Biofilme

A chave para compreender e controlar o crescimento bacterial em Sistemas de gua Potvel Automatizados
Segunda Edio por Paula H. Dreeszen Junho 2003

Definies
Adsoro processo fsico que ocorre quando uma substncia adere superfcie de uma outra. Adsoro um processo fsico que ocorre sem reao qumica. Aerbico requere ar ou oxignio livre para se desenvolver. Anaerbico se desenvolve sem ar ou oxignio livre. AWS Automated Watering System sistema de gua automatizado. Camada limtrofe a zona laminar ou quieta na parede da tubulao onde a velocidade de vazo cai para zero. Carga de superfcie o balano entre os nmeros de cargas positivas e negativas expostas a uma superfcie slida. Chemotaxis movimento de organismos em resposta ao gradiente qumico. Energia livre de superfcie o grau de hidrofobia ou hidrofilia de uma superfcie. Flagella plural de flagellum. Algumas bactrias possuem mais que um flagellum. Flagellum anexo filamentoso longo que impulsiona a bactria; significado literal chicote; veja Figura 3. Glycocalyx substncias polimricas extracelulares (polmeros pegajosos) que a bactria excreta para aderir s superfcies slidas e alojar nutrientes. Hidroflico tem a caracterstica de absorver gua. Hidrofbico tem a caracterstica de repelir a gua (exemplo: Teflon um material hidrofbico.) Motil movimento independente da gua. Oligotrophs bactrias e outros organismos capazes de se desenvolver em ambientes com limitao de nutrientes. Plantnica microrganismos de livre flutuao cujos movimentos so controlados pelo movimento da gua (no agregados s superfcies). RA Roughness Average media de rugosidade ou o desvio da mdia aritmtica da linha de centro de uma superfcie. RDS Room Distribution System sistema de distribuio de sala, parte de um sistema de gua automatizado. RMS Root Mean Square a raz quadrada mdia dos desvios da linha de centro de uma superfcie. Sssil agregada s superfcies slidas (oposto de plantnicas). Vazo laminar movimento de fluido em camadas paralelas suaves, contnuas, no tubulentas que no se misturam entre si.

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Introduo
O que so biofilmes?
Mais propriamente conhecida como biofilme, colnias de lama prosperam em todo lugar que h gua na cozinha, nas lentes de contato, revestimento de tripas animais. Quando a propagao urbana extensiva, biofilmes podem ser vistos a olho nu, cobrindo o interior de tubulaes de gua ou deslizamento oscilante e o verde do chumbo. (Coghlan, 1996). Simplesmente colocado, biofilmes so uma coleo de microorganismos cercados pela lama que secretam, agregados tanto em uma superfcie inerte como viva. Voc j est familiarizado com alguns biofilmes: a placa em seu dente, o lodo escorregadio em pedras de rios, e o filme como gel dentro de vasos de flores que ficaram durante uma semana. O biofilme existe em todo lugar que a superfcie entra em contato com gua. Mais que 99 por cento de toda bactria viva em comunidades de biofilme. Algumas so benficas. Plantas de tratamento de esgoto, por exemplo, confiam no biofilme para remover contaminantes da gua. Mas biofilmes podem tambm causar problemas corroendo tubulaes, obstruindo filtros de gua, causando rejeio de implantes mdicos, e bactrias perigosas que contaminam gua potvel.

Por que aprender sobre biofilmes?

Microbiologistas tradicionalmente focaram no crescimento de bactria flutuante em culturas de laboratrio; ainda eles recentemente perceberam que no mundo natural a maioria das bactrias se agregam como biofilmes, uma forma na qual elas se comportam de maneira bem diferente. Como resultado, biofilmes so atualmente um dos tpicos mais quentes na microbiologia (Potera, 1996). Como em qualquer sistema de gua, 99 por cento das bactrias em um sistema automatizado de gua so provveis de estar em biofilmes agregados s superfcies internas. Biofilmes so a fonte de muitas bactrias de livre flutuao em gua potvel, algumas das quais podem causar infeco e doena em animais de laboratrio. Uma bactria comum de biofilme, Pseudomonas aeruginosa, um patognico secundrio que pode infectar animais com sistema imunolgico diminudo. Alm de ser um reservatrio de bactrias que podem afetar a sade animal, os biofilmes podem tambm causar corroso em sistemas de tubulao de ao inoxidvel. Para projetar e operar sistemas de gua automatizados que entreguem a qualidade bacterial exigida pelos nossos clientes, ns temos que compreender como biofilmes se desenvolvem, alguns dos problemas que eles podem causar, e como eles podem ser controlados. Compreender a bactria em biofilmes um dos passos em direo para o futuro. Estamos atualmente obedecendo as maiores exigncias de qualidade de gua na demanda microbiolgica de nossos clientes fornecendo gua clorada de osmose reversa e mantendo a qualidade da gua por lavagem e sanitizao. (Refere a Estudo Microbiolgico de Sistemas de gua Automatizados Microbiological Survey of Automated Watering Systems, D209, Dreeszen 1996.) Mas o que fazer se o uso de cloro em gua potvel de animais proibido? Ou o que fazer se as exigncias de qualidade da gua tornam se cada vez mais restritas com o uso de novos animais especializados?

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 claro, voc deve apenas querer aprender sobre biofilmes para admirar a capacidade da bactria de se adaptar ao seu ambiente e escapar s tentativas de elimina-la.

Fases no Desenvolvimento do Biofilme

No instante que uma tubulao preenchida com gua, um biofilme j comea a se formar. O desenvolvimento do biofilme ocorre nas seguintes fases.

Condio da superfcie
As primeiras substncias associadas com a superfcie no so bactrias mas traos orgnicos. Quase imediatamente aps a superfcie da tubulao limpa entrar em contato com gua, uma camada orgnica se deposita na interface gua/slido (Mittelman 1985). Estes orgnicos so ditos formarem uma camada de condicionamento que neutraliza excessiva carga de superfcie e energia livre de superfcie que pode prevenir uma clula de bactria de se aproximar o bastante para comear a agregar. Alm disso, as molculas orgnicas adsorvidas sempre servem como uma fonte de nutrientes para bactria.

Adeso da bactria pioneira

Em uma tubulao de vazo de gua, algumas das bactrias plantnicas (livre flutuao) abordaro a parede da tubulao e se entranham dentro da camada limtrofe, a zona inativa da parede do tubo onde a velocidade de vazo baixa para zero. Algumas destas clulas se lanaro e adsorvero superfcie por algum tempo, e ento se desorvero. Isto chamado adsoro reversvel. Esta agregao inicial baseada em atrao eletrosttica e foras fsicas, sem qualquer agregao qumica. Algumas das clulas adsorvidas reversivelmente comeam a fazer preparaes para uma estadia prolongada formando estruturas que podem aderir permanentemente a clula superfcie. Estas clulas se tornam irreversivelmente adsorvidas.

