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Captulo VI Uso de herramientas moleculares para la identificacin de hongos micorrzicos

Beatriz Xoconostle Czares1, Roberto Ruiz Medrano1, Melina Lpez Meyer2 e Ignacio Maldonado Mendoza2
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Departamento de Biotecnologa y Bioingeniera, CINVESTAV, Ave. IPN 2508 San Pedro Zacatenco Mxico, D.F. 2CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa. Boulevard Juan de Dios Btiz. No. 250. AP280. Guasave, Sinaloa, 81101.
CONTENIDO INTRODUCCIN CRITERIOS DE CLASIFICACION TAXONMICA TRADICIONALES HERRAMIENTAS DE BIOLOGA MOLECULAR AMPLIFICACIN DE SECUENCIAS ESPECFICAS POR PCR CARACTERIZACIN DE GENES QUE CODIFICAN ARN RIBOSOMALES Y SUS SECUENCIAS ESPACIADORAS OBTENCIN DE FRAGMENTOS RIBOSOMALES POR PCR Y ANLISIS POR RESTRICCIN (RFLP) INTEGRACIN DE LOS MTODOS DE BIOLOGA MOLECULAR PARA LA IDENTIFICACIN DE HONGOS CONSIDERACIONES EN EL USO DE LAS TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR E INTERPRETACIN DE DATOS HONGOS IDENTIFICADOS EN JALES DE MINAS DE ZIMAPAN CONCLUSIONES LITERATURA CITADA

INTRODUCCIN Las interacciones que se establecen entre plantas y microorganismos del suelo son sofisticadas y estn finamente reguladas. En suelos contaminados por desechos de minas, como en el caso de Zimapn, Hidalgo, dichas interacciones se ven alteradas por las condiciones de contaminacin que se presentan.

Un primer paso para introducir esquemas de fito-remediacin a sitios contaminados consiste en la descripcin tanto de la composicin florstica de la zona como de la composicin microbiolgica del suelo asociado a las races vegetales. De manera notable, algunos de estos microorganismos del suelo, no solamente son capaces de crecer en sitios con contenidos altos de metales pesados, sino que adems generan condiciones que permiten el establecimiento de algunas especies vegetales en estos ambientes tan adversos. Un ejemplo de ello es el aumento en la tolerancia a arsnico que algunos hongos simbiticos le confieren a plantas para crecer en suelos con altos contenidos de este contaminante (Gonzlez-Chvez, 2000, GonzlezChvez y Meharg, 2001, Gonzlez-Chvez y col., 2002). En el presente captulo se presenta el anlisis de la composicin de los microorganismos asociados a la rizsfera de distintas plantas presentes en suelos en proceso de remediacin de la zona de Zimapn, Hidalgo. Es de particular importancia la caracterizacin de hongos simbiticos tales como las micorrizas por lo que haremos referencia a este grupo de organismos a lo largo de este captulo. HERRAMIENTAS HONGOS TRADICIONALES DE IDENTIFICACIN DE

La sistemtica ha utilizado diversas herramientas para la clasificacin taxonmica de los hongos, siendo el anlisis morfolgico la ms utilizada. Discutimos a continuacin el caso de los hongos endomicorrizcos arbusculares. Estos organismos simbiticos son de vital importancia para las plantas que crecen en ambientes agrestes como en el caso de los jales de minas. Este es un grupo de hongos recalcitrantes a ser cultivados in vitro y son considerados simbiontes obligados, ya que son incapaces de completar su ciclo de vida sin el hospedero vegetal. El anlisis morfolgico como se discute en el captulo V se basa principalmente en la caracterizacin de las esporas, las cuales son estructuras reproductivas y de resistencia normalmente encontradas en el suelo donde creci una planta colonizada, y de las hifas intra-, y extra-radicales las cuales son caractersticas de las interacciones entre una especie de hongo y de planta hospedera especficas. Con el desarrollo de sistemas axnicos de crecimiento de estos hongos in vitro, es ahora posible utilizar criterios adicionales para la clasificacin de los hongos micorrzicos tales como algunas caractersticas concernientes al ciclo de vida del hongo, as como algunos de sus aspectos fisiolgicos y bioqumicos. Un sistema axnico de hongos micorrzicos consiste en el cultivo in vitro bajo condiciones estriles de races de planta colonizadas con una especie en particular de hongo micorrzico. La presencia de la raz permite que el hongo micorrzico pueda completar su ciclo de vida bajo estas 2

