramagntica electrnica rpm- Rotaes por minuto SOD- Superxido dismutase TC- Clulas T citotxicas TH- Clulas T auxiliares TNF- - Factor de necrose tumoral TS- Clulas T supressoras u.m.a.- Unidades de massa atmica

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RESUMO

Evidncias crescentes tm indicado que a exposio humana a metais pesados pode desencadear reaces imunolgicas prejudiciais para o hospedeiro. Entre os diversos metais, tem-se demonstrado que o nquel (Ni), na sua forma inica, particularmente capaz de induzir efeitos biolgicos adversos, nomeadamente efeitos alergnicos, pr-inflamatrios e txicos, quer in vivo quer in vitro. Os neutrfilos (leuccitos polimorfonucleares) so os leuccitos mais abundantes da corrente sangunea e participam activamente na defesa inata do hospedeiro. Estas clulas so as primeiras a chegar zona de inflamao, tendo um papel importante no processo inflamatrio e subsequentes danos teciduais. Apesar do interesse actual relacionado com os efeitos pr-inflamatrios do Ni pouco se sabe ainda sobre a interaco dos ies de Ni com os neutrfilos humanos. Assim, o objectivo deste estudo o de implementar e aplicar uma metodologia experimental, in vitro, para avaliar a possvel activao de neutrfilos humanos pelo nitrato de nquel. O primeiro trabalho experimental realizado no mbito da presente dissertao de mestrado visou a implementao de uma metodologia para o isolamento de neutrfilos humanos, pelo mtodo de centrifugao de gradiente de densidade. Neste estudo, utilizaram-se diferentes anticoagulantes no processo de recolha de amostras sanguneas, como o citrato, cido etilenodiamino tetra-actico (EDTA) e heparina, com o objectivo de avaliar a sua influncia na eficcia do isolamento dos neutrfilos, ou seja, na viabilidade celular e nmero de neutrfilos isolados. Constatou-se que existem diferenas significativas relativamente ao nmero de neutrfilos isolados, tendo sido o EDTA o que permitiu um maior nmero de neutrfilos isolados por mL de sangue (1,7106 1,5105 neutrfilos/mL sangue), quando comparado com a heparina e com o citrato (6,6105 1,5104 neutrfilos/mL sangue e 4,6105 9,5104 neutrfilos/mL sangue, respectivamente) (mdia erro padro da mdia). A viabilidade celular dos neutrfilos isolados foi sempre superior a 98%, independentemente do anticoagulante utilizado. No trabalho experimental seguinte, implementou-se uma tcnica de

quimioluminescncia, para avaliar a activao dos neutrfilos isolados, pelo acetato de

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miristato de forbol (PMA). O objectivo foi verificar se a utilizao de diferentes anticoagulantes influencia a resposta dos neutrfilos ao PMA. Verificou-se que a activao dos neutrfilos foi diferente consoante o anticoagulante utilizado durante o isolamento, tendo o EDTA originado um menor grau de activao relativamente ao citrato e heparina. Obteve-se as seguintes percentagens de activao dos neutrfilos, relativamente ao controlo, com EDTA, citrato e heparina: 370 30%, 830 98% e 827 77 %, respectivamente (mdia erro padro da mdia). No terceiro trabalho experimental efectuou-se a quantificao do clcio livre intracelular em neutrfilos isolados de sangue tratado com citrato, EDTA ou heparina. O objectivo deste estudo foi verificar se existiam diferenas nos nveis de clcio intracelulares em neutrfilos tratados com os diferentes anticoagulantes. Constatou-se que a concentrao de clcio livre foi inferior com EDTA (94,4 3,1 nM) quando comparado com citrato e heparina (156,2 28,7 nM e 165,3 14,8 nM, respectivamente) (mdia erro padro da mdia). No quarto trabalho avaliou-se a activao dos neutrfilos humanos pelo nitrato de nquel, utilizando as condies experimentais implementadas anteriormente. Foram testadas vrias concentraes de nitrato de nquel, 3,9; 7,8; 15,6; 31,3; 62,5 e 125 M. Todas levaram a uma activao dos neutrfilos, sendo essa activao dependente da concentrao. Tal como o PMA, tambm o nitrato de nquel levou a uma activao diferente consoante o anticoagulante utilizado durante o isolamento dos neutrfilos. Como exemplo representativo, o nitrato de nquel na concentrao de 125 M originou as seguintes percentagens de activao dos neutrfilos, relativamente ao controlo, com heparina, citrato e EDTA: de 263 28%, 233 29% e 129 10%, respectivamente (mdia erro padro da mdia). No quinto trabalho experimental avaliaram-se os processos envolvidos na gerao de espcies reactivas durante a activao dos neutrfilos pelo nitrato de nquel. Para o efeito, foram realizados estudos com inibidores especficos de enzimas responsveis pela gerao espcies reactivas ou captadores especficos de espcies reactivas, nomeadamente o cloreto de difenilenoiodnio (DPI) [inibidor da nicotinamida adenina dinucletido fosfato oxidase (NADPH oxidase)], cido 4-aminobenzico hidrazida (ABAH) [inibidor da mieloperoxidase (MPO)], tiron [captador do anio radical superxido (O2-.)], catalase [enzima metabolizadora do perxido de hidrognio (H2O2)]

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e manitol [captador do radical hidroxilo (HO.)]. A inibio da activao dos neutrfilos foi independente dos anticoagulantes utilizados no processo de isolamento. Verificou-se que as seguintes espcies reactivas de oxignio (ROS): O2-., H2O2, HO. e cido hipocloroso (HOCl), participam no processo de activao dos neutrfilos e que a NADPH oxidase e a MPO tm um papel preponderante na sua gerao. O envolvimento das espcies reactivas de azoto (RNS) foi testado com a utilizao de cloridrato de ster metlico da n-nitro-L-arginina (L-NAME), inibidor da enzima xido ntrico sintetase (NOS). Os resultados obtidos indicam que a activao dos neutrfilos no foi alterada pelo L-NAME, sugerindo que, nas presentes condies experimentais, o xido ntrico (.NO) e o anio peroxinitrito (ONOO-) no tm uma participao relevante na activao das clulas.

ABSTRACT

Increasing evidence indicates that human exposure to heavy metals may trigger immunological reactions that may be highly detrimental to the host. Among metals, nickel has been shown to induce adverse biological effects that have cast uncertainty on its safety for use in the body. Nickel ions are the most allergenic and pro-inflammatory metal ions known, and has been shown to elicit toxic effects in vitro and in vivo. Neutrophils (polymorphonuclear leukocytes) are the most abundant leukocytes of the blood and participate actively in the innate host defence response. These are also the first type of cells to arrive at an inflammatory site where they play a major role in the inflammation and subsequent tissue damage. In spite of the interest related to nickel pro-inflammatory effects, little is known concerning the interaction of nickel ions with human neutrophils. Thus, the objective of the present study is to implement a human neutrophil activation assay and use it to evaluate the putative activation of these cells by nickel nitrate. The first experimental work, aimed the implementation of a methodology for the isolation of human neutrophils by the gradient density centrifugation method. In this study, different anticoagulants were used in the blood samples collecting process, namely citrate, ethylene diaminetetracetic acid (EDTA) and heparin, in order to evaluate their influence in the effectiveness of the neutrophils isolation, that is, in the cellular viability and number of isolated neutrophils. Significant differences were observed in the number of isolated neutrophils. The greatest number of isolated neutrophils per mL of blood was obtained for EDTA (1,7106 1,5105 neutrophils/mL blood), when compared with heparin and citrate (6,6105 1,5104 neutrophils/mL blood and 4,6105 9,5104 neutrophils/mL blood, respectively) (mean standard error of the mean). The viability of the isolated neutrophils was always above 98%, independently of the anticoagulant used. In the second experimental work, one chemiluminescence technique was implemented to evaluate the activation of the isolated neutrophils by phorbol myristate acetate (PMA). The aim of this work was to verify if the use of different anticoagulants influences the neutrophils response to PMA. It was verified that the activation of neutrophils was different with citrate, EDTA and heparin. EDTA originated less degree of activation (370 30%) relatively to citrate (830 98%) and heparin (827 77 %). xi

In the thirth experimental work, the intracellular free calcium was quantified in neutrophils isolated from blood trated with citrate, EDTA or heparin. The aim of this study was to verify if there were any differences in the intracellular levels of free calcium in neutrophils treated with different anticoagulants. It was observed that the concentration of free calcium was lower with EDTA (94,4 3,1 nM) when compared with citrate and heparin (156,2 28,7 nM e 165,3 14,8 nM, respectively) (mean standard error of the mean). In the fourth experimental work, it was evaluated the activation of human neutrophils by nickel nitrate, using the previously implemented methodology. Different nickel nitrate concentrations were tested, 3,9; 7,8; 15,6; 31,3; 62,5 e 125 M. It was observed that nickel nitrate activated the neutrophils in a concentration-dependent manner. Similarly to PMA, the nickel nitrate-induced activation, was dependent on the previous use of citrate, EDTA or heparin. As a representative example, the nickel nitrate in the concentration of 125 M originated the following percentages of neutrophils activation, relatively to the control, for citrate, EDTA and heparin: 263 28%, 233 29% e 129 10%, respectively (mean standard error of the mean). In the fifth experimental work, the processes involved in the generation of reactive species during the neutrophils activation by nickel nitrate were evaluated. For this purpose, different studies were performed, involving specific inhibitors of the enzymes reponsible for the generation of reactive species namely diphenyleneiodonium chloride (DPI) [inhibitor of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase (NADPH oxidase)], 4-aminobenzoic acid hydrazide (ABAH) [inhibitor of myeloperoxidase (MPO)] or specific scanvengers of reactive species namely tiron [superoxide radical (O2-.) scavenger], catalase [metbolize enzyme of hydrogen peroxide (H2O2)] and mannitol [hydroxyl radical (HO.)scavenger]. The inhibition of the neutrophils activation was independent of the anticoagulants used in the isolation process. It was verified that the reactive oxygen species (ROS): O2-., H2O2, HO. hypochlorous acid and (HOCl), participate in the neutrophils activation process and that NADPH oxidase and MPO have a preponderant paper in their generation. The envolvement of reactive nitrogen species (RNS) was tested with an inhibitor of oxide nitric sintetase (NOS), the N-nitroL-arginine methyl ester (L-NAME). The results indicate that the neutrophils activation was not modified by the L-NAME, suggesting that, in the present experimental

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conditions, nitric oxide (.NO) and peroxynitrite anion (ONOO-), do not have an important participation in the activation process.

xiii

ndice NDICE

INTRODUO GERAL ....................................................................................... 4 1.1 1.2 Consideraes Gerais ....................................................................................... 5 Objectivos do trabalho e estrutura da dissertao ............................................ 6

INTRODUO ...................................................................................................... 7 2.1 Nquel............................................................................................................... 8 Abundncia e obteno............................................................................. 8 Principais caractersticas fsico-qumicas................................................. 9 Aplicaes .............................................................................................. 10 Papel Biolgico ...................................................................................... 11 Estudos epidemiolgicos ........................................................................ 15

2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 2.1.5 2.2

Sangue............................................................................................................ 18 Origem das clulas do sangue ................................................................ 19 Componentes do sangue ......................................................................... 21 Plasma................................................................................................. 21 Glbulos vermelhos............................................................................ 22 Plaquetas............................................................................................. 25 Glbulos Brancos ............................................................................... 27

2.2.1 2.2.2 2.2.2.1 2.2.2.2 2.2.2.3 2.2.2.4 2.3

Espcies reactivas de oxignio e azoto ........................................................ 35

MATERIAL E MTODOS ................................................................................. 45 3.1 3.2 3.3 Reagentes ....................................................................................................... 46 Equipamento ................................................................................................. 46 Isolamento de neutrfilos humanos pelo mtodo de centrifugao de

gradiente de densidade............................................................................................. 47

ndice 3.3.1 3.3.2 Fundamento do mtodo .......................................................................... 47 Utilizao de EDTA, citrato e heparina como anticoagulantes no

isolamento dos neutrfilos humanos ...................................................................... 49 3.3.3 3.3.4 3.4 Fundamento do mtodo .......................................................................... 49 Procedimento experimental .................................................................... 52

Avaliao da viabilidade celular e clculo do nmero de neutrfilos

isolados....................................................................................................................... 53 3.4.1 3.4.2 3.5 Fundamento do mtodo .......................................................................... 53 Procedimento experimental .................................................................... 53

Avaliao da activao de neutrfilos humanos pelo PMA, com utilizao

de uma tcnica de quimioluminescncia................................................................. 55 3.5.1 3.5.2 3.6 Fundamento da tcnica ........................................................................... 56 Procedimento experimental .................................................................... 58

Quantificao do clcio livre intracelular nos neutrfilos humanos

isolados, com utilizao de uma tcnica de fluorescncia ..................................... 59 3.6.1 3.6.2 3.7 Fundamento da tcnica ........................................................................... 59 Procedimento experimental .................................................................... 61

Avaliao da activao de neutrfilos humanos pelo nitrato de nquel,

com utilizao de uma tcnica de quimioluminescncia ....................................... 62 3.7.1 3.7.2 3.8 Fundamento da tcnica ........................................................................... 62 Procedimento experimental .................................................................... 62

Estudo das espcies reactivas envolvidas no processo de activao dos

neutrfilos, pelo nitrato de nquel, com a utilizao de uma tcnica de quimioluminescncia ................................................................................................ 63 3.8.1 3.8.2 3.8.3 3.9 Fundamento da tcnica ........................................................................... 63 Procedimento experimental .................................................................... 64 Estudos complementares ........................................................................ 65

Anlise estatstica.......................................................................................... 65 2

ndice 4 RESULTADOS ..................................................................................................... 66 4.1 Viabilidade dos neutrfilos humanos isolados a partir de amostras de sangue

tratadas com os anticoagulantes EDTA, citrato e heparina ........................................ 67 4.2 Nmero de neutrfilos humanos isolados a partir de amostras de sangue

tratadas com os anticoagulantes EDTA, citrato e heparina ........................................ 67 4.3 4.4 4.5 4.6 Activao de neutrfilos humanos pelo PMA................................................ 68 Quantificao do clcio livre intracelular nos neutrfilos humanos isolados 69 Activao de neutrfilos humanos pelo nitrato de nquel .............................. 70 Processos envolvidos na gerao de espcies reactivas durante a activao dos

neutrfilos pelo nitrato de nquel................................................................................ 71

DISCUSSO ......................................................................................................... 73

CONCLUSES FINAIS ...................................................................................... 83

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................................... 85

Introduo geral

1 INTRODUO GERAL

Introduo geral

1.1

CONSIDERAES GERAIS

Esta dissertao foi realizada no mbito do Curso de Mestrado em Qumica Analtica e Ambiental. O tema escolhido para a dissertao teve como base geral a preocupao actual sobre o impacto negativo da contaminao ambiental por metais pesados na sade dos organismos, nomeadamente no Homem, estando assim em armonia com os objectivos deste Curso de Mestrado. O metal pesado escolhido para os estudos relacionados com esta dissertao foi o Ni. Devido s suas propriedades fsico-qumicas, o Ni metlico e os seus compostos so muito utilizados na indstria moderna. O elevado consumo dos produtos que contm Ni inevitvel e origina poluio, quer durante a produo, reciclagem e mesmo durante a sua utilizao. A exposio humana ao Ni ocorre principalmente via inalao e ingesto, embora a utilizao de jias que contenham este elemento na sua composio seja tambm um factor importante de exposio pois leva ao desenvolvimento de alergias em aproximadamente 10 a 20% da populao. Estudos epidemiolgicos realizados nas ltimas dcadas a pessoas expostas ocupacionalmente a este elemento, comprovam que os compostos de Ni, excepto o Ni metlico, so pr-inflamatrios e pr-cancergenos em humanos. Apesar do interesse actual relacionado com os efeitos pro-inflamatrios do Ni pouco se sabe ainda sobre a interaco dos ies de Ni com os neutrfilos humanos. Os neutrfilos constituem os leuccitos mais abundantes da corrente sangunea e participam activamente na defesa inata do hospedeiro. Uma vez iniciada a resposta inflamatria, estas clulas so as primeiras a serem recrutadas para os locais afectados, devido sua elevada mobilidade e capacidade fagocitria. Os neutrfilos utilizam mecanismos dependentes e independentes do oxignio para a eficiente destruio de agentes invasores. Os mecanismos independentes do oxignio so a quimiotaxia, fagocitose, desgranulao e libertao de enzimas lticas e pptidos bactericidas. J os dependentes do oxignio incluem a produo de ROS e RNS. A sobre-activao dos neutrfilos, poder levar gerao sustentada de ROS e RNS em nveis elevados, resultando em efeitos deletrios para o organismo. Assim, a metodologia experimental escolhida para avaliar possveis efeitos adversos do Ni envolveu a utilizao de neutrfilos humanos isolados para estudar a sua possvel activao por este metal. 5

Introduo geral 1.2 OBJECTIVOS DO TRABALHO E ESTRUTURA DA DISSERTAO

O objectivo principal deste estudo foi o de implementar e aplicar uma metodologia experimental, in vitro, para avaliar a possvel activao de neutrfilos humanos pelo nitrato de nquel. Para atingir este objectivo dividiu-se o trabalho experimental em vrias fases complementares. A primeira fase visou a implementao de uma metodologia para o isolamento de neutrfilos humanos, pelo mtodo de centrifugao de gradiente de densidade. Na segunda fase implementou-se uma tcnica de quimioluminescncia, para avaliar a activao dos neutrfilos isolados, pelo PMA. Na terceira fase, quantificou-se o clcio livre intracelular dos neutrfilos isolados. Na quarta fase avaliou-se a activao dos neutrfilos humanos pelo nitrato de nquel, bem como os processos envolvidos na gerao de espcies reactivas durante a activao. Em todas as fases do estudo, foram utilizados diferentes anticoagulantes no processo de recolha de amostras sanguneas, nomeadamente o citrato, EDTA e heparina, com o objectivo de avaliar a sua influncia na eficcia do isolamento dos neutrfilos, ou seja, na viabilidade celular e nmero de neutrfilos isolados bem como na sua activao pelo PMA e pelo nitrato de nquel.

Esta dissertao divide-se em 6 captulos. O primeiro, designado Introduo, consiste num enquadramento terico em que se faz uma abordagem s principais caractersticas do nquel. Tambm neste captulo se caracterizam todos os componentes do sangue e a produo de ROS e RNS por algumas clulas de defesa, nomeadamente pelos neutrfilos. No segundo captulo so descritos os Materiais e Mtodos utilizados na fase experimental deste trabalho. Este captulo inclui o fundamento terico das tcnicas utilizadas e os procedimentos experimentais efectuados. Os Resultados obtidos so apresentados num terceiro captulo, a que se segue a Discusso e Concluses no quarto e quinto captulo, respectivamente. Por ltimo so apresentadas as Referncias Bibliogrficas que sustentaram o desenvolvimento do presente trabalho.

Introduo

2 INTRODUO

Introduo 2.1 NQUEL

O nquel um elemento qumico de smbolo Ni, nmero atmico 28 (28 protes e 28 electres) e massa atmica 58,7 u.m.a.. temperatura ambiente, o Ni encontra-se no estado slido. um elemento de transio situado no grupo 10 (8 B) da Classificao Peridica dos Elementos (The Merck Index, 2001). O uso do Ni remonta aproximadamente ao sculo IV A.C. geralmente junto com o cobre j que aparece com frequncia em ligas com este metal. Bronzes originrios da actual Sria tm contedos de Ni superiores a 2%. Manuscritos chineses sugerem que o cobre branco era utilizado no Oriente desde 1400-1700 A.C.. Entretanto, a facilidade de confundir as minas de Ni com as de prata induzem a pensar que, na realidade, o uso do Ni foi posterior, a partir do sculo IV A.C. (Soine e Wilson, 1957; Maibach e Menn, 1989; Lide, 1998). Os mineiros de Hartz atribuem ao viejo Nick (o diabo) o motivo pelo qual alguns minerais de cobre no poderiam ser trabalhados. O metal responsvel por isso foi descoberto em 1751 por Axel Frederik Cronstedt, quando tentava extrair cobre da niquelina, o qual denominou o kupfernickel, diabo do cobre (Maibach e Menn, 1989; Soine e Wilson, 1957).