Glicoclix ou formao de lodo

As bactrias do biofilme excretam substncias polimricas extracelulares, ou polmeros aderentes, que mantm o biofilme junto a si e consolida-se na parede da tubulao. Alm disso, estes polmeros alojam nutrientes escassos e protegem as bactrias dos biocidas. De acordo com Mittelman (1985), Agregao mediada por polmeros extracelulares que se estendem para fora da parede da clula bacterial (bem parecido com a estrutura de uma teia de aranha). Este material polimrico, ou glicoclix, consiste de grupos polissacardeos neutros e alterados que no s facilitam agregao mas tambm agem como um sistema de troca inica para alojar e concentrar

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traos de nutrientes da gua externa. O glicoclix tambm age como um revestimento protetivo para as clulas agregadas que abranda os efeitos de biocidas e outras substncias txicas.

Fig. 1 Adsoro de molculas orgnicas em uma superfcie limpa forma um filme de condicionamento (Characklis 1990)

TRANSPORTE ADVETIVO

ADSORO REVERSIVEL

DESSORO

ADSORO IRREVERSIVEL

Fig. 2 Transporte de clulas de bactria para a superfcie condicionada, adsoro, dessoro, e adsoro irreversvel (Characklis 1990)

Flagelo

Membrana celular

Material polimrico extracelular Estruturas da parede celular Contedo intracelular

Fig. 3 Bactrias selvagens so clulas peludas com polmeros extracelulares que aderem superfcies (Mittelman 1985)

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Quando se acumulam os nutrientes, as clulas pioneiras comeam a se reproduzir. As clulas irms produzem ento seu prprio glicoclix, aumentando largamente o volume da superfcie de troca inica. Logo uma prspera colnia de bactrias estabelecida (Mayette 1992). Em um biofilme maduro, a maior parte do volume ocupado pela matriz de glicoclix livremente organizada (75-95%) do que por clulas bacteriais (5-25%) (Geesey 1994). Porque a matriz de glicoclix retm muita gua, uma superfcie coberta por biofilme gelatinosa e escorregadia. O biofilme construdo de micrbios e uma teia de polmeros extracelulares.

Colonizadores Secundrios
Assim como molculas de nutrientes alojadas, a rede de glicoclix tambm armazena outros tipos de clulas microbiais atravs de restrio fsica e interao eletrosttica. Estes colonizadores secundrios metabolizam resduos dos colonizadores primrios bem como produzem seus prprios resduos que outras clulas ento utilizam na verdade. De acordo com Borenstein (1994), estas outras bactrias e fungos se associam superfcie seguindo a colonizao pelas espcies pioneiras por uma questo de dias.

Biofilme de funes completas

O biofilme maduro, de funes completas como um tecido vivo na superfcie da tubulao. uma comunidade metabolicamente cooperativa e complexa composta de diferentes espcies cada uma vivendo em um micronicho caracterstico. Os biofilmes so ainda considerados possuidores de sistemas circulatrios primitivos. Biofilmes maduros so imaginariamente descritos no artigo Cidade de Lodo: Espcies diferentes vivem lado a lado em cidades de lodo, ajudando umas s outras para utilizar suprimentos de alimento e para resistir contra antibiticos atravs de interaes vizinhas. Resduo txico produzido por uma espcie pode ser devorada com fome por seu vizinho. E por associao de suas reservas bioqumicas para construir uma cidade de lodo comum, vrias espcies de bactrias, cada uma munida com diferentes enzimas, podem quebrar o suprimento de alimento que nenhuma espcie isolada poderia digerir sozinha. Os biofilmes so permeados em todos os nveis por uma rede de canais atravs dos quais gua, resduos bacteriais, nutrientes, enzimas, metablitos e oxignio viajam de uma lado para outro. Gradientes de reagentes e ons entre microzonas oferecem a fora para manobrar as substncias em volta do biofilme. (Coghlan 1996)

Biofilmes crescem e se espalham

Um biofilme pode se espalhar em sua prpria velocidade pela diviso normal de clula e tambm liberar periodicamente novas clulas pioneiras para colonizar sees mais baixas da tubulao. Ao filme crescer para uma espessura que permita se estender atravs das camadas limtrofes nas zonas de velocidade maior e vazo mais turbulenta, algumas clulas sero descartadas. De acordo com Mayette (1992), Estas clulas pioneiras posteriores tem uma vida maior do que aquelas precedentes j que o filme inicial liberar resduos no fluxo que podem servir tanto como

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revestimento orgnico inicial para sees no colonizadas de tubulao no fluxo de baixo como substncias nutrientes para outros tipos de clulas.

Fig. 4 Bactrias e outros microrganismos desenvolvem colnias cooperativas ou consrcio dentro do biofilme. Um biofilme anaerbico pode se desenvolver embaixo da camada aerbica. A espessura do biofilme alcanar um equilbrio quando a gua corrente destacar clulas se estendendo no fluxo turbulento. (Borenstein 1994)

Qual a velocidade do biofilme se desenvolver?

De acordo com Mittelman (1985), o desenvolvimento de um biofilme maduro pode levar algumas horas at algumas semanas, dependendo do sistema. Pseudomonas aeruginosa uma bactria pioneira comum e usada em uma srie de pesquisas de biofilme. Em um experimento (Vanhaecke 1990, veja resumo do teste pg 5), pesquisas verificaram que clulas Pseudomonas aderem ao ao inoxidvel, mesmo em superfcies eletropolidas, dentro de 30 segundos de exposio.
FLUIDO PRINCIPAL

BIOFILME AERBICO

BIOFILME ANAERBICO microcolnia

PAREDE DA TUBULAO
Fig. 5 Biofilme periodicamente libera clulas pioneiras

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Benefcios Bactria: alimento e proteo

A associao de bactrias com a superfcie e o desenvolvimento de um biofilme pode ser visto como um mecanismo de sobrevivncia. A obteno de nutrientes e a proteo contra biocidas beneficiam as bactrias.

