Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro Instituto de Florestas Curso de Graduao em Engenharia Florestal

Seleo de estirpes de rizbio eficientes na fixao biolgica de nitrognio para leguminosas com potencial de uso na recuperao de reas mineradas

Keila Caroline Dalle Laste

Seropdica, RJ Dezembro, 2008

Seleo de estirpes de rizbio eficientes na fixao biolgica de nitrognio para leguminosas com potencial de uso na recuperao de reas mineradas

Keila Caroline Dalle Laste

Sob orientao do pesquisador

Sergio Miana de Faria

Monografia apresentada ao Curso de Engenharia Florestal, como requisito para a obteno do ttulo de Engenheiro Florestal, Instituto de Florestas da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro.

Seropdica, RJ Dezembro, 2008

ii

Seleo de estirpes de rizbio eficientes na fixao biolgica de nitrognio para leguminosas com potencial de uso na recuperao de reas mineradas

Keila Caroline Dalle Laste

Aprovada em 04 /12 / 2008

______________________________________________________ Sergio Miana de Faria Pesquisador-Embrapa Agrobiologia (orientador)

_____________________________________________________ Eliane Ribeiro da Silva Pesquisadora-Embrapa Agrobiologia

_____________________________________________________ Gustavo Ribeiro Xavier Pesquisador-Embrapa Agrobiologia

iii

Para minha me Anadir (in memorian)

iv

AGRADECIMENTOS minha famlia, em especial ao meu pai Eugnio, minhas irms Ctia e Cassiele e minha madrinha Angelina por todo o amor. Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro pela educao gratuita e de qualidade. Embrapa Agrobiologia pelo suporte na execuo dos trabalhos. Companhia Vale e Fapur pelo financiamento do projeto. Ao pesquisador Sergio Miana de Faria pela oportunidade de iniciao cientfica. Aos pesquisadores do Laboratrio de Leguminosas Cludia Pozzi Jantalia e Alexander Silva de Resende pela ajuda nas correes dos trabalhos e ao querido e saudoso Paulinho por todo o carinho. Aos componentes da banca examinadora pelo tempo e ateno disponibilizados. A Abdala Diedhiou, pela ajuda e conselhos na etapa final. Aos tcnicos do laboratrio de Leguminosas da Embrapa Agrobiologia: Telmo Flix da Silva, Carlos Fernando da Cunha e Adriana Santos Nascimento pelo auxlio e o bom humor contagiante. Aos funcionrios da casa de vegetao da Embrapa Agrobiologia: Naldo, Claudinho, Luizinho e Serginho por toda ajuda e boa vontade sempre! Aos estagirios do laboratrio de Leguminosas pelo sofrimento dividido e risadas multiplicadas, em especial a Fernando Soares Gonalves, Elizabeth Silva Uchas, Wardsson Lustrino Borges, Anatoly Torres e Pedro Medrado Krainovic. minha famlia ruralina pelos inesquecveis momentos vividos: Tattiane G. Costa, Deivid L. Machado, Samoel S. Monteiro, Luany L. da Silva, Anderson R. Diniz, Gabryella M. Pereira, Caroline Pinheiro, Lvia Cabral e Andria Afonso, pra sempre no corao! A todos que direta ou indiretamente contriburam para a realizao deste trabalho. E enfim, a Ele que nunca me abandona.

Muito obrigada.

O papel dos infinitamente pequenos infinitamente grande Louis Pasteur

vi

RESUMO Leguminosas florestais so conhecidas pelo importante papel que desempenham na recuperao de reas degradadas, e por essa propriedade algumas espcies so utilizadas na revegetao de reas mineradas. Muitas leguminosas se associam com bactrias fixadoras de nitrognio, promovendo o crescimento. O objetivo deste trabalho avaliar a eficincia e a eficcia de diferentes bactrias fixadoras de nitrognio em associao com quatro leguminosas (Desmodium leiocarpum, Tephrosia adunca, Mimosa xanthocentra e Mimosa somnians) em dois substratos (areia e vermiculita esterilizados e em solo no esterilizado) e verificar o efeito da adio de trs diferentes formas de nitrognio mineral no crescimento dessas espcies. Estirpes de bactrias foram testadas em comparao com controle nitrogenado e controle absoluto (planta sem N) em casa de vegetao da Embrapa Agrobiologia, Seropdica RJ. Foram obtidas diferentes respostas da planta em relao bactria inoculada. As duas melhores estirpes de bactrias para o desenvolvimento da planta em substrato esterilizado so BR 2216 e BR 6610 para D. leiocarpum, BR 5303 e BR 3628 para T. adunca, e BR 3523 e BR 3454 para M. xanthocentra. E em solo no esterilizado os melhores resultados obtidos foram BR 3467e BR 4406 para D. leiocarpum, BR 5609 e BR 96 para T. adunca, e BR 3477e BR 3474 para M. somnians. Os resultados mostram que a resposta da planta inoculao depende da bactria e do substrato utilizado, e para o sucesso da recuperao torna-se necessrio selecionar uma boa parceria (planta e bactria). Palavras-chave: simbiose, eficcia, crescimento

vii

ABSTRACT Legume trees are known to play important roles in recovery of degraded areas, thus some species have been used in substrate reconstitutions and restoration of mined areas. Most of these legumes are associated with nitrogen fixing bacteria (NFB) which may improve their growth. The aim of this work was to evaluate the efficiency and effectiveness of different NFB in association with four legumes (Desmodium leiocarpum, Tephrosia adunca, Mimosa xanthocentra and Mimosa somnians) in two substrates (sterilized mixture of vermiculite and sand, and non sterilized soil). Fifty-four bacterial strains were tested in comparison with supply of nitrogen sources to plants, and control treatment (plant without nitrogen supply) in a greenhouse at Embrapa Agrobiologia, Seropdica RJ. Contrasting responses of plants to bacterial inoculations were obtained. The two best bacterial strains for plant benefit in the sterilized substrate were BR 2216 and BR 6610 for D. leiocarpum, BR 5303 and BR 3628 for T. adunca, and BR 3523 and BR 3454 for M. xanthocentra. While in the non sterilized soil the best performances were obtained with BR 3467 and BR 4406 for D. leiocarpum, BR 5609 and BR 96 for T. adunca, and BR 3477 and BR 3474 for M. somnians. Our results clearly showed that the response of tree species to inoculation depends on associated bacterial strains and growing substrate, and therefore raised the question of selection of good partners (plant and bacteria) for land reclamation. Key words: symbiosis, efficacy, growth

viii

SUMRIO LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS 1. INTRODUO 2. REVISO DE LITERATURA 2.1 A atividade de minerao 2.2 Recuperao de reas degradadas 2.3 As leguminosas 2.4 O nitrognio 2.5 A simbiose planta-bactria 2.6 A metodologia de seleo de estirpes
3. MATERIAL E MTODOS

x xi 1 1 1 2 2 3 3 4 4 4 4 8 8 9 10 10 10 10 10 10 10 10 13 15 16 16 17 18 19 20 23