condiciones de cultivo in vitro (Bcard y Fortin, 1988). Con la excepcin de algunos pocos ejemplos, tales como los cultivos de races de zanahoria colonizados con el hongo Glomus intraradices, la mayora de los cultivos axnicos de este grupo de hongos se encuentran an en desarrollo, y sin duda, su establecimiento contribuir a elucidar las estrategias fisiolgicas que han desarrollado los simbiontes en su conjunto para ser tan exitosos sobre la tierra. A continuacin, discutiremos las desventajas del uso de los criterios de clasificacin taxonmica convencional y porqu en el presente estudio, abordamos no nicamente los criterios morfolgicos convencionales sino tambin empleamos tcnicas de biologa molecular para conocer la composicin de los hongos del suelo en los jales. Los criterios de clasificacin taxonmica de los hongos incluyendo a los hongos micorrzicos arbusculares (Glomerales) se basan en la caracterizacin de diferentes aspectos morfolgicos (ver captulo V). Uno de stos es el tamao del esporocarpo y de las esporas (Walker y Vestberg, 1998). Adems, la forma, color, caractersticas de la pared, ornamentacin y caractersticas de germinacin de las esporas son criterios frecuentemente utilizados en la caracterizacin de hongos micorrzicos arbusculares. La desventaja de usar estas caractersticas es que el medio ambiente puede tener un efecto en las caractersticas morfolgicas de las esporas. El micelio extra-radical es considerado otro carcter taxonmico, sin embargo, condiciones diferentes determinadas por distintos tipos de suelo pueden modificar el fenotipo del micelio y dar apariencias muy contrastantes a la misma especie de hongo. Las estructuras fngicas internas desarrolladas durante la colonizacin de la raz pueden tener un carcter de diagnstico, aunque, como en el caso del micelio extra-radical, diversas condiciones ambientales pueden modificar la apariencia, lo cual debe considerarse al momento de utilizar este criterio. Esto ejemplifica la dificultad de emplear criterios taxonmicos morfolgicos como determinantes para la taxonoma de hongos. Adems, otras de las principales desventajas de emplear estos mtodos es lo laborioso y tardado de los mismos y el requerimiento de contar con personal con experiencia para llevar a cabo la identificacin de manera adecuada. An as, estudios morfolgicos detallados, como el descrito en el captulo V, nos brindan informacin muy certera en cuanto a la identificacin de estos organismos. Se han desarrollado paralelamente otras herramientas que permiten hacer una determinacin taxonmica de hongos micorrzicos. Tal es el caso de la determinacin del patrn de protenas extradas de fase acuosa de hifas extramatricales y/o esporas (Breuninger et al., 2004). Las protenas se resuelven en geles desnaturalizantes de 3

poliacrilamida en una dimensin. El patrn electrofortico puede ser diagnstico de una especie. Aunque es posible identificar protenas cuya presencia caracterice a una especie en particular, debe tomarse en cuenta que el patrn de expresin proteico es influenciado de manera importante por el medio ambiente. Por ejemplo, hifas desarrolladas bajo condiciones nutritivas contrastantes pueden presentar patrones de protenas modificados al compararse entre ellas, y por lo tanto, un perfil difcil de caracterizar. Adicionalmente, la cantidad de protena que debe ser extrada para observarse en un gel puede ser limitante, considerando la cantidad tan pequea de tejido fngico con el que normalmente se cuenta para su anlisis. Las isoenzimas han sido ampliamente utilizadas en la determinacin de especies en diversos sistemas (Seidl et al., 2005). Aplicado a las micorrizas, representa una opcin interesante para ser considerada como herramienta de diagnstico. El patrn electrofortico de las enzimas glutamina sintetasa, [NAD]+-glutamato deshidrogenasa, glucosa fosfato isomerasa, superxido dismutasa, malato deshidrogenasa, aspartato aminotransferasa y gliceraldehdo 3-fosfato deshidrogenasa, mismas que pueden cuantificarse con mtodos colorimtricos, ha sido utilizado para establecer perfiles de isoenzimas en diversos hongos (Sasaki et al., 2004; Duarte et al., 2004). Los perfiles de cidos grasos, tanto fosfolpidos como cidos grasos neutros, han sido tambin utilizados para caracterizar hongos micorrzicos. En esta estrategia, bsicamente estos compuestos son cuantificados y su proporcin es referida al aislado que se estudia (Jansa et al., 1999). La cantidad de lpidos neutros (para almacenamiento de energa) es generalmente mayor que la de fosfolpidos (componentes de membrana) en HMAs ya que estos hongos almacenan una gran cantidad de su energa en forma de carbono, como lpidos neutros (Olsson y Johanssen, 2000). Los lpidos neutros en los hongos glomerales se encuentran enriquecidos en cidos grasos de 16 carbonos comparados con los fosfolpidos y en especial el cido graso lpido neutro (NLFA) 16:15 es muy abundante (Graham et al., 1995; Olsson y Johanssen, 2000). Este cido graso no se encuentra normalmente en otros hongos (Mller et al., 1994) y ha sido usado como un lpido clave para identificar HMAs en diferentes sistemas de crecimiento (Green et al., 1999; Larsen et al., 1998; Olsson, 1999). Sin embargo, a la fecha no se emplea este mtodo como identificador taxonmico debido a las dificultades inherentes de la medicin de estos lpidos y a que no se encuentran identificados los patrones de las distintas especies de HMAs y a que an no se cuentan con plantillas o huellas de identificacin para estos compuestos en HMAs.