Alimento
gua potvel, especialmente sistemas de gua de alta pureza, so ambientes limitadores de nutrientes, mas mesmo concentraes muito baixas de nutrientes so suficientes para permitir crescimento microbial e reproduo. Bactrias e outros organismos capazes de se desenvolver em ambientes limitadores de nutrientes so chamados oligotrophs. Bactrias desenvolveram meios de achar e aderir a superfcies para aumentar as chances de encontrar nutrientes. Que vantagens so oferecidas pela adeso s superfcies e desenvolvimento de biofilme? 1. Traos orgnicos se concentraro nas superfcies. 2. Alm disso, polmeros extracelulares concentraro nutrientes do volume de gua. 3. Colonizadores secundrios utilizam os produtos de descarte de seus vizinhos. 4. Juntando seus recursos bioqumicos, vrias espcies de bactrias, cada uma com diferentes enzimas, podem quebrar o suprimento de alimento que nenhuma espcie simples pode digerir sozinha. Que meios as bactrias desenvolveram para encontrar e aderir s superfcies? 1. Motilidade e Chemotaxis Bactrias motis podem nadar ao longo de um gradiente de concentrao qumica em direo a uma maior concentrao de um nutriente. O movimento de organismos em resposta ao gradiente qumico (nutriente) chamado chemotaxis. Pseudomonas aueruginosa uma das bactrias motis que usa um flagellum para se mover em direo a maiores concentraes de nutrientes na aprede da tubulao. No estudo da adeso de Pseudomonas s superfcies de ao inoxidvel (Stanley 1983), pesquisadores colocaram clulas em um misturador para remover a flagella. Eles descobriram que a velocidade de adeso da clula diminuiu ao menos 90% quando as flagellas foram removidas. 2. Parede de clula hidrofbica Muitos organismos ao se depararem com as condies de inanio encontradas em sistemas de gua purificada, respondem alterando sua estrutura de parede celular para aumentar sua afinidade superfcie. Alterando a composio da protena e lipdio da membrana externa, a carga e a hidrofobicidade pode ser mudada. A parede da clula se torna hidrofbica. Tais clulas hidrofbicas querem nada mais que encontrar seu caminho de sada da coluna de gua. Uma vez na camada limtrofe (a zona morta na parede da tubulao onde a velocidade de vazo cai para zero), elas so atradas pela superfcie da tubulao(Mayette 1992).

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3. Produo de polmero extracelular Uma vez ba superfcie, as clulas de bactria se ancoram na superfcie com seus polmeros aderentes. Corte simples (fluxo) no mais adequado para remover estas clulas (Veja seo de velocidade de vazo, pgina 8).

Proteo dos desinfetantes

Uma vez os microorganismos agregados, eles devem ser capazes de resistir a processos de desinfeco normais. Bactrias de biofilme demonstram uma resistncia a biocidas que pode ser considerada chocante. (LeChevallier 1988). Este pesquisador demonstrou que a bactria associada ao biofilme pode ser 150-3000 vezes mais resistente ao cloro livre e 2-100 vezes mais resistente monocloramina do que bactrias de livre flutuao. Um trabalho de outro pesquisador (Anderson 1990, veja resumo abaixo) sugere que Pseudomonas tem um inteligente modo de iludir seus atacantes: Ela secreta um lodo aderente que cresce no interior da tubulao. Um germicida passado atravs do sistema de distribuio de gua mata micrbios de livre flutuao, mas no pode tocar na bactria embutida no biofilme viscoso. Quando a bactria est dentro de um filme, elas so muito resistentes aos biocidas. Na verdade, elas sempre produzem mais exopolmeros aps o tratamento com biocidas para se protegerem (Borenstein 1994).

Resumo do Teste: Pseudomonas Desinfeco e Redesenvolvimento em Tubulaes

Roger Anderson e seus colegas do Centro de Controle de Doenas com base em Atlanta pegaram tubulaes de plstico e preencheram-nas com gua contaminada com dois tipos de Pseudomonas. Aps a incubao da bactria por oito semanas, os cientistas retiraram a gua infestada e mergulharam as tubulaes em reagentes eliminadores de germes, incluindo cloro, por sete dias. Eles ento preencheram novamente as tubulaes com gua esterilizada e periodicamente retiraram amostras da gua limpa. A equipe relatou que ambos os tipos sobreviveram nas tubulaes quimicamente tratadas e l restabeleceram colnias.

Como o biofilme fornece proteo contra os desinfetantes?

1. Escudo protetivo Com o objetivo de destruir a clula responsvel pela formao do biofilme, o desinfetante deve primeiro reagir com a rede de polissacardeos circundante. As clulas sozinhas no so

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realmente mais resistentes, apenas esto circundadas com um escudo protetivo. O poder oxidante do desinfetante usado antes dele poder alcanar a clula. 2. Limitaes de difuso Quando clulas so agregadas a uma parede de tubulao, o fornecimento de desinfetante limitado pela proporo de difuso do composto ao longo da camada limtrofe e atravs do filme. Necessita-se uma concentrao maior alm de um perodo de contato mais longo para o desinfetante atingir as clulas de bactrias em um biofilme se comparado aos organismos de livre flutuao.

Novas descobertas
Pesquisa recente do Centro para Engenharia do Biofilme derrubou algumas suposies antigas sobre bactrias e biofilmes.

Centro para Engenharia do Biofilme O Centro para Engenharia do Biofilme foi estabelecida na Universidade do Estado de Montana, Bozeman, MT, em 1990 pelo programa dos Centros de Pesquisa de Engenharia da Fundao de Cincia Nacional (National Science Foundation Engineering Research Centers). Sua misso avanar o conhecimento bsico e educao exigida para compreender, controlar e explorar os processos de biofilme. Visite seu site em: www.erc.montana.edu

Estrutura do biofilme
No passado, microbiologistas assumiram que biofilmes continham grumos desordenados de bactrias localizadas em nenhuma estrutura ou modelo particular. Novas tcnicas para aumentar biofilmes sem destruir a estrutura gelatinosa permitiram aos pesquisadores descobrir a complexa estrutura de biofilmes como se visse uma cidade de um satlite. Esta estrutura descrita no artigo recente Slime City (Cidade de Lodo Coghlan 1996): Na maioria dos casos, a base do biofilme uma camada densa e opaca de lodo de 5 a 10 micrometros (197-394 micropolegadas) de espessura. uma mistura pegajosa de polissacardeos, outras substncias polimricas e gua, todos produzidos pelas bactrias. Subindo muito 100 a 200 micrometros (3940-7840 micropolegadas) esto colnias de bactrias em formato de cogumelos ou cones. Acima nvel de rua torna-se mais lodoso, desta vez de uma consistncia varivel e mais mascarada com gua com uma rede de canais atravs do qual gua, lixo bacterial, nutrientes, enzimas, metablitos, e oxignio viajam.

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Fig. 6 Modelo conceitual da arquitetura de um biofilme de espcie isolada baseado em observaes diretas usando um microscpio confocal. Algumas microcolnias so estruturas cnicas simples, enquanto outras tem o formato de cogumelos. gua corrente (setas) fluem em canais entre as colnias carregando nutrientes e resduo. (Costerton 1995)

NOTA: Em um sistema de gua potvel automatizado que se passa o fluxo regularmente, a espessura do biofilme deve ser menos que 200 microns. Veja seo na espessura do biofilme e velocidade de vazo, pgina 11.