3.1 Experimento em condies estreis 3.1.1 Montagem do experimento 3.1.2 Sementes 3.1.3 Inoculao 3.2 Conduo do experimento 3.2 Experimento em condies no estreis 3.2.1 Montagem do experimento 3.2.2 Sementes 3.2.3 Inoculao 3.3.5 Conduo do experimento 4. RESULTADOS E DISCUSSO 4.1 Experimento em condies estreis 4.1.1 Desmodium leiocarpum 4.1.2 Tephrosia adunca 4.1.3 Mimosa xanthocentra 4.2 Experimento em condies no estreis 4.2.1 Desmodium leiocarpum 4.1.2 Tephrosia adunca 4.1.3 Mimosa somnians 5. CONCLUSO 6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 7. ANEXO A

ix

LISTA DE FIGURAS Figura 1. Casa de vegetao, Embrapa Agrobiologia.............................................................. Figura 2. Bactrias crescidas em meio 79 slido e semi-slido............................................... Figura 3. Comparao entre o melhor tratamento, testemunha nitrogenada e testemunha absoluta em D. leiocarpum....................................................................................................... Figura 4. Desenvolvimento do sistema radicular de T. adunca frente trs tratamentos................................................................................................................................ Figura 5. Competitividade das estirpes inoculadas que proporcionaram bom desenvolvimento em D. leiocarpum, em substrato no esterilizado....................................... Figura 6. Tratamento inoculado, testemunha nitrogenada e testemunha absoluta de T. adunca em vaso de solo no estril.......................................................................................... 8 9 11 13 17 19

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Listagem das estirpes utilizadas nos experimentos, os hospedeiros da qual foram coletados os ndulos e sua origem........................................................................................... Tabela 2. Acmulo de massa da parte area seca e de ndulos, eficincia e eficcia dos tratamentos para D. leiocarpum, coletado aos 104 dias aps o plantio....................................................................................................................................... Tabela 3. Acmulo de massa da parte area seca e de ndulos, eficincia e eficcia dos tratamentos para T. adunca...................................................................................................... Tabela 4. Massa da parte area seca e dos ndulos secos, eficincia e eficcia das estirpes que proporcionaram nodulao em M. xanthocentra............................................................... Tabela 5. Acmulo de massa da parte area seca, ndulos, raiz, eficincia e eficcia dos tratamentos para D. leiocarpum, em vaso com solo................................................................ . Tabela 6. Massa da parte area seca, ndulos, raiz, eficincia e eficcia dos tratamentos para T. adunca, cultivada em vaso com solo............................................................................
.

12 14 15

16

18

Tabela 7. Acmulo de massa da parte area seca, ndulos, raiz, eficincia e eficcia dos tratamentos para M. somnians..................................................................................................

19

xi

1. INTRODUO O despertar da sociedade com as questes ambientais vem trazendo mudanas de comportamento e busca de solues que atenuem as agresses, bem como recuperem o ambiente agredido. O panorama atual busca mecanismos que permitam alcanar o desenvolvimento econmico aliado conservao da natureza. Entre os recursos no renovveis, o setor de minerao destaca-se com um dos mais importantes para a economia nacional e internacional. No entanto, esta atividade quando mal conduzida, compromete o meio ambiente. A atividade de minerao resulta em reas que perdem sua capacidade de resilincia, e com isso necessitam de interveno antrpica, a fim de reverter os processos de degradao. As principais fontes de degradao nas atividades de minerao so: a deposio de resduos ou rejeitos decorrentes do processo de beneficiamento e a deposio do material estril ou inerte, no aproveitvel, proveniente do decapeamento superficial (IBRAM, 1987). Quando se avalia a relao custo/benefcio ambiental, o uso de recursos naturais apresenta a melhor relao quando comparados aos demais mtodos de recuperao de reas degradadas (MACHADO et al., 2003). Neste sentido, a implantao de leguminosas florestais associadas a microrganismos uma alternativa para minimizar as perdas de nutrientes por percolao e eroso, alcanar a auto-suficincia em nitrognio atravs da fixao biolgica e obter mxima reciclagem de nutrientes no ambiente. A simbiose mutualista planta, bactria diazotrficas e fungos micorrzicos, adquirem a capacidade de incorporar C e N ao solo, sendo mais eficientes na absoro de nutrientes, tornando as plantas mais tolerantes aos estresses ambientais (FRANCO & BALIERO, 2000). A capacidade de se associar com bactrias que formam ndulos e fixam N no uma caracterstica comum a todas as leguminosas. A nodulao tem sido relatada na maioria das espcies da sub-famlias Mimosoideae e Papilionoideae, sendo que na subfamlia Caesalpiniodeae, menos expressiva (FARIA & GUEDES, 1999; BARBERI et al, 1998; SPRENT, 2001). Contudo, para o sucesso no uso de recursos naturais para reabilitar reas alteradas pela atividade de minerao, torna-se necessrio um programa de seleo de espcies florestais com potencial de uso na recuperao, bem como estirpes eficientes na fixao biolgica de nitrognio e, desta forma permitir que as plantas hospedeiras se tornem total ou parcialmente independentes da adubao mineral. Este trabalho teve como objetivo selecionar estirpes de rizbio eficientes na fixao biolgica de nitrognio para Desmodium leiocarpum Spreng. G Don, Tephrosia adunca Benth., Mimosa xanthocentra Mart. e Mimosa somnians Willd. e estudar o efeito da adio de trs diferentes formas de nitrognio mineral no crescimento dessas espcies. 2. REVISO DE LITERATURA 2.1. A atividade de minerao Dentre os diversos fatores de degradao no mundo, o superpastejo responsvel por 34,5 % das reas degradadas, o desmatamento por 29,4 %, as atividades agrcolas por 28,1 %, a explorao intensa da vegetao para fins domsticos por 6,8 % e as atividades industriais e bioindustriais (incluindo as atividades de minerao e emprstimo) por 1,2% (OLDEMAN, 1994). A minerao est entre as principais atividades econmicas no Brasil. De acordo com o SUMRIO MINERAL (2008), em 2007, o pas ocupou a 3 posio na produo mundial de

bauxita, contribuindo com 12,7% do total produzido mundialmente e de minrio de ferro com 18,8%. A minerao pode ser considerada uma das atividades mais impactantes ao solo, mas de forma geral no afeta grandes extenses territoriais. A extrao de minrios caracteriza-se pela rigidez locacional do depsito mineral (uma jazida encontra-se onde os condicionantes geolgicos a criaram) e no se podem extrair minrios sem modificar o ambiente (HERRMANN, 2007) Algumas conseqncias deletrias para o ambiente quando as atividades de minerao no so bem conduzidas so citadas por HERRMANN et al. (1987), tais como: eroso, impactos entre a fauna e a flora, poluio da gua, do ar, solo, sonora e visual, alterao do lenol fretico entre outras. A minerao, na sua maioria, envolve uma intensa movimentao e retirada das camadas superficiais e sub-superficiais de solo, retirada da vegetao e gerao de rejeitos e outros substratos (estril) de difcil colonizao (REISSMANN, 1996). A intensidade da degradao depende do volume, do tipo de minerao e dos rejeitos produzidos (REIS, 2006). 2.2. Recuperao das reas degradadas A recuperao de reas degradadas visa fornecer as condies para que o ecossistema possa restabelecer suas funes iniciais mnimas e assim restaurar um novo equilbrio do solo e sua paisagem (DIAS & GRIFFITH, 1988). A recuperao de reas degradadas por minerao regida pela Constituio Federal de 1988, artigo 225, onde estabelece que: aquele que explorar recursos minerais fica obrigado a recuperar o meio ambiente degradado, de acordo com soluo tcnica exigida pelo rgo pblico competente, na forma de lei. O Decreto N 97.632 de 10 de abril de 1989 estabelece a finalidade do Plano de recuperao de rea degradada (PRAD) pela minerao onde: A recuperao dever ter por objetivo o retorno do stio degradado a uma forma de utilizao, de acordo com um plano preestabelecido para o uso do solo, visando obteno de uma estabilidade do meio ambiente. A recuperao do ambiente um processo difcil na medida em que estas reas praticamente no possuem nutrientes essenciais ao crescimento das plantas, alm de possurem caractersticas fsicas que dificultam o crescimento de razes e o estabelecimento de plantas espontneas. De acordo com o IBAMA (1990), a revegetao a prtica mais adequada para se obter a formao de um novo solo, controlar a eroso, evitar a poluio das guas, e se for escolhida a manuteno da vida selvagem como uso futuro do solo, promover o retorno da mesma. Os plantios servem ainda como poleiros, atraindo principalmente aves e morcegos dispersores de frutos e sementes, responsveis pela introduo de novas espcies na rea. 2.3. As Leguminosas A famlia Leguminosae compreende cerca de 20000 espcies espalhadas por todo o mundo com exceo das ilhas Malvinas e Antrtida (SPRENT, 2001). dividida em trs subfamlias: Mimosoideae, Papilionoideae e Caesalpiniodeae, as quais se prestam a uma gama de utilizaes, como produo de gros, forragens, carvo e celulose, madeira, adubao verde e arborizao (SIQUEIRA & FRANCO, 1988). A implantao de Leguminosas florestais uma alternativa para a reabilitao e transformao dos substratos de reas mineradas. Essas espcies podem crescer em solos com limitaes de fertilidade, alm de favorecer uma incorporao relativamente rpida de

