ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

PRÁCTICA Nº 03
Método indirecto de determinación
de células viables
ASIGNATURA :

Microbiología de los Alimentos I

DOCENTE :

Dra. Graciela Albino Cornejo

ALUMNO :

Rómulo Aycachi Inga

CICLO :

2007 - II

Lambayeque, 31 de enero de 2008.

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 PRÁCTICA Nº 03
MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE CÉLULAS
VIABLES: MÉTODO DE REDUCCION DE
COLORANTES
I. Introducción:

La complejidad bioquímica de la leche en su composición y su elevada actividad de

agua la convierte en una de los alimentos naturales donde proliferan fácilmente la
mayor parte de los microorganismos y bien se podría catalogar como un medio
universal de cultivo.
Los microorganismos en la leche tienen varias orientaciones. Unos son beneficiosos por
las transformaciones que producen y otros perjudiciales y su control presenta aspectos
sanitarios y comerciales, el primero se refiere al riesgo que el alimento puede suponer
para la salud del consumidor cuando es portador de microorganismos patógenos o de
sus toxinas y el segundo a las características de conservación de la misma que viene
determinada por la presencia de un mayor o menor número de flora saprofitita, esta en
elevadas concentraciones puede producir defectos y disminución de las propiedades
nutritivas y organolépticas del producto.
Existen grupos de microorganismos (M.O) que son tomados como indicadores en la
Industria Láctea, pues su presencia permitirá comprobar el cumplimiento de la
aplicación de las buenas prácticas higiénicas.
M.O indicadores:
 Bacterias aeróbicas mesófilas
 Coliformes totales y fecales
 Enterobacterias torales
 Enterococos
Los métodos de análisis para evaluar la calidad higiénico sanitaria de la leche han
evolucionado sustancialmente desde la década de los 60, llegando a oficializare los
métodos convencionales de conteo en placa. Estos métodos universalmente conocidos
tienen limitantes como son el excesivo tiempo de realización, amplia laboriosidad y
utilización de gran cantidad de medios de cultivo, placas y otros insumos. Es por eso
que en la actualidad se han desarrollado métodos más rápidos y prácticos.
El desarrollo de métodos rápidos y/o automatizados en el diagnostico de la calidad
higiénico sanitaria de la leche y sus productos constituye en los últimos años una
necesidad enfocada en lo fundamental en la obtención de la respuesta en el menor
tiempo posible para tomar las medidas correctivas sobre las posibles brechas en la
higiene de algunas de las fases de la cadena productiva antes de que el producto sea
liberado en el mercado.
Estos métodos rápidos de diagnóstico bacteriológico en leche se han clasificado
atendiendo a diferentes puntos de vistas, no obstante, en lo fundamental han tomado
como base los aspectos siguientes: Rapidez con que se obtienen las respuestas, la
actividad metabólica de los microorganismos, posibilidades de automatización y
principios de medición en que se basan las lecturas.
Teniendo en cuenta la diversidad de estas clasificaciones y para una mayor inclusión de
métodos rápidos empleados en el diagnóstico microbiológico de la leche, están

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agrupados en tres grupos: métodos directos, indirectos y en métodos para diagnóstico de
microorganismos específicos.
El método usado en esta práctica es un método indirecto, el método de reducción de
colorantes (Reductasa), usando azul de metileno.
Los tests de reducción de colorantes se han utilizado durante muchos años como
indicadores de la calidad microbiológica de la leche y otros productos alimenticios.
Están basados en la medición de la actividad metabólica de las bacterias, ya que muchas
de ellas poseen las enzimas deshidrogenasas, las cuales transfieren hidrógeno de un
sustrato a un aceptor biológico reduciéndolo. Tal es el uso de la Prueba de Reducción
del Azul de Metileno, de la Resazurina y del Trifenilfetrazolium, no obstante, a partir de
los años 60 la introducción masiva de la refrigeración trajo consigo la predominancia en
la microflora de la leche de los gérmenes psicrófilos, los cuales tienen poco poder
reductor, limitando con ello la utilidad de la prueba de reducción (ya que se realiza a 37
ºC).
En el procedimiento se utilizan patrones de azul de metileno o resazurina y se observa el
proceso de reducción del colorante (de azul a blanco para el azul de metileno; de azul
apizarrado a rosa o blanco para la resazurina). El tiempo necesario para que se produzca
la reducción del colorante está relacionado con el número de microorganismos de la
muestra.
Teniendo en cuenta que los métodos de reducción no funcionan eficazmente en leches
refrigeradas, se ha sugerido la sustitución de estas por otras técnicas rápidas.

II. Objetivos:

 Determinar las células viables presentes en la muestra de leche a partir de la

prueba de la reductasa.
 Determinar a calidad de las muestras de leche.

III. Materiales:
 Material Biológico: Leche fresca
 Material no biológico:
- Tubos con tapa rosca estériles
- Pipetas de 1 y 10 mL.
- Baño María (regulado 37 ºC ± 0.1)
- Agua destilada estéril
- Botella de vidrio estéril
- Gradillas
- Reloj
- Azul de metileno

IV. Procedimiento:

- Primero preparamos el azul de metileno a usar en la prueba, ya que el que

teníamos a disposición era una solución madre (saturada) y había que
diluirla.
- Se pipeteó 60 mL de agua destilada estéril en una botella y se le agregó 3
mL de la solución madre de azul de metileno (dilución 1/10).