2.1.1

Abundncia e obteno

O Ni existe em abundncia na crosta terrestre, representando 0,01% das rochas gneas. Trata-se, de facto, do vigsimo quarto elemento mais abundante no nosso planeta. Est presente em quase todos meteoritos, juntamente com o ferro (formando as ligas kamacita e taenita) e um dos constituintes fundamentais do ncleo da Terra. Os minrios que possuem Ni na sua composio, mais representativos, so a pentlandite [(Fe, Ni)9S8], a nicolite (NiAs) e a garnierite [3(Mg, Ni)O.2SiO2.2H2O] (The Merck Index, 2001; ATSDR, 2005). As minas de Nova Calednia, Austrlia e Canad produzem actualmente 70% do Ni consumido. Outros produtores so Cuba, Porto Rico, Rssia e China (Lide 1998; Denkhaus e Salnikow, 2002; ATSDR, 2005).

Introduo Os processos de extraco do Ni so muito complexos: nas suas fases finais, o NiS obtido ustulado a NiO e o xido reduzido com gs de gua (mistura de CO e H2) (Equao 1) (Soine e Wilson, 1957; The Merck Index, 2001). Equao 1:
2NiO (s) + CO (g) + H2 (g) 2Ni (s) + CO2 (g) + H2O (g)

Sendo o metal obtido bastante impuro, pode ser purificado pelo processo de Mond, que se traduz no seguinte equilbrio qumico (Equao 2) (Soine e Wilson, 1957; The Merck Index, 2001):

Equao 2:
Ni + 4CO (g) Ni(CO)4 (g)

2.1.2

Principais caractersticas fsico-qumicas

um metal de transio de colorao branco/prateada, condutor de electricidade e calor, dctil e malevel. No pode ser laminado, polido ou forjado facilmente, apresentando certo carcter ferro-magntico. A densidade do Ni 8,90 vezes a densidade da gua a 20C, funde-se a 1453C e entra em ebulio a 2732C (Soine e Wilson, 1957; Lide, 1989; The Index Merck, 2001; ATSDR, 2005). O catio Ni (II) (aq) um cido bastante fraco (pka =10,92), motivo pelo qual se pode obter solues aquosas lmpidas de Ni (II) sem adio de cido. O seu estado de oxidao mais comum +2 podendo apresentar estados de oxidao -1, 0, +1, +3 e +4 em complexos, sendo porm pouco comuns (Gould, 1959; Maibach e Menn, 1989; Denkhaus e Salnikow, 2001; ATSDR, 2005). H muitos compostos de Ni pouco solveis em gua (por exemplo NiCO3, NiC2O4, Ni(CN)2). Uma propriedade notvel do Ni, a sua capacidade de absorver monxido de carbono: 100 g de Ni(CO)4 podem absorver 500-800 mL de monxido de carbono (Denkhaus e Salnikow, 2002).

Introduo
Na natureza so encontrados 5 istopos estveis: Ni-58, Ni-60, Ni-61, Ni-62 e Ni64, sendo o mais leve o mais abundante (68,27%). Foram caracterizados 18 radioistopos, dos quais os mais estveis so o Ni-59, o Ni-63 e o Ni-56 com tempos de meia-vida de 76000 anos, 100,1 anos e 6,077 dias, respectivamente. Os demais radioistopos com massas atmicas desde 52 u.m.a. (Ni-52) a 74 u.m.a. (Ni-74), apresentam tempo de meia-vida inferior a 60 horas, embora a maioria no alcance os 30 segundos. O Ni tem tambm um estado metaestvel (The Merck Index, 2001; Denkhaus e Salnikow, 2002).

2.1.3

Aplicaes

O Ni puro usado em galvanoplastia, sendo depositado galvanicamente nas superfcies de peas metlicas para lhes conferir resistncia corroso, conferindo-lhes tambm um aspecto bastante liso e brilhante. Cerca de 65% do Ni consumido empregado na fabricao de ao inoxidvel e outros 12% em superligas de nquel. Os restantes 23% so repartidos na produo de outras ligas metlicas, baterias recarregveis, cunhagem de moedas, revestimentos metlicos e fundio (Lide, 1989; The Index Merck, 2001; ATSDR, 2005). A seguir referem-se algumas ligas metlicas fabricadas a partir deste elemento (Lide, 1989; The Index Merck, 2001; ATSDR, 2005): - Alnico (Al, Ni, Fe e Co), ligas para manes permanentes. - Monel (Ni, Cu e algum Fe), so muito resistentes corroso, utilizando-se em motores martimos e indstria qumica. - Nitinol-55 (Ni e Ti), apresenta o fenmeno de memria de forma e usado em robtica. Tambm existe em ligas que apresentam superelasticidade. - Raney, ou o chamado Ni de Raney obtido por tratamento de uma liga de Al e Ni com NaOH (aq), muito utilizado como catalisador de hidrogenaes, como por exemplo, na converso de gorduras insaturadas no comestveis em gorduras alimentares, como a margarina.

10

Introduo 2.1.4 Papel Biolgico

O Ni um elemento essencial para todas as formas de vida. Este metal ocupa o centro activo de sete enzimas microbianas (superxido dismutase (SOD), urease, hiderogenase, CO-desidrogenase e Acetil Coenzima A sintetase, Metil-Coenzima M reductase, glioxalase I e cis-trans isomerase) (Watt e Ludden, 1999). As enzimas que contm Ni no centro activo so vulgares no metabolismo de bactrias anaerbias, como por exemplo, as chamadas bactrias metanognicas, que podem crescer na presena de uma mistura de H2 e CO2, e so sistemas altamente especializados, sendo os nicos organismos capazes de produzir metano (CH4) como produto final do seu metabolismo (Baran, 1995; Watt e Ludden, 1999).

Superxido dismutase

A enzima Ni-superxido dismutase (Ni-SOD) foi isolada em 1996 a partir de duas espcies de Streptomyces. uma protena homotetramrica com 4 subunidades de 13 KDa. O Ni induz a sua expresso, reprime a FeZn-SOD (SOD que contm zinco e ferro) e encontra-se envolvido na maturao de um precursor polipeptdico. Resultados de Ressonncia Paramagntica Electrnica (RPE), indicam que o Ni est no estado Ni (III) e est axialmente coordenado por um ligando de azoto, provavelmente histidina. Estudos recentes revelam que o Ni pode tambm conter um ligando de enxofre presumivelmente um derivado da cistena (Baran, 1995; Ragsdale, 1998; Watt e Ludden, 1999). Esta enzima cataliza a reaco de dismutao do O2-. com formao de H2O2 e O2 (Equao 3).

Equao 3:
2H+ + 2O2-. H2O2 + O2

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Introduo Urease

Esta enzima conhecida h mais de 100 anos e foi, historicamente, a primeira enzima obtida sob a forma cristalina (1926). Aps a sua descoberta, a enzima urease foi identificada como uma metaloprotena que contm dois tomos de Ni (II) no seu centro activo, e capaz de catalisar a hidrlise da ureia em CO2 e amnia, acelerando a reaco 1014 vezes (Equao 4). A geometria de coordenao octadrica distorcida e a configurao electrnica do Ni (II) de alto spin. A esfera de coordenao dos tomos de Ni constituda por oxignios e azotos, no contendo enxofre. Esta enzima tem um papel crucial em ruminantes pois permite a utilizao da ureia como fonte de azoto para a sntese de protenas, de acordo com a Equao 4 (Kaim e Schwederski, 1994; Watt e Ludden, 1999).

Equao 4:
H2N-CO-NH2 + 2H2O 2NH3 + H2CO3

Hidrogenase

A hidrogenase uma enzima que catalisa a gerao e o consumo de hidrognio gasoso (Equao 5), com a participao de dadores ou aceitadores electrnicos adequados. Esta reaco possui um papel importante durante a fixao de azoto e durante a fermentao de biomassa com a produo de CH4. Tanto os microorganismos aerbios como os anaerbios contm hidrogenases. Por outro lado, o H2 pode ser utilizado como fonte de energia ou aparecer como produto final de processos redutores (Kaim e Schwederski, 1994; Baran, 1995; Ragsadale, 1998). As hidrogenases podem ser classificadas, de um modo geral, em: i) hidrogenases apenas de ferro, tambm conhecidas como Hase [Fe], de ocorrncia rara, no apresentando Ni e contendo dois agregados [4Fe-4S], alm de um agregado de ferro-enxofre, o centro H, considerado ser o centro cataltico. A estrutura deste centro H ainda desconhecida; ii) hidrogenases de Ni e com ferro-enxofre, tambm denominadas Hase [NiFe], sendo de longe as mais comuns e apresentam dois agregados [4Fe-4S], um agregado [3Fe-4S] e um centro

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Introduo
metlico contendo Ni. Pode ser feita ainda uma sub-diviso dentro desta classe de modo a incluir hidrogenases em que um dos ligandos do nquel uma seleno-cistena (Hase[NiSeFe]). Estas ltimas no possuem um agregado [3Fe-4S] (Baran, 1995; Ragsdale, 1998; Watt e Ludden, 1999). De acordo com Baran (1995), o tomo de Ni das enzimas Hase [NiFe], est coordenado por dois ou trs tomos de enxofre e por dois a quatro tomos de O e N, o que leva a uma coordenao octadrica distorcida. Durante a actividade, o Ni parece variar o seu estado de oxidao entre Ni (III) e Ni (II).

Equao 5:
2H+ + 2e H+ + HH2

CO-desidrogenase e Acetil Coenzima A sintetase

Muitas bactrias metanognicas ou acetonognicas, contm uma protena bifuncional com duas subunidades, uma CO-desidrogenase e uma acetil-Coenzima A sintetase. Por sua vez, a bactria fotossinttica prpura Rhodospirillum rubrum, contm apenas uma subunidade com uma CO-desidrogenase, que catalisa somente a oxidao de CO. Esta enzima catalisa a oxidao de CO a CO2 e como se trata de uma reaco reversvel, pode tambm servir para a fixao do CO2 pelas bactrias fotossintticas. A enzima tem um efeito duplo, j que, para alm de catalisar a reduo de CO2 a CO, a sua funo biolgica essencial est associada sntese de acetil coenzima A, actuando conjuntamente com a coenzima A, da denominar-se acetil CoA sintetase. Nas bactrias metanognicas o acetato degrada-se a CH4 e CO2, aparentemente atravs da formao intermdia de CO (Kaim e Schwederski, 1994; Ragsadale, 1998; Watt e Ludden, 1999). Diversos estudos espectroscpios e estruturais sugerem que este sistema contm um centro muito particular de composio Fe3NiS4. Outra possibilidade a existncia de um centro constitudo por [4Fe-4S] acopolado ao Ni atravs de um ligando. Este ltimo parece ter uma esfera de coordenao rica em enxofre (Baran, 1995; Watt e Ludden, 1999).

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Introduo Metil-Coenzima M reductase

Esta enzima utilizada por bactrias metanognicas para gerar CH4 por catlise da reduo da metil-coenzima M, sendo esta a ltima etapa da gerao de CH4 a partir de CO2 (Equao 6). A metil-coenzima M reductase constituda por vrios componentes, indispensveis para a actividade enzimtica. O centro activo propriamente dito est localizado numa protena dimrica formada por vrias subunidades de peso molecular de aproximadamente 300 KDa. Da mesma pode-se isolar uma unidade de baixo peso molecular, factor F-430, a qual contm Ni. A conformao desta enzima permite que o Ni (II) tenha a sua reactividade aumentada e que possa ocorrer a sua reduo (Ni (II)Ni (I)). Por outro lado, diversos estudos espectroscpios sugerem que na protena a coordenao do Ni (II) seria octadrica e a configurao do metal de alto spin (Kaim e Schwederski, 1994; Baran, 1995; Ragsdale, 1998; Watt e Ludden, 1999).

Equao 6:
CH3S(CH2)2SO3- + 2e- + 2H+ CH4 + HS(CH2)2SO3-

Glioxalase I

Esta enzima pertence a um sistema de duas enzimas, a glioxalase I e glioxalase II. A glioxalase I, uma metaloprotena tipicamente de zinco, que catalisa a isomerizao de hemitioacetal formado no enzimaticamente atravs da glutationa e -cetoaldedos citotxicos como o metilglioxal. Esta enzima foi isolada da bactria E. coli, e no activada pelo zinco, que o metal nativo nos seres humanos e leveduras. A activao ocorre com Ni (II). Esta foi a primeira glioxalase cujas funes so activadas por um metal diferente do zinco (Clugston et al., 1998; Watt e Ludden, 1999).

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Introduo Isomerase

Esta enzima foi isolada da bactria E. coli, por cromatografia de afinidade com metal imobilizado. uma cis-trans-isomerase que possui uma susposta ligao ao Ni (Watt e Ludden, 1999).

2.1.5

Estudos epidemiolgicos

O Ni pode ser absorvido pelo organismo por inalao (fumo de cigarro), ingesto (alguns alimentos, nomeadamente derivados de plantas, podem conter 1 mg Ni /Kg) e penetrao pela pele (vrias jias, moedas, utenslios diversos contm na sua composio este metal) (Denkhaus e Salnikow, 2002; Kasprzak et al., 2003; Lu et al., 2005), sendo a ltima forma a menos relevante, pois os compostos de Ni ionizados no conseguem penetrar na pele, desde que esta esteja intacta (Denkhaus e Salnikow, 2002). A quantidade de Ni absorvido no sistema gastrointestinal depende das espcies de Ni ingeridas, do contedo total neste elemento e da absoro individual. Contudo, sabe-se que 1 a 2% do Ni ingerido numa dieta normal absorvido, enquanto o resto excretado na urina e fezes (Kasprzak et al., 2003; Silvulka, 2005). Estudos epidemiolgicos realizados nas ltimas dcadas a pessoas expostas ocupacionalmente a este elemento, comprovam que os compostos de Ni, excepto o Ni metlico, so cancergenos em humanos (Denkhaus e Salnikow, 2002; Sivulka, 2005). Tendo em conta que a principal via de exposio ao Ni por inalao, compreensvel que se verifique com maior frequncia cancro nas vias respiratrias e pulmes (International Agency for Research on Cncer (IARC), 1997). Em 1990, o IARC sugeriu que haveria riscos de contrair cancro nas vias respiratrias, quando existia uma exposio a Ni solvel em concentraes superiores a 1 mg/m3 enquanto que a exposio a formas de Ni menos solveis, se poder tolerar concentraes at 10 mg/m3. Todavia, esta organizao no conseguiu definir com confiana as concentraes a partir das quais este elemento se torna efectivamente perigoso (IARC, 1997). Neste momento, existe a preocupao de descobrir sob que forma qumica que

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Introduo
o Ni se torna carcinognico. Ensaios laboratoriais demonstraram que partculas insolveis (menores que 5 m) podem ser fagocitadas por culturas de clulas e formam vacolos intracelulares que geram Ni (II) perto do ncleo. Quanto mais negativa for a carga da superfcie da partcula, mais facilmente fagocitada. Aps a fagocitose, as partculas do interior dos vacolos so rapidamente dissolvidas a pH 4,5 o que leva a um aumento dos nveis intracelulares de Ni. Consequentemente, considerveis quantidades de Ni (II) so libertadas desses vacolos, podendo atingir o ncleo (Figura 1) (Costa et al., 2001; Costa et al., 2002; Lu et al., 2005).

Figura 1. Modelo da fagocitose e dissoluo intracelular de NiS e Ni3S2 cristalinos, NiS

amorfo e sais solveis de Ni (adaptado de Costa et al., 2002).

Os caties de Ni (II) podem tambm ser transportados atravs da membrana celular por difuso ou atravs de canais de clcio, sendo contudo processos mais ineficientes e inefectivos quando comparados com a fagocitose (Costa et al., 2001; Costa et al., 2002; Denkhaus e Salnikow, 2002). Foi recentemente descoberto que ies solveis de Ni entram na clula por uma via transportadora de metais divalentes (Costa

et al., 2002), podendo afectar a homeostase do ferro de vrias formas. Pode competir
com o ferro para entrar na clula, a nvel extracelular, mas pode tambm competir a nvel intracelular, por exemplo, com enzimas que contenham este metal. Esta competio ocorre devido s semelhanas das estruturas atmicas destes elementos (Davidson et al., 2005).

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Introduo
Atravs da quantificao directa da concentrao de Ni no interior da clula, foi demonstrado que a exposio das clulas a sais de Ni solveis em gua, resulta em nveis elevados deste elemento no citoplasma e baixos no ncleo, enquanto que uma exposio a Ni3S2 cristalino leva a elevados nveis no ncleo. Esta diferena concordante com a baixa actividade cancergena dos compostos de Ni (II) solveis em gua (NiSO4), quando comparados com os insolveis em gua (Ni3S2, NiS, NiO) (Haber

et al., 2000; Costa et al., 2001, Costa et al., 2002).

Aps vrios estudos realizados em animais, concluiu-se que os compostos de Ni so os nicos da classe de cancergenos que induzem cancro no local sujeito exposio e podem ser responsveis por diferentes tipos de cancro (Costa et al., 2001; Denkhaus et

al., 2002; Lu et al., 2005).

A produo de ROS est envolvida no mecanismo de toxicidade e carcinogenicidade do Ni. Essa produo pode causar peroxidao lipdica, alteraes no DNA, tais como mutaes em pares de base, rearranjos, deleces, inseres, podendo afectar o sinal de transduco e, consequentemente, ter implicaes irreversveis na sequncia de DNA (Denkhaus e Salnikow, 2002; Cavallo et al., 2003; Chen et al., 2003a, Babu et al., 2006). O Ni tem dois mecanismos de induo de danos oxidativos no DNA. Um deles directo, em que o Ni (II) que entra nas clulas e reage com H2O2, formando um complexo oxo-Ni (IV) ou um complexo Ni (III) perxido, levando produo de outras ROS, nomeadamente HO. (Kawanishi et al., 2002). Segundo Chen

et al. (2003a) o radical HO. pode danificar as bases do DNA, causar quebras nas
ligaes do DNA e causar ligaes cruzadas DNA-protena. Esta genotoxicidade parece contribuir para o efeito carcinognico deste metal. O outro mecanismo indirecto, provocado por inflamao, o que leva produo de ROS pelas clulas de defesa (neutrfilos e macrfagos). O ONOO- gerado nos tecidos inflamados pode causar danos, inclusive no DNA, nas clulas adjacentes (Kawanishi et al., 2002). Segundo o estudo realizado por Kawanishi et al. (2002), o NiSO4, NiO e Ni3S2 provocam danos indirectos no DNA atravs da inflamao. O Ni3S2 pode provocar tambm danos directos no DNA. Alguns estudos demonstram que existem clulas que desenvolvem mecanismos de resistncia contra o stresse oxidativo provocado pelo Ni, como por exemplo um aumento de cerca de 1,8 vezes de glutationa em clulas expostas a este metal (Denkhaus

et al., 2002). Contudo, outros revelam que a aplicao de Ni a clulas pode danificar os
17

Introduo
mecanismos de defesa antioxidantes, bem como, os mecanismos de reparao do DNA (Lynn et al., 1997; Cavallo et al., 2003). De acordo com Denkhaus e Salnikow (2002), Cavallo et al. (2003), Chen et al. (2003a) e Babu et al. (2006), conclui-se que a exposio das clulas a compostos de Ni induz a produo de ROS, que por sua vez, tm uma forte interferncia nos mecanismos biolgicos da prpria clula, estando directamente envolvidos na carcinogenicidade deste metal. De referir que apesar da carcinogeniciade atribuda ao Ni, o desenvolvimento de cancro em humanos depende de muitos factores, como a extenso do dano no DNA, o sistema de reparao do DNA e dos genes reguladores de sinal.