Bioqumica das bactrias do biofilme

Pesquisadores do passado assumiram que bactrias de biofilme comportavam-se muito como microrganismos de livre flutuao e solitrios. Agora, esto descobrindo que enquanto verdade que a bactria de biofilme tem exatamente a mesma mscara gentica que suas primas de livre flutuao, sua bioqumica muito diferente porque se ajustam usando um grupo diferente de genes. Por exemplo, o Centro para Engenharia do Biofilme estudou como Pseudomonas aeruginosa forma biofilmes. No instante que as bactrias se instalam no vidro, elas se ajustam em certos genes envolvidos na sntese de alginate (uma forma pegajosa no usual de lodo), sendo novamente liberadas uma vez que as bactrias so engolidas no alginate. Pesquisadores agora estimam que 30 a 40 por cento das protenas presentes nas paredes das clulas bacteriais diferem entre bactrias ssseis e plantnicas (chamadas moradores de cidade e livreflutuadores por Coghlan 1996). Algumas das metas para antibiticos so no estar mais l, assim as bactrias se tornam difceis de matar. Este principalmente um problema com biofilmes dentro de humanos e animais. Sinais Qumicos Pesquisadores esto estudando as composies qumicas (chamadas fatores sigma) o que sinaliza a bactria para mudar sua bioqumica para a vida em um biofilme (Costerton 1995). Se eles podem descobrir um fator sigma reverso que mudaria as bactrias do biofilme em livre flutuadores plantnicos, pode ser possvel dissolver biofilmes enviando o equivalente de um sinal de evacuao. (Coghlan 1996)
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Implicaes para sanitizao Testes de desinfetantes tradicionais foram feitos com culturas de laboratrio de livre flutuao de espcie isolada. A constante CT para um desinfetante o produto da (concentrao) x (tempo) exigido para matar uma bactria particular. Entretanto, valores CT no devem ser extrapolados para bactrias em biofilmes. O que isto significa para sistemas de gua potvel automatizados? Para uma coisa, explica como as contagens de bactrias podem ser medidas mesmo quando a gua contm baixos nveis de cloro. Tpicos nveis de cloro em gua drenada ficam entre 0.5-2.0 ppm. Esta quantidade de cloro demonstrou matar bactrias de livre flutuao, mas pode no ser suficiente para matar bactrias de biofilme. Nacos de biofilme descartados podem conter bactrias viveis que aparecem nas contagens de placa. Este um problema particular com Pseudomonas que um grande produto de lodo, e tambm mais resistente ao cloro. Uma instalao animal determinou atravs de seus prprios testes que eles necessitavam aproximadamente 3 ppm de cloro em gua OR (Osmose Reversa) para alcanar baixas contagens de Pseudomonas.

Fatores que afetam a agregao e crescimento do biofilme

Material de superfcie
O material de superfcie tem pouco ou nenhum efeito no desenvolvimento do biofilme. Ao inoxidvel to suscetvel quanto tubulao de plstico. De acordo com Mayette (1992), material de tubulao em que os microorganismos no possam aderir ainda precisa ser descoberto. Estudos mostraram que micrbios aderem ao ao inoxidvel, Teflon, PVC e PVDF (Kynar) com quase o mesmo entusiasmo. Um artigo fala sobre incorporao de um aditivo antimicrobial no plstico para retardar ou reduzir a agregao de biofilme (Hamilton 1988). Entretanto, o reagente que usam no seguro para fornecimento de gua potvel. Algumas resinas de troca inica so revestidas de prata para prevenir o crescimento microbial. Porm, populaes bacteriais tolerantes prata podem se desenvolver (Flemming & Geesey 1990, pg 67). No h exemplos prticos de revestimentos de superfcie txicos para gua potvel. Resumo do Teste: Superfcies de Ao Inoxidvel vs. PVC Pesquisadores na Sucia (Pedersen 1990) compararam o desenvolvimento de biofilme em superfcies de ao inoxidvel e PVC expostas ao fluxo de gua potvel municipal. Aps 167 dias, eles mediram o nmero de microrganismos desenvolvidos nas superfcies. No havia diferena na quantidade das clulas no ao inoxidvel eletropolido hidroflico e o PVC hidrofbico. Entretanto, eles descobriram que um acabamento rugoso opaco de ao inoxidvel teve 1.4 vezes mais microrganismos que o ao eletropolido. As duas razes propostas para a diferena na rugosidade da superfcie foram 1. Superfcies rugosas tem mais rea de superfcie. 2. Superfcies rugosas fornecem mais proteo das foras de corte (fluxo).
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rea de superfcie
O fator que mais influencia o desenvolvimento do biofilme em sistemas de gua purificada a rea de superfcie. Sistemas de gua industriais, ao contrrio da maioria dos ambientes naturais (lagos e rios), oferecem uma quantidade tremenda de rea de superfcie para agregao. Membranas RO, resinas DI, tanques de estocagem, filtros cartuchos, e sistemas de tubulao todos oferecem superfcies adequadas para agregao e crescimento bacterial (Mittelman 1985).

Nivelamento da superfcie
Embora superfcies mais lisas retardam o surgimento de bactrias agregadas, o nivelamento no afeta significativamente a quantidade total de biofilme que ir se agregar superfcie. De acordo com Meltzer (1993), nunca foi encontrada uma superfcie que seja isenta de bioresduos. A estrutura da superfcie aparece para influenciar a proporo de resduo, mas apenas inicialmente durante as primeiras poucas horas de exposio. Em geral, superfcies lisas se sujam a uma velocidade inicial menor do que superfcies rugosas, mas a formao de biofilme aps um perodo de dias inevitvel. Esta concluso baseada em pesquisa da aderncia da Pseudomonas ao ao inoxidvel (veja o resumo do teste abaixo).

Resumo: Aderncia da Pseudomonas e Rugosidade de Superfcie

Pesquisadores na Blgica (Vanhaecke 1990) compararam a proporo de agregao da Pseudomonas aeruginosa ao ao inoxidvel 304 e 316-L como valores de rugosidade de grana 120, grana 320, grana 400, e eletropolida. Eles encontraram: 1. O nmero mximo de bactrias aderidas por centmetro quadrado era independente do tipo de ao inoxidvel ou da rugosidade da superfcie. 2. Adeso mensurvel, mesmo nas superfcies eletropolidas, ocorreu dentro de 30 segundos. 3. Esforo com paredes de clula hidrofbica agrega na mesma velocidade independente da rugosidade de superfcie testada. Esforo hidroflico agregou mais rpido para a superfcie mais rugosa grana 120 e teve mnima adeso nas superfcies eletropolidas. (Lembre-se, em gua pura as bactrias alteraro sua parede celular e se tornaro hidrofbicas).

Um estudo da limpeza do ao inoxidvel usado para superfcies de contato com alimentos (Milledge), concluiu que se o acabamento de superfcie tem um efeito sobre o poder de limpeza, provavelmente pequeno em relao a outros fatores durante a limpeza (temperatura, concentrao de detergente, etc.). At agora, nenhuma pesquisa conseguiu comparar a capacidade de sanitizar as superfcies com diferentes acabamentos em sistemas de gua.

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Pode haver algumas vantagens em superfcies lisas. 1. Tubulao lisa deve suportar menos biofilme porque tem menos rea total de superfcie do que tubulao rugosa. Isto foi visto no teste realizado por Pedersen (veja resumo do teste, pagina 10) mas no foi visto no teste realizado por Vanhaecke (veja resumo do teste acima). 2. Superfcies lisas (especialmente eletropolidas) devem ter menos biocorroso. Uma das causas da biocorroso a corrente que passa entre os picos e vales de uma superfcie rugosa.