Inclusive se han generado anticuerpos policlonales y monoclonales usando protenas de paredes de esporas. Los anticuerpos reconocen molculas altamente inmunognicas como los polisacridos, principalmente beta-glucanos, los cuales poseen caractersticas hidroflicas. Sin embargo, dada la ubicuidad de estos polisacridos, el uso de este mtodo siempre deber ser utilizado con rigurosos controles para reducir la posibilidad de interpretaciones equivocadas por falsos positivos (Giollant et al., 1993). HERRAMIENTAS DE BIOLOGA MOLECULAR Esta estrategia es la que ha cobrado mayor importancia en los ltimos aos para la identificacin de hongos micorrzicos. Esto se debe a que el anlisis a nivel de secuencia de regiones especficas en el ADN del hongo puede permitir su comparacin con secuencias ya descritas en la base de datos e inferir su identificacin, con la gran ventaja de que los resultados que se obtienen no fluctan en funcin de cambios ambientales. Dichas regiones especficas en el ADN se han empleado como huella gentica en muchos otros microorganismos y son descritas mas adelante en este captulo. Debido a que la identificacin molecular nicamente requiere de una muestra de ADN del organismo a analizar, sta puede tomarse en cualquiera de las etapas de su ciclo de vida. Es por esto que, a diferencia de la identificacin morfolgica, la estrategia molecular no requiere de la observacin de cada una de las estructuras desarrolladas a lo largo del ciclo de vida del hongo, lo cual permite que la identificacin pueda hacerse en mucho menos tiempo. An as, siempre es recomendable acompaar los datos moleculares con observaciones morfolgicas para llegar a una conclusin ms contundente respecto a la posible identidad del organismo en cuestin. A continuacin, se presenta la estrategia que se emple para la identificacin molecular de hongos en la zona de minas de Zimapn, Hidalgo. Se emplearon herramientas moleculares para tener un diagnstico rpido de los microorganismos presentes en la rizsfera de plantas colectadas en los jales de estas minas (ver captulo V). AMPLIFICACIN DE SECUENCIAS ESPECFICAS POR PCR Esta metodologa nos permite amplificar genes conocidos mediante el uso de oligonucletidos especficos. Esta fue la estrategia utilizada para la identificacin de los microorganismos presentes en el suelo de jales de minas de Zimapn, Hidalgo.

La PCR o reaccin en cadena de la polimerasa es una reaccin en la que una regin del ADN es reproducida mltiples veces in vitro. La especificidad de la reaccin es determinada por un par de oligonucletidos de entre 18-25 bases nucleotdicas (A,C,G, T). La secuencia de uno de los oligonucletidos debe ser complementaria a una regin especfica de una de las hebras del ADN blanco, la cual en este caso corresponde al ADN del hongo a identificar, mientras que el segundo oligonucletido debe hibridar con la otra hebra complementaria. Las posiciones de los oligonucletidos en el ADN blanco deben ser tal que la polimerizacin por parte de la ADN polimerasa ( Taq polimerasa) incluida en la reaccin, sintetice hebras complementarias de ADN. La Taq polimerasa es una enzima que une los nucletidos A, C, G, T, y forma hebras de ADN sencillas basndose en copiar una hebra complementaria del ADN, esto es, si en una hebra se tiene la secuencia aggact la Taq polimerasa sintetizar la secuencia TCCTGA a partir de ella. Esto lo hace basndose en las reglas sencillas de complementariedad, en donde, si la enzima encuentra una A en una secuencia a copiar adiciona una T, que es la base complementaria a la A, y si encuentra una C adiciona una G. Esto funciona tambin de manera inversa si encuentra en la secuencia una T adiciona una A, o si encuentra una G adiciona una C. El resultado final es la formacin de fragmentos de ADN de doble hebra de tamao y secuencia especfica (Figura 1). Una reaccin de PCR se basa en la sucesin de tres pasos fundamentales: el primer paso consiste en la desnaturalizacin del ADN blanco por calor (95C), posteriormente, un segundo paso en el que se baja la temperatura de la reaccin a tal punto que los oligonucletidos puedan unirse a la regin complementaria de la hebra correspondiente (normalmente es entre 37 y 60C) y un tercer paso en el que la temperatura se eleva a 72C, la cual es la temperatura para la actividad ptima de la enzima Taq polimerasa, para que se lleve a cabo la sntesis de las hebras complementarias correspondientes. Estos tres pasos constituyen un ciclo en la reaccin de PCR, durante el cual, a partir de una molcula de ADN de doble cadena se sintetizan dos. Si estas dos molculas de ADN pasan por un segundo ciclo de PCR, al final se tendrn cuatro molculas. Y si estas cuatro molculas pasan por un tercer ciclo de PCR, se tendrn ocho molculas. De esta manera, el nmero de molculas al final de la reaccin ser igual a 2n, en donde n corresponde al nmero de ciclos (Figura 1). Usualmente, se utilizan alrededor de 30 ciclos en una reaccin de PCR y se estima que el nmero de molculas sintetizadas a partir de una copia de ADN blanco es del orden de los cientos de millones.