2.2

SANGUE

O sangue um tecido lquido que circula pelo sistema vascular sanguneo dos animais vertebrados. Num homem adulto representa cerca de 1/12 do peso do seu corpo, o que corresponde a 5-6 L (Tagliasacchi e Carboni, 1997). Trata-se de um tecido conjuntivo especializado, constitudo, em volume, por 45% de clulas sanguneas, tambm designadas como elementos figurados e 55% de plasma sanguneo. As clulas sanguneas so de trs tipos funcionais (Figura 2): (i) hemcias (ou eritrcitos, glbulos vermelhos) que transportam oxignio dos pulmes para os tecidos perifricos; (ii) leuccitos (ou glbulos brancos) que possuem um papel defensivo, destruindo os organismos infectantes como bactrias e vrus, assim como auxiliando na remoo dos tecidos mortos ou lesados; (iii) plaquetas (trombcitos), os quais constituem a primeira linha de defesa contra a leso dos vasos sanguneos, aderindo s solues de continuidade e participando no sistema de coagulao do sangue. O plasma, formado por 90% de gua, meio que facilita a circulao de muitos factores indispensveis de que constitudo (Young e Heath, 2000; Seeley et al., 2001; Gartner e Hiatt, 2003).

18

Introduo

Figura 2. Composio do sangue (adaptado de www.oxfordreference.com).

2.2.1

Origem das clulas do sangue

O tempo de vida limitado das clulas do sangue exige a sua renovao regular, a fim de manter constante a populao de clulas circulantes. O processo pelo qual as clulas sanguneas maduras se desenvolvem a partir de clulas precursoras denominado hematopoese (tambm denominado hemocitopoese ou hemopoeise) (Young e Heath, 2000; Gartner e Hiatt, 2003). No incio da gravidez, o embrio retira os alimentos de que precisa das paredes do tero materno. Por volta das trs semanas de gestao, inicia-se a hematopoese no saco vitelino onde se formam pequenas massas celulares, que se vo transformando em agrupamentos sanguneos, designados ilhotas de Wolff. Estas ilhotas desenvolvem-se a partir de hemocitoblastos, os progenitores das clulas hematopoiticas e endoteliais (Kierszenbaum, 2004). As clulas que delimitam o contorno das ilhotas vo originar as paredes dos primeiros vasos sanguneos. Gradualmente, o interior dessas ilhotas vai ficando vazio e as clulas mais internas transformam-se em glbulos vermelhos primitivos. No incio do segundo ms, o sangue j tem glbulos vermelhos, brancos e plaquetas. Os vasos sanguneos e glbulos vermelhos so de origem extra-embrionria, ou seja, fora do embrio. Aps o segundo trimestre, a hematopoese fetal continua no fgado e depois no bao (Kierszenbaum, 2004). Durante o stimo ms de vida intrauterina, inicia-se a fase mielide (de myelos, medula) de produo de sangue, em que a medula ssea (tecido gelatinoso que preenche a cavidade interna dos ossos longos e 19

Introduo
esterno) comea a desempenhar o papel de principal estrutura produtora de sangue, e assim permanece durante toda a vida (Young e Heath, 2000; Gartner e Hiatt, 2003; Kierszenbaum, 2004). Na altura do nascimento, a medula ssea vermelha o principal local de produo de eritrcitos, o que lhe confere uma cor vermelha profunda, da o nome medula vermelha (Young e Heath, 2000). Como a medula ssea apenas atende s necessidades normais, qualquer demanda maior (por exemplo devido perda excessiva de sangue ou no caso de destruio extensa da medula ssea) pode levar retoma de actividade hemopoitica por parte do fgado e bao (Stevens e Lowe, 1995). No adulto, um volume de cerca de 1,7 L de medula contm 1012 clulas hematopoiticas (Kierszenbaum, 2004). Com o passar dos anos, a maior parte da medula vai perdendo a sua funo, sendo substituda por um tecido gorduroso, passando a ser designada medula amarela. Esta pode ser reactivada se surgir a necessidade de hematopoese aumentada (Young e Heath, 2000). Segundo Seeley et al. (2001), todos os elementos figurados do sangue derivam de uma nica populao de clulas indiferenciadas denominadas hemocitoblastos (Figura 3).

Figura 3. Clulas envolvidas na hematopoese (adaptado de www.msd-brazil.com).

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Introduo
Essas clulas do origem aos progenitores imediatos dos vrios tipos de clulas do sangue: os proeritroblastos, que originam os eritrcitos; os mieloblastos, que originam os granulcitos; os linfoblastos, que originam os linfciotos; os megacarioblastos que originam as plaquetas.

2.2.2

Componentes do sangue

2.2.2.1 Plasma

Mais de 50% do sangue consiste num lquido de cor amarela plida, que composto por cerca de 91% de gua e 9% de outras substncias, (Tagliasacchi e Carboni, 1997; Seeley et al., 2001), tais como protenas plasmticas, que correspondem a 7%, 0,9% de sais inorgnicos, sendo o restante formado por compostos orgnicos diversos (gases, aminocidos, vitaminas, hormonas e glicose) (Junqueira e Carneiro, 2004). As protenas plasmticas so responsveis por diversas caractersticas biofsicas do plasma, como a densidade, a viscosidade e a presso onctica. As protenas do plasma so de trs tipos principais, a albumina, a globulina e o fibrognio. A albumina representa 58% do total de protenas plasmticas, e como no passa facilmente do sangue para os tecidos, possui a importante funo de manuteno da presso onctica do sangue. Isto possvel porque esta protena extrai gua dos tecidos para os capilares, dificultando, por outro lado, a sua sada dos capilares para os tecidos (Seeley et al., 2001; Gartner e Hiatt, 2003). As globulinas correspondem a 38% das protenas plamticas, funcionando algumas como molculas de transporte e participando outras no sistema de defesa e nos mecanismos de imunidade e alergia. O fibrognio constitui 4% do total de protenas do plasma e fundamental nos fenmenos de coagulao sangunea.

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Introduo 2.2.2.2 Glbulos vermelhos

Os glbulos vermelhos, tambm designados hemcias ou eritrcitos (erythros, vermelho; kitos, clula), so as clulas maioritrias do sangue (cerca de 700 vezes mais numerosas que os leuccitos e 17 vezes mais que as plaquetas) (Seeley et al., 2001). A quantidade de eritrcitos no sangue varia com o sexo. No homem adulto normal, a sua concentrao de aproximadamente 5,2 milhes de eritrcitos por mL3 de sangue (variando entre 4,2 e 5,8 milhes), enquanto que na mulher normal 4,5 milhes por mL3 (variando entre 3,6 e 5,2 milhes) (Seeley et al., 2001; Junqueira e Carneiro, 2004). Os glbulos vermelhos no se movem activamente. So movidos atravs da circulao pelas foras responsveis pela circulao sangunea. So clulas de forma bicncava, anucleadas, medindo em mdia 7,5 m de dimetro (Junqueira e Carneiro, 2004; Kierszenbaum, 2004), 2 m de espessura na sua regio mais larga e menos de 1

m no centro (Gartner e Hiatt, 2003). A forma bicncava dos eritrcitos favorece a

existncia de uma grande superfcie de difuso, em relao ao seu tamanho e volume, acentuando desse modo a troca de gases. Essa forma, juntamente com a fluidez da membrana plasmtica, permite que o eritrcito se deforme prontamente tornando mais fcil o seu movimento atravs dos pequenos vasos sanguneos (3-4 m), sem que ocorra o rompimento da membrana celular (Young e Heath, 2000; Seeley et al., 2001; Gartner e Hiatt, 2003). Apesar das clulas precursoras dos eritrcitos dentro da medula ssea serem nucleadas, durante o seu desenvolvimento e maturao, expelem, no somente o ncleo, como tambm todos os seus organelos, antes de serem libertadas na circulao sangunea (Gartner e Hiatt, 2003). Esse facto favorece o transporte de oxignio, pois as clulas podem conter maior quantidade de hemoglobina, contribuindo para uma maior eficincia por unidade de volume. Aproximadamente 60% da clula do glbulo vermelho constituda por gua e o restante pelos elementos slidos. Da parte slida, cerca de 90% ocupada por hemoglobina, protena responsvel pela sua cor vermelha. Fazem ainda parte do eritrcito, lpidos, adenosina trifosfato (ATP) e a enzima andrase carbnica (Seeley et al., 2001). Esta enzima, possui a importante funo de catalisar a reaco entre o CO2 e gua dando origem a cido carbnico, que por sua vez, se dissocia formando ies bicarbonato e hidrognio (Equao 7). sob a forma de bicarbonato que grande parte do CO2 transportado para os pulmes onde expelido. A

22

Introduo
produo de ies bicarbonato tambm importante para a regulao do pH do sangue (Seeley et al., 2001; Gartner e Hiatt, 2003).

Equao 7:

CO2 + H2O

H2CO3

H+ + HCO3-

A hemoglobina possui a funo vital de transporte dos gases respiratrios, nomeadamente a distribuio do oxignio pelo organismo. Quimicamente uma molcula bastante complexa, podendo ser dividida em mais de 500 aminocidos. composta por quatro cadeias de protenas e quatro grupos heme. Cada protena, chamada globina, est ligada a um grupo heme. Cada grupo heme uma molcula pigmentada de vermelho contendo um tomo de ferro, sendo este responsvel por manter o oxignio ligado molcula. O corpo humano adulto, normalmente contm cerca de 4 g de ferro, 2/3 dos quais, associados hemoglobina (Seeley et al., 2001). J o dixido de carbono, no se combina com os tomos de ferro, mas liga-se aos grupos amina da molcula globina (Seeley et al., 2001). A configurao qumica da hemoglobina permite um aproveitamento excepcional do oxignio (cada molcula pode transportar quatro molculas de oxignio). Em zonas onde a presso de oxignio alta, como nos pulmes, as molculas de hemoglobina combinam-se com molculas de oxignio, formando a oxi-hemoglobina, cuja colorao vermelho viva. Esta combinao reversvel, e o oxignio transportado por esta protena transferido para os tecidos, onde a presso de oxignio baixa. A combinao de hemoglobina com o dixido de carbono produzido nos tecidos tambm facilmente reversvel quando o sangue chega aos pulmes. Essa combinao designa-se carbamino-hemoglobina, sendo a sua colorao vermelho escura. Contudo, grande parte do CO2 transportada dos tecidos para os pulmes, dissolvida no plasma (Junqueira e Carneiro, 2004). O.NO uma substncia neurotransmissora que tambm pode ser captada pela hemoglobina. Provoca a dilatao dos vasos sanguneos tornando possvel a libertao de mais oxignio e a captao de uma maior quantidade de dixido de carbono pelos eritrcitos presentes nos tecidos do corpo (Gartner e Hiatt, 2003). Com base na sequncia de aminocidos, existem quatro cadeias polipeptdicas humanas normais de hemoglobina do feto, denominadas , , e . Segundo Gartner e Hiatt (2003), a principal hemoglobina do feto, a hemoglobina fetal (HbF) constituda 23

Introduo
por duas cadeias e duas cadeias . Representa cerca de 100% da hemoglobina do feto e cerca 80% da hemoglobina do recm-nascido, baixando a sua taxa progressivamente at ao oitavo ms de idade, quando atinge a percentagem encontrada nos adultos (cerca de 1%) (Junqueira e Carneiro, 2004). Este tipo de hemoglobina, tem uma enorme afinidade para o oxignio, e constitui uma adaptao fisiolgica, com a finalidade de extrair mais oxignio da circulao materna da placenta. H dois tipos normais de hemoglobina no adulto, HbA1 (22) e HbA2 (22), sendo esta ltima forma muito mais rara. Num adulto normal a HbA1 representa 97%, a HbA2, cerca de 2% da hemoglobina e os restantes 1% dizem respeito HbF (Gartner e Hiatt, 2003; Junqueira e Carneiro, 2004). A vida mdia das hemcias de 100 a 120 dias (Young e Heath, 2000; Seeley et

al., 2001) e regida, em parte, pela sua capacidade de manter a forma bicncova.
medida que as suas protenas, enzimas, componentes da membrana celular e outras estruturas degeneram, os glbulos vermelhos ficam velhos, tornando-se anormais quer na forma, quer na funo. Os eritrcitos tambm ficam sujeitos a sofrer diversos danos durante a circulao pelos vasos. Os glbulos vermelhos anormais, velhos ou alterados so removidos do sangue por macrfagos, localizados principalmente no fgado e bao, mas tambm noutros tecidos linfticos. No interior do macrfago, enzimas lisossmicas iniciam a assimilao da hemoglobina. (Young e Heath, 2000; Seeley et al., 2001), ocorrendo um fraccionamento da globina nos aminocidos que a constituem, muitos dos quais so reutilizados na produo de outras protenas. Os tomos de ferro tambm so libertados para que possam ser reaproveitados. Os grupos heme so convertidos em bilirrubina, que por sua vez, conjugada com o cido glucurnico no fgado e excretada pela blis, sendo convertida em pigmentos por microorganismos intestinais, conferindo s fezes a sua cor caracterstica amarelo-acastanhada. Alguns desses pigmentos so reabsorvidos do intestino e eliminados na urina, dando-lhe uma cor caracterstica (Seeley et al., 2001). Em condies normais, cerca de 2,5 milhes de glbulos vermelhos so destrudos por segundo. Este nmero surpreendente, todavia, representa somente 0,00001% do total de 25 trilies contidos na circulao de um adulto normal. Mais surpreendente ainda, o facto desses 2,5 milhes de glbulos vermelhos serem substitudos pela produo de um nmero igual em cada segundo (Seeley et al., 2001). A quantidade de glbulos vermelhos no sistema circulatrio controlada pelo organismo, de tal forma que um nmero adequado est sempre disponvel para o transporte de oxignio para os

24

Introduo
tecidos. Qualquer condio que diminua a quantidade de oxignio nos tecidos, tende a aumentar a produo de glbulos vermelhos. A produo de eritrcitos pela medula bastante estimulada por uma protena presente no plasma, denominada eritropoietina (Seeley et al., 2001). A produo de eritrcitos exige a presena de vitamina B12 e um factor da mucosa do estmago, designado factor intrnseco, que se combina com a vitamina B12. Outro componente importante no processo de formao e maturao de eritrcitos o cido flico.

2.2.2.3 Plaquetas

As plaquetas, tambm designadas como trombcitos, so pequenos fragmentos (24 m), anucleados, derivados dos megacarioblastos. Estes so clulas extremamente grandes (com dimetros superiores a 100 m) formadas na medula ssea, que desenvolvem projeces citoplasmticas originando as pr-plaquetas, que por sua vez se fragmentam dando origem s plaquetas. Este um processo que pode levar 10 a 12 dias (Tagliasacchi e Carboni, 1997; Seeley et al., 2001; Kierszenbaum, 2004). Existem entre 250 000 e 400 000 plaquetas por mm3 de sangue, sendo formadas cerca de 30 000 plaquetas por dia/mL de sangue (Gartner e Hiatt, 2003). A estrutura interna das plaquetas bastante complexa. Observadas ao microscpio electrnico, mostram 10 a 15 microtbulos dispostos paralelamente uns aos outros e formando um anel no hialmero (regio perifrica). Na regio central apresentam o granulmero. Os microtbulos contm monmeros de actina e miosina e contribuem para manter a morfologia discide das plaquetas, bem como, para formar alongamentos ou pseudpodes, alm de contrair as plaquetas quando estimuladas pelo aumento de clcio no interior do citoplasma. A contraco desses microfilamentos comprime os organelos e grnulos do citoplasma, fazendo com que o seu contedo passe para o plasma atravs do sistema tubular aberto. Esta disposio permite um aumento da rea de superfcie da plaqueta e facilita a libertao de molculas activas armazenadas nas plaquetas (Young e Heath, 2000; Gartner e Hiatt, 2003). O granulmero contm algumas mitocndrias, depsitos de glicognio, peroxissomas e alguns tipos de grnulos (delimitados por membrana): grnulos , grnulos e grnulos (lisossomas), cujas 25

Introduo
caractersticas se encontram listadas no Quadro 1. O granulmero tambm contm um sistema de enzimas que possibilita s plaquetas catabolizar o glicognio, consumir oxignio e gerar ATP. As plaquetas so de fundamental importncia nos processos de hemopatia (visa impedir a perda de sangue) e coagulao do sangue. A participao das plaquetas na coagulao do sangue pode ser resumida da forma que se segue (Stevens e Lowe, 1995; Seeley et al., 2001; Gartner e Hiatt, 2003):

Agregao primria: aps uma leso num vaso, ocorre perda do endotlio de revestimento dos vasos, segue-se uma adeso das plaquetas ao colagneo, formando o denominado tampo plaquetrio.

Agregao secundria: as plaquetas do tampo libertam adenosina difosfato (ADP), este um potente indutor da agregao plaquetria, levando a um aumento do nmero de plaquetas.

Coagulao do sangue: quando h uma hemorragia considervel, h necessidade de se formar um cogulo sanguneo, j que este mais consistente e firme do que o tampo plaquetrio. Um cogulo sanguneo uma rede de fibras proteicas filiformes, denominada fibrina, que retm clulas sanguneas, plaquetas e lquido.

Retraco do cogulo: inicialmente o cogulo faz uma grande projeco para o interior do vaso. Entretanto, por aco da actina, miosina e ATP das plaquetas, contrai-se.

Remoo do cogulo: a parede do vaso, protegida pelo cogulo, forma novo tecido, acabando por se restaurar. O cogulo ento removido maioritariamente pela enzima plasmina e tambm por enzimas libertadas pelos lisossomas.

26

Introduo Quadro 1. Caracterizao dos grnulos das plaquetas. Estrutura (Tamanho) Contedo
Fibrognio, factor de crescimento derivado das Grnulos (300- 500 nm) plaquetas, tromboplastina plaquetria, trombospondina, factores de coagulao. Grnulos (250- 300 nm) Grnulos (lisossomas) (200-250 nm) Clcio, ADP, ATP, serotonina, histamina, pirofosfatase. Enzimas hidrolticas. Facilitam a agregao e a adeso plaquetria, bem como, a vasoconstrio. Auxiliam a reabsoro do cogulo. Facilitam a reparao dos vasos, a agregao plaquetria e a coagulao do sangue.

Funo

ADP: adenosina difosfato; ATP: adenosina trifosfato.