quantidades substanciais de matria orgnica e nitrognio ao solo, facilitando o estabelecimento de espcies no fixadoras e mais exigentes nutricionalmente. Isso se deve ao fato de que muitas destas espcies possuem a capacidade de se associar com bactrias que formam ndulos e transformam o N2 do ar em compostos nitrogenados, assimilveis pelos vegetais. Resultados positivos da recuperao com o uso de leguminosas associadas a microrganismos tanto em reas de minerao como em reas degradadas por outras atividades, so encontrados em vrios trabalhos (FRANCO et al, 1996; FARIA et al, 2002; CHADA et al, 2004). 2.4. O nitrognio O nitrognio o elemento mais abundante na atmosfera terrestre. Nas plantas o componente responsvel por vrias reaes alm de fazer parte da estrutura da clorofila, de enzimas e protenas. Cerca de 78% do ar atmosfrico constitudo por esse elemento. Apesar disso, no utilizado de forma direta pelos seres vivos, com exceo de alguns microrganismos, como as bactrias diazotrficas. A associao entre planta e bactria apresenta grande importncia do ponto de vista econmico e ecolgico, podendo dispensar total ou parcialmente o uso de fertilizantes nitrogenados industriais, e com isso viabiliza o plantio das espcies reduzindo os custos com esse insumo (BARBERI et al.,1998). O nitrognio atmosfrico tambm pode ser transformado atravs de processos industriais, como o Haber-Bosch, que produzem os fertilizantes nitrogenados. Entretanto, estes fertilizantes geralmente tm baixo aproveitamento agronmico e podem ser poluentes do solo, gua e atmosfera (MOREIRA & SIQUEIRA, 2002), alm de acelerar a decomposio da matria orgnica, diminuir a capacidade de aerao e reteno de gua, afetando o desenvolvimento das razes. 2.5. A Simbiose e a fixao biolgica de nitrognio A fixao biolgica de nitrognio (FBN) um processo pelo qual o N2 atmosfrico reduzido a NH4+, podendo dessa forma, ser transferido para compostos contendo carbono, a fim de produzir aminocidos e outras substncias orgnicas que contm nitrognio (RAVEN et al., 2001). Segundo FARIA et al. (2003), a fixao biolgica de nitrognio em leguminosas realizada por bactrias vulgarmente chamadas de rizbio, que ao se associarem com as plantas formam estruturas denominadas ndulos. Em troca a planta fornece metablitos ao microrganismo, e tem-se assim uma simbiose mutualista. Diversos fatores influenciam a fixao biolgica de nitrognio em Leguminosas. Tanto os fatores biticos como os abiticos podem atuar sobre a bactria e/ou sobre o hospedeiro afetando a simbiose. De acordo com MOREIRA & SIQUEIRA (2006), os fatores limitantes so: a) caractersticas intrnsecas da espcie hospedeira (capacidade de nodular); b) fatores edficos como o pH e o nitrognio mineral presente no solo; c) clima; e d) populaes de bactrias nativas do solo. As quantidades de N2 fixado e os efeitos da inoculao na produo dependem muito da estirpe de rizbio empregada e da leguminosa cultivada (SIQUEIRA & FRANCO, 1988). A formao de ndulos no representa necessariamente que a estirpe de rizbio esteja fixando nitrognio eficientemente, o que resulta em gasto energtico para a planta. Estirpes de rizbio e espcies de leguminosas podem variar de altamente especficas at altamente promscuas, se so capazes de estabelecer simbiose com poucos parceiros ou com vrios parceiros (MOREIRA & SIQUEIRA, 2002). Dessa forma, a seleo de estirpes

eficientes para cada espcie de leguminosa, visando a produo de inoculantes especficos, um dos componentes fundamentais para o sucesso da tecnologia de uso de espcie arbrea (FARIA, 2000). 2.6. A Metodologia de seleo de estirpes A metodologia para seleo de estirpes para leguminosas florestais segue quatro bases de recomendao. Na base de recomendao I, a seleo feita em condies estreis de laboratrio para testar se a bactria purificada rizbio e se possui a capacidade de nodular a planta testada. Para a base de recomendao II as estirpes so testadas em vasos Leonard em casa de vegetao, utilizando substrato esterilizado. Os testes realizados em casa de vegetao utilizando substrato estril possibilitam comprovar que o isolado realmente rizbio e possvel obter uma preliminar avaliao do potencial de fixao de nitrognio das bactrias. Esta etapa importante, pois se assemelha de certa forma as reas de minerao, onde inexiste rizbios nativos no substrato. A base de recomendao III feita em vasos com solo no estril, avaliando a competitividade das bactrias testadas com as estirpes nativas do solo. Dos resultados obtidos nos experimentos em condies esterilizadas, selecionaram-se as estirpes e testaram-se as mesmas em vasos de solo no estril com o mesmo hospedeiro. Esta etapa verifica a eficincia, eficcia e a competitividade das estirpes inoculadas frente s nativas do solo. A etapa IV consiste no teste em condies de campo e/ou viveiro das estirpes selecionadas na etapa III (FARIA, 2000). 3. MATERIAL E MTODOS 3.1. Experimento em condies estreis- Base de recomendao ll 3.1.1 Montagem do experimento Os experimentos foram realizados em casa de vegetao estril na Embrapa Agrobiologia (Figura 1). As leguminosas estudadas nestas condies foram: D. leiocarpum, T. adunca e M. xanthocentra, todas herbceas. Foram utilizados vasos de Leonard, contendo como substrato areia e vermiculita (2:1,v:v) esterilizados (VINCENT, 1970). O vaso de Leonard formado por duas partes: a superior constituda de uma garrafa invertida e cortada o fundo onde colocado o substrato e outra parte inferior, o copo, que serve como base para a primeira contm a soluo nutritiva para as plantas. O delineamento experimental utilizado foi de blocos ao acaso com trs repeties. Os tratamentos foram: testemunhas nitrogenadas com adio de trs diferentes fontes de nitrognio mineral: NH4NO3, (NH4)2SO4, e KNO3, testemunha absoluta (livre de bactrias e de N mineral) e estirpes de bactrias pertencentes a coleo do laboratrio de leguminosas da Embrapa Agrobiologia. As estirpes testadas foram as de maior eficincia nos experimentos anteriores, de acordo com GONALVES et al., (2007), e as bactrias isoladas de espcies vegetais taxonomicamente prximas espcie alvo. A Tabela 1 apresenta as estirpes utilizadas, seu hospedeiro inicial e sua origem.