Utilizando la tcnica de PCR se amplifica una regin especfica del ADN del hongo que es comnmente usada como una huella gentica. Para esto se emplean oligonucletidos universales para ADN ribosomal con el fin de amplificar un fragmento de ADN que incluye las regiones ITS o IGS del ADN ribosomal (para explicacin ver la siguiente seccin). Una vez amplificados, los fragmentos de ADN pueden ser separados electroforticamente en geles de agarosa y visualizados bajo luz UV posterior a su tincin con bromuro de etidio. Los fragmentos de ADN son escindidos y eludos de la agarosa y clonados en un vector bacteriano o plsmido. Un plsmido es una molcula de ADN circular, con propiedades que le permiten replicarse mltiples veces dentro de una bacteria. De esta manera, el fragmento amplificado a partir del ADN del hongo es mantenido y replicado indefinidamente y puede ser purificado para su secuenciacin.

3 5 3

5 3 5

DNA del hongo (blanco)

5 3 5 3 Oligonucletido 1 5 3 5 5 3 3 5 Oligonucletido 2 3 5

3 5

Paso 1 PCR (95 C) Desnaturalizacin por calor

3 5

Paso 2 PCR (37-60 C) Hibridizacin de los oligonucletidos a las hebras complementarias de DNA

Paso 3 PCR (72 C) Sntesis de DNA complementario

30 ciclos

5 Paso 1 PCR (95 C)

Figura 1. Diagrama de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). En el paso 1 el ADN blanco se desnaturaliza con calor. En un segundo paso, la temperatura de la reaccin se disminuye para permitir la hibridacin de los oligonucletidos en el ADN blanco. En un tercer paso la temperatura se eleva a 72C para permitir la sntesis de ADN por la enzima Taq polimerasa. Estos tres pasos constituyen un ciclo en la reaccin de PCR, el cual consiste normalmente de 30 ciclos (Saiki et al., 1988).

CARACTERIZACIN DE GENES QUE CODIFICAN RIBOSOMALES Y SUS SECUENCIAS ESPACIADORAS

ARN

Todos los eucariontes poseen genes que codifican para ARN ribosomales. En general, estos genes estn fsicamente dispuestos

como se indica en la Figura 2. Se hipotetiza que los eucariontes sufrieron una radiacin evolutiva a partir de un ancestro comn no identificado, lo cual dio origen a diversos grupos que fueron modificndose en el curso de la evolucin. Se considera que, entre ms diversas sean las secuencias de los ARNs ribosomales entre dos grupos, estos debieron haberse separado mas temprano en la radiacin evolutiva. Basados en este criterio, actualmente se utiliza la comparacin de secuencias de estos genes para indicar relaciones filogenticas. Si dos individuos presentan regiones de ARN ribosomal muy diversas, se concluye que se separaron filogenticamente hace mucho tiempo, mientras que lo contrario puede sugerir eventos recientes de especiacin. En una regin del ADN del hongo se encuentra el gen que codifica para el ARN ribosomal 18S, seguido de una secuencia no codificante, denominada ITS1 (por sus siglas en ingls, Internal Transcribed Sequence). ITS1 es seguido, a su vez, por el gen que codifica para el ARN ribosomal 5.8S. Este es contiguo a una regin intergnica denominada ITS2, la cual tiene en su extremo 3 al gen que codifica al ARN ribosomal 28S. A continuacin se localiza una secuencia espaciadora intergnica (IG1) seguida del gen ribosomal 5S, y luego una segunda secuencia espaciadora intergnica (IG2). Inmediatamente seguido de IG2, se inicia el gen que codifica para la subunidad 18S ribosomal (Figura 2). Mientras que los genes de ARN ribosomal conservan alta homologa entre individuos de diferentes especies, las secuencias espaciadoras son altamente variables en su contenido de bases y en su longitud (Jansa et al., 1992). Este es el fundamento en el que se basa la identificacin molecular, ya que la clonacin de segmentos de ADN codificantes y espaciadores y su posterior secuenciacin permite establecer homologas y diferencias entre dos organismos (Sanders, 1995). La estrategia utilizada incluye la amplificacin por PCR de dichas secuencias de ADN para su posterior clonacin y secuenciacin.
ARCH1311 GLOM1310 NS5 18S rDNA LETC1670 ACAU1650 ITS1F ITS1 5.8S ITS2 GLOM5.8R GIGA5.8R . 28S 5S IG2 18S