2.2.2.4 Glbulos Brancos

As clulas brancas do sangue (leuccitos) so assim designadas por estarem presentes na camada branca que flutua acima das clulas vermelhas quando o sangue coagula num tubo de ensaio (Stevens e Lowe, 1995). O nmero de leuccitos muito menor do que os glbulos vermelhos, tendo um adulto normal entre 6500 a 10000 glbulos brancos por mm3 de sangue. A principal funo destas clulas proteger o corpo contra microorganismos invasores e remover clulas mortas e corpos estranhos do organismo. Ao contrrio dos eritrcitos, os leuccitos no agem na corrente sangunea, utilizam-na como veculo para o trnsito entre os locais de formao, de armazenamento e de actividade (Gartner e Hiatt, 2003). Estas clulas saem da corrente sangunea e entram nos tecidos por diapedese. Durante este processo, os leuccitos estreitam-se e alongam-se passando entre ou, em alguns casos, atravs das clulas que formam as paredes dos vasos. Os glbulos brancos so tradicionalmente divididos em dois grupos, com base na sua forma nuclear e nos grnulos citoplasmticos: granulcitos (neutrfilos, eosinfilos e basfilos) e os agranulcitos (linfcitos e moncitos). Os 27

Introduo
granulcitos so assim designados devido aos seus grnulos secretores citoplasmticos proeminentes, podendo tambm ser denominados clulas mielides, pois so originados na medula ssea. De acordo com o tipo de colorao dos grnulos especficos, distinguem-se trs tipos de granulcitos: neutrfilos, eosinfilos e basfilos. Alm dos grnulos especficos, estas clulas possuem grnulos azurfilos (lisossomas). Tm como caracterstica o facto de possurem um nico ncleo multilobulado (Young e Heath, 2000; Gartner e Hiatt, 2003). Os agranulcitos tm forma mais regular e o citoplasma no possui granulaes especficas, podendo apresentar grnulos azurfilos, inespecficos, presentes tambm noutros tipos celulares (Young e Heath, 2000; Gartner e Hiatt, 2003).

2.2.2.4.1 Neutrfilos

Os neutrfilos, tambm denominados polimorfonucleares (PMN), so o tipo mais comum de leuccitos no sangue e constituem de 60 a 75% dos glbulos brancos circulantes (Gartner e Hiatt, 2003). Os neutrfilos representam a primeira linha de defesa contra agentes invasores e actuam em consonncia com os linfcitos e macrfagos. Uma vez iniciada a resposta inflamatria, estas clulas so as primeiras a serem recrutadas para os locais afectados, devido sua elevada mobilidade e capacidade fagocitria (Costa et al., 2006). Os neutrfilos normalmente permanecem na circulao durante 10 a 12 horas, migrando em seguida para outros tecidos, onde tm uma vida mdia de cerca de um a dois dias (Jlio, 1999; Seeley et al., 2001). Estas clulas possuem ncleos formados por dois a cinco lbulos (mais frequentemente trs) ligados entre si por finas pontes de cromatina. Nas clulas jovens o ncleo no lobulado e tem forma de um bastonete curvo. Nos neutrfilos de indivduos do sexo feminino, o cromossoma x condensado, ou corpsculo de Barr, existe sob a forma de um apndice pequeno em formato de raquete (Young e Heath, 2000; Junqueira e Carneiro, 2004). O citoplasma dos PMN apresenta trs tipos de granulaes: os grnulos primrios ou azurfilos (lisossomas), os grnulos secundrios e os grnulos tercirios. Os grnulos azurfilos so os primeiros grnulos a aparecer durante a diferenciao dos neutrfilos. Contm hidrolases cidas, tpicas dos lisossomas, e uma quantidade considervel de 28

Introduo
agentes microbicidas, inclusive a MPO (Stevens e Lowe, 1995; Young e Heath, 2000). Os grnulos secundrios so especficos dos neutrfilos. Estes grnulos contm e secretam substncias envolvidas na resposta inflamatria aguda, como mediadores inflamatrios e activadores do complemento. Os grnulos tercirios contm enzimas (por exemplo gelatinase que degrada o colagnio lesado) que so secretadas para o ambiente extracelular. Tambm inserem algumas glicoprotenas nas membranas celulares, o que pode promover a adeso celular, e desse modo possivelmente facilitar a fagocitose (Stevens e Lowe, 1995; Young e Heath, 2000). A exposio dos granulcitos a vrios tipos de estmulos induz a activao da actividade celular, nomeadamente a fagocitose. Para chegar a uma rea de infeco, ou leso tecidual, os neutrfilos deixam a circulao aderindo s clulas endoteliais por meio de molculas de adeso expressas em resposta secreo local de citocinas e movem-se atravs do endotlio e da membrana basal. Uma vez no tecido de sustentao, os neutrfilos respondem a factores quimiotticos (quimiotaxinas), libertados pelo tecido lesado e gerados pela interaco dos anticorpos com os antignios na superfcie dos microorganismos, movendo-se para a regio de concentrao mais alta (Stevens e Lowe, 1995; et al., 1995; Young e Heath, 2000). O processo pelo qual os microorganismos ou partculas so recobertos por anticorpos e complemento ou outros factores, sendo ento preparados para o reconhecimento e posterior ingesto pelas clulas fagocticas denomina-se opsonizao. Os anticorpos (imunoglobina G, (IgG), imunoglobina A (IgA) e imunoglobina E (IgE)) tm uma importante capacidade opsonizante. Os PMN tm nas suas membranas receptores para o complemento, os quais tambm facilitam a fagocitose. Os anticorpos podem ser opsonizantes directamente ou atravs da capacidade de activar o sistema complemento (Jlio, 1999). Segundo Young e Heath (2000) os organismos que no geram quimiotaxinas ou que no so opsonizados so portanto relativamente resistentes fagocitose neutroflica e consequentemente altamente patognicos. Como primeira etapa da fagocitose, o organismo circundado por pseudpodes que ento se fundem para englob-lo completamente numa vescula endocitria designada fagossoma. Os lisossomas e outros grnulos citoplasmticos unem-se ao fagossoma, formando o fagolisossoma (Figura 4). Esses grnulos descarregam o seu contedo, expondo o organismo entre outros componentes, a uma mistura potente de enzimas lisossmicas.

29

Introduo

Figura 4. Esquema de fagocitose pelos neutrfilos (adaptado de www.wikipedia.org).

Os PMN utilizam mecanismos dependentes e independentes do oxignio para a eficiente destruio de patognios. Os mecanismos independentes do oxignio so os j referidos quimiotaxia, fagocitose, desgranulao e libertao de enzimas lticas e pptidos bactericidas. J os dependentes do oxignio incluem a produo de ROS e RNS (Quinn e Gauss, 2004; Barreiros et al., 2006; Costa et al., 2006). Tendo executado a sua funo, ocorre a morte dos PMN por um processo designado por apoptose (morte celular programada), permitindo o seu reconhecimento e a consequente retirada pelos macrfagos dos tecidos. evitada, deste modo, a libertao de produtos indesejveis potencialmente txicos dos grnulos para o meio extracelular. Contudo, a morte destas clulas pode resultar na formao de pus, ou seja, a acumulao de leuccitos, bactrias mortas e fluido extracelular (Jlio, 1999; Gartner e Hiatt, 2002).

2.2.2.4.2 Basfilos
Os basfilos so os menos comuns dos leuccitos constituindo menos de 1% dos leuccitos no sangue. Os basfilos so caracterizados por grnulos citoplasmticos grandes, que muitas vezes obscurecem o ncleo. So provavelmente os precursores dos mastcitos e so intensamente basfilos (Stevens e Lowe, 1995;Young e Heath, 2000). O basfilo (de 14 a 16 m de dimetro) tem um tamanho intermdio entre o neutrfilo e o eosinfilo, tem um ncleo volumoso, com forma retorcida e irregular, geralmente com o aspecto da letra S (Young e Heath, 2000; Gartner e Hiatt, 2003). Os grnulos especficos dos basfilos so metacromticos, medem aproximadamente 0,5 m de 30

Introduo
dimetro e esto, frequentemente, comprimidos contra a periferia da clula tornando a periferia rugosa caracterstica do basfilo, quando vista ao microscpio ptico (Gartner e Hiatt, 2003). Contm histamina, factores quimiotcticos para eosinfilos e neutrfilos, leucotrienos e heparina, que responsvel pela metacromasia do grnulo (Junqueira e Carneiro, 2004). Os grnulos contm tambm outros mediadores dos processos inflamatrios, por exemplo, a substncia de reaco lenta da anafilaxia (SRS-A) e o

factor quimiotctico eosinoflico da anafilaxia (ECF-A). A principal funo dos

basfilos provavelmente a resposta imunolgica a certos parasitas (Young e Heath, 2000). Os basfilos contm na membrana receptores especficos para o segmento Fc da IgE, que produzida pelos plasmcitos em resposta a uma variedade de antignios ambientais. A ligao de antignios s molculas de IgE na superfcie dos basfilos leva libertao do contedo dos seus grnulos especficos para o espao extracelular (desgranulao). A libertao de histamina e outros mediadores vasoactivos, responsvel pela chamada reaco de hipersensibilidade imediata (anafilctica), caracterstica da rinite alrgica, de algumas formas de asma e de urticria. Os basfilos participam tambm na reaco de hipersensibilidade tardia, que leva a reaco alrgica da pele (Kierrszenbaum, 2004). Os leucotrienos tm efeitos semelhantes histamina, embora com aces mais lentas e mais persistentes. Alm disso, os leucotrienos activam os leuccitos levando-os a migrar para o local do desafio antignico (Young e Heath, 2000; Gartner e Hiatt, 2003).

2.2.2.4.3 Eosinfilos
Os eosinfilos perfazem de 1 a 6% dos leuccitos no sangue circulante. O seu nmero exibe uma variao diurna acentuada, sendo mais numerosos pela manh e menos numerosos tarde (Stevens e Lowe, 1995). Estas clulas tm aproximadamente o mesmo tamanho dos neutrfilos (12 a 17 m de dimetro), o seu ncleo bilobulado e so facilmente identificadas devido presena de granulaes ovides que coram pela eosina (granulaes acidfilas). As microradiografias electrnicas revelam grnulos especficos que apresentam um centro de elevada densidade, assemelhando-se a um cristal, denominado internum, cujo principal componente uma protena bsica, rica em

31

Introduo
arginina, que constitui 50% das protenas do grnulo, possuindo tambm enzimas hidrolticas lisossmicas e uma peroxidase diferente da MPO dos neutrfilos. A camada que envolve o internum possui menor densidade, sendo rica em fosfatase cida e designa-se externum. Os grnulos inespecficos so os lisossomas, que contm enzimas hidrolticas semelhantes s encontradas nos neutrfilos. Estas funcionam na destruio de vermes parasitrios e na hidrlise de complexos antignio-anticorpo internalizados pelos eosinfilos (Young e Heath, 2000; Gartner e Hiatt, 2003). Os eosinfilos so clulas fagocitrias, com um metabolismo semelhante ao dos neutrfilos, parecendo ser, todavia, menos microbicidas do que estes. No entanto, tm uma afinidade fagocitria particular pelos complexos antignio-anticorpo. Tal como os neutrfilos, os eosinfilos movem-se quimiotaticamente em resposta a produtos bacterianos e componentes do complemento. So atrados preferencialmente por substncias libertadas pelos mastcitos, nomeadamente histamina e o ECF-A, assim como por linfcitos activados. Todos os eosinfilos tm receptores para a IgE que podem ser importantes na destruio dos parasitas e no esto presentes nos neutrfilos (Stevens e Lowe, 1995; Young e Heath, 2000). A fagocitose ocorre da maneira usual, embora, se o objecto for muito grande (por exemplo um parasita), o eosinfilo o elimine libertando o contedo dos seus grnulos para o ambiente externo. Os eosinfilos podem ter um papel na melhoria de certos aspectos das reaces de hipersensibilidade, pois so capazes de neutralizar a histamina e de produzir um factor (inibidor derivado do eosinfilo) que provavelmente composto por prostaglandinas E1 e E2, que se acredita ser capaz de inibir a desgranulao dos mastcitos. Os eosinfilos quando activados inibem substncias vasoactivas (por exemplo o leucotrieno, SRS-A) produzidas pelos mastcitos e basfilos.

2.2.2.4.4 Moncitos
Os moncitos constituem cerca de 3 a 8% dos leuccitos e so as maiores clulas do sangue circulante (at 20 m de dimetro) (Young e Heath, 2000). Os moncitos tm o ncleo ovide, em forma de rim, geralmente excntrico, que se cora menos intensamente que o dos outros leuccitos, devido ao arranjo pouco denso da sua 32

Introduo
cromatina (Junqueira e Carneiro, 2004). O citoplasma possui dois tipos de grnulos, os grnulos azurfilos (lisossomas) que contm fosfatase cida, aril sulfatase e peroxidase, que so anlogos aos grnulos azurfilos dos neutrfilos. O contedo do outro tipo de grnulo no bem conhecido. Numerosos pequenos pseudpodes so visveis nestas clulas, reflectindo a sua habilidade fagocitria e movimentos amebides. Os moncitos so precursores localizados na medula ssea e no sangue dos macrfagos encontrados nos tecidos e rgos linfides, sendo membros de uma mesma unidade funcional o sistema mononuclear fagocitrio. Os moncitos permanecem na circulao durante somente alguns dias, e atravessam, por diapedese, a parede dos capilares e vnulas, migrando para o tecido conjuntivo, onde se diferenciam em macrfagos (Stevens e Lowe, 1995; Young e Heath, 2000; Gartner e Hiatt, 2003). Os moncitos respondem presena de material necrtico (necrotaxia), aos microorganismos invasores (quimiotaxia) e inflamao, diferenciando-se em macrfagos que com a sua grande capacidade de fagocitose e o abundante contedo de enzimas hidrolticas, engolfam e destroem os detritos dos tecidos e material estranho, como parte do processo de cura e de restaurao da funo normal. Algumas dessas funes formam parte integrante dos mecanismos imunolgicos, p. ex. a apresentao do antignio e a destruio final do antignio. Nesse caso, a activao dos linfcitos resulta na produo de factores que acentuam a actividade fagocitria dos macrfagos. Em resposta a partculas estranhas de elevadas dimenses, os macrfagos fundem-se uns com os outros, formando clulas gigantes, capazes de fagocitar esse tipo de partculas (Young e Heath, 2000; Gartner e Hiatt, 2003).

2.2.2.4.5 Linfcitos
Os linfcitos constituem 20 a 25% da populao total de leuccitos circulantes e so responsveis pelo funcionamento adequado do sistema imunolgico (Gartner e Hiatt, 2003). Esta percentagem varia muito de acordo com a sade do paciente, sendo o seu nmero bastante aumentado no caso de infeces virais. Os linfcitos podem ser subdivididos em trs categorias funcionais: linfcitos B (clulas B), linfcitos T (clulas T) e clulas nulas. Estas categorias so indiferenciadas quando analisadas por microscopia, sendo, no entanto, diferenciveis por tcnicas imunocitoqumicas para deteco de receptores especficos da membrana. Cerca de 80% dos linfcitos 33

Introduo
circulantes so clulas T, as clulas B representam 15% e o restante so clulas nulas. Os seus tempos de vida variam de alguns anos no caso das clulas T a alguns meses nas clulas B. Os linfcitos so os leuccitos mais pequenos, medindo geralmente 6 a 8 m de dimetro (Seeley et al., 2001). Contudo, existem cerca de 3% de linfcitos grandes, que podem atingir os 18 m (Junqueira e Carneiro, 2004). Possuem um ncleo esfrico, preenchendo quase toda a clula, deixando o citoplasma com uma pequena rea, abrigando entre outros grnulos, um pequeno nmero de lisossomas. Embora tenham origem na medula ssea, estas clulas migram atravs do sangue at aos tecidos linfticos onde amadurecem e expressam marcadores e receptores de superfcie. As clulas B migram para zonas ainda no identificadas da medula ssea, enquanto que as clulas T migram para o timo (Phipps et al., 1993). Ao contrrio dos outros leuccitos que no retornam ao sangue depois de migrarem para os tecidos, os linfcitos voltam dos tecidos para o sangue circulando continuamente, sendo que a maior parte destas clulas se encontra nos tecidos linfticos: gnglios linfticos, bao, amgdalas e timo (Seeley et al., 2001). Depois de serem estimuladas por um antignio especfico, tanto as clulas B como as T proliferam e diferenciam-se em duas subpopulaes: as clulas de

memria no participam na resposta imunolgica, mas permanecem como parte de um

clone com uma memria imunolgica, prontas para montar uma resposta contra uma exposio subsequente a um determinado antignio ou substncia estranha; as clulas

efectoras podem ser classificadas em clulas B e clulas T (e seus subtipos). As clulas

B so responsveis pelo sistema imunolgico mediado pelos fluidos do corpo, ou seja, so caracterizadas pela sua capacidade de sintetizar anticorpos, os quais so glicoprotenas destinadas a ligarem-se a antignios especficos. Os anticorpos podem circular no sangue, ou nos fluidos corporais ou permanecer ligados superfcie da clula B onde se comportam como receptores de antignios, activando a clula B quando o antignio apropriado encontrado. As clulas T so responsveis pelo sistema imunolgico mediado por clulas. Diversos subconjuntos de clulas T agem para regular a funo das mesmas e aumentar a produo de anticorpos pelas clulas B. Temos as clulas T auxiliares (TH), que so essenciais para activar outros linfcitos T, linfcitos B, natural killers e macrfagos. As clulas T citotxicas (TC) atacam e destroem as clulas malignas e as infectadas por vrus. As clulas T conhecidas como

clulas T supressoras (TS), operam para evitar ou modificar as funes dos dois
sistemas. Pensa-se que podem desligar a reaco imunitria especfica quando a mesma j no necessria. Os linfcitos T trabalham principalmente atravs da segregao de 34

Introduo
mensageiros qumicos potentes, conhecidos como citocinas (linfocinas), que recrutam e activam fagcitos reactivos no-especficos, incluindo componentes da resposta inflamatria e clulas natural killer. As clulas nulas so compostas por duas populaes distintas: clulas tronco que do origem a todos os elementos figurados do sangue e clulas natural killer, matam algumas clulas estranhas e as alteradas por vrus, sem influncia do timo ou de linfcitos T (Phipps et al., 1993; Stevens e Lowe, 1995; Gartner e Hiatt, 2003).