Velocidade de vazo
Alta vazo de gua pode alterar o crescimento do biofilme mas no prevenir a agregao das bactrias nas superfcies da tubulao. Esta concluso defendida por Mittelman (Parte 1 1985), Patterson (1991) e Meltzer (1994). Alta vazo no previne contra aglomerao de bactrias nem remove biofilmes existentes pelas seguintes razes: 1. Baixa vazo na camada limtrofe Apesar da velocidade de gua, ela flui mais lenta nas camadas adjacentes das superfcies da tubulao. Mesmo quando a vazo de gua no centro da tubulao turbulenta, a velocidade de vazo cai para zero na parede da tubulao. A distncia fora da parede da tubulao no qual a razo de fluxo no turbulenta chamada de camada limtrofe ou subcamada laminar. A espessura da subcamada laminar foi calculada por Pittner (1988) para vrias velocidades de vazo e para 3 tamanhos de tubulao (veja a tabela a seguir) Pittner calculou que as foras de cisalhamento dentro da subcamada laminar so muito menores que aquelas exigidas para deslocar uma clula de bactria. 2. Forte adeso por exopolmeros Nos sistemas de gua com vazo de alta velocidade contnua, a bactria que acumula no biofilme tende a ser de variedade filamentosa (como Pseudomonas) especialmente apropriado para aderncia por filamentos. A bactria se ancora superfcie com seus aderentes exopolmeros.

Tabela 1: Espessura da Subcamada Laminar (microns) (Pittner 1988)

Tamanho da tubulao 0.2 E.I. RDS 0.428 ID 1/2" Sch.80 1" Sch.80 2" Sch.80 3 Sch.80 4 Sch.80 * * * 537 563 582 1.0 * * 265 291 305 312 Velocidade (ps/seg) 2.0 5.0 125 136 146 158 165 170 55 60 65 69 74 75 8.0 37 40 43 46 48 50 12.0 26 28 30 32 33 34

* O fluxo pode ser ou no turbulento nestas condies Velocidade de vazo E.I. RDS atual aproximadamente 3-4 ps/seg.

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Embora a alta velocidade de vazo no previna a adeso de bactrias s superfcies da tubulao, ela tem os seguintes efeitos na estrutura do biofilme. 1. Biofilme mais denso De acordo com Mittelman (1985) a maiores velocidades de vazo, um biofilme mais denso e mais tenaz formado. Como resultado, estas superfcies sempre aparecem livres de incrustantes, j que no so viscosos ao toque. 2. Espessura de biofilme limitada A espessura mxima do biofilme pode ser considerada a espessura da camada de vazo laminar (veja Tabela 1). Em um sistema de fluxo constante, uma espessura de equilbrio alcanada que depende da velocidade da gua e nutrientes. O crescimento do biofilme alm da camada laminar resultar na liberao de clulas plantonicas pioneiras que, em condies favorveis, estabelecer o biofilme em uma outra seo da tubulao. (Patterson 1991). Em sistemas que possuem fluxo de gua flutuante, tais como sistemas de gua automatizados com fluxo peridico, as bactrias se desprendero durante o fluxo. Isto resulta em chuveiro de partculas aleatrias de bactrias que podem explicar dia a dia flutuaes vistas em resultados de contagem total de bactrias.

Nutrientes limitados
Tabela 2: Nutrientes para crescimento bacterial encontrado em sistemas de gua pura (Mittleman 1985)
Nutriente Carbono Orgnico Origens cidos hmico e fulvico (origem gua) Plastificantes e solventes de tubulao Plsticos reforados de fibra de vidro (FRPs) Lubrificantes de bitola e bomba Subprodutos microbiais Pessoal P do ar cidos hmico e flvico (origem gua) Nitratos e nitritos (origem gua) Subprodutos microbiais P do ar Fosfatos (origem gua) Subprodutos microbiais P do ar Sulfatos (origem gua) cido sulfrico (pr-tratamento de RO) Surfactantes de membrana P do ar Origem gua Tubulao do processo plsticos reforados (FRPs) Componentes de sistema de ao inoxidvel Reagentes do pr-tratamento de RO Pessoal P do ar

Nitrognio

Fsforo Enxofre

Traos de metais e sais

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Como outras criaturas vivas, as bactrias necessitam de certos nutrientes para crescerem e se reproduzirem. Limitando estes nutrientes pode se limitar o crescimento da bactria, porm os nveis de nutrientes em sistemas de alta pureza so inequivocamente suficientes para permitir a reproduo e crescimento microbial para uma extenso problemtica (Husted 1994). A Tabela 2 lista algumas fontes de nutrientes em sistemas de gua purificada.

Nutrio do substrato
A bactria pode obter alguns de seus nutrientes da tubulao e juntas em um sistema de gua? Sim, de acordo com Flemming & Geesey (p. 67, 1990). A maioria dos plsticos no so biodegradveis, mas cementadores e plastificantes de tubulao que derivam de resinas epxi, tubulao de PVC e tubulao de poliamida podem ser fontes de carbono orgnico para bactrias. Membranas de RO a base de celulose tambm pode ser uma fonte de nutriente. Esta a razo porque devemos clorar o alimentador de gua de RO. Alm disso, bactrias podem obter nutrientes de traos de metais do ao inoxidvel e outros componentes de metal.

gua purificada
Sob perfeitas condies de crescimento, uma clula bacterial se divide em duas clulas irms a cada 20 minutos (Harfst 1992). Isto significa que uma clula simples e seus descendentes crescero exponencialmente para mais de 2 milhes de clulas em oito horas ou para 4.000.000 de libras de bactrias em 24 horas! claro que esta proporo de crescimento nunca realmente realizada (especialmente em gua potvel limpa) porque so limitadas pelo espao e nutrientes disponveis. As bactrias podem morrer de fome ou ao menos ser inibidas em seu crescimento privando elas de nutrientes orgnicos e oxignio? Infelizmente, mesmo mnimas quantidades de material orgnico sustentam muitas bactrias. Isto explicado no seguinte exemplo por Pittner (1988): Se apenas uma parte por bilho de material orgnico em uma amostra de 1 mililitro de gua for convertida a corpos bacteriais (assumindo que a bactria 20% de material orgnico e a gravidade especfica da bactria sendo a da gua), aproximadamente 9.500 bactrias, a cada 1.0 micron de dimetro, estaria presente em 1 mililitro de amostra. ou 9.500 bactrias/ml em 1 ppb de material orgnico. Tecnologia disponvel atual no pode reduzir os nveis de nutrientes completamente, por isso o controle total de bactrias no alcanvel simplesmente pelo controle de nutrientes. Da mesma forma, quantidades muito pequenas de oxignio sustentaro adequadamente luxuoso crescimento bacterial mesmo que a bactria no se reverta a respirao anaerbica,que a maioria das bactrias so capazes de fazer. Por estas razes, uma farta populao bacterial pode existir mesmo em sistemas de gua de alta pureza.. (Pittner 1988). Ambientes limitadores de nutrientes podem realmente promover o agregamento de bactrias s superfcies porque onde os traos orgnicos se acumulam e polmeros extracelulares no biofilme capturam traos de nutrientes. Embora no podemos matar completamente a bactria de fome, gua de osmose reversa pobre em nutrientes sustenta menos biofilme que suprimentos de gua tamponada regulares.