VANS1

IG1

AM1

ITS4

Figura 2. Ubicacin de los genes ribosomales que se usan en la identificacin de especies de hongos micorrzicos arbusculares. Los segmentos rojos

muestran las secuencias hipervariables en contenido de bases y longitud. ITS: espaciadores internos transcritos, IGS: espaciador intergnico. Se indican con flechas la ubicacin de los iniciadores para amplificar diferentes segmentos de los genes ribosomales. Los nombres corresponden al grupo de hongos micorrizicos arbusculares que son amplificados con los iniciadores indicados. Adaptado de Redecker et al., 2000.

A la fecha se han descrito un gran nmero de pares de oligonucletidos que sirven de iniciadores de secuencias ribosomales universales por un lado, o de secuencias especficas por otro, que permiten la amplificacin de fragmentos de ADN correspondientes a diferentes grupos de hongos micorrzicos (White et al., 1990). En el cuadro 1 se muestran los iniciadores utilizados para amplificar los diferentes grupos de Glomerales hasta la fecha descritos. La identificacin de los organismos se realiza una vez que se elucida la secuencia de los fragmentos de ADN amplificados en las reacciones de PCR.

Grupo taxonmico
Glomus mosseae/intraradices Glomus versiforme Glomus etunicatum/claroideum Acaulosporacea Gigasporaceae A. gerdemanni/A. trappei G. occultum/G. brasilianum Geosiphon pyriforme

Iniciador
GLOM1310 GLOM5.8 -----LETC1670 ACAU1660 GIGA5.8R ARCH1311 ------

Secuencia
ACGTAGGYCTAACATTGTTA TCCGTTGTTGAAAGTGAYC GATCGGCGATCGGTGAGT TGAGACTCTCGGATCGG ACTGACCCTCCAAGCAKGTG TGCTAAATAGCCAGGCTGC

Cuadro 1. Descripcin de iniciadores que son utilizados para la amplificacin de los diferentes grupos de hongos micorrzicos arbusculares. Basado en Redecker, 2000.

OBTENCIN DE FRAGMENTOS RIBOSOMALES ANLISIS POR RESTRICCIN (RFLP)

POR

PCR

Las muestras que contienen el hongo a determinar pueden provenir de races colonizadas frescas, almacenadas a baja temperatura, suelo donde creci la planta micorrizada o disecciones de micelio. El aislamiento de ADN total puede contener el material gentico de la raz, as como de todos los microorganismos presentes, hongos patgenos, saprobios o micorrzicos, as como de bacterias de la