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- Luego que tenemos nuestro colorante, colocamos 1 mL a cada uno de los
tubos tapa rosca.
- Luego, con una pipeta de 10 mL tomamos esa misma cantidad de muestra
de leche y la pasamos al tubo tapa rosca (cada muestra de leche en su
propio tubo).
- Tapamos el tubo y pasamos a mezclar suavemente 3 veces.
- Previamente debemos tener ya al baño María calentado a 37 ºC (± 0.1),
verificar que en éste haya un control más y menos y un tubo con la muestra
y el termómetro.
- Luego, rotulamos los tubos, los ponemos en su gradilla y lo sumergimos en
el baño María (aflojar las tapas para que el contenido del tubo alcance la Tº
adecuada más rápidamente).
- Revisar cada 30 min.
- Si pasados los primeros 30 min. no “se vuelve blanco” el contenido del
tubo, lo sacamos, lo invertimos suavemente 3 veces y lo volvemos a poner
en el baño María por otros 30 min. y así hasta que el contenido se vuelva
blanco.
- Al final, anotamos el tiempo que demore en virar de color e interpretamos:

> 4h = Muy buena (A)

Entre 3 – 4 h = Buena (B)
> 30 min. a 3 h = Aceptable (C)
< 30 min. = Inaceptable (D)

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 V. Resultados:

- La muestra que se trajo a analizar viró de color a 2 horas después de

ponerla en el baño María, por lo que se puede interpretar que es una leche
aceptable
- La docente recomendó que para la toma de la muestra hubo que
etiquetarla, cosa que no se realizó, pero, para mayores datos, la muestra fue
tomada en una esquina del Mercado Modelo de Lambayeque, entre las
calles López Vidal y Emiliano Niño, a un expendedora ambulante de leche.

A la media hora A una hora A hora y media A dos horas

VI. Cuestionario:

1. ¿Qué otros métodos indirectos existen para hacer un diagnóstico microbiológico

indirecto en leche?
- Entre los distintos métodos de diagnóstico microbiológico indirecto en leche que
existen tenemos: por su actividad metabólica tenemos al método de tensión de
oxígeno, el de la catalasa, citocromo E oxidasa, microcalorimetría, flujo
citométrico, el método de la Impedancia y el de turbidimetría además del
método de la reductasa que pertenece a este grupo.
- Hay pruebas indirectas relacionadas con las mediciones de las concentraciones
de constituyentes específicos de las celúlas, entre ellas tenemos el método de
Bioluminiscencia y el Limulus TEST.

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 - Por último, hay pruebas indirectas que se fundamentan en la determinación de
compuestos metabólicos que aparecen en la muestra como consecuencia de la
transformación de los componentes del sustrato; entre ellos tenemos la prueba
del Piruvato.
2. ¿Qué otros colorantes se utiliza para realizar los métodos de reducción?
- Además del azul de metileno se puede utilizar la Resazurina (que cambia de azul
apizarrado a rosa o blanco) y la Trifenilfetrazolium.

3. ¿Para qué otros alimentos se puede usar el método de reducción del colorante?
- Además del uso de este método para productos lácteos (líquidos), también puede
ser usado para otros alimentos como por ejemplo jugos de frutas y variedades,
en los que se encuentran los jugos de soya, piña y otros, sobre todo alimentos
liquidos en los que también se podría observar el viraje de color del azul de
metileno u otro colorante a usar.

4. ¿Cómo se prepara el azul de metileno y cuál es su fórmula?

- El azul de metileno (C16H18ClN3S .3H2O), es un colorante que tiene un PM =
373, 9. Viene en cristales o polvo cristalino de color verde oscuro, con brillo
bronceado. Es inodoro o prácticamente inodoro. Es estable al aire. Sus
soluciones en agua o en alcohol, son de color azul profundo. Soluble en agua y
en cloroformo; moderadamente soluble en alcohol.
- Para su preparación (100 mL) primero pesamos 0.31g de azul de metileno (como
es sólido se tritura en un matraz), luego agregamos 30 mL de alcohol etílico,
mezclamos y agregamos los 100 mL de agua destilada (para evitar precipitados
lo pasamos por papel filtro).
- El azul de metileno de Loeffler tiene en vez de agua destilada una solución de
KOH al 0.01%.

VII. Referencias:

- MORENO M., M.; M. T., SILVA G. y CALDERON M., W. (2006). Guía de

Prácticas: Microbiología General. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo –
Facultad de Ciencias Biológicas. Lambayeque.
- Comisión Permanente de la Farmacopea Nacional Argentina (2003) Azul de
Metileno. Obtenido el 24 de enero de 2008 en
http://www.anmat.gov.ar/anmat/drvisapi.dll?MIval=fna_show_monog&ID=AZUL_
DE_METILENO
- DAVILA FERNANDEZ, N. y HERNANDEZ GARCIA, J. M. (2006). Métodos de
ensayos rápidos de deteccion de microorganismos en la leche. Revista electrónic ade
Veterinaria REDVET. Vol. VII. 18 pp. Obtenido el 24 de enero de 2008 en
http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n070706/070603.pdf
- NOTAS DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS (2005) Metodos de recuento de
microorganismos. Obtenido el 24 de enero de 2008 en

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http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20general/notas_de_micro
biologia_de_los_al.htm