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Propores de Biofilme e Sistemas de gua

At aqui, este artigo descreveu como uma camada de biofilme se desenvolve no interior de tubulaes de gua e como esta camada alcana um certo equilbrio na espessura dependendo da velocidade de vazo e nveis de nutrientes. E discutiu como o nivelamento da superfcie no fator significativo na agregao do biofilme. Agora, voc pode estar querendo saber... 1. Como o tamanho da clula de bactrias se compara com a profundidade de ranhuras e impactos na superfcie de tpicas tubulaes de ao inoxidvel? H uma ou um milho de clulas nestas ranhuras? 2. Se a espessura do biofilme limitada a 100 ou 50 microns pela vazo, quantas clulas de bactrias espessas se tem? espessa o suficiente para esperar uma zona de bactrias anaerbicas na parede da tubulao ou dentro das ranhuras da superfcie da tubulao? 3. Qual a espessura do biofilme comparado ao dimetro interno de da tubulao de ao inoxidvel? Ele pode ser visto? Esta seo mostrar graficamente como o tamanho e a proporo de uma clula de bactrias individual se compara rugosidade de superfcie, espessura de biofilme, e dimetro de tubulao. Converso de Unidades de Medio 1 polegada = 1.000.000 ou 1 x 106 micro-polegadas ( pol. ou ) 1 metro = 1.000.000 ou 1 x 106 micrometros (m) 1 metro = 39,37 polegadas 1 micrometro (m) = 1 micron = 39,37 micro-polegadas ( pol.)

Acabamento de superfcie e tamanho de clula

Por muitos anos, o acabamento fornecido nas superfcies de ao inoxidvel foi um padro laticnio definido pelo Nmero ou Grana tais como #4 ou grana 150. O Acabamento de Grana usado com polimento mecnico e se refere ao nmero de linhas de grade por polegada de abrasivo. Quanto maior o nmero mais lisa a superfcie. Embora as indstrias de laticnios e farmacutica ainda usam cdigos de grana para acabamentos, elas esto sendo levadas a um sistema onde a rugosidade da superfcie pode ser medida mais precisamente. A rugosidade de superfcie pode ser medida por um perfilmetro, um dispositivo de estilo usado para traar ao longo do perfil de superfcie. Os resultados so expressos tanto como RA, que o desvio mdio aritmtico da linha de centro da superfcie, ou como RMS, que a raiz quadrada dos desvios da linha de centro. Valores de RA ou RMS so dados tanto em microns (o mesmo que micrometros ou ) ou micro-polegadas (). Nos desenhos das Indstrias Edstrom, a rugosidade da superfcie especificada como RMS em micro-polegadas. RMS ser aproximadamente 11 por cento mais alta que o nmero de RA para uma dada superfcie. [RA x 1.11 = RMS].

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Acabamento de Tubulao de gua Farmacutica em Ao Inoxidvel

De acordo com Meltzer (1993), no h uma norma universalmente aceita para acabamento de superfcie de ao inoxidvel. Tubos dos EUA tem geralmente acabamento interno de grana 150 a 180. Das quatro grandes fabricantes farmacuticas em Chicago, duas confiam em acabamentos grana 150, uma em um acabamento grana 180, e uma em uma em um acabamento grana 180 seguido de eletropolimento. gua para Injeo (Water-For-Injection) tem geralmente fluxo em acabamento de tubulao grana 240 a grana 320

Nivelamento de Tubulao de Plstico

De acordo com Gillis (1996), tubulaes de PVDF e polipropileno extrudados so to lisos quanto ao inoxidvel eletropolido. No h irregularidades de significativas propores na faixa de tamanho de uma clula bacterial.

Acabamento de Conexes e Vlvulas das Indstrias Edstrom

Para conexes e vlvulas de bebidas usinadas, o acabamento padro especificado no bloco de ttulo de nossos desenhos 64 micropolegadas RMS. Quando um acabamento mais liso necessrio, para superfcies de vedao o-ring por exemplo, um acabamento mais liso de 32 ou 16 micropolegadas pode ser especificado. Se as peas usinadas forem eletropolidas, a rugosidade deve ser reduzida em 30-40%.

Acabamento em Tubos RDS em Ao Inoxidvel E.I.

O tubo de ao inoxidvel usado nas tubulaes de sala e manifolds da Edstrom tem uma costura soldada, mas no tem um nivelamento de superfcie interior definido. um acabamento laminado que aparece liso mas pode ter fendas formadas por metal achatado durante a laminao. Assume que no mais liso que um acabamento grana 180.

Tabela 3. Comparaes de Medidas de Superfcie (Meltzer 1993)

RMS (micropolegada) 80 58 47 34 17 14 RMS (m) 2.03 1.47 1.2 0.6 0.43 RA (micropolegada) 71 52 42 30 15 12 RA (m) 1.90 1.32 1.06 0.76 0.38 0.30 Tamanho da grana 80 120 150 180 240 320

Estes valores so os dados mdios de vrios testes. Por causa das muitas variveis que derivam estes dados, desvios de 5% sero considerados dentro dos parmetros de boas medidas. Tirado do Boletim de Finalizadores e Soldas de Materiais por DCI, Inc. (Meltzer 1993)

Altura do perfil
Na maioria das superfcies a altura total do perfil da rugosidade da superfcie, ou altura do picopara-vale ser aproximadamente quatro vezes o valor de RA. Sabendo a rugosidade medida, um perfil aproximado da superfcie pode ser desenhado (veja Figura 7).

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Tamanho Tpico de Clulas de Bactrias de Biofilme

Uma bactria de biofilme comum a Pseudomonas aeruginosa. Clulas de Pseudomonas tem formato de basto e aproximadamente 0.3-0.8 microns de largura por 1.0-1.2 microns de comprimento. Isto equivale a 12-31 micropolegadas de largura x 40-47 micropolegadas de comprimento.

Comparando Perfil de Superfcie ao Tamanho de Clulas de Bactria

O perfil de rugosidade de vrios acabamentos de ao inoxidvel usados em sistemas de gua mostrado esquematicamente na Figura 7. Note que um acabamento de 34 RMS ou grana 180 (que considerada sanitria para usos laticnios, alimentcios, e farmacuticos) tem riscos grandes suficientes para armazenar bactrias. Um acabamento de 14 RMS (grana 320), que tpica de aplicaes de gua para Injeo (WFI Water-for-Injection), tem riscos com profundidade de aproximadamente apenas uma clula de bactrias. Uma superfcie grana 320 seguida de eletropolimento tem apenas mnimas variaes de superfcie relativas ao tamanho da clula.

Figura 7 Perfil de rugosidade de variados acabamentos em ao inoxidvel.