rizsfera. La purificacin de este ADN total consiste en eliminar a protenas y sustancias de bajo peso molecular con propiedades elctricas similares al ADN. De particular inters es la eliminacin de cidos hmicos, los cuales tienen la misma carga que los cidos nucleicos e inhiben las reacciones como PCR y digestin con enzimas. Es importante sealar la disponibilidad de una base de datos que contiene los patrones electroforticos de productos de PCR que han sido digeridos con enzimas de restriccin. De esta manera, al amplificar secuencias de organismos no conocidos, se pueden restringir y comparar directamente con esta base de datos, sin la necesidad de otros procedimientos de biologa molecular como la clonacin y secuenciacin, que emplean tiempo y recursos de manera significativa. De manera general se emplea por convencin las digestiones producidas por las enzimas MboI y HinfI para distinguir morfoespecies de hongos glomerales, con la excepcin de Gigaspora (Redecker, 2003). El uso de esta tcnica ha permitido caracterizar comunidades micorrzicas en diversos sistemas, como el de plantas epiparsitas con endofitos (Bidartondo et al., 2002). Existen otras tcnicas de caracterizacin molecular aunque la identificacin de especies de hongos micorrzicos ha sido principalmente realizada por el anlisis de los genes ribosomales y sus espacios intergnicos. Estos otros mtodos incluyen el empleo de la amplificacin de secuencias polimrficas con oligonucletidos al azar, denominada RAPD o rapid, por sus siglas en ingls (Random Amplified Polymorphic DNA), la cual es muy utilizada para identificar variaciones en secuencias de ADN. Tambin se ha empleado la amplificacin de secuencias satlites, las cuales son secuencias en el genoma de un hongo repetidas en muy diversa orientacin, sea directa o inversa. Tales secuencias son susceptibles de ser detectadas por amplificacin o restriccin del genoma con enzimas. Los productos digeridos con enzimas se separan en un gel de agarosa y las bandas pueden ser analizadas con sondas moleculares marcadas. Los perfiles de ADN repetido se han utilizado en diversas especies como diagnstico (Lian et al., 2003). INTEGRACIN DE LOS MTODOS DE BIOLOGA MOLECULAR PARA LA IDENTIFICACIN DE HONGOS La caracterstica ms utilizada es la amplificacin de los genes ribosomales y sus secuencias espaciadoras y su subsecuente secuenciacin. En la base de datos del Genbank, ms de 5000 nmeros de acceso contienen informacin, por ejemplo, del grupo de los hongos micorrzicos arbusculares. A la fecha se cuenta con secuencias particulares que definen a las siguientes familias: 10

Glomaceae, (Glomus), Gigasporaceae (Gigaspora y Scutellospora) y Acaulosporaceae (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). De manera paralela, la identificacin de grupos de ectomicorrizas ha utilizado herramientas similares en este estudio. A la fecha existe una importante base de datos con secuencias ribosomales y sus secuencias intergnicas que permiten la determinacin de hongos, como Amanita, Hebeloma, Pisolithus, Rhizopogon, Cenococcum, pezizales y trufas (Horthon, 2002; http://www.ncbi.nlm.nih.gov). CONSIDERACIONES EN EL USO DE LAS TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR Como se indic, la pureza del ADN es determinante para amplificar de manera consistente a cualquier secuencia codificada en la muestra. Se recomienda utilizar los iniciadores ms especficos posibles, por ejemplo, en el caso de los hongos micorrzicos arbusculares, existe tambin la presencia de hongos patognicos o saprobios, los cuales pueden ser co-amplificados. A la fecha no ha sido posible disear iniciadores que amplifiquen de manera especfica a los Glomerales, esto es debido principalmente a que no conocemos las secuencias de todos las especies de hongos en la naturaleza, como se comenta en la siguiente seccin solo conocemos entre el 1 y 5% de la biodiversidad de los microorganismos existentes en el suelo. Por ello, se recomienda el uso de una batera de iniciadores como los descritos en este captulo. Asimismo, la presencia de dos ITS idnticos no significa automticamente que dos hongos tienen el mismo origen, solo que estn altamente relacionados evolutivamente. De manera general, se asume que un solo locus de comparacin, en este caso el rADN no podra dar suficiente informacin entre variaciones intra- o interespecie. Este ultimo concepto, el de especie tambin deber de ser cuidadosamente utilizado, ya que su definicin, que implica reproduccin sexual, no se ha observado en algunos hongos, como es el caso de los micorrzicos arbusculares (Taylor, 2000). Se ha descrito que, por ejemplo, en micelios cenocticos de hongos micorrzicos arbusculares los ncleos son genticamente diferentes (Kuhn et al., 2001). Tambin se reporta la formacin de anastomosis en micelio, que podra producir movimiento horizontal de informacin gentica, (Giovanetti et al., 1999) generando as la variabilidad gentica observada. Sin embargo, este tipo de estudios solo se ha hecho en algunos grupos de hongos y an es requerida mucha informacin a este respecto para considerarla como un mecanismo de transmisin gentica generalizada en estos organismos.