Tabela 1. Listagem das estirpes utilizadas nos experimentos, os hospedeiros da qual foram coletados os ndulos e sua regio de origem. BR 1405 BR 2216 BR 281 BR 3405 BR 3432 BR 3450 BR 3454 BR 3460 BR 3461 BR 3462 BR 3463 BR 3466 BR 3467 BR 3469 BR 3470 BR 3473 BR 3474 BR 3477 BR 3485 BR 3505 BR 3506 BR 3509 BR 3514 BR 3522 BR 3523 BR 3608 BR 3609 BR 3610 BR 3611 BR 3617 BR 3624 BR 3628 BR 3630 BR 3631 BR 3632 BR 3634 BR 3804 Arachis hypogaea Desmodium discolor Phaseolus vulgaris Mimosa caesalpiniifolia Mimosa acutistipula Mimosa caesalpiniifolia Mimosa scabrella Mimosa bimucronata Mimosa bimucronata Mimosa flocculosa Mimosa flocculosa Mimosa tenuiflora Mimosa pellita Mimosa camporum Mimosa bimucronata Mimosa somnians Mimosa somnians Mimosa somnians Mimosa sp. Mimosa sp. Mimosa setosa Mimosa pigra Mimosa setosa Mimosa setosa Mimosa hostilis Acacia mearnsii Acacia auriculiformes Acacia auriculiformes Acacia podalyriifolia Acacia mangium Acacia auriculiformes Acacia saligna Acacia angustissima Acacia holocericea Acacia farnesiana Acacia melanoxylon Chamaecrista ensiformis Zimbabwe Embrapa Agrobiologia (RJ) Rio Grande do Sul Embrapa Agrobiologia(RJ) Fortaleza (BA) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Marliria(MG) Linhares (ES) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Porto Trombeta (PA) Minas Gerais Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Campos do Jordo (SP) Embrapa Agrobiologia (RJ) Porto Trombeta (PA) Embrapa Agrobiologia (RJ) Linhares (ES) Linhares (ES) Embrapa Agrobiologia (RJ) Campos do Jordo (SP) Linhares (ES) Linhares (ES) Linhares (ES) Linhares (ES) Linhares (ES) Linhares (ES) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Botucatu (SP) Linhares (ES)

BR 3815 BR 3901 BR 4007 BR 4017 BR 4101 BR 4103 BR 4301 BR 4305 BR 4405 BR 4406 BR 4812 BR 4830 BR 5004 BR 5005 BR 5301 BR 5401 BR 5404 BR 5411 BR 5609 BR 5610 BR 5611 BR 5613 BR 6009 BR 6010 BR 6205 BR 6609 BR 6610 BR 6815 BR 6822 BR 7407 BR 7409 BR 7601 BR 8003 BR 8007 BR 814 BR 8205 BR 824 BR 827 BR 8601

Chamaecrista cathartica Melanoxylum brauna Prosopis juiflora Prosopis chilensis Ormosia nitida Ormosia nitida lliandra surinamensis Calliandra macrocalyx Enterolobium contortisiliquum Enterolobium contortisiliquum Piptadenia stipulacea Piptadenia adiantoides Dimorphandra jorgei Dimorphandra jorgei Tephrosia sinapou Sesbania virgata Sesbania marginata Sesbania exasperata Falcataria moluccana Falcataria moluccana Falcataria moluccana Albizia procera Lonchocarpus costatus Lonchocarpus costatus Albizia saman Inga sessilis Inga semialata Albizia pedicellaris Albizia sp Melilotus officinalis Medicago sativa Trifloium subteraneum Clitoria fairchildiana Clitoria fairchildiana Leucaena leucocephala Poecilanthe parviflora Leucaena leucocephala Leucaena leucocephala Bowdichia virgiloides

Mariana(MG) Embrapa Agrobiologia (RJ) Fortaleza (CE) Embrapa Agrobiologia (RJ) Linhares (ES) Linhares (ES) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) UFC Mariana(MG) Linhares (ES) Linhares (ES) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Linhares (ES) Linhares (ES) Linhares (ES) Embrapa Agrobiologia (RJ) Linhares (ES) Linhares (ES) Embrapa Agrobiologia (RJ) Paulo Murtinho(BA) Mogi Guau(SP) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) USA Rio Grande do Sul Rio Grande do Sul Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Linhares (ES) Linhares (ES) Linhares (ES)

BR 8603 BR 8651 BR 8653 BR 8801 BR 9002 BR 9004 BR 96 SMF 597-2 SMF 597-3 SMF 597-4 SMF 597-5 SMF 597-9 SMF 697-1 SMF 697-11 SMF 697-12 SMF 697-3 SMF 697-5 SMF 697-7 SMF 697-8

Bowdichia virgiloides Pterocarpus indicus Pterocarpus indicus Glircidea sepium Parapiptadenia pterosperma Parapiptadenia pterosperma Glycine max Tephrosia sinapou Tephrosia sinapou Tephrosia sinapou Tephrosia sinapou Tephrosia sinapou Desmodium discolor Desmodium discolor Desmodium discolor Desmodium discolor Desmodium discolor Desmodium discolor Desmodium discolor

Linhares (ES) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Rio Grande do Sul Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ) Embrapa Agrobiologia (RJ)

Figura 1. Casa de vegetao, Embrapa Agrobiologia.

3.1.2. Sementes As sementes foram escarificadas com cido sulfrico concentrado durante 5 minutos, esterilizadas superficialmente em H2O2 (30%) por 5 minutos e em seguida lavadas com gua esterilizada (10x). Posteriormente, foram colocadas em placas de Petri previamente esterilizadas, que continham filtro de papel e algodo umedecidos e levadas a cmara de germinao at a emisso da radcula. Cada vaso de Leonard recebeu quatro plntulas. 3.1.3 Inoculao No preparo do inculo colnias puras de bactrias (Figura 2A) foram repicadas em tubos contendo 10 mL de meio 79 semi-slido (FRED & WAKSMAN, 1928), (Figura 2B). A fim de acelerar a multiplicao, as bactrias ficaram sob agitao horizontal orbital (150 rpm), na temperatura de 27C. Aps o crescimento das colnias, que variou entre 3 e 7 dias, realizou-se a inoculao. No momento do plantio, foi adicionando com uma pipeta de preciso, 1 mL de inculo (1X108 bactrias mL-1) por plntula. Ao fim da inoculao cobriu-se as plntulas com areia estril.

Figura 2A. Isolados crescidos em meio 79 slido; 2B. Isolados crescidos em meio 79 semislido 3.1.4 Conduo do experimento Aps 15 dias foi realizado o desbaste, deixando-se apenas uma plntula por vaso de Leonard. Todos os tratamentos receberam quinzenalmente soluo nutritiva (Anexo A) segundo Norris, citada por GRUZSMAN & DBEREINER (1968). Semanalmente as testemunhas nitrogenadas receberam doses de nitrognio mineral contendo 5mg de N mL-1. Os experimentos foram coletados quando os tratamentos apresentaram diferenciao. A parte area foi seca em estufa para obteno do seu peso . Os ndulos foram retirados manualmente e tambm secos em estufa e posteriormente foram pesados. A partir dos valores de parte area, foi possvel calcular a eficincia seguindo a frmula:

MSPA trat eficincia = MSPA testabs 100

Onde: MPAS trat: massa da parte area seca do tratamento; MPAS testabs: massa da parte area seca da testemunha absoluta; e a eficcia segundo a frmula:

MPAS trat eficcia = MPAS testnitr 100

Onde: MPAS trat: massa da parte area seca do tratamento; MPAS testnitr: massa da parte area seca da testemunha nitrogenada. Para este clculo foram utilizados os valores de rendimento proporcionados pelo tratamento nitrogenado com maior incremento de massa de parte area seca.