2.3

ESPCIES REACTIVAS DE OXIGNIO E AZOTO

No organismo humano, as ROS e RNS so geradas de forma basal em processos fisiolgicos, verificando-se um aumento da sua produo em vrios processos de agresso ao organismo, nomeadamente em processos inflamatrios, envolvendo macrfagos, neutrfilos e eosinfilos. Estas espcies so de extrema importncia no combate a agentes invasores. No entanto, o seu excesso est associado ao denominado stresse oxidativo, que se pode definir como um desiquilbrio entre espcies proxidantes e antioxidandes a favor das primeiras, num sistema biolgico (Ferreira e Matsubara, 1997; Barreiros e David, 2006; Vieira, 2006). Os alvos maioritrios do stresse oxidativo a nvel celular so a membrana celular (inactivao de enzimas e alteraes do transporte transmembranar), o citoplasma e os seus constituintes (protenas e lpidos) e, fundamentalmente, o DNA do ncleo das clulas eucariticas (mutagnese) (Ferreira e Matsubara, 1997; Barreiros et al., 2006). As doenas cardiovasculares, a carcinognese e o envelhecimento so exemplos representativos de consequncias que decorrem do stresse oxidativo. As ROS, de que so exemplo o O2-., HO., HO2., 1O2, H2O2, HOCl, so derivados de oxignio molecular com actividade redox, apresentando maior reactividade do que este. J as RNS, que englobam o .NO2 ONOO-, ONOOH, N2O3, so derivados do .NO que tambm possuem actividade redox (Cheesman e Slater, 1993; Vieira, 2006). Ambas so constitudas por elementos radicalares e no radicalares. Os radicalares definem-se como qualquer tomo, grupo de tomos ou molcula com um ou mais que um electro desemparelhado ocupando uma rbita externa (Vieira, 2006). O no emparelhamento do 35

Introduo
electro leva a uma elevada instabilidade electrnica, e por esta razo, mesmo tendo um tempo de vida muito curto, apresentam elevada reactividade, pois possuem uma forte tendncia para doar ou receber electres. O O2-., HO. e .NO, so exemplos de radicais (Cheesman e Slater, 1993; Campos e Yoshida, 2004). As espcies no radicalares, como por exemplo H2O2, ONOO- e oxignio singuleto (1O2) tambm apresentam reactividade, mas no possuem um electro desemparelhado na ltima camada, no podendo ser classificadas como radicais (Cheesman e Slater, 1993; Campos e Yoshida, 2004; Vieira, 2006). Sendo os neutrfilos as clulas alvo do presente estudo, interessa referir que estas clulas constituem os leuccitos mais abundantes da corrente sangunea, e participam activamente na resposta inflamatria. Quando os neutrfilos so activados por contacto com estmulos solveis ou por ingesto de materiais estranhos para os fagossomas (fagocitose), estes iniciam um burst respiratrio, com consumo de oxignio molecular, o que resulta na formao de radical superxido (O2.-) atravs da aco da NADPH oxidase (Figura 4) (Babior, 2004; Quinn e Gauss, 2004). A NADPH oxidase situa-se na membrana plasmtica dos neutrfilos e composta por vrias subunidades: a glicoprotena gp91phox e os polipptidos p22phox, p67phox, p47phox e p40phox, todos codificados pelo gene phox (phagocyte oxidase) no cromossoma X. O flavocitrocomo, conhecido como citocromo b558, forma um complexo associado membrana e constitudo por uma molcula de gp91phox e duas molculas de p22phox. Os polipptidos p67phox, p47phox e p40phox encontram-se distribudos no citoplasma (Nixon e McPhail, 1999, Seguchi e Kobayashi, 2002). Tambm fazem parte da NADPH oxidase activada, protenas G de baixo peso molecular (Rac 1 e Rac 2) que se encontram dissociadas da enzima quando esta est inactiva (Quinn e Gauss, 2004; Klebanoff, 2005). Alguns estudos tm demonstrado que o citrocomo b558 pode ser encontrado na membrana dos grnulos especficos (Angosto, 2005), grnulos de gelatinase, e vesculas secretoras de neutrfilos humanos (Borregaard e Cowland, 1997; Seguchi e Kobayashi, 2002) migrando at membrana plasmtica ou membrana dos fagossomas quando se d a activao dos neutrfilos (Seguchi e Kobayashi, 2002; Angosto, 2005). Esta enzima pode ser activada na ausncia de fagossoma, sugerindo que a activao da oxidase pode ocorrer na membrana dos grnulos que contm citocromo b558. A activao da NADPH oxidase leva a uma deslocao das protenas citoslicas at membrana onde se unem s subunidades l existentes, resultando numa oxidase activa (Figura 5).

36

Introduo

Figura 5. Activao do complexo NADPH oxidase. esquerda mostram-se os

componentes da NADPH oxidase quando a enzima est inactiva. direita representa-se o complexo activo (adaptado de Angosto, 2005).

geralmente aceite que a NADPH oxidase activada quer na membrana plasmtica do PMN, quer na membrana do fagossoma. Quando a produo das ROS resulta da activao na membrana plasmtica, estas so libertadas da clula. Quando a activao se d na membrana do fagossoma, as ROS ficam retidas no seu interior (Dahlgren e Karlsson, 1999; Babior, 2000; Karlsson e Dahlgren, 2002; Quinn e Gauss, 2004). A activao da enzima inicia-se com a fosforilao da subunidade p47phox, que segundo Angosto (2005), o primeiro elemento a interagir com o citocromo b558. Esta subunidade forma um complexo com os componentes citoslicos p67phox e p47phox e responsvel pelo transporte do complexo para a membrana durante a activao (Babior, 2000; Angosto, 2005). A protena quinase C (PKC) responsvel pela fosforilao da subunidade p47phox, sendo portanto essencial para a activao da NADPH oxidase. A PKC, por sua vez, activada pelo diacilglicerol (DAG), produzido pela fosfolipase. A produo do DAG ocorre quando um receptor membranar estimulado por diversos factores tais como o factor C5a do complemento, ou complexos imunolgicos (Nauseef et al., 1991; El Benna et al., 1995; Seguchi e Kobayashi, 2002).

37

Introduo
O O2-. funciona como redutor ou oxidante, solvel em gua e no capaz de permear a membrana celular, atravessando-a via canais aninicos (Hampton et al., 1998). Isoladamente este radical pouco reactivo e, portanto, no altamente citotxico (Campos e Yoshida, 2004; Misso e Thompson, 2005), todavia, tem alguma capacidade para danificar o DNA (Ferreira e Matsubara, 1997; Shackelford et al., 2000). O HO2. a forma protonada do O2-. (Equao 8). mais reactivo que o O2-. e, como no possui carga, atravessa mais facilmente as membranas celulares. Embora a pH fisiolgico a razo [O2-.]/[HO2.] seja elevada (100/1 a pH=6,8 e 1000/1 a pH=7,8), devido s suas caractersticas o HO2. poder ter alguma relevncia se existirem condies propcias sua formao, nomeadamente a diminuio dos valores de pH nos locais de gerao de O2-. (Grey, 2002).

Equao 8:
O2-. + H+ HO2.

O O2-., convertido, espontaneamente (Equao 9) ou pela aco da enzima SOD (Equao 10), em H2O2 e O2 (Cheesman e Slater, 1993; Campana et al., 2004).

Equao 9:
HO2. + HO2. H2O2 + O2

Equao 10:
2O2-. + 2H+ SOD H2O2 + O2

O H2O2 apesar de no ser um radical, pois no tem electres desemparelhados na ltima camada, importante porque participa nas reaces que produzem o radical HO., seja via reaco de Fenton (Equao 11) ou de Haber-Weiss (Equao 12). Pelas reaces apresentadas pode-se constatar o papel relevante dos metais de transio na formao de ROS (Ferreira e Matsubara, 1997; Mladenka et al., 2006). Embora o cobre possa tambm catalisar a reaco de Haber-Weiss, o ferro o metal pesado mais abundante no organismo e est biologicamente mais capacitado para catalisar as

38

Introduo
reaces de oxidao de biomolculas (Ferreira e Matsubara, 1997). No homem, em condies fisiolgicas, o ferro livre escasso. Quase todo o ferro sequestrado pelas protenas. No plasma encontra-se ligado transferrina, em vrias clulas est fortemente ligado ferritina, nos glbulos vermelhos est firmemente incorporado na hemoglobina e nos msculos est ligado mioglobina (Mladenka et al., 2006). Em situaes de inflamao, o ferro (III) libertado, pois o O2-. tem capacidade de o mobilizar da ferritina (Barbosa et al., 2006), j o H2O2 pode reagir com a membrana eritrocitria e levar libertao de ferro da hemoglobina (Tolando et al., 2000).

Equao 11:
Fe (III) + O2-. Fe (II) + O2

H2O2 + Fe (II)
Equao 12:
O2-. + H2O2 Fe

Fe (III) + HO. + HO-

O2 + HO. + HO-

O H2O2 uma ROS que pode funcionar como agente oxidante ou como agente redutor, embora a sua reactividade seja fraca. O H2O2 parece ser capaz de inactivar algumas enzimas, normalmente por oxidao dos grupos sulfidrilo (-SH) dos locais activos (Halliwell e Gutteridge, 1999). Apesar da sua fraca reactividade, o H2O2 pode ser altamente citotxico, sendo que esta citotoxicidade pode ser aumentada de dez para mil vezes quando em presena de ferro, como ocorre, por exemplo, na hemocromatose transfusional (Ferreira e Matsubara, 1997). As enzimas catalase, glutationa peroxidase e tiorredoxina peroxidase removem o H2O2 das clulas humanas, levando formao de gua (Halliwell e Gutteridge, 1999; Barbosa et al., 2006). O HO. considerado a ROS mais reactiva em sistemas biolgicos. As reaces em que o HO. participa podem ser classificadas em trs tipos principais: adio de hidrognio, remoo de hidrognio e transferncia de electres. Este radical capaz de remover tomos de hidrognio do grupo metileno de cidos gordos polinsaturados, dando incio peroxidao lipdica que pode levar lise da membrana celular (Ferreira e Matsubara, 1997; Campos e Yoshida, 2004). As reaces do HO. com compostos aromticos procedem-se normalmente por adio, como acontece nas reaces com a

39

Introduo
guanina e timina no DNA. Assim, se o HO. for produzido prximo de DNA, podero ocorrer alteraes das suas bases, levando inactivao ou mutao do DNA (Ferreira e Matsubara, 1997; Hampton et al., 1998; Barreiros et al., 2006). O HO. participa ainda em reaces de transferncia de electres com ies halogeneto, como o caso do io cloreto (Equao 13) bem como com o io nitrito (NO2-) (Equao 14). Da reaco do HO. com o io carbonato (CO32-), resulta um poderoso agente oxidante, o anio radical carbonato (CO3.-) (Equao 15) (Halliwell e Gutteridge, 1999).

Equao 13:

Cl- + HO.
Equao 14:
NO2- + HO.

Cl. + HO-

NO2 + HO-

Equao 15:
CO32- + HO. CO3-. + HO-

Os grnulos azurfilos dos neutrfilos contm elevadas quantidades de MPO, que pode ser libertada quer para o meio extracelular, quer para o interior dos fagossomas. Esta enzima reage com H2O2 e Cl- produzindo cido hipocloroso (HOCl) (Equao 16) (Hampton et al., 1998; Peskin e Winterbourn, 2001; Splettstoesser e Werner, 2002). Este um poderoso agente antimicrobiano e, como tal, tem um papel de destaque na defesa imunitria do organismo desencadeada pelos neutrfilos (Prtz, 1996). A MPO uma enzima heme que contm no seu grupo prosttico o mesmo heme encontrado na hemoglobina. Ao contrrio da hemoglobina e outras protenas heme, a MPO no vermelha, possuindo uma cor verde, responsvel pela colorao esverdeada do pus (Babior, 2000; Arnhold, 2004). In vivo, o HOCl pode atacar vrios alvos. Uma das suas principais aces a inactivao da 1-antiproteinase (pelo ataque ao resduo da metionina), um importante protector das clulas contra o ataque de enzimas proteolticas como a elastase (Nve et al., 2001). O HOCl, pode reagir com aminocidos dos microorganismos, para formar cloraminas. A cloramina decompe-se espontaneamente em: aldedo (RCHO), txico para microorganismos; amnio, CO2 e cloreto. Tanto o HOCl como as cloraminas parecem interferir com o DNA, nomeadamente com os mecanismos de reparao do DNA (Hampton, 1998; Nve et al., 2001). O HOCl oxida 40

Introduo
grupos sulfidrilo, o ascorbato, o NADPH e promove a colorao das bases do DNA, especialmente as pirimidnicas, e dos resduos de tirosina nas protenas. Caso o HOCl passe pelas membranas celulares, pode provocar danos nas protenas das mesmas, os danos nos constituintes celulares ocorrem se houver passagem para o citoplasma (Prtz, 1996).

Equao 16:
H2O2 + ClMPO HOCl + HO-

A interaco de O2.-, H2O2 e HOCl pode originar o 1O2. Constitui a forma excitada de oxignio molecular e no possui electres desemparelhados na ltima camada (Ferreira e Matsubara, 1997). Os compostos naturais que melhor captam o 1O2 so os carotenides, devido s mltiplas insaturaes conjugadas. Assim, o 1O2 reage mais lentamente com os cidos gordos do que com o -caroteno, e quanto maior o nmero de insaturaes presentes nos cidos gordos, mais rapidamente eles iro reagir (Barreiros et

al., 2006).
Outro radical com alguma relevncia nos mecanismos de defesa fagocitrios o
.

NO. um radical gasoso que se difunde rpida e facilmente entre as clulas

(Heiduschka e Thanos, 1998). Este radical sintetizado nos organismos vivos por uma famlia de enzimas designadas oxido ntrico sintetases NOS, que convertem o aminocido L-arginina em .NO e noutro aminocido, a L-citrulina (Equao 17). Esta reaco dependente do oxignio e do NADPH (Fernandes et al., 2003; Ricciardolo et

al., 2006). Equao 17:

L-arginina

NOS

.NO

+ L-Citrulina

As NOS podem ser classificadas em constitutivas (cNOS) e indutveis (iNOS). As formas constitutivas esto presentes no endotlio vascular, nas plaquetas e em alguns neurnios do sistema nervoso central e do sistema nervoso perifrico. A actividade das cNOS dependente do Ca2+ e da calmodulina e produzem quantidades relativamente baixas de .NO, da ordem dos nanomolar. As iNOS geram uma maior quantidade de .NO
41

Introduo
(prxima do micromolar), comparativamente com as cNOS, sendo que essa libertao pode permanecer algumas horas e mesmo dias aps a exposio das clulas (Fernandes

et al., 2003; Hofseth et al., 2003; Ricciardolo et al., 2006). Esta isoforma pode ser
induzida por agentes proinflamatrios, tais como endotoxinas, factor de necrose tumoral- (TNF-), interferon- (IFN-) e interleucina-1 (IL-1). Nas iNOS, a sntese de .NO independente dos nveis intracelulares de clcio. As iNOS encontram-se nos macrfagos e neutrfilos activados mas tambm noutros tipos de clulas como as do msculo liso, hepatcitos, clulas do pncreas e vrios tipos de clulas tumorais (Hofseth et al., 2003; Ricciardolo et al., 2006). O efeito do .NO nas clulas depende de vrios factores como a sua taxa de produo e difuso, do tipo de clula, da sua interaco com ROS, ies metlicos e protenas (Hofseth et al., 2003; Dedon e Tannenbaum, 2004). As reaces a que este radical pode estar sujeito resumem-se aos seguintes processos: i) autoxidao do .NO na presena de O2, com formao de N2O3 (Equao 18), um potente agente nitrosante; ii) reaco com O2-. para formar ONOO- (Equao 19) (Dedon e Tannenbaum, 2004). Alguns estudos revelam que o .NO pode ter efeitos deletrios para a clula e os tecidos que a circundam, nomeadamente induzir danos no DNA. J outros estudos comprovam os benefcios do .NO, como um protector da citotoxicidade (Wink et al., 1996; Hofseth

et al., 2003; Dedon e Tannenbaum, 2004). Equao 18:

2.NO + O2 2.NO + 2.NO2 2.NO2 2.N2O3

Equao 19:
.NO

+ O2-.

ONOO-

A reaco do .NO com o O2.- aparece referida na literatura no sentido da formao do ONOO-. Contudo, de acordo com Coddington et al. (1999), a reaco inversa tambm possvel, embora ocorra muito mais lentamente. Como o .NO neutro e hidrofbico, capaz de atravessar membranas, enquanto que o O2.- aninico a pH neutro, a formao do ONOO- ocorre predominantemente perto dos local de formao do O2.- (Alvarez e Radi, 2003). Por sua vez, o ONOO- atravessa as membranas por
42

Introduo
difuso passiva, sob a forma do seu cido conjugado, o cido peroxinitroso (ONOOH) ou atravs de canais aninicos, quando na sua forma aninica. O ONOO- muito mais reactivo do que os seus precursores (Whiteman et al., 2002; Alvarez e Radi, 2003). Em condies fisiolgicas o ONOO- tem um tempo vida inferior a 1 segundo sendo imediatamente convertido sua forma protonada, ONOOH, que por fisso homoltica origina .NO2 e HO. (Equao 20) (Coddington et al., 1999; Whiteman et al., 2002; Alvarez e Radi, 2003). A reaco directa do ONOO- com CO2 particularmente importante devido elevada concentrao deste elemento in vivo e rapidez com que a reaco ocorre. A maior parte do CO2 que se encontra dissolvido no plasma est em equilbrio com o HCO3-, sendo o sistema HCO3-/CO2 um dos principais sistemas tampo do sangue. Da reaco do ONOO-

com

CO2

resulta

noutro

RNS,

nitrosoperoxicarbonato (ONOOCO2 ), cuja decomposio origina cerca de 70% de CO2 e NO3- e 30% dos radicais .NO2 e CO3.- (Denicola et al., 1998; Coddington et al., 1999; Whiteman et al., 2002).

Equao 20:
ONOO- + H+ ONOOH
.NO 2+ .HO

O ONOO- e seus derivados podem induzir oxidao dos grupos tiol de protenas, nitrao da tirosina, peroxidao lipdica e outras reaces de nitrao que alteram o metabolismo da clula e provocam danos a nvel celular. Podem contribuir tambm para a ocorrncia de danos no DNA, quebra da cadeia de DNA, nitrao e desaminao de bases de DNA (especialmente guanina) e a nitrao dos resduos de aminocidos aromticos em protena. A formao excessiva de ONOO- pode estar envolvida em doenas de que so exemplo: a doena de Alzheimer e Parkinson, cancro, asma, artrite reumatide (Squadrito e Pryor, 1998; Coddington et al., 1999; Choi et al., 2002; Whiteman et al., 2002; Denicola e Radi, 2005).

43

Introduo

Figura 6. Esquema resumo da produo de ROS e RNS pelos neutrfilos durante a

fagocitose (adaptado de www.bioscience.org).

44

Material e mtodos

3 MATERIAL E MTODOS

45

Material e mtodos

3.1

Reagentes

O Histopaque 1077, Histopaque 1119, azul tripano 0.4%, soluo salina de tampo fosfato isotnico sem Ca2+ e Mg2+ (PBS), soluo salina de tampo fosfato isotnico com Ca2+ e Mg2+ (PBS com Ca2+ e Mg2+), luminol, PMA, tiron, L-NAME, catalase, DPI, etileno glicol-bis -aminoetil ter (EGTA), fura PE3, calcimicina (A23187) foram adquiridos Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). O cloreto de sdio foi adquirido Panrec Qumica S.A. (Barcelona, Espanha). O manitol foi adquirido Riedel de Han (Alemanha). O ABAH foi adquirido Calbiochem (San Diego, CA, USA). O nitrato de nquel foi adquirido Fluka Chemie GmbH (Steinheim, Alemanha). Os tubos de vcuo com citrato, EDTA e heparina foram adquiridos Vacutainer Systems (U.K.).

3.2

Equipamento

As leituras de quimioluminescncia foram realizadas em leitor de microplacas Synergy HT (BIO-TEK), com deteco espectrofotomtrica, fluorimtrica e quimioluminomtrica, de acordo com a tcnica utilizada. As centrifugaes foram efectuadas numa centrfuga 5810 R (Eppendorf). As leituras de microscopia foram realizadas num microscpio ptico Eclipse E 400 (Nikon). A contagem das clulas foi realizada em cmara de Neubauer. Foram ainda utilizados um banho termostatado NE510D (Clifton) e uma balana analtica AG285 (Metler Toledo).

46

Material e mtodos

3.3

Isolamento de neutrfilos humanos pelo mtodo de centrifugao de

gradiente de densidade

Neste ensaio procedeu-se ao isolamento dos neutrfilos de todos os outros componentes do sangue humano.

3.3.1

Fundamento do mtodo

Os neutrfilos foram isolados pelo mtodo de centrifugao de gradiente de densidade. Este mtodo foi descrito em 1968 por Boyum e melhorado por English e Anderson em 1974. Consiste na separao das clulas mononucleares e granulcitos do sangue. Esse objectivo conseguido utilizando duas solues de diferentes densidades, Histopaque 1077 (densidade de 1,077) e Histopaque 1119 (densidade de 1,119), respectivamente. Num tubo de centrfuga de polipropileno (material que evita a adeso das clulas parede do tubo) adicionado igual volume das solues acima referidas, ficando a mais densa em baixo, a menos densa por cima. O sangue cuidadosamente adicionado por ltimo. Por aco da fora centrfuga, as clulas sero distribudas de acordo com a sua densidade, pelo que, os eritrcitos ficam no fundo do tubo, os granulcitos, na interface 1077/1119, e os mononucleares e as plaquetas ficam na interface plasma/1077 (Figura 7). Esta centrifugao realizada a 20C, pois temperaturas inferiores podem resultar na aglutinao celular e numa m recuperao. Os neutrfilos so recolhidos para um tubo de centrfuga ao qual se adiciona soluo tampo PBS sem Ca2+ e Mg2+, no sentido de se proceder a uma lavagem das clulas, seguindo-se uma centrifugao durante cinco minutos a uma temperatura de 4C. Esta temperatura permite preservar a integridade das clulas. Para garantir que no h contaminao dos neutrfilos por eritrcitos, decanta-se o sobrenadante resultante da centrifugao e ressuspende-se as clulas com soluo tampo PBS sem Ca2+ e Mg2+. Adiciona-se gua destilada e aguarda-se cerca de dois minutos, tempo aps o qual restabelecida a isotonia do meio adicionando NaCl 3% (m/v). Esta suspenso

47

Material e mtodos
novamente centrifugada a 4C durante cinco minutos, o sobrenadante decantado e os neutrfilos ressuspendidos com soluo tampo PBS com Ca2+ e Mg2+.