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As figuras 8 e 9 mostram fotografias reais de clulas Pseudomonas em uma superfcie em ao inoxidvel grana 180. Os tamanhos relativos de clulas de bactrias e riscos de superfcie mostradas nestas fotos so semelhantes ao perfil grana 180 da Figura 7.

Fig. 8 Micrografia de varredura eletrnica com ampliao de 400x de uma superfcie de ao inoxidvel 316L polida mecanicamente na grana 180 aps incubao de 180 minutos com Pseudomonas aeruginosa. Note que as clulas tendem a congregar marcas longas de polimento. (Gillis 1996).

Fig. 9 Mesma superfcie grana 180 como na Figura 8, mas com ampliao de 500x. Note que os riscos so grandes o suficiente para armazenar bactrias.

Espessura do biofilme e velocidade de vazo

Os biofilmes podem consistir de uma monocamada de clulas ou podem ser to espessos quanto 300-400 mm, como em esteiras algceas. (Characklis 1990) O fluxo ir limitar a espessura do biofilme em sistemas de gua automatizados. Como discutido anteriormente (pginas 11-13), foras de corte causadas por fluxo desprender biofilme que se estende no fluxo turbulento no centro de uma tubulao. Por isso, a espessura mxima do biofilme ser aproximadamente a mesma da camada laminar para uma particular velocidade de vazo.

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A Tabela 1 (pgina 8) mostra a espessura aproximada da camada laminar em microns para tubulao RDS 1/2" em ao inoxidvel das Indstrias Edstrom para variadas velocidades de vazo. Nos sistemas de gua automatizados atuais, a tubulao RDS tem fluxo de aproximadamente 1.51.75 gpm. Esta uma velocidade mdia de vazo de 3-4 ps/seg. A 3-4 ps/seg., a espessura deve ser limitada a aproximadamente 70-90 microns. A Figura 10 mostra a mxima espessura de biofilme para variadas velocidades de vazo na tubulao RDS em ao inoxidvel das Indstrias Edstrom. Lembre-se que a espessura do biofilme tambm limitada pelos nutrientes disponveis, assim a espessura de equilbrio pode ser menor que aquela limitada apenas pela velocidade de vazo. Compare a espessura do biofilme com uma clula individual de Pseudomonas e note que o biofilme pode ter muitas camadas de bactrias. Tambm, note que irregularidades no acabamento de superfcie so pequenas comparadas a espessura mxima de biofilme possvel. Isto explica o que pesquisadores descobriram (Vanhaecke 1990): o nmero mximo de bactrias aderentes superfcie independente da rugosidade da superfcie.

Condies de Superfcie Anaerbica

Bactrias aerbicas perto da superfcie externa de um biofilme consomem oxignio. Se o biofilme espesso o suficiente, o oxignio se esgotar na superfcie da tubulao criando um ambiente anaerbico. Condies de superfcie anaerbicas so indesejveis porque pode haver mais problemas de corroso (veja pgina 13). O biofilme em sistemas de gua automatizados pode ser espesso o suficiente para ter zonas anaerbicas? Uma fonte (abaixo) indica que o oxignio pode ser esgotado dentro de 30-40 microns da interface gua/biofilme. A profundidade do gradiente de oxignio no biofilme variar dependendo do oxignio contido no volume da gua, temperatura da gua, e vazo de gua, mas isso fornece uma idia grosseira de quo longe o oxignio pode se difundir. Biofilmes Aerbicos de P. aeruginosa cresceram 30-40 m em profundidade como monoculturas, mas aumentaram em profundidade para 130 m quando a cultura foi compensada com bactrias anaerbicas. Esta evidncia indireta sugere que o esgotamento de oxignio no de nutrientes limitou o desenvolvimento vertical do biofilme de P. aeruginosa. (Costerton 1995). Se a espessura de biofilme em um sistema de gua automatizado apenas limitada por fluxo, ela pode ter espessura de 50-125 microns e ter algumas zonas anaerbicas. claro, fendas como juntas de tubulao o-ring e conexes roscadas podem ter biofilmes muito mais profundos e so os favorveis a ter zonas anaerbicas.

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Fig. 10

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Espessura do Biofilme Comparada ao Dimetro da Tubulao

A ltima comparao proporcional olhar a espessura mxima de biofilme na parede da tubulao RDS e comparar ao dimetro interno global da tubulao. Esta comparao mostrada na Figura 11 que mostra o dimetro interno do tubo OD 1/2" em ao inoxidvel das Indstrias Edstrom (dimetro interno = 0.428) e a seo transversal de uma junta o-ring. A espessura do biofilme pequena comparada ao dimetro global da tubulao e comparada profundidade do biofilme que pode se desenvolver em uma fenda de junta o-ring.

Corroso Influenciada Microbiologicamente

A presena fsica de clulas microbiais em uma superfcie metlica, tanto quanto suas atividades metablicas, podem causar Corroso Influenciada Microbiologicamente (MIC Microbiologically Influenced Corrosion) ou biocorroso. As formas de corroso causadas por bactrias no so nicas. A biocorroso resulta em pits, corroso por pontos, desligamento seletivo, fratura por fadiga de corroso, e corroso sob depsitos. Os seguintes mecanismos so algumas causas da biocorroso.

Esgotamento de oxignio ou clulas de aerao diferenciadas

Colonizao no uniforme (irregularidade) por bactrias resulta em clulas de aerao diferenciadas. Este esquema mostra a iniciao do pit devido ao esgotamento de oxignio sob um biofilme (Borenstein 1994). Filme protetivo de ao inoxidvel O esgotamento de oxignio na superfcie do ao inoxidvel pode destruir o filme passivo protetivo. Lembre-se que o ao inoxidvel confia no filme de xido estvel para oferecer resistncia corroso. A corroso ocorre quando o filme de xido danificado ou o oxignio preso na superfcie do metal por microorganismos em um biofilme. Bactria de reduo de sulfato O esgotamento de oxignio na superfcie tambm oferece uma condio favorvel ao crescimento de organismos anaerbicos como bactria de reduo de sulfato (SRB Sulfate-Reducing Bacteria). Este grupo de bactria uma das mais freqentes causas de biocorroso. Elas reduzem o sulfato para sulfeto de hidrognio que reage com metais para produzir sulfetos de metal como produtos de corroso. Bactria aerbica perto da superfcie externa do biofilme consome oxignio e cria um habitat favorvel para a bactria de reduo de sulfato na superfcie do metal. SRBs podem se desenvolver em gua parada nas reas estagnadas, como pernas mortas de tubulao. Sintomas de corroso influenciada por SRB so o cheiro de sulfeto de hidrognio (ovo podre), escurecimento de guas, e depsitos pretos. O depsito preto principalmente sulfeto de ferro. (Borenstein 1994 e Geesey 1994)

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Uma forma de limitar a atividade da SRB reduzir a concentrao de seus nutrientes essenciais: fsforo, nitrognio, e sulfato. Alm disso, guas purificadas (RO ou DI) teriam menos problemas com SRBs. Tambm, qualquer prtica que minimize a espessura do biofilme (fluxo, sanitizao, eliminao de fendas de extremidade morta) minimizar as reas anaerbicas no biofilme que as SRBs necessitam. (Geesey 1994).