3.2. Experimentos em condies no estreis- Base de recomendao lll 3.2.1. Montagem do experimento Os experimentos foram conduzidos em casa de vegetao no estril da Embrapa Agrobiologia, Seropdica, RJ. As leguminosas estudadas foram D. leiocarpum, T. adunca e M. somnians. O delineamento experimental utilizado foi blocos ao acaso, com quatro repeties. Foram utilizados vasos de polietileno contendo 3 kg solo por vaso. O solo utilizado foi Argissolo Vermelho Amarelo procedente do Terrao (rea experimental da Embrapa Agrobiologia). Os tratamentos utilizados foram: testemunha absoluta, testemunha nitrogenada que apresentou maior desenvolvimento em vasos de Leonard e estirpes de bactrias tambm pr-selecionadas no experimento em vasos de Leonard (base de recomendao II). 3.2.2. Sementes As sementes foram escarificadas com cido sulfrico concentrado por 5 minutos, esterilizadas superficialmente em H2O2 (30%), lavadas com gua estril (10X), colocadas em placas de Petri com algodo e papel de filtro umedecido, devidamente esterilizado. Posteriormente foram levadas para germinao, at a emisso da radcula. 3.2.3. Inoculao As bactrias foram cultivadas em meio 79 semi-slido (FRED & WAKSMAN, 1928) sob agitao horizontal orbital (150 rpm) at apresentarem crescimento. A inoculao foi realizada no momento do plantio adicionando 1mL (1X108 bactrias mL-1) por plntula. 3.2.4. Conduo do experimento Semanalmente adicionou-se uma soluo contendo 5 mg mL-1 de N na testemunha nitrogenada. Os experimentos foram coletados quando os tratamentos apresentaram diferenciao. Foi obtida a massa de parte area seca, massa seca de ndulos e massa seca de raiz. Os resultados foram analisados no programa estatstico SISVAR. Para o clculo da eficincia e eficcia utilizaram-se as seguintes equaes: [(MPAS tratamento/MPAS testemunha absoluta) x100] e [(MPAS tratamento/MPAS da testemunha nitrogenada) x100], respectivamente.

4. RESULTADOS E DISCUSSO 4.1.Experimentos em condies esterilizadas- Base de recomendao II 4.1.1. Desmodium leiocarpum O experimento foi coletado aos 104 dias aps o plantio (Figura 3). Das 54 estirpes testadas, 37 proporcionaram nodulao. Os resultados obtidos com relao massa de parte area seca, de ndulos, eficincia e eficcia das estirpes que promoveram a nodulao so apresentados na Tabela 2.

10

Com o total de 495 mg/N adicionado, a testemunha mineral com adio de nitrognio que mais respondeu ao tratamento nitrogenado foi (NH4)2SO4. Para este tratamento foi observado um acmulo de 1,69 gramas de matria seca por planta e este valor foi utilizado para o clculo de eficcia. A quantidade de N aplicado foi inferior ao ideal da espcie, pois o melhor tratamento inoculado teve uma eficincia maior que o tratamento nitrogenado. As estirpes que proporcionaram os maiores acmulos de massa de parte area seca foram as estirpes BR 6610 e BR 2216 apresentando respectivamente desenvolvimento 14 e 18 vezes maior quando comparadas testemunha absoluta. Os resultados apresentados pelas estirpes, BR 7409, BR 5613, BR 281, BR 3467, BR 3405, BR 6610 e BR 2216 apresentaram eficincia e eficcia elevada em condies controladas, o que pode possibilitar a substituio parcial ou total da aplicao de nitrognio mineral para esta espcie em programas de revegetao. Para tanto, novos experimentos devem ser realizados, em diferentes condies. A estirpe BR 2216 isolada de Desmodium sp. apresentou a maior eficincia na FBN para Desmodium leiocarpum, o que pode sugerir algum nvel de especificidade desta bactria para este gnero de planta, uma vez que, resultados similares foram observados para outra espcie do mesmo gnero Desmodium cf. triflorum (LASTE et al., 2008).

Figura 3: Comparao entre os melhores tratamentos, a testemunha nitrogenada e a testemunha absoluta para Desmodium leiocarpum.

11

Tabela 2. Acmulo de massa da parte area seca e de ndulos, eficincia e eficcia dos tratamentos para Desmodium leiocarpum, coletado aos 104 dias aps o plantio.
Tratamento Massa Parte area (g) Ndulos (mg) Eficincia
1

Eficcia2

TN3 KNO3 SMF 697-12 T. absoluta BR 7601 BR 4812 BR 5004 BR 3505 BR 4406 BR 3608 BR 6822 SMF 697-3 BR 3611 BR 96 SMF 697-7 BR 5609 TN1 (NH4)2NO3 BR 5411 BR 1405 BR 3454 BR 4301 BR 3631 BR 6815 BR 8003 BR 8601 BR 8205 BR 6009 BR 3901 SMF 697-11 TN2(NH4)2SO4 BR 3609 BR 3469 BR 6205 SMF 697-8 SMF 697-5 BR 7409 BR 5613 BR 281 BR 3467 BR 3405 BR 6610 BR2216 CV%

0,09 0,18 0,24 0,29 0,39 0,41 0,58 0,61 0,65 0,70 0,79 0,84 0,87 0,89 0,96 0,99 1,00 1,03 1,04 1,10 1,11 1,13 1,14 1,23 1,35 1,36 1,48 1,68 1,69 1,76 1,87 1,98 1,98 2,01 2,16 2,26 2,92 2,92 3,28 3,37 4,43 144,79

b b b b b b b b b b b b b b b b b b b b b b b b b b b a a a a a a a a a a a a a a

0,000 20,01 0,000 10,05 10,15 10,00 20,14 20,33 30,25 20,14 20,47 30,14 50,47 20,44 40,55 0.000 40,86 60,41 40,20 40,26 30,85 30,75 40,89 30,55 30,95 50,45 40,44 70,58 0,000 40,90 90,12 40,70 40,80 50,70 60,65 50,75 80,20 90,50 100,3 110,8 90,45 120,0

a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a

37,5 75 100 120 162 170 241 254 270 291 329 350 362 370 400 412 416 429 433 458 462 470 475 512 562 566 616 700 704 733 779 825 825 837 900 941 1216 1216 1366 1404 1845

5 10 14 17 23 24 34 36 38 41 46 49 51 52 56 58 59 60 61 65 65 66 67 72 79 80 87 99 100 104 110 117 117 118 127 133 172 172 194 199 262

Mdias comparadas pelo teste de Scott Knott (p 0,05) 1.Eficincia: (MSPA trat./MSPA tabs x 100). 2.Eficcia (MSPA trat./MSPA TN x 100).

12

4.1.2 Tephrosia adunca A coleta do experimento ocorreu 121 dias aps o plantio. Neste experimento foram testadas 52 estirpes de bactrias e destas, 35 promoveram a nodulao. Ao final do experimento obtiveram--se a massa de parte area seca e ndulos, eficincia e eficcia das estirpes que promoveram a nodulao (Tabela 3). Na Figura 4 possvel verificar a diferena visual no desenvolvimento da raiz diante dos trs diferentes tratamentos: testemunha absoluta, testemunha nitrogenada e testemunha inoculada de maior MPAS. Os tratamentos que receberam nitrognio mineral (825 mg) no diferiram estatisticamente em si pelo teste Scott Knott 5%, no entanto a fonte de N que proporcionou o maior incremento de massa de parte area seca (MPAS) foi NH4NO3. Das 35 estirpes de bactrias que induziram a nodulao, dez proporcionaram uma eficcia superior a 50%. A estirpe BR 5301 apresentou para Tephrosia adunca a terceira maior eficincia com desenvolvimento 83 vezes maior que a testemunha absoluta. Resultados encontrados por FRANCO et al.,1996 em experimento com Tephrosia sinapou indicam a eficincia desta estirpe em fixar nitrognio neste gnero de leguminosa. As duas estirpes que proporcionaram o maior incremento de MPAS foram BR 3628 e BR 5303 e apresentaram desenvolvimento 110 e 109 vezes maior que a testemunha absoluta. Houve diferena estatstica entre os tratamentos para os parmetros avaliados. A estirpe BR 5303 foi isolada de Tephrosia sinapou e se mostrou muito eficiente na FBN, comprovando a especificidade da estirpe pelo hospedeiro do mesmo gnero a qual foi isolada.