Centrifugao: 2100 rpm a 20C durante 30 min.

Retirar a camada dos neutrfilos; adicionar PBS, pH 7,4.

Centrifugao: 2000 rpm a 4C durante 5 min.

Aspirar o sobrenadante e ressuspender os neutrfilos com PBS, pH 7,4.

Aspirar o sobrenadante e proceder lise dos glbulos vermelhos.

Centrifugao: 2000 rpm a 4C durante 5 min.

Contagem dos neutrfilos em cmara de Neubauer

Figura 7. Esquema resumo do procedimento efectuado referente ao isolamento dos

neutrfilos.

48

Material e mtodos 3.3.2 Utilizao de EDTA, citrato e heparina como anticoagulantes no

isolamento dos neutrfilos humanos

Neste ensaio, utilizaram-se diferentes anticoagulantes, nomeadamente o citrato, EDTA e heparina, no processo de recolha de amostras sanguneas.

3.3.3

Fundamento do mtodo

Durante a recolha, o sangue deve ser tratado com agentes que evitem a sua coagulao, de forma a ser possvel proceder-se ao isolamento dos seus componentes celulares. No entanto, a escolha do anticoagulante deve ser criteriosa de forma a permitir no s um bom isolamento dos neutrfilos mas tambm que estes possuam boas condies de funcionamento aps este processo. A formao de um cogulo sanguneo depende de um conjunto de protenas existentes no plasma, denominadas factores de coagulao. A activao do mecanismo de coagulao sangunea tem incio por duas vias diferentes: via intrnseca e via extrnseca. A denominao de via intrnseca deriva do facto de que na activao tomam parte, apenas, os factores circulantes da coagulao, enquanto na via extrnseca um factor no circulante, factor tecidular, proveniente da clula endotelial, o principal desencadeador. A via de coagulao extrnseca resume-se ao seguinte: os tecidos danificados libertam o factor tecidular, que com o factor VII e ies clcio, activam o factor X. O factor X activado, o factor V, os fosfolpidos e ies clcio, formam a protombinase. Esta converte a protrombina em trombina, que por sua vez, converte o fibrognio em fibrina, que responsvel pela formao de um cogulo (Figura 8). Na via de coagulao intrnseca, os vasos danificados causam a activao do factor XII, que vai activar o factor XI que, por sua vez, activa o factor IX. Este, conjuntamente com o factor VIII e os fosfolpidos das plaquetas, activa o factor X. A partir daqui o processo o mesmo da via de coagulao extrnseca (Figura 8) (Seeley et al., 2001; Kierszenbaum, 2004).

49

Material e mtodos

Figura 8. Mecanismo de coagulao sangunea e mecanismo de anticoagulao do

citrato, EDTA e heparina.

A heparina uma mistura heterognea de polmeros de um polissacardeo natural, extrado de vsceras animais, com peso molecular variando entre 3000 e 30000 Da (Figura 9). Constitui um anticoagulante natural produzido pelos basfilos e mastcitos. A interaco com a antitrombina III confere-lhe o seu principal efeito anticoagulante, atravs de uma mudana na conformao da antitrombina III, que acelera a sua habilidade em inactivar as enzimas da coagulao: trombina e factores Xa e IXa (Figura 8). A ligao da heparina com o anticoagulante natural antitrombina III, aumenta a actividade deste factor cerca de 1000 vezes (Hamerschlak e Rosenfeld, 1996; Sadagopan et al., 2003).

50

Material e mtodos

Figura 9. Estrutura qumica da heparina (adaptado de www.wikipedia.org).

EDTA o acrnimo em ingls: EthyleneDiamineTetrAcetic acid (cido etilenodiamino tetra-actico). um cido poliprtico contendo quatro grupos carboxlicos e dois grupos amina (Figura 10). Constitui um composto quelante que age como ligante polidentado, formando complexos muito estveis com diversos ies metlicos. Actua como agente anticoaguante quelatando ies clcio, essenciais a algumas reaces qumicas indispensveis formao do cogulo sanguneo (Figura 8) (Lanigan e Yamarik, 2002; Cern et al., 2004).

O O OH N HO O
Figura 10. Estrutura qumica do EDTA(adaptado de www.wikipedia.org).

O- K+

O-K+

51

Material e mtodos
O citrato (Figura 11) tem um modo de aco muito semelhante ao EDTA. Quelata ies clcio, que promovem a coagulao sangunea (Figura 8) (Bagshaw et al., 2005)

O O Na+OOH

O- Na O

O-Na+

Figura 11. Estrutura qumica do citrato de sdio (adaptado de www.wikipedia.org).

3.3.4

Procedimento experimental

Recolheu-se sangue venoso, de voluntrios humanos saudveis, do sexo masculino, por venipunctura antecubital, para tubos de vcuo cada um dos quais com um tipo de anticoagulante e procedeu-se ao isolamento dos neutrfilos de acordo com o descrito por Costa et al. (2006). Num tubo de centrfuga de 12 mL adicionou-se 3 mL de Histopaque 1077, sobre 3 mL de Histopaque 1119. De seguida, colocou-se cuidadosamente uma camada de 6 mL de sangue sobre a camada superior do tubo. Centrifugou-se a 2100 rpm durante 30 min a 20oC. Concluda a centrifugao, foram aspiradas, por vcuo, as camadas que ficam por cima da camada dos granulcitos. Os granulcitos, foram recolhidos cuidadosamente com o auxlio de uma pipeta Pasteur de vidro para um tubo de centrfuga, ao qual se adicionou soluo tampo PBS sem Ca2+ e Mg2+ at completar 12 mL. Agitou-se levemente para homogeneizar e efectuou-se uma centrifugao a 2000 rpm durante 5 min a uma temperatura de 4oC. Aspirou-se o sobrenadante e adicionou-se 1,25 mL de soluo tampo PBS sem Ca2+ e Mg2+, mais 5,25 mL de gua destilada. Passados 2 min adicionou-se 2,2 mL de NaCl a 3% (m/v). Esta suspenso foi novamente sujeita a uma centrifugao a 2000 rpm durante 5 min a uma temperatura de 4oC, aps a qual se recolheu o sobrenadante e se ressuspendeu os neutrfilos com soluo tampo PBS com Ca2+ e Mg2+.

52

Material e mtodos 3.4 Avaliao da viabilidade celular e clculo do nmero de neutrfilos isolados

Com este ensaio pretendeu-se avaliar a influncia da utilizao dos anticoagulantes, citrato, EDTA e heparina, durante o isolamento dos neutrfilos humanos, no nmero de neutrfilos isolados e viabilidade celular.

3.4.1

Fundamento do mtodo

Para a determinao da viabilidade dos neutrfilos e clculo do nmero de neutrfilos isolados, utilizou-se o mtodo da excluso do azul tripano. O azul tripano um corante orgnico azul que excludo pelas clulas que possuem as respectivas membranas citoplasmticas intactas, enquanto que as clulas com membranas danificadas o incluem rapidamente. Este corante, tem carga negativa e excludo pelos neutrfilos como resultado de uma manuteno do potencial de membrana. A perda deste potencial, devido a danos celulares, permite a penetrao do corante. Para que a incluso se efectue no exigida a existncia de danos em grande extenso uma vez que, geralmente, as membranas citoplasmticas das clulas coradas aparecem frequentemente intactas quando vistas ao microscpio ptico (Fernandes, 1996).

3.4.2

Procedimento experimental

Num tubo tipo eppendorf adicionou-se 20 L de suspenso de neutrfilos a 20 L de azul tripano 0,4% e homogeneizou-se a mistura. Deixou-se em repouso, num banho de gelo, durante 2 minutos. Com o auxlio de uma micropipeta, encheu-se a cmara de Neubauer e procedeu-se contagem dos neutrfilos ao microscpio ptico (ampliao de 40). A determinao da viabilidade celular foi efectuada a partir da Equao 21.

53

Material e mtodos Equao 21:

Viabilidade (%) = n de neutrfilos viveis n de neutrfilos viveis + n de neutrfilos no viveis x 100

O nmero de neutrfilos isolados por mL de sangue recolhido foi calculado segundo a Equao 22.

Equao 22:
N N neutrfilos/mL sangue = V x 2 xY

Volume total de sangue

N- n de neutrfilos viveis V- volume da cmara de Neubauer (0,1 mm3) 2- factor de diluio aplicado quando se adiciona 20 L de azul tripano a 20 L da suspenso de neutrfilos. Y- volume total de suspenso

O nmero de neutrfilos/mL de suspenso fez-se de acordo com a Equao 23 e resultou da mdia da contagem de dois quadrantes da cmara de Neubauer.

Equao 23:

N neutrfilos/mL suspenso =

N V

x2x Y

N- n de neutrfilos viveis V- volume da cmara de Neubauer (0,1 mm3). 2- factor de diluio aplicado quando se adiciona 20 L de azul tripano a 20 L da suspenso de neutrfilos.

54

Material e mtodos
Y- volume total de suspenso

O nmero de neutrfilos obtido durante o isolamento foi ajustado para 4 106/mL de suspenso com soluo tampo PBS com Ca2+ e Mg2+, segundo a Equao 24.

Equao 24:

N V1 = V

x2xY -Y

4 x 106

V1- volume de soluo tampo PBS com Ca2+ e Mg

2+

a adicionar suspenso dos

neutrfilos para obter 4106 neutrfilos/mL de suspenso. N- n de neutrfilos viveis V- volume da cmara de Neubauer (0,1 mm3). 2- factor de diluio aplicado quando se adiciona 20 L de azul tripano a 20 L da suspenso de neutrfilos. 4 106- corresponde ao n de neutrfilos/mL de suspenso necessrios para a realizao do ensaio. Y- volume total de suspenso

3.5

Avaliao da activao de neutrfilos humanos pelo PMA, com utilizao de

uma tcnica de quimioluminescncia

Este ensaio teve como objectivo avaliar a activao de neutrfilos isolados de sangue tratado com citrato, EDTA e heparina, pelo PMA.

55

Material e mtodos 3.5.1 Fundamento da tcnica

O PMA um composto solvel obtido por sntese qumica, capaz de activar os neutrfilos (Robinson et al., 1987; Downey et al., 1992; Nixon e McPhail; 1999; Seguchi e Kobayashi, 2002; Saito et al., 2005). O seu mecanismo de aco muito semelhante ao DAG, activando directamente a PKC (Figura 12) (Robinson et al., 1987; Downey et al., 1992; Nixon e McPhail; 1999; Seguchi e Kobayashi, 2002; Saito et al., 2005), a qual por sua vez tem um papel crucial na activao da NADPH oxidase.

Figura 12. Mecanismo de activao dos neutrfilos pelo PMA

Segundo Karlsson e Dahlgren (2002) existem cinco isoenzimas PKC nos neutrfilos humanos, a PKC-, I, II (classificadas como convencionais: cPKC, so clcio-dependentes, activadas pela fosfatildilserina e pelo DAG), PKC- (classificadas como no convencionais: nPKC, so clcio-independentes, reguladas pelo DAG e fosfatildilserina) e PKC- (denominada atpica: aPKC, requer apenas fosfatildilserina para a sua activao) (Majumdar, et al., 1991). A PKC-, PKC- ou PKC-, constituem

56

Material e mtodos
os primeiros candidatos a mediar a resposta do PMA (Nixon e McPhail, 1999). Sendo a PKC- a isoforma mais comum dos neutrfilos, a mais susceptvel aco deste activador (Majumdar, et al., 1991; Downey et al., 1992). O PMA promove a translocao da PKC do citosol para a membrana, onde ocorre a fosforilao do p47phox, etapa fundamental para a activao da NADPH oxidase (Majumdar, et al., 1991; Downey et al., 1992; Nixon e McPhail, 1999; Karlsson e Dahlgren, 2002) (Figura 12). Uma vez activada a NADPH oxidase, inicia-se a produo de O2.-, com a consequente gerao de outras espcies reactivas (ver 1.3 da introduo). A deteco de espcies reactivas geradas durante a activao dos neutrfilos isolados foi feita por quimioluminescncia. Em 1888 Eilhardt Weidemann apresentou pela primeira vez o termo quimioluminescncia, definindo-a como a emisso de radiao luminosa resultante de uma reaco qumica (Ferreira e Rossi, 2002). Tendo em conta a exactido, sensibilidade e baixo custo do equipamento de medida, a quimioluminescncia tem sido frequente utilizada na avaliao da capacidade dos neutrfilos produzirem ROS (Briheim et al., 1984; Hasegawa et al., 1997; Kopprasch et

al., 2003). Todavia, para a luminescncia das clulas ser detectvel, normalmente
recorre-se a luminforos, sendo o luminol um dos mais utilizados. A luz emitida pelo luminol (Figura 13) advm da sua oxidao e da consequente formao de uma espcie electronicamente excitada que se decompe originando o di-anio 3-aminoftalato no estado excitado, que ao regressar ao estado fundamental, emite fotes (Rost et al., 1998; Ferreira e Rossi, 2002). O comprimento de onda de emisso mxima da reaco quimioluminescente do luminol depende do solvente utilizado, podendo variar entre 431 e 500 nm (Ferreira e Rossi, 2002). O luminol pode ser oxidado por vrias ROS (Caldefie-Chzet et al., 2002) como o caso do HO. (Oosthuizen e Greyling, 2001), do O2- (Kopprasch et al., 2003), do 1O2 (Oosthuizen et al., 1997; Myhre et al., 2003), do H2O2 (Briheim et al 1984; Rost et al., 1998; Ferreira e Rossi, 2002; Kopprasch et al., 2003) e do HOCl, bem como por RNS, nomeadamente o ONOO- (Radi et al., 1993; Chen et al., 2003a). O .NO no parece ser capaz de oxidar o luminol (Radi et al., 1993).

57

Material e mtodos

NH2

OH N N OH ROS ONOO-

NH2

O O O O + N2 + H2O + h

Luminol

3-Aminoftalato

Figura 13. Reaco de oxidao do luminol com a formao do di-anio 3 aminoftalato

e emisso de luz (adaptado de Rost et al., 1998).

A monitorizao da luminescncia resultante da reaco do luminol com cada uma das espcies reactivas supramencionadas pode ser utilizada como meio de estudar a potencial capacidade de determinados compostos para captarem as mesmas (Cynshi et

al., 1990; Mira et al., 1994; Demiryrek et al., 1998; Rao et al., 1998), j que estes
compostos, ao captarem uma determinada espcie reactiva, vo competir com o luminol na sua reaco com estas originando assim uma diminuio da luminescncia. Tendo em conta que o luminol pode ser oxidado por vrias ROS, constitui um bom indicador da sua gerao pelos neutrfilos activados (Hasegawa et al., 1997).

3.5.2

Procedimento experimental

A avaliao da activao dos neutrfilos realizou-se por quimioluminescncia, amplificada pelo luminol, de acordo com o descrito por Oosthuizen e Greyling (2001). A mistura reaccional continha, num volume final de 200 L, os seguintes constituintes nas concentraes finais indicadas: luminol (500 M), soluo tampo PBS com Ca2+ e Mg2+, pH 7,4, PMA (1,6 10-7 M) e neutrfilos (106 neutrfilos/mL). Todos os compostos foram dissolvidos em soluo tampo PBS com Ca2+ e Mg2+, pH 7,4. Durante todo o ensaio a mistura reaccional esteve sujeita a uma agitao suave e a uma temperatura de incubao de 37C. As leituras da luminescncia (L) foram efectuadas 58

Material e mtodos
durante 25 min e os valores de luminescncia lidos nos picos obtidos nessas cinticas ( 15 min). Cada estudo correspondeu, no mnimo, a quatro ensaios realizados em duplicado. O efeito de activao dos neutrfilos foi expresso sob a forma de percentagem oxidao do luminol induzida pelas espcies reactivas de acordo com a equao 25.

Equao 25:
Activao de neutrfilos = humanos pelo PMA (%) ( LPMA x 100 Lbranco ) - 100

LPMA- Luminescncia do ensaio que contem PMA. Lbranco- Luminescncia do ensaio sem PMA.

3.6

Quantificao do clcio livre intracelular nos neutrfilos humanos isolados,

com utilizao de uma tcnica de fluorescncia

Este ensaio teve como objectivo avaliar a influncia da utilizao dos anticoagulantes citrato, EDTA e heparina, durante o processo de isolamento dos neutrfilos, na concentrao do clcio livre intracelular nos neutrfilos isolados.

3.6.1

Fundamento da tcnica

O io Ca2+ um mensageiro intracelular ubiquitrio que regula diversas funes, incluindo contraco, secreo, metabolismo, expresso gentica, sobrevivncia e morte celulares (Yan et al., 2006). Como tal, a quantificao do Ca2+ livre presente no citoplasma importante para se entender a fisiologia de qualquer tipo de clula. No caso dos neutrfilos torna-se ainda mais relevante, j que a quimiotaxia, fagocitose, apoptose

59

Material e mtodos
e exocitose so muito influenciadas pela concentrao de Ca2+ no citoplasma (Hallet et

al., 1999), sendo a activao da NADPH oxidase tambm dependente da concentrao

deste io (Yan et al., 2006). Para a quantificao dos nveis de Ca2+ pode recorrer-se a sondas fluorescentes e ionforos. No presente trabalho utilizou-se uma sonda fluorescente, o Fura PE3 (Figura 14) que um derivado do Fura 2, sendo o espectro de absoro e emisso muito semelhante ao original Fura 2 (364/508 nm).

CO2N

CO2-

CO2N

CO2-

O N O CO2
-

C N N

CH2CO2Figura 14. Estrutura qumica da sonda fluorescente Fura PE3 (adaptado de

www.wikipedia.org).

Tem como vantagem relativamente ao Fura 2 o facto de ser estruturalmente capaz de permanecer mais tempo no citoplasma (Takahashi et al., 1999). O Fura PE3 constitui um grupo ster capaz de atravessar a membrana plasmtica. No interior da clula, fica sujeito aco de esterases inespecficas que quebram a molcula originando a forma cida da sonda. Esta forma hidroflica e portanto, dificilmente atravessa a membrana citoplasmtica. sob a forma protonada que a sonda se liga aos ies clcio e emite fluorescncia (Davies et al., 1997; Hallett et al., 1999; Takahashi et al., 1999). A concentrao do clcio livre calculada segundo a seguinte equao:

60

Material e mtodos Equao 26:

Ca2+ = Kd x F - Fmin Fmax - F

Onde Kd representa a constante de dissociao, que reflecte a afinidade da sonda para o clcio (quanto menor a Kd, maior a afinidade da sonda para os ies clcio) (Hallett et

al., 1999). Segundo Vondran et al. (1995) o valor de Kd para o Fura PE3 290 nM. F
a fluorescncia da amostra celular incubada com a sonda. Fmax representa a fluorescncia mxima obtida tratando as clulas com um ionforo, calcimicina (A23187). Este derivado de Streptomyces chartreusensis e tem capacidade de transportar ies clcio para o interior da clula e assim saturar a sonda, originando a fluorescncia mxima. Fmin significa fluorescncia mnima e obtida adicionando MnCl2 s clulas tratadas com A23187. Os ies Mn2+ tm a capacidade de libertar os ies Ca2+ da sonda, permitindo avaliar o valor de Fmin (Sela et al., 2002).