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Por ltimo, debe tomarse en consideracin que la base de datos del Genbank no ha sido depurada en su totalidad. Esto se refiere a que muchas de las secuencias depositadas en la base de datos no corresponden a hongos plenamente identificados tanto desde el punto de vista de morfologa, como del molecular. Por esto, debe de analizarse bien la lista de candidatos con homologa a nuestra secuencia que provee la herramienta de comparacin tal como la opcin BlastN en el sitio del Genebank. En lo posible, la identificacin a nivel molecular debe de basarse en la informacin de secuencias de organismos tipo, esto es, identificados, y descritos a detalle en las colecciones internacionales de Glomerales (INVAM y BEG). HONGOS IDENTIFICADOS EN JALES DE MINAS DE ZIMAPAN En el presente trabajo se analizaron ms de 100 productos amplificados por PCR y se defini de acuerdo a sus patrones electroforticos de restriccin empleando la enzima EcoRI, cerca de 50 clonas. De estas, se pudieron clonar y secuenciar 25 que permitieron identificar a nivel molecular 16 especies de hongos y un alga rodofita (Gymnogongrus chiton) (Cuadro 2). Es posible, que a pesar de que los oligonucletidos, o iniciadores empleados para amplificar el ADN ribosomal fueran especficos para hongos, se pueda reconocer esta misma regin en algunos otros organismos como el caso del alga identificada en el presente estudio. Esta posibilidad es explicable en base a que solo conocemos una muy baja proporcin de la biodiversidad de microorganismos de la rizsfera. Segn la Sociedad Americana de Microbiologa, clculos conservadores indican que solo conocemos del 1 al 5% de la diversidad total de microorganismos (http://www.asm.org/Policy/index.asp?bid=4861). En parte, esto es debido a que an no conocemos la manera de cultivarlos in vitro y en el caso de los hongos muchos no se pueden reproducir de manera sexual in vitro. Con excepcin de dos hongos basidiomicetos (Pisolithus tinctorius, y Sporobolomyces lactosus), casi todos los hongos identificados en el presente trabajo pertenecen al grupo de los ascomicetos (Cuadro 2). Este hecho es interesante, ya que en estudios similares de identificacin, usando los mismos oligonucletidos para amplificar la regin ITS del ADN ribosomal, en suelos no-contaminados del Valle de Guasave, Sinaloa se identificaron un nmero proporcional de ascomicetos, basidiomicetos y glomeromicetos (Martnez-lvarez et al., 2003). Se requiere confirmar con pruebas microbiolgicas este hallazgo, ya que esto pudiera sugerir que existe una mayor tendencia a que los hongos ascomicetos colonicen de manera preferencial los suelos de esta rea. 12

A un total de cinco de estos hongos no se les puede asignar una funcin, ya que al comparar su homologa en base a la secuencia de ADN contra la base de datos del Genbank arroja resultados que sugieren tener una alta homologa con organismos de los cuales se desconoce su gnero o especie. Esto es posible debido a que algunas de estas secuencias incluidas en este banco de datos corresponde a secuencias amplificadas por PCR a partir de ADN extrado de suelo, el cual puede incluir muchos organismos an no identificados ni descritos a detalle. Se identificaron algunos hongos (Exophiala sp. y un hongo xylarial) con posible actividad saprotrfica (Liers et al., 2006), es decir, hongos encargados de la degradacin de la biomasa vegetal residual en estos suelos. Estos organismos son comunes de encontrar y representan un indicio de que el ecosistema de los jales podra estar en camino de establecer un equilibrio ,ya que la funcin de estos hongos saprotrficos es la de degradar madera y otros restos vegetales. Dos de ellos se reportan previamente como probables fitopatgenos (Phoma sp. y Nectria haematococca) de algunas especies vegetales, y otros dos hongos (Phoma glomerata, Aspergillus ustus) poseen una posible actividad de agente de biocontrol contra otros hongos causantes de enfermedades como la cenicilla polvosa (Sullivan y White, 2000), o contra nemtodos (Eapen et al., 2005) como Meloidogyne incognita causante de las agallas de races en algunas plantas. Se encontr un hongo endoftico particularmente de hoja de Picea glauca, y tres hongos ectomicorrzicos (Cladosporium tenuissimum, Pisolithus tinctorius, y un hongo ascomiceto no cultivado), los cuales probablemente presentan asociaciones de tipo simbitico asociados a races de las plantas de estos sitios contaminados, y probablemente contribuyan al establecimiento de las plantas en estos suelos contaminados con metales. Un hallazgo interesante es el hongo Sporobolomyces lactosus, el cual se ha reportado previamente creciendo en sitios con niveles muy altos de desechos de la industria petrolera (Grabinska-Loniewska et al., 1993), y el cual probablemente sea un buen candidato a continuar estudiando en cuanto a su capacidad de supervivencia en presencia de metales. Algo notable de mencionar es que tres de las especies de hongos descritos en este trabajo (Exophiala sp., Phoma sp., y Aspergillus ustus), los cuales son hongos comunes del suelo, se han reportado 13

como agentes causales de micosis humanas, principalmente en pacientes con inmunodeficiencia, o con problemas en los que la salud general del paciente se encuentra comprometida. Esto resalta la importancia de este tipo de estudios para conocer a los posibles patgenos humanos que pudieran tener efecto en la salud en algunas regiones.
Hongos identificados
1. Ascomiceto de hojarasca cepa its321 aislado 1000540537 2. Hongo de suelo no cultivado clona 115-76 3. Hongo endofito OTm-1 4. Exophiala sp. JS-1171 5. Hongo xylarial no cultivado 6. Phoma sp. 2 7. Hongo de suelo no cultivado clona 68a21 8. Ascomiceto micorrzico no cultivado aislado 1 9. Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum 10. Phoma glomerata 11. Aspergillus ustus cepa NRRL 1974 12. Gymnogongrus chiton aislado 23.xii.92 13. Cladosporium tenuissimum 14. Pisolithus tinctorius 15. Endofito de hoja de Picea glauca sp. P3 16. Sporobolomyces lactosus 17. Nectria haematococca