Figura 4. Desenvolvimento da raiz A.tratamento absoluto B.tratamento nitrogenado e C.tratamento inoculado.

13

Tabela 3. Acmulo de massa da parte area seca e de ndulos, eficincia e eficcia dos tratamentos para T. adunca Massa seca (%) Tratamento Parte area (g) Ndulos (mg) Eficincia1 Eficcia2
BR 814 BR 3505 BR 9004 BR 6009 T absoluta BR 3608 BR 3901 SMF 597-3 BR 5401 BR 4007 BR 7407 BR 281 BR 3631 BR 1405 BR 4101 BR 4301 BR 96 BR 3630 BR 3466 BR 5610 TN3 KNO3 BR 3611 SMF 597-2 SMF 597-5 BR 3509 BR 8601 BR 3609 BR 6815 BR 3611 BR 4406 BR 6822 BR 6205 BR 5613 BR 5004 BR 5609 BR 5301 TN1 (NH4NO3) BR 5303 BR 3628 TN2(NH4)2SO4 %CV 0,01 0,02 0,02 0,03 0,04 0,09 0,25 0,31 0,44 0,46 0,62 0,79 0,92 1,05 1,17 1,19 1,27 1,44 1,52 1,59 1,63 1,64 1,68 1,83 1,94 1,95 2,01 2,05 2,17 2,49 2,64 2,84 2,99 3,04 3,31 3,32 4,20 4,36 4,40 4,73 122,20 b b b b b b b b b b b b b b b b b a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 0,630 0,630 2,700 8,770 0,000 2,300 2,670 0,730 3,930 26,90 18,83 35,23 43,13 15,20 16,30 23,37 70,27 60,12 5,670 59,30 0,000 57,20 35,10 25,83 26,70 70,87 86,63 37,03 54,90 42,37 58,70 18,13 63,40 55,53 73,67 87,67 0,000 114,47 133,73 0,000 178,58 b b b b b b b b b b b b a b b b a a b a b a b b b a a b a a a b a a a a b a a b 25 50 50 75 100 225 625 775 1100 1150 1550 1975 2300 2625 2925 2975 3175 3600 3800 3975 4075 4100 4200 4575 4850 4875 5025 5125 5425 6225 6600 7100 7475 7600 8275 8300 10225 10900 11000 10500 0.2 0.4 0.4 0.6 0.8 2 5 6 9 10 13 17 19 22 25 25 27 30 32 34 34 35 35 38 41 41 42 43 46 53 56 60 63 64 70 70 89 92 93 100

Mdias comparadas pelo teste Scott Knott (p=0,05) 1.Eficincia=(MPAS trat / MPAS Tabs)*100 2.Eficcia=(MPAS trat/ MPAS TN)*100

14

4.1.3 Mimosa xanthocentra

O experimento foi coletado aos 69 dias aps o plantio. Foram testadas 49 estirpes de bactrias e destas, apenas 21 proporcionaram ndulos. A estirpe BR 3454 isolada de Mimosa scabrella promoveu o maior incremento de MPAS mostrando-se eficiente na fixao biolgica de nitrognio. Segundo GONALVES et al. (2007), esta estirpe tem boa afinidade com leguminosas da Tribo Mimoseae, mostrando-se eficiente na FBN para M. artemisiana, M. camporun, M. somnians e quando inoculada na prpria M. scabrella. Com adio de 200mg, o tratamento mineral (NH4)2SO4 proporcionou maior MPAS, diferindo estatisticamente dos outros tratamentos (Tabela 4). Para essa espcie sugere-se novo experimento a fim de selecionar novas estirpes, j que os melhores resultados apresentam eficcia apenas de 50%. Tabela 4. Massa da parte area seca e dos ndulos secos, eficincia e eficcia das estirpes que proporcionaram nodulao em M. xanthocentra. Massa seca (%) Tratamento Parte area(g) Ndulos (mg) Eficincia1 Eficcia2
BR 3632 BR 6610 BR 3630 BR 827 BR 3467 TABSOLUTA BR 3610 BR 8801 BR 5610 BR 4305 BR 3624 BR 9002 BR 3463 TN3 (KNO3) BR 3461 BR 9004 BR 3514 BR 3469 BR 3509 BR 3522 BR 3473 BR 3523 BR 3454 TN1 (NH4NO3) TN2 (NH4)2SO4 %CV 0.096 0.114 0.126 0.146 0.148 0.150 0.163 0.163 0.171 0.198 0.233 0.357 0.389 0.399 0.490 0.546 0.553 0.554 0.570 0.663 0.730 0,742 0,913 1,063 1,803 100 c c c c c c c c c c c c c c b b b b b b b b b b a 3,767 1,400 2,033 8,467 1,000 0,000 4,500 2,633 3,967 1,160 2,100 3,600 28,53 0,000 12,43 22,93 21,66 17,80 23,23 27,63 25,33 33,50 31,83 0,000 0,000 164 b b b b b b b b b b b b b b b b b a a a a a a b b 64 76 84 97 98 100 108 108 114 132 155 238 259 266 326 364 368 369 380 442 486 494 608 708 1202 5 6 6 8 8 8 9 9 9 10 12 19 21 22 27 30 30 30 31 36 40 41 50 58 100

Mdias comparadas pelo teste Scott Knott (p=0,05) 1.Eficincia=(MPAS TRAT / MPAS Tabs)*100 2.Eficcia=(MPAS TRAT / MPAS TN)*100

15

4.2. Experimentos em condies no estreis - Base de recomendao lll 4.2.1 Desmodium leiocarpum No ensaio de Desmodium leiocarpum foram testadas 10 estirpes da coleo Embrapa Agrobiologia. Entre as estirpes testadas esto as de maior eficincia e estirpes escolhidas aleatoriamente que foram testadas em etapa anterior, na base de recomendao II. A coleta ocorreu aos 87 DAP (Figura 5). Os parmetros analisados esto demonstrados na Tabela 4. A fonte de N utilizada foi (NH4)2SO4, sendo aplicado 425 mg por vaso. A quantidade de N no foi suficiente pra suprir a espcie na sua capacidade mxima de absoro deste elemento, pois o melhor tratamento inoculado teve sua MPAS superior ao tratamento nitrogenado. A estirpe BR 3467 e a estirpe BR 4406 (Tabela 5) so as mais eficientes na FBN para Desmodium leiocarpum sob base de recomendao III, diferindo do par encontrado sob base de recomendao II. A estirpe BR 4406 foi isolada de Enterolobium contortisiliquum e se mostrou bastante promscua, pois foi muito eficiente para 14 espcies dentro da famlia Leguminosae. A estirpe BR 3467 foi isolada de Mimosa pellita e se mostrou bastante especfica para tribo Mimoseae (GONALVES et al., 2007).