3.6.2

Procedimento experimental

A concentao de clcio livre intracelular foi determinada por uma tcnica de fluorimetria, monitorizando-se a fluorescncia da sonda Fura PE3 de acordo com o descrito por Sela et al. (2002), com modificaes. Para a determinao do F, incubou-se numa microplaca de fluorescncia, a mistura reaccional que continha, num volume final de 210 L, os seguintes constituintes nas concentraes finais indicadas: suspenso celular (3106 clulas/mL) e sonda fluorescente Fura PE3 (10 M). Procedeu-se leitura da fluorescncia (comprimento de onda de excitao e emisso 364 e 508 nm, respectivamente). Seguidamente adicionouse o ionforo A23187 (5 mol/L), efectuou-se a leitura de fluorescncia e obteve-se o

Fmax. Para a determinao do Fmin adicionou-se MnCl2 (2 mM). Durante todo o ensaio a
mistura reaccional esteve sujeita a uma agitao suave e a uma temperatura de incubao de 37C.

61

Material e mtodos 3.7 Avaliao da activao de neutrfilos humanos pelo nitrato de nquel, com utilizao de uma tcnica de quimioluminescncia

Este ensaio teve como objectivo avaliar a activao de neutrfilos isolados de sangue tratado com citrato, EDTA e heparina, pelo nitrato de nquel.

3.7.1

Fundamento da tcnica

A avaliao da activao de neutrfilos humanos pelo nitrato de nquel, foi realizada atravs de uma tcnica de quimioluminescncia cujo fundamento se encontra discutido em 2.5.1.

3.7.2

Procedimento experimental

A mistura reaccional continha, num volume final de 200 L, os seguintes constituintes nas concentraes finais indicadas: luminol (500 M), soluo tampo PBS com Ca2+ e Mg2+, pH 7,4, nitrato de nquel (3,9; 7,8; 15,6; 31,3; 62,5 e 125 M) e neutrfilos (4106 clulas/mL). Todos os compostos foram dissolvidos em soluo tampo PBS, pH 7,4, excepto o nitrato de nquel, que no sendo solvel nessa soluo, foi dissolvido em gua. Durante todo o ensaio a mistura reaccional esteve sujeita a uma agitao suave e a uma temperatura de incubao de 37C. As leituras da luminescncia (L) foram efectuadas durante 25 min e os valores de luminescncia lidos nos picos obtidos nessas cinticas ( 15 min). Cada estudo correspondeu, no mnimo, a quatro ensaios realizados em duplicado. O efeito de activao dos neutrfilos foi expresso sob a forma de percentagem oxidao do luminol induzida pelas espcies reactivas de acordo com a equao 27.

62

Material e mtodos Equao 27:

Activao de neutrfilos = humanos pelo nitratode nquel (%) ( LNiNO3 x 100 ) Lbranco - 100

LNiNO3- Luminescncia do ensaio que contem NiNO3. Lbranco- Luminescncia do ensaio sem NiNO3.

3.8

Estudo das espcies reactivas envolvidas no processo de activao dos neutrfilos, pelo nitrato de nquel, com a utilizao de uma tcnica de quimioluminescncia

O objectivo deste ensaio foi identificar os processos envolvidos na gerao de espcies reactivas durante a activao dos neutrfilos pelo nitrato de nquel.

3.8.1

Fundamento da tcnica

A produo de espcies reactivas pelos neutrfilos inicia-se com a activao da enzima NADPH oxidase, com produo de O2-. (Majumdar, et al., 1991; Downey et al., 1992; Nixon e McPhail, 1999; Karlsson e Dahlgren, 2002). Este radical rapidamente convertido, espontaneamente ou pela aco da enzima SOD, em H2O2 (Cheesman e Slater, 1993; Campana et al., 2004). O H2O2 importante pois origina, via reaco de Fenton ou de Haber-Weiss o radical HO. (Ferreira e Matsubara, 1997; Barbosa et al., 2006; Mladenka et al., 2006). O H2O2, pela aco da MPO resulta na formao de HOCl (Hampton et al., 1998; Peskin e Winterbourn, 2001; Splettstoesser e Werner, 2002). A interaco de O2-., H2O2 e HOCl pode originar uma molcula muito reactiva, o
1

O2 (Ferreira e Matsubara, 1997; Splettstoesser e Werner, 2002). A enzima NOS

converte o aminocido L-arginina em .NO e L-citrulina (Fernandes et al., 2003; 63

Material e mtodos
Ricciardolo et al., 2006). O .NO reage rapidamente com o O2-. para formar ONOO(Dedon e Tannenbaum, 2004). Tendo em conta que que o luminol permite detectar vrias espcies reactivas (ver ponto 2.5.1), utlizou-se inibidores enzimticos e captadores de espcies reactivas, j que estes compostos, ao inibirem uma determinada enzima ou captarem uma determinada espcie reactiva, vo competir com o luminol na sua reaco com estas, originando assim, uma diminuio da luminescncia. Os inibidores enzimticos escolhidos foram o DPI (NADPH oxidase), ABAH (MPO) e o L-NAME (NOS). Os captadores utilizados foram o tiron, manitol e catalase, que captam o O2-., HO. e H2O2, respectivamente.

3.8.2

Procedimento experimental

As condies experimentais utilizadas neste ensaio foram semelhantes s utilizadas no ensaio anterior. A mistura reaccional continha, num volume final de 200

L, os seguintes constituintes nas concentraes finais indicadas: luminol (500 M); um

dos seguintes inibidores enzimticos DPI (1 M), ABAH (10 M) ou L-NAME (1 M) ou captadores de espcies reactivas tiron (2 mM e 50 M), manitol (10 mM) ou catalase (2,5 U/mL); nitrato de nquel (125 M) e neutrfilos (106 clulas/mL). Durante todo o ensaio a mistura reaccional esteve sujeita a uma agitao suave e a uma temperatura de incubao de 37C. As leituras da luminescncia (L) foram efectuadas durante 25 min e os valores de luminescncia lidos nos picos obtidos nessas cinticas ( 15 min). Cada estudo correspondeu, no mnimo, a quatro ensaios realizados em duplicado. O efeito da inibio activao dos neutrfilos foi expresso sob a forma de percentagem de inibio da oxidao do luminol pelas espcies reactivas e calculado de acordo com a equao 28.

64

Material e mtodos Equao 28:

Inibio da activao de neutrfilos humanos = 100 pelo nitrato de nquel125 M (%) ( Lcaptador ou inibidor - Lbranco ) x 100 L controlo - Lbranco

Lcaptador ou inibidor- Luminescncia do ensaio na presena de captadores das espcies reactivas ou inibidores enzimticos e nitrato de nquel na concentrao de 125 M. Lbranco- Luminescncia do ensaio na ausncia dos captadores das espcies reactivas ou inibidores enzimticos e do nitrato de nquel. Lcontrolo- Luminescncia do ensaio na ausncia dos captadores das espcies reactivas ou inibidores enzimticos e na presena de nitrato de nquel na concentrao de 125 M.

3.8.3

Estudos complementares

Traaram-se os espectros dos compostos testados tendo-se verificado que estes no absorviam na regio prxima de 431 nm (regio em que o luminol oxidado apresenta um mximo de emisso (Ferreira e Rossi, 2002), o que permite eliminar a possibilidade destes compostos actuarem como quenchers da luz emitida pelo luminol oxidado.

3.9

Anlise estatstica

Os resultados so expressos como mdia erro padro da mdia. A anlise estatstica foi realizada usando o mtodo no paramtrico de anlise de varincia (ANOVA) seguido pelo teste Bonferroni. Valores de p inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.

65

Resultados

4 RESULTADOS

66

Resultados 4.1 Viabilidade dos neutrfilos humanos isolados a partir de amostras de sangue tratadas com os anticoagulantes EDTA, citrato e heparina

A viabilidade celular dos neutrfilos isolados foi sempre superior a 98%, independentemente do anticoagulante utilizado.

4.2

Nmero de neutrfilos humanos isolados a partir de amostras de sangue tratadas com os anticoagulantes EDTA, citrato e heparina

Na Figura 15 esto representados os resultados obtidos no estudo do nmero de neutrfilos isolados de sangue tratado com cada um dos anticoagulantes estudados, citrato, EDTA e heparina. Da anlise da mesma ressaltam as diferenas no nmero de clulas isoladas com cada um dos trs anticoagulantes. O nmero de neutrfilos isolados por mL de sangue recolhido foi o seguinte: EDTA (1,7106 1,5105 neutrfilos/mL de sangue) > heparina (6,6105 1,5104 neutrfilos/mL de sangue) > citrato (4,6105 9,5104 neutrfilos/mL de sangue) (mdia erro padro da mdia).
2000000 N neutrfilos humanos isolados por mL de sangue 1750000 1500000 1250000 1000000 750000 500000 250000 0

**

Citrato

EDTA Anticoagulante

Heparina

Figura 15. Nmero de neutrfilos isolados de sangue tratado com cada um dos trs
anticoagulantes em estudo (citrato, EDTA e heparina) por mL de sangue. Os valores so 67

Resultados
apresentados como a mdia erro padro da mdia (n = 10); ** p < 0.01, comparativamente ao tratamento com citrato ou com heparina.

4.3

Activao de neutrfilos humanos pelo PMA

Na figura 16 esto representados os resultados obtidos no estudo da activao de neutrfilos, isolados de sangue tratado com diferentes anticoagulantes, pelo PMA. Verificou-se uma activao dos neutrfilos pelo PMA, muito semelhante com citrato e heparina (830 98% e 827 77%, respectivamente) e menor com EDTA (370 30%) (mdia erro padro da mdia).
1100 Activao de neutrfilos humanos pelo PMA (%) 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 Citrato EDTA Anticoagulante Heparina

**

Figura 16. Activao de neutrfilos humanos isolados de sangue tratado com diferentes
anticoagulantes (citrato, EDTA e heparina), pelo PMA, relativamente ao ensaio em branco (%). Os valores so apresentados como a mdia erro padro da mdia (n = 6); ** p < 0.01, comparativamente ao tratamento com citrato ou com heparina.

68

Resultados 4.4 Quantificao do clcio livre intracelular nos neutrfilos humanos isolados

Na figura 17 esto representados os resultados obtidos na quantificao do clcio livre intracelular em neutrfilos isolados de sangue tratado com EDTA, citrato e heparina. Verificou-se que os neutrfilos tratados com EDTA possuem uma menor concentrao de clcio livre intracelular (94,4 3,1 nM) quando comparado com os neutrfilos tratados com citrato e heparina (156,2 28,7 nM e 165,3 14,78 nM, respectivamente) (mdia erro padro da mdia).
200 175 Concentrao de clcio intracelular (nM) 150 125 100 75 50 25 0

Citrato

EDTA Tipo de anticoagulante

Heparina

Figura 17. Quantificao do clcio livre intracelular em neutrfilos humanos isolados

de sangue tratado com diferentes anticoagulantes (citrato, EDTA e heparina). Os valores so apresentados como a mdia erro padro da mdia (n = 3); * p < 0.05, comparativamente ao tratamento com heparina.

69

Resultados 4.5 Activao de neutrfilos humanos pelo nitrato de nquel

Na figura 18 esto representados os resultados obtidos no estudo da activao de neutrfilos isolados, de sangue tratado com diferentes anticoagulantes, pelo nitrato de nquel. Pela anlise da mesma, verificou-se que houve uma activao dos neutrfilos pelo nitrato de nquel. Esta activao das clulas foi dependente da concentrao de Ni2+, tendo-se registado maior activao para uma concentrao de nitrato de nquel 125

M. A activao dos neutrfilos foi diferente dependendo do anticoagulante utilizado.

Por exemplo, verificou-se que a concentrao mais baixa de Ni2+, 3,9 M, levou a uma activao de 50 9% com citrato, 36 7% com EDTA e 107 16% (mdia erro padro da mdia) com heparina. J a concentrao de 125 M originou uma activao de 263 28%, 233 29% e 130 10% (mdia erro padro da mdia) com a heparina, o citrato e o EDTA, respectivamente.
Activao de neutrfilos humanos pelo nitrato de nquel (%) 300

Ci trato EDTA * *

250

Hepari na

200

150 100

50

0.0

3.9

7.8 15.6 31.2 Concentrao de Ni 2 + ( M)

62.5

125.0

Figura 18. Activao de neutrfilos humanos isolados de sangue tratado com diferentes
anticoagulantes (citrato, EDTA e heparina), pelo nitrato de nquel, relativamente ao ensaio em branco (%). Os valores so apresentados como a mdia erro padro da mdia (n = 10). * p < 0.05; comparao dos valores de citrato vs EDTA. p< 0.01 e

<0.001, comparao dos valores de EDTA vs heparina. p < 0.05 e p < 0.01,
comparao dos valores de heparina vs citrato. 70

Resultados 4.6 Processos envolvidos na gerao de espcies reactivas durante a activao dos neutrfilos pelo nitrato de nquel

Na figura 19 esto representados os resultados obtidos no estudo da identificao das espcies reactivas envolvidas no processo de activao dos neutrfilos pelo nitrato de nquel. Foram testados inibidores enzimticos e/ou captadores de vrias espcies reactivas, sendo a % de inibio da produo de espcies reactivas pelos neutrfilos isolados de sangue tratado com citrato, EDTA e heparina, representada no Quadro 2. Como se pode verificar, os resultados foram muitos semelhantes entre os diferentes anticoagulantes estudados.

125 Inibio da activao de neutrfilos humanos (%)

Citrato

EDTA

Heparina

100

75

50

25

0
m M m M /m L 1m M M M PI 1 U 50 l1 M E 10 A BA H 2 0 M

ro n

Ti r

ito

2. 5 al as e L.

on

M an

Figura 19. Percentagem de inibio da activao de neutrfilos pela aco do tiron,

manitol, DPI, catalase, L-NAME, e ABAH, quando estimulados pelo nitrato de nquel (125 M). Os valores so apresentados como a mdia erro padro da mdia (n = 10).

C at

N A

Ti

71

Resultados Quadro 2. Percentagem de inibio da activao de neutrfilos pela aco do tiron,

manitol, DPI, catalase, L-NAME, e ABAH, quando estimulados pelo nitrato de nquel (125 M). Os valores so apresentados como a mdia erro padro da mdia (n = 10).

COMPOSTOS ESTUDADOS ENZIMTICOS DPI 1 M ABAH 10 M L-NAME 1 mM Tiron 2 mM

REACTIVAS

Inibio (%) (mdia erro padro da mdia) CITRATO

100 13 99 8 67 100 8 53 13 33 7 47 14

EDTA
100 7 100 4 48 100 6 37 7 29 7 48 10

HEPARINA
100 5 89 7 89 100 1 59 9 38 5 27 6

CAPTADORES

DE ESPCIES

INIBIDORES

Tiron 50 M Manitol 10 mM Catalase (2,5 U/mL)

72

Discusso

5 DISCUSSO

73

Discusso
Os resultados obtidos no presente estudo permitiram atingir os objectivos inicialmente propostos. Ficou demonstrado que o nmero de neutrfilos isolados depende do anticoagulante utilizado, sendo o EDTA o que proporcionou o maior nmero, enquanto que a heparina e o citrato no diferem significativamente entre si. Por outro lado, a viabilidade celular dos neutrfilos isolados foi sempre superior a 98%, independentemente do anticoagulante utilizado. Verificou-se, no entanto, que o grau de activao, pelo PMA, dos neutrfilos isolados de sangue tratado com EDTA, relativamente heparina e ao citrato, era significativamente menor, tendo estes ltimos originado, mais uma vez, valores semelhantes entre si. Finalmente, confirmou-se que o nitrato de nquel possui o potencial de activar os neutrfilos humanos isolados, tendo sido obtido um perfil relativo de activao semelhante ao do PMA, tendo em conta os anticoagulantes utilizados. Estes dados ainda no tinham sido divulgados na literatura cientfica, pelo que podero contribuir significativamente para os conhecimentos relativos ao isolamento e activao de neutrfilos humanos in vitro e na sua activao pelo nitrato de nquel. Os neutrfilos foram isolados pelo mtodo de centrifugao de gradiente de densidade, no qual se utilizou duas solues de diferentes densidades, Histopaque 1077 (densidade de 1,077) e Histopaque 1119 (densidade de 1,119). Esta metodologia permitiu encontrar grandes diferenas entre o nmero de clulas isoladas com cada um dos trs anticoagulantes estudados, citrato, EDTA e heparina. Foi efectuada a contagem do nmero de neutrfilos antes de se proceder ao isolamento, com o aparelho autoanalizador hematolgico Sysmex SF 3000 (Roche). No se verificaram diferenas no nmero de neutrfilos de sangue tratado com citrato, EDTA e heparina, o que sugere que o diferente nmero de neutrfilos isolados est estreitamente relacionado com o processo de isolamento. Ao longo dos ensaios verificou-se que existia uma melhor separao dos gradientes com o EDTA, o que permitiu uma recolha muito mais eficiente da camada dos granulcitos. Com citrato e heparina a separao dos gradientes no foi to eficaz, o que resultou numa pior recolha das clulas alvo deste estudo e consequentemente no menor nmero de clulas isoladas por mL de sangue. Estes resultados corroboram um estudo realizado anteriormente por Nielsen (1985), que estudou a influncia de cinco anticoagulantes no isolamento e actividade funcional de moncitos humanos. Neste estudo, o isolamento foi efectuado por um mtodo de centrifugao de gradiente de densidade utilizando sangue tratado com EDTA, citrato,

74

Discusso
heparina, oxalato e EGTA. O nmero de moncitos isolados foi superior com EDTA e heparina. A viabilidade celular e a actividade funcional no apresentaram variaes com os anticoagulantes. Globalmente, o presente trabalho e o estudo realizado anteriormente por Nielsen (1985) indicam que a utilizao de diferentes anticoagulantes durante a recolha de sangue poder ter uma grande influncia nos nveis de clcio nos componentes sanguneos e consequentemente com os resultados de ensaios a realizar posteriormente. Estando a metodologia utilizada para a separao das clulas relacionada com diferenas de densidade, o que permite a separao em gradiente de diferentes camadas de clulas, estes resultados sugerem que a heparina e o citrato alteram de alguma forma a densidade das mesmas, originando uma menor eficincia na sua distribuio pelos gradientes, nomeadamente na camada dos granulcitos. Em termos prticos, com o citrato, verificou-se um arrastamento de mononucleares praticamente at camada dos granulcitos. Esta por sua vez no se encontrava bem definida, prolongando-se at camada dos glbulos vermelhos. Com a heparina, a diferenciao das camadas era ligeiramente melhor do que com o citrato mas pior do que com o EDTA. Isto pode indicar que o citrato e heparina originam uma agregao das clulas, resultando em diferenas na densidade e consequentemente numa pior disposio das camadas. Esta hiptese corroborada por Mahony e Ferguson (1992), cujo estudo teve como objectivo comparar as caractersticas de sangue tratado com heparina ou citrato. Aps anlise ao microscpio de sangue do mesmo dador, tratado com heparina, os autores detectaram que existia agregao de clulas. Esse agregado era composto maioritariamente por plaquetas, alguns neutrfilos e uma pequena quantidade de linfcitos. A anlise, por ultrasons, de sangue tratado com citrato revelou uma agregao de plaquetas e neutrfilos, embora menos considervel em quantidade e tamanho do que com a heparina. De certa forma, estes resultados podem explicar o diferente nmero de neutrfilos isolados com os trs anticoagulantes estudados no presente trabalho. De facto, a pior visualizao das camadas de clulas com citrato e heparina, parece ter origem nas diferenas de densidade resultantes da agregao de clulas, nomeadamente plaquetas e neutrfilos. Passada a fase da recolha dos granulcitos para outro tubo, procede-se a uma lavagem com soluo tampo PBS e a um processo de lise, no sentido de eliminar alguma contaminao por glbulos vermelhos. Nesta etapa, verificou-se que com citrato e heparina a contaminao por glbulos vermelhos era superior, o que