Probable funcin
desconocida desconocida desconocida saprtofo, patgeno humano desconocida, possible saprtofo de madera fitopatgeno, patgeno humano desconocida ectomicorriza fitopatgeno micoparsito de cenicilla polvosa micoparsito del nemtodo agallador de las races, patgeno humano alga rodofita ectomicorriza ectomicorriza endofito de conferas hongo aislado de desechos de petrleo fitopatgeno

Nm. del jal (rizsfera de la especie vegetal)


2 (pltano) 2 (pltano) 2 (pltano) 2 (cactcea, Opuntia sp.) 2 (cactcea, Opuntia sp.) 3 (leguminosa) 3 (leguminosa) 3 (leguminosa) *1; *2 (abrojo, Cylindropuntia sp.; Tagetes/ Rincheliytrum repens Willd. Hubb) *1 (pasto) *1 (higuerilla, Rhicinus communis L.) 1 (platanillo, Canna indica L.) *2 (pata de gallo, Chloris virgata Sw.) 1; *2 (Eucalipto, Eucalyptus canaldulensis Denhardt; cactcea, Opuntia sp.) *1 (Eucalipto, Eucalyptus canaldulensis Denhardt) *1 (abrojo, Cylindropuntia sp.) *2 (cactcea, Opuntia sp.)

Cuadro 2. Lista de especies de hongos identificadas por taxonoma molecular y su probable funcin en la rizsfera. Se indica en la tercera columna el nmero del jal de donde se colect la muestra y el nombre cientfico y comn de las especies vegetales con las cuales se encontraron asociados estos hongos. Los nmeros de los sitios marcados con un asterisco indican que los hongos indicados en el Cuadro 2 fueron aislados a partir de tejido de raz, cuando no se indica un asterisco el DNA empleado para la identificacin fue aislado de suelo.

CONCLUSIONES

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Las herramientas de biologa molecular han permitido en poco tiempo avanzar en el conocimiento de la diversidad de los hongos. Las bases de datos pblicas que contienen las secuencias, principalmente ribosomales de un gran nmero de aislados permiten tener un panorama actual de la gran diversidad de este grupo de organismos en la tierra. Estas herramientas, sin embargo permitirn abordar otros aspectos adems de la sistemtica de los hongos, como entender la bioqumica, fisiologa e interacciones de estos en la rizsfera. Todos estos elementos nos permitirn comprender el xito en el establecimiento de los hongos en ecosistemas tan agrestes como los jales. Estas tcnicas no solo se aplican para identificar la presencia de estos hongos en sitios tales como jales de minas o zonas donde se implementa la bio-remediacin de suelos. Tambin son empleadas para entender los mecanismos por los cuales estos organismos son capaces de crecer en condiciones de suelos contaminados con metales pesados. Este aprendizaje deber permitirnos en el futuro desarrollar esquemas especficos de bio-remediacin que involucren el empleo de especies vegetales fito-extractoras en combinacin con hongos que ayuden a aumentar la tolerancia a metales en plantas, o acten como bio-filtros para evitar que los metales ejerzan su efecto nocivo en las plantas. Al final de cuentas, el objetivo principal de este tipo de estudios es poder lograr recuperar suelos que han sido contaminados con metales. Agradecimientos: BXC es financiada por el CONACyT (Sagarpa 2005027). LITERATURA CITADA Bcard, G., J. Fortin. 1988. Early events of vesicular-arbuscular mycorrhiza formation on Ri T-ADN transformed roots. New Phytologist 108: 211-218. Breuninger, M., C. G. Trujillo, E. Serrano, R. Fischer, N. Requena. 2004. Different nitrogen sources modulate activity but not expression of glutamine synthetase in arbuscular mycorrhizal fungi. Fungal Genet Biol. 41: 542-52. Bidartondo, M. I., D. Redecker, I. Hijri, A. Wiemken, T. D. Bruns, L. Domnguez, A. Srsic, J. R. Leake, D. J. Read. 2002. Epiparasitic plants specialized on arbuscular mycorrhizal fungi. Nature 419: 389 393. 15

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