Tabela 5. Acmulo de massa da parte area seca, ndulos, raiz, eficincia e eficcia dos tratamentos para D. leiocarpum, em vaso com solo.
Tratamento MSPA (g/planta) MSN(mg/planta) MSR(g/planta) Eficincia1(%) Eficcia2

BR 1405 BR 8601 BR 3405 BR 6610 Tabsoluta BR 2216 BR 6009 BR 4301 BR 6205 BR 4406 TN (NH4)2SO4 BR 3467 CV%

11,06 11,28 12,26 13,33 13,72 15,01 15,36 15,81 15,88 16,10 16,23 16,37 8,44

c c c b b a a a a a a a

286 327 259 262 258 202 224 199 313 244 187 437 45,21

a a a a a a a a a a a a

5,36 5,54 4,66 5,02 5,08 6,58 3,62 7,15 4,70 5,79 6,75 7,46 30,29

a a a a a a a a a a a a

80 82 89 97 100 109 111 115 115 117 118 119

68 69 76 82 85 92 95 97 98 99 100 101

Mdias comparadas pelo teste Scott Knott (p=0,05) 1.Eficincia=(MPAS Trat / Tabs)*100 2.Eficcia=(MPAS Trat / MPAS TN)*100

16

Figura 5.Competitividade das estirpes inoculadas que proporcionaram bom desenvolvimento em D.leiocarpum, em substrato no esterilizado.

4.2.2 Tephrosia adunca A coleta ocorreu aos 59 dias aps o plantio, quando os tratamentos apresentavam diferena visual em altura (Figura 5). Das 6 estirpes testadas, as duas que proporcionaram o maior acmulo de massa de parte area seca (MPAS) foram BR 5609 e BR 96, mostrando-se eficientes na competio com os rizbios nativos do solo, onde proporcionaram uma eficincia de 142 e 138% e eficcia de 84 e 82% respectivamente (Tabela 6). A estirpe de bactria BR 3628 proporcionou a menor eficincia e menor acmulo de massa de parte area seca, este resultado diferiu do experimento sob condio estril, onde esta proporcionou a maior eficincia e maior acmulo de massa de parte area seca (GONALVES et al. 2008). Dentre as seis estirpes testadas somente a BR 3628 proporcionou eficincia e eficcia inferior a 55%, e todas as demais estirpes BR 3609, BR 3630, BR 5303, BR 96 e BR 5609 proporcionaram uma eficincia e eficcia superior a 60%. A estirpe BR 5609 isolada de Falcataria moluccana mostrou ser a mais eficiente para Tephrosia adunca, o mesmo foi observado para Tephrosia sinapou sob condies estreis (FARIA & FRANCO, 2002). Para os parmetros avaliados MPAS, MNS e MRS no houve diferena estatstica significativa com o teste utilizado, no entanto, a eficincia e a eficcia apresentada pelas estirpes puderam ser claramente observadas. A aplicao 350mg de nitrognio mineral reduziu, mas no impediu a nodulao pelas bactrias nativas do solo, o que indica que houve maior demanda da planta por nitrognio, estimulando a nodulao.

17

Tabela 6. Acmulo de massa da parte area seca, de ndulos, raiz, eficincia e eficcia dos tratamentos para T. adunca, cultivada em vaso com solo.
Tratamento MPAS (g/planta) MSN (mg/planta) MSR (g/planta) Eficincia1 (%) Eficcia2 (%)

BR 3628 Tabsoluta BR3609 BR 3630 BR 5303 BR 96 BR 5609 TN (NH4NO3) CV%

1,25 2,35 2,40 2,65 2,74 3,25 3,33 3,95 41,00

a a a a a a a a

5,00 18,9 11,1 1,90 1,60 6,80 39,5 0,800 134

b b b b b b a b

0,26 0,56 0,63 0,56 0,52 0,36 0,67 0,46 51,2

a a a a a a a a

53 100 102 113 117 138 142 168

31 59 61 67 69 82 84 100

Mdias comparadas pelo teste Scott Knott (p=0,05) 1.Eficincia=(MPAS Trat / MPAS Tabs)*100 2.Eficcia=(MPAS Trat / MPAS TN)*100

BR 5609

TN

Tabs

BR 5609

TN

TABS

Figura 5. Tratamento inoculado, testemunha nitrogenada e testemunha absoluta de Tephrosia adunca em vaso de solo no estril.

4.2.3 Mimosa somnians Este experimento teve durao de 100 dias. Os resultados encontrados no experimento esto demonstrados na Tabela 7. A quantidade de ndulos encontrados na testemunha absoluta sem inoculante e sem nitrognio mineral indica a presena de estirpes nativas no solo. Entretanto, este tratamento apesar de no diferir estatisticamente dos outros resultados, apresentou a menor massa de

18

parte area seca (MPAS), mostrando que as estirpes nativas so menos eficiente que as estirpes introduzidas. A fonte de nitrognio mineral aplicada foi (NH4)2SO4, onde, a dose de 725mg resultou na maior eficincia entre os tratamentos. Esta quantidade de nitrognio dispensou a formao de ndulos e fixao biolgica de nitrognio pelos microrganismos. As estirpes BR 3473 e BR 3474 e a estirpe BR 3477 isolada de Mimosa sp., selecionadas em experimento em condies estreis (dados no publicados), confirmaram sua eficincia em vaso de solo, sob condies no estreis. Tabela 7. Acmulo de massa da parte area seca, ndulos, raiz, eficincia e eficcia dos tratamentos para M. somnians.
Tratamento MSPA(g/planta) MSN(mg/planta) MSR (g/planta) Eficincia1 (%) Eficcia2 (%)

Tabsoluta BR 3485 BR 3464 BR 3470 BR 3473 BR 3474 BR 3477 TN2 (NH4)2SO4 CV%

4,18 4,61 4,70 4,71 5,74 6,43 6,97 7,46 34,86

a a a a a a a a

45,7 18,00 50,00 44,00 102,0 39,70 38,00 0,000 124,36

a a a a a a a a

4,98 2,89 3,17 3,98 3,10 6,82 4,95 9,61 77,46

a a a a a a a a

100 110 112 112 137 153 166 178

56 61 63 63 76 86 93 100

Mdias comparadas pelo teste Scott Knott (p=0,05) 1.Eficincia=(MPAS Trat / MPAS Tabs)*100 2.Eficcia=(MPAS Trat / MPAS TN)*100

Os resultados deste trabalho evidenciam as possibilidades de seleo de pares simbiontes eficientes quanto ao processo de fixao biolgica de nitrognio, que um passo fundamental para estabelecimento de espcies de plantas em reas degradadas.

5. CONCLUSO As estirpes selecionadas com maior eficincia na fixao biolgica de nitrognio em condies estreis foram BR 2216 e BR 6610 para D. leiocarpum, BR 3628 e BR 5303 para T. adunca e BR 3454 e BR 3523 para M. xanthocentra. Nos experimentos em condies no esterilizadas as estirpes selecionadas para D. leiocarpum foram BR 3467 e BR 4406, para T. adunca BR 5609 e BR 96 e para M. somnians as estirpes BR 3477 e BR 3474. Nos experimentos em condies estreis a fonte de nitrognio mineral que proporcionou o maior desenvolvimento em D. leiocarpum foi (NH4)2SO4, em T. adunca foi NH4NO3 e em M.
xanthocentra (NH4)2SO4.