75

Discusso
advm do facto da camada de granulcitos ser menos visvel com estes anticoagulantes. Essa maior contaminao levou a que se repetisse a lise at se conseguir eliminar todos os glbulos vermelhos. Este tarefa foi difcil quando os neutrfilos foram tratados com citrato, em que se chegou a efectuar trs lises. A agregao de componentes celulares verificada anteriormente por Mahony e Ferguson (1992), poder explicar a maior resistncia dos eritrcitos aos processos de lise, embora sejam ainda necessrios estudos experimentais para confirmar esta hiptese. Os resultados obtidos no estudo seguinte, no qual se testou a activao, pelo PMA, de neutrfilos humanos isolados de sangue tratado com citrato, EDTA ou heparina, permitiram verificar o grau de estimulao dos neutrfilos isolados. Vrios autores referiram j a capacidade deste composto solvel, obtido por sntese qumica, em estimular os PMN (Robinson et al., 1987; Downey et al., 1992; Nixon e McPhail; 1999; Seguchi e Kobayashi, 2002; Saito et al., 2005). O seu mecanismo de aco muito semelhante ao DAG, promovendo a translocao da PKC do citoplasma para a membrana plasmtica, onde ocorre a fosforilao do p47phox, etapa crucial na activao da NADPH oxidase. Aps activao da enzima h produo de O2-., que constitui o primeiro produto para a gerao de espcies reactivas (Majumdar, et al., 1991; Downey

et al., 1992; Nixon e McPhail, 1999; Karlsson e Dahlgren, 2002). Este radical
rapidamente convertido, espontaneamente ou pela aco da enzima SOD, em H2O2 (Cheesman e Slater, 1993; Campana et al., 2004). O H2O2 importante pois origina, via reaco de Fenton ou de Haber-Weiss, o radical mais reactivo e deletrio para o organismo, o radical HO. (Ferreira e Matsubara, 1997; Barbosa et al., 2006; Mladenka

et al., 2006). O H2O2 pode tambm ficar sujeito aco da MPO, presente nos grnulos
azurfilos dos neutrfilos. Esta enzima contribui consideravelmente para a capacidade bactericida dos PMN, via formao de HOCl (Hampton et al., 1998; Peskin e Winterbourn, 2001; Splettstoesser e Werner, 2002). A interaco de O2-., H2O2 e HOCl pode originar uma molcula muito reactiva, o 1O2 (Ferreira e Matsubara, 1997; Splettstoesser e Werner, 2002). Segundo Tepperman et al. (2000), a PKC tem tambm a capacidade de activar a iNOS, responsvel pela converso do aminocido L-arginina em
.

NO e L-citrulina (Fernandes et al., 2003; Ricciardolo et al., 2006). O .NO reage

rapidamente com o O2-. para formar ONOO- (Dedon e Tannenbaum, 2004). Em condies fisiolgicas o ONOO- tem um tempo vida inferior a 1 segundo, sendo imediatamente convertido sua forma protonada, ONOOH, que por fisso homoltica

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Discusso
origina .NO2 e HO. (Coddington et al., 1999; Whiteman et al., 2002; Alvarez e Radi, 2003). A reaco directa do ONOO- com CO2 particularmente importante devido elevada concentrao deste elemento in vivo e rapidez com que a reaco ocorre. Dessa reaco resulta um novo aducto, o ONOOCO2-, cuja decomposio origina cerca de 70% de CO2 e NO3- e 30% dos radicais .NO2 e CO3-. (Denicola et al., 1998; Coddington et al., 1999; Whiteman et al., 2002). Verificou-se que o grau de activao dos neutrfilos pelo PMA foi diferente consoante o anticoagulante utilizado, sendo menor com o EDTA e semelhante com citrato e heparina. Este perfil manteve-se quando os PMN foram estimulados com nitrato de nquel. Engstad et al. (1997) compararam o efeito de quatro anticoagulantes, EDTA, citrato, heparina e hirudina, noutras funes desempenhadas por moncitos, PMN e plaquetas de sangue humano, nomeadamente a activao dos moncitos, no sangue total, induzida pela adio de 5 ng/mL de lipopolissacardeos durante 1 a 6 horas, a activao dos PMN, que foi determinada pela medio da concentrao da lactoferrina no sangue total aps 90 min de incubao, com ou sem, lipopolissacardeos. Nas plaquetas, os autores estudaram a capacidade dos anticoagulantes modificarem a libertao dos grnulos por parte destas clulas. Embora estes resultados tenham sido observados noutro tipo de funes, o perfil relativo de activao foi semelhante ao obtido no presente trabalho, ou seja, verificou-se uma maior activao dos neutrfilos com heparina, e menor com citrato e EDTA. A maior activao dos neutrfilos tratados com heparina, pode estar relacionada com o facto deste anticoagulante levar a uma maior expresso de molculas de adeso. Quando o neutrfilo recebe a informao de uma reaco inflamatria em curso, ocorre uma profunda alterao no seu metabolismo com a consequente activao da clula. Essa activao passa pela expresso das suas molculas de adeso, com a posterior produo de espcies reactivas. As molculas de adeso so glicoprotenas expressas na superfcie celular, que medeiam o contacto entre duas clulas ou entre clulas e a matriz extracelular (Sgarbi et al., 2006). O processo de adeso pode ser dividido em pelo menos trs etapas distintas. Num primeiro momento, o neutrfilo circulante, que em situaes normais ocupa a regio central do vaso sanguneo, aproxima-se da parede vascular e rola sobre o endotlio. Numa segunda fase, o neutrfilo entra em contacto com o vaso, sofre a aco de substncias solveis libertadas no local (citocinas quimiotcticas) e passa a expressar molculas activadas que vo determinar uma ligao firme superfcie endotelial. Somente, ento, o

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Discusso
leuccito capaz de migrar atravs do vaso em direco ao tecido (Quintaes e Noronha, 1998; Sgarbi et al., 2006). Diferentes molculas esto envolvidas em cada uma das etapas de adeso e migrao. Assim, de maneira geral, as molculas de adeso dividemse em i) selectinas; ii) integrinas e iii) superfamlia das imunoglobulinas. As selectinas promovem uma fraca ligao inicial do neutrfilo ao endotlio (Cavalcanti, 1997; Quintaes e Noronha, 1998). A superfamlia das imunoglobulinas compreende uma variedade de protenas de cadeia nica com mltiplos domnios de caractersticas semelhantes s das imunoglobulinas e actuam como ligantes de outras molculas de adeso (Cavalcanti, 1997; Quintaes e Noronha, 1998). As integrinas so heterodmeros, expressos na superfcie dos leuccitos, que formam uma classe especial de receptores constitudos por subunidades e . Entre os diversos membros da famlia das integrinas, trs esto especialmente envolvidos na adeso do leuccito ao vaso: CD11a/CD18, CD11b/CD18 e CD49d/CD29. As demais integrinas so responsveis por interaces com a matriz extracelular (Cavalcanti, 1997; Quintaes e Noronha, 1998). Segundo vrios autores, a heparina, ao contrrio do citrato e EDTA, leva activao de molculas de adeso dos neutrfilos, nomeadamente as integrinas CD11b e a CD18 (Habbal et al., 1995; Repo et al., 1995; 1996; Shalekoff et al., 1998). Ambas constituem um marcador da activao dos neutrfilos e so expressas na superfcie dos neutrfilos ou podem ser mobilizadas de trs organelos intracelulares, os grnulos especficos, grnulos de gelatinase e vesculas secretoras (Shalekoff et al., 1998; Caimi

et al., 2006). Habbal et al. (1995) alertam para a escolha adequada do anticoagulante,
pois a elevada expresso da CD11b com a consequente estimulao de neutrfilos tratados com heparina pode levar a falsos positivos. A expresso da CD11b ocorre facilmente durante os processos de isolamento das clulas, entre outros factores, porque muito dependente da temperatura, como tal, os neutrfilos devem ser mantidos em gelo e de preferncia todo o manuseamento das clulas ser efectuado a baixas temperaturas. Uma alterao de temperatura de 4C para 37C origina uma expresso elevada desta integrina (Repo et al., 1995; Youssef et al. 1995). O mesmo pode ter acontecido no presente trabalho, j que a heparina per si leva expresso da CD11b/CD18, o que associado ao facto das leituras no leitor de placas serem realizadas a 37C, pode ter levado a uma maior expresso dessas integrinas e assim, explicar a superior sensibilidade dos neutrfilos a activadores do burst respiratrio. De acordo com a bibliografia consultada, o EDTA no aumenta a expresso das integrinas CD11b/CD18 nos neutrfilos. Este facto parece estar relacionado com a sua capacidade 78

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de quelatar ies clcio do meio extracelular, que so essenciais para a estrutura e funo de adeso das integrinas. O citrato, embora tambm actue como quelante de ies, no afecta tanto a expresso da CD11b, sugerindo que no interfere com os locais de ligao do clcio s molculas CD11b (Repo et al., 1995). A menor activao dos neutrfilos tratados com EDTA foi tambm verificada por Wu et al. (1999), que estudaram o efeito do anticoagulante na percentagem de neutrfilos activados. Sugeriram que a heparina seria uma melhor opo ao EDTA, pois o ltimo inibia a activao dos PMN. A menor activao dos neutrfilos tratados com EDTA pode estar relacionada com o seu mecanismo de anticoagulao passar pela quelatao de ies clcio (Engstad et al., 1997). Estes constituem um elemento crucial na transduo de sinais extracelulares, responsveis pela activao de algumas respostas por parte dos neutrfilos, como desgranulao, a activao de oxidases como a NADPH oxidase com produo de superxido e consequentemente de outras espcies reactivas (Geiszt et al., 1997). O fluxo de clcio no interior dos neutrfilos pode ocorrer de duas formas: i) rpida, com aumento de clcio intracelular devido libertao deste io armazenado no interior da clula, nomeadamente no retculo endoplasmtico, induzida pelo inositol 1,4,5-trifosfato (IP3); ii) aumento do clcio intracelular devido ao seu influxo do meio extracelular. H evidncias de que a libertao do clcio armazenado no interior da clula leva a um aumento do influxo deste io pelos canais membranares (Geiszt et al., 1997). O clcio extracelular tem um papel importante na resposta oxidativa das clulas, possivelmente atravs da activao da fosfolipase A2. Esta enzima hidrolisa fosfolpidos da membrana, libertando cido araquidnico, que tem um papel importante na activao da NADPH oxidase (Tithof et al., 1998). Porm, os mecanismos pelos quais o clcio intracelular origina um aumento da gerao de superxido so ainda pouco claros (Valentin et al., 2001). Rac1 uma protena G monomrica, que faz parte da NADPH oxidase. Fazem parte desta enzima outras subunidades: p67phox, p47phox e p40phox, que se encontram distribudas no citoplasma, o flavocitocromo b558, que pode estar na membrana plasmtica ou na membrana de alguns grnulos dos neutrfilos e outra protena G, a Rac 2. A activao da NADPH oxidase leva a uma deslocao das protenas citoplasmticas at membrana onde se unem s subunidades l existentes, resultando numa oxidase activa, capaz de produzir superxido (Nixon e McPhail, 1999, Seguchi e Kobayashi, 2002, Klebanoff, 2005). Segundo Valentin et al. (2001) a mobilizao do clcio intracelular

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Discusso
leva activao da Rac 1, que por sua vez, estimula a actividade da NADPH oxidase. Um estudo realizado por Movitz et al. (1997) refere que a translocao das subunidades citoplasmticas no induzida pelo clcio per si, mas sim por molculas de sinalizao celular geradas em resposta a um aumento da clcio intracelular (de referir que essas molculas no esto ainda identificadas). Um aumento dos nveis de clcio intracelular suficiente para activar a NADPH oxidase situada nos grnulos dos neutrfilos, tal no se verificando com a NADPH oxidase localizada na membrana plasmtica (Karlsson e Dahlgren, 2002). Tendo em conta a importncia deste io na activao dos neutrfilos, efectuou-se um estudo no mbito de quantificar o clcio livre intracelular em neutrfilos isolados de sangue tratado com citrato, EDTA e heparina. Os resultados revelaram que os neutrfilos tratados com EDTA possuem uma menor concentrao de clcio livre intracelular. Este um resultado concordante com a forma de aco deste anticoagulante, ou seja, sendo um agente quelante, tem a capacidade de quelatar ies clcio e consequentemente originar uma menor entrada de clcio para o interior da clula. Portanto, a menor activao verificada com o EDTA poder estar relacionada com uma diminuio dos nveis de clcio durante o processo de isolamento. No estudo referente activao pelo nitrato de nquel, de neutrfilos humanos, tratados com diferentes anticoagulantes, verificou-se que os sais de Ni tm capacidade para activar os neutrfilos, induzindo a produo de espcies reactivas. Em trabalhos anteriores, Huang et al. (2001) realizaram medidas por ressonncia electrnica de spin e demonstraram que fibroblastos de rato em cultura, em contacto com 10 g de Ni3S2 ou 2 mM de NiCl2 aumentam significativamente a gerao de ROS. Testaram inibidores enzimticos e capatadores de espcies reactivas e concluram que a estimulao dos fibroblastos pelos compostos de Ni gera HO., e que o O2-. e o H2O2 esto envolvidos no mecanismos de gerao desse radical. Tambm Chen et al (2003b), atravs da oxidao da diclorofluorescena, revelaram que NiCl2 leva produo de ROS, de uma forma dependente da concentrao (0-10 mM), em linfcitos humanos. Um estudo por citometria de fluxo, realizado por Cavallo et al. (2003) demonstrou um aumento dos nveis de ROS numa linha de clulas humanas (Jurkat) expostas durante quatro horas a uma concentrao de 0,17 M de NiSO4. O processo pelo qual ocorre a produo de espcies reactivas ainda no est totalmente esclarecido. A produo de espcies reactivas depende muito da habilidade do Ni em formar o par redox Ni(III)/Ni(II). O Ni (II) pode reagir com O2 ou H2O2, gerando HO. (Kasprzak et al., 2003). A gerao do

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Discusso
radical HO. pode ocorrer atravs da reaco Fenton/Haber-Weiss (Torreilles e Gurin, 1990). Segundo alguns autores, o Ni leva a um aumento dos nveis intracelulares de clcio (Salnikow e Costa, 1999; Memba-Meka et al., 2005). De acordo com MBembaMeka et al. (2005), embora o Ni possa funcionar como bloqueador dos canais de clcio ou competir com este pela entrada na clula pelos mesmos canais, o Ni tem um efeito compensatrio, aumentando os nveis de clcio por duas vias, pela libertao pela mitocndria e pelo retculo endoplasmtico. Tendo em conta o supracitado acerca da importncia do clcio na activao dos neutrfilos, este pode ser considerado um dos mecanismos pelos quais o Ni levou a uma activao dos PMN, embora sejam necessrios mais estudos para corroborar esta hiptese. Com a utilizao do luminol como luminforo podemos saber se existem espcies reactivas envolvidas no processo de activao dos neutrfilos. Contudo, no possvel inferir sobre quais as que efectivamente participam no processo. Nesse sentido, realizou-se um estudo com inibidores enzimticos e captadores de espcies reactivas, j que estes compostos, ao captarem uma determinada espcie reactiva, ou inibirem a sua produo, vo competir com o luminol na sua reaco com estas originando assim uma diminuio da luminescncia. As enzimas NADPH oxidase e mieloperoxidase so determinantes na produo de ROS, sendo a primeira responsvel pela formao de O2.com subsequente formao de H2O2 e HO. e a segunda pela formao de HOCl. Tendo isso em conta, foram utilizados inibidores das enzimas acima referidas, DPI (1 M) e ABAH (10 M), respectivamente. O DPI e o ABAH originaram uma inibio praticamente completa da activao dos neutrfilos independentemente dos anticoagulantes anteriormente utilizados. Este resultados permitem confirmar que o O2.e o HOCl esto envolvidos no processo de activao dos neutrfilos. Testou-se tambm um captador do O2.-, o tiron, cuja concentrao de 2 mM levou a uma inibio completa da activao, o que corrobora o supracitado. Com a catalase (2,5 U/mL), captador do H2O2, obteve-se uma inibio da produo de espcies reactivas inferior mas ainda assim efectiva. Os resultados obtidos indicam que no processo de activao dos neutrfilos, para alm do H2O2, existem outras espcies que contribuem para a oxidao do luminol. Tendo em conta os efeitos do DPI e tiron sobre a produo de espcies reactivas, pode-se concluir que o O2-. participa na activao dos neutrfilos, contribuindo para a oxidao do luminol na presena de catalase. A aplicao do manitol, captador do HO., aos neutrfilos isolados com citrato originou tambm alguma

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Discusso
inibio da activao dos neutrfilos. Poder concluir-se que h produo de vrias espcies reactivas, decorrente da estimulao dos neutrfilos, nomeadamente o O2.-, H2O2 , o HO. e o HOCl. A enzima NOS muito relevante na produo de RNS, levando libertao de .NO e subsequentemente de ONOO-. Como tal, testou-se o L. NAME, cujo efeito inibir a aco desta enzima. Os resultados obtidos indicaram que a activao dos neutrfilos foi apenas ligeiramente inibida, sugerindo que, nas presentes condies experimentais, as RNS no tm uma participao preponderante na activao das clulas. Segundo Radi et al. (1993) o .NO no capaz de oxidar o luminol. Contudo no interior do neutrfilo, este rapidamente convertido em ONOO-, e este sim tem capacidade para oxidar o luminol (Radi et al., 1993; Chen et al., 2003a). De referir que os resultados dos captadores de espcies reactivas e inibidores enzimticas foram semelhantes com os trs anticoagulantes alvo deste estudo, sugerindo que o tipo de espcies reactivas produzidas pelos neutrfilos no variam consoante o anticoagulante utilizado.

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Concluses finais

6 CONCLUSES FINAIS

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Concluses finais
O trabalho realizado permitiu a obteno de novos conhecimentos acerca do isolamento e estimulao de neutrfilos humanos. As concluses mais relevantes dos estudos realizados so as seguintes:

1. A eficincia no isolamento dos neutrfilos depende do anticoagulante utilizado, sendo o EDTA o que proporciona o isolamento de um maior nmero de neutrfilos.

2. O grau de activao dos neutrfilos pelo PMA depende do anticoagulante, verificando-se maior estimulao das clulas com heparina e citrato do que com EDTA.

3. Os neutrfilos isolados de sangue tratado com EDTA possuem uma menor concentrao de clcio livre intracelular, relativamente aos obtidos de sangue tratado com heparina e com citrato.

4. O grau de activao dos neutrfilos isolados de sangue tratado com EDTA est estreitamente correlacionado com os nveis de clcio intracelulares quantificados aps o isolamento destas clulas.

5. Constatou-se que o nitrato de nquel possui o potencial de activar os neutrfilos humanos isolados de sangue tratado com heparina citrato e EDTA, tendo sido obtido um perfil relativo de activao semelhante ao do PMA.

6. Nas presentes condies experimentais, os neutrfilos activados pelo nitrato de nquel originam as seguintes ROS: O2-., H2O2, HO. e HOCl. O .NO no parece ter um papel relevante durante a estimulo dos neutrfilos pelo nitrato de nquel.

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