19

6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS BARBERI, A.; CARNEIRO, M. A. C.; MOREIRA, F. M. S.; SIQUEIRA, J.O. Nodulao em leguminosas florestais em viveiros no sul de Minas Gerais. Revista cerne, v.4, n.1, p. 145-153, 1998. CHADA, S. de S.; CAMPELLO, E.F.C.; FARIA, S.M. de. Sucesso vegetal em uma encosta reflorestada com leguminosas arbreas em Angra dos Reis, RJ. Revista rvore, v.28, n.6, p.801-809, 2004. DIAS, L.E. & GRIFFITH, J.J. Conceituao e caracterizao de reas de degradadas. In: DIAS, L. E.; MELLO, J. W. V. (Eds.). Recuperao de reas Degradadas. Viosa: UFV/ DS/ SOBRADE, p. 1-7. 1998. FARIA, S.M. de. & GUEDES, R.E. Obteno de estirpes de rizbio eficientes na fixao biolgica de nitrognio para espcies florestais (aproximao 1999). EmbrapaCNPAB; p.2,1999. FARIA, S. M. de. Obteno de estirpes de rizbio eficientes na fixao de nitrognio para espcies florestais (aproximao 2000). Seropdica: Embrapa Agrobiologia 2000, 10 p. (Embrapa Agrobiologia. Documentos, 116), 2000. FARIA, S. M. de. & FRANCO, A.A. Identificao de bactrias eficientes na fixao biolgica de nitrognio para espcies leguminosas arbreas. Seropdica: Embrapa Agrobiologia, 16.p (Embrapa Agrobiologia. Documento, 158), 2002. FARIA, S. M. de.; MOREIRA, J. F.; CORDEIRO, F. C.; MACHADO, R. L. Obteno de estirpes de rizbio para leguminosas florestais (aproximao de 2004). Seropdica: Embrapa Agrobiologia, 5 p. (Embrapa Agrobiologia. Comunicado tcnico 61), 2003. FARIA, S. M. de.; SILVA, M.G.; GRAIG, J. e DIAS, S. L.; LIMA, H. C.; NARA, M. Revegetao com espcies arbreas fixadoras de nitrognio em taludes de explorao de ferro na Samarco Mineraes Mariana MG. In: gua e biodiversidade. Palestras... Belo Horizonte 521-522.p. SIMPSIO NACIONAL SOBRE RECUPERAO DE REAS DEGRADADAS, 5,. Belo Horizonte, MG. 2002 FRANCO, A. A. & BALIERO, F. de C. The Role of biological nitrogen fixation in land reclamation, agroecology and sustainability of tropical agriculture. In: ROCHAMIRANDA, C.E., (Ed.). Transition to global sustainability: The contribution of brazilian science. Rio de Janeiro: Academia Brasileira de Cincias, 209-234p. 2000. FRANCO, A. A.; CAMPELLO, E.F.C.; DIAS, L. E.; FARIA, S. M. de. Uso de leguminosas associadas a microrganismos na revegetao de reas de minerao de bauxita em Porto Trombetas-Pa. Itagua: EMBRAPA-CNPAB; 71p. (EMBRAPA-CNPAB. Documentos, 27). 1996.

20

FRANCO, A. A.; DIAS, L. E.; FARIA, S. M. de; CAMPELLO, E. F. C.; SILVA, E. M. R. Uso de leguminosas florestais noduladas e micorrizadas como agentes de recuperao e manuteno da vida do solo: Um modelo tecnolgico. In: ESTEVES, F. de A. (Coord.) Estrutura, funcionamento e manejo de ecossistemas brasileiros. Rio de Janeiro, 459-467p. (Oecologia Brasilienses, v. 1),UFRJ, 1995. FRED, E. B. & WAKSMAN, S. A. Laboratory manual of general microbiology with special reference to the microrganisms of the soil. New York: Mcgraw-Hill Book Company, New York, 145p., 1928. GONALVES, F.S.; LASTE, K.C.D.; UCHAS, B.S.; BORGES, W.L.; FARIA, S.M. de. Especificidade hospedeira de estirpes de rizbio dentro da famlia Leguminosae. In XVII Jornada de Iniciao Cientfica da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. Seropdica, RJ, 2007. GRUZMAN, I. & DEBEREINER, J. Reunio Latino Americana sobre Inoculantes para Leguminosas. Anais... Porto Alegre: UFRGS, p. 84,1968. HERMANN, H. Recuperao scio-ambiental de reas mineradas. IN: ALBA,J.M.F. Recuperao de reas mineradas a viso dos especialistas brasileiros. Pelotas, RS: Embrapa Clima Temperado, 2007. p. 87-97. IBAMA. Manual de Recuperao de reas Degradadas pela Minerao: Tcnicas de Revegetao. Braslia: IBAMA, 96 p. 1990. INSTITUTO BRASILEIRO DE MINERAO - IBRAM. Minerao e Meio Ambiente. Belo Horizonte:IBRAM, 56p. 1987. LASTE, K.C.D.; GONALVES, F.S.; FARIA, S. M. de. Estirpes de rizbios eficientes na fixao biolgica de nitrognio em simbiose com Desmodium cf. triflorum. In: FertBio. Londrina-PR. MACHADO, R. L.; MOREIRA, J. F.; FARIA, S. M. de. Seleo de estirpes de rizbio para leguminosas com potencial de uso na recuperao de reas degradadas. In; Congresso Brasileiro de Cincia do Solo, 29., 2003, Ribeiro Preto. Resumos... Botucatu: SBCS, 2003. 4 p. CD ROM. MILAN, P. A., RITTER, W. & DALLAGNOL, M. Seleo de leguminosas forrageiras tolerantes a alumnio e eficientes na utilizao de fsforo. Pesquisa agropecuria brasileira, Braslia, 26(1): 119-124, janeiro de 1999. MOREIRA, F.M.S. & SIQUEIRA, J.O. Microbiologia e bioqumica do solo. 1 ed., Editora UFLA. 626p. 2002. MOREIRA, F.M.S. & SIQUEIRA, O. S. Microbiologia e Bioqumica do Solo. 2 ed. Atual e Aplicada, Lavras, Ed. UFLA, p.729, 2006.

21

OLDEMAN, L.R. The global extent of soil de gradation. In: Soil Resilience and Sustainable Land Use. GREENLAND, D. J. & SZABOCLS, I (Eds.) Cab International, Wallingford, VK, p. 99-118. 1994. RAVEN, P.; EVETR, R.R; EICHHORN,S.E. Biologia Vegetal. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p.307-311. 2001. REIS, L. L. Monitoramento da recuperao ambiental de reas de mineraode bauxita da Floresta Nacional de Sarac-Taquera, Porto Trombetas(PA)-Tese (doutorado), UFRRJ, 159 p.,2006. REISSMANN, C.B. Contribuio do Pinus taeda na recuperao de solos degradados em reas de emprstimos/ um estudo de caso com horizontes orgnicos. In: ll Curso de Atualizao-Recuperao de reas Degradadas. Curitiba, Paran. Apostila, 135-140 p. 1996. SPRENT, J. I. Nodulation in legumes. Kew: Royal Botanic Gardens, 2001. SIQUEIRA, J. O. & FRANCO, A. A. Biotecnologia do solo: Fundamentos e perspectivas. Braslia: MEC/ESAL/FAEPE/ABEAS, 236 p, 1988. SUMRIO MINERAL. Sumrio em:<http://www.dnpm.gov.br> Mineral 2008 -DNPM. Disponvel

VINCENT, J. M. A Manual for de pratical study of root-nodule bactria. london: international biological programme HANDBOOK, 15, 1970.

22

ANEXO A Soluo para vasos de Leonard, segundo Norris (modificada). Utilizada para florestais, dissolvida em 40L de gua : 1)KCL ...................................................................................................................5,96g 2)K2HPO4 ..............................................................................................................2,00g 3)KH2PO4 ..............................................................................................................4,00g 4)CASO4.2H2O ...................................................................................................13,76g 5)MgSO4.7H2O....................................................................................................19,72g 6)CuSO4.5H2O ......................................................................................................0,15g ZnSO4.7H2O .........................................................................................................0,44g MnSO42H2O .........................................................................................................0,40g (NH4)6Mo7O24.4H20 .............................................................................................0,02g H3BO3....................................................................................................................1,40g 7)FeEDTA..............................................................................................................1,32g 8)cido ctrico..........................................................................................................0,2g Completar o volume para 1000 mL com gua destilada. Esterilizar.

23