Subprodutos de metabolismo bacterial

Um outro mecanismo de corroso baseado em subprodutos de metabolismo bacterial.

Colnias no uniformes (irregularidades) de biofilme resultam na formao de clulas de aerao onde reas sob colnias que respiram so esgotadas de oxignio relativo a reas no colonizadas circundantes. Tendo diferentes concentraes de oxignio em dois locais em um metal obtm-se uma diferena no potencial eltrico e conseqentemente a corroso ocorre. Sob condies aerbicas, as reas sob colnias que respiram se tornam andicas e as reas circundantes se tornam catdicas. Bactria produtora de cido As bactrias pem produzir metabolismos, tais como cidos orgnicos e inorgnicos. Por exemplo, Thiobacillus thiooxidans produz cido sulfrico e Clostridium aceticum produz cido actico. cidos produzidos por bactrias aceleram a corroso dissolvendo xidos (filme passivo) da superfcie do metal e acelerando a velocidade de reao catdica (Borestein 1994). Bactria produtora de hidrognio Muitos microorganismos produzem gs hidrognio como um produto da fermentao do carboidrato. O gs hidrognio pode se difundir nos metais e causar fragilizao por hidrognio.

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Bactria de Ferro Bactria oxidante de ferro, como Gallionella, Sphaerotilus, Leptothrix, e Crenothrix, so bactrias aerbicas e filamentosas que oxidam o ferro da forma ferrosa solvel (Fe2+) para uma forma frrica insolvel (Fe3+). O ferro ferroso dissolvido pode ser proveniente tanto da alimentao de gua como da superfcie do metal. Este ferro frrico que estas bactrias produzem pode atrair ons cloreto e produzir depsitos de cloreto frrico que pode atacar ao inoxidvel austentico, os depsitos so geralmente marrons ou marrons avermelhados.

Mtodos de Sanitizao para Biofilmes

Biofilme pode ser removido e/ou destrudo por tratamentos qumicos e fsicos. Biocidas qumicos podem ser divididos em dois maiores grupos: oxidantes e no oxidantes. Tratamentos fsicos incluem esfregamento mecnico e gua quente. Um artigo por Mittelman (1986) tem o mais compreensiva informao no tratamento de bioincrustao nos sistemas de gua purificada.

Biocidas oxidantes
Mittelman diz que a efetividade dos biocidas oxidantes em sistemas de gua purificada baseada numa dosagem igual a miligramas por litro decresce na seguinte ordem: oznio > dixido de cloro > cloro > iodo > perxido de hidrognio

Cloro De acordo com Mittelman (1986), Cloro provavelmente o mais efetivo e menos caro de todos os biocidas oxidantes e no oxidantes. A atividade do cloro contra biofilmes agregados particularmente alta; no apenas mata bactrias plantnicas e biofilme, mas o cloro tambm reage e destri rede de polissacardeos e suas agregaes superfcie. Destruindo os polmeros extracelulares, o cloro quebra a integridade fsica do biofilme. Characklis (1990) recomenda a melhora de um programa de tratamento com cloro tomando as seguintes medidas:

1. Aumento da Concentrao de Cloro na Interface gua-Biofilme Quando o cloro se difunde no biofilme, ele usado nas reaes com clulas de bactria e materiais extracelulares. baixos nveis de cloro, as bactrias do biofilme podem produzir material extracelular mais rpido que a velocidade do cloro difundir atravs dele assim elas ficam protegidas no lodo. Aumentando a concentrao, o cloro difundir mais profundamente no biofilme. Ao realizar a desinfeco de biofilmes, alta concentrao de cloro com curta durao mais efetiva que baixa concentrao por maiores duraes.

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2. Aumento da Fadiga por Corte de Fluido na Interface gua-Biofilme Simultnea sanitizao por cloro e circulao resulta em uma maior tomada de cloro pelo biofilme e em maior desagregao de biofilme devido a: Maior transferncia de massa de cloro da gua principal para o biofilme. Ruptura do biofilme durante a clorao expe novas superfcies de biofilme ao ataque de cloro. Espessura menor de subcamada viscosa ou laminar.

3. Uso do Controle de pH O alto pH favorece a desagregao de on hipoclorito promovido de biofilmes maduros, e baixo pH melhora a desinfeco por cido hipocloroso de filmes finos. Characklis props um procedimento interessante que seria alterar entre clorao contnua pH 6.5 e clorao de choque pH 8. Ele no indicou que isto tenha sido testado.

Dixido de cloro Dixido de cloro tem atividades biocidas similares quelas do cloro. Por ser instvel, ele deve ser misturado e preparado no local. Como o cloro, o dixido de cloro corrosivo aos metais e deve ser manuseado com cuidado.

Oznio Como um oxidante, oznio aproximadamente duas vezes mais poderoso que o cloro nas mesmas concentraes. Como dixido de cloro, oznio deve ser gerado no local por causa de sua alta reatividade e relativa instabilidade. Os sistemas devem ser projetados com materiais apropriados resistentes ao oznio. Oznio geralmente dosado em uma base contnua a 1-2 mg/l. O sucesso no emprego de dosagens mais altas em uma base descontnua tem sido limitado, possivelmente por causa da limitada solubilidade do oznio em gua purificada, difcil produzir altas concentraes de oznio na soluo. (Mittelman 1986). Embora o cloro no seja to poderoso como oznio quando voc compara 1-2 mg/l de cada, o cloro pode ser usado em concentraes sanitizantes mais altas com igual fora desinfetante.

Perxido de hidrognio Perxido de hidrognio freqentemente usado como um biocida em sistemas de gua purificada com grau microeletrnico porque no produz subprodutos; ele rapidamente se degrada em gua e oxignio. Uma soluo a 10% em volume em gua purificada parece efetiva para matar bactrias plantnicas, mas so necessrios mais estudos na efetividade contra biofilmes agregados. (Mittelman 1986).

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Biocidas no oxidantes
Compostos Quaternrios de Amnio Em adio a sua atividade biocida, quats so surfactantes/detergentes efetivos, que podem ser um fator importante em seu uso para desativao de biofilme remoo das superfcies. A capacidade de enxge pode ser um problema j que a remoo de um sistema de gua purificada sempre exige enxge exaustivo.

Formaldedo Formaldedo tem sido aplicado em sistemas de grau farmacutico. Ele relativamente no corrosivo ao ao inoxidvel. Sua efetividade contra o biofilme questionvel e um carcinognico txico.

Agentes Aninicos e Noninicos de Ativao da Superfcie Estes compostos surfactantes ou detergentes tem atividade biocida limitada contras as bactrias em sistemas de gua purificada. Aplicaes podem ser encontradas para estes detergentes em conjunto com outros biocidas para melhorar a remoo de biofilme e outro particulado.

Tratamentos Fsicos
Aquecimento Sistemas Farmacuticos de gua para Injeo (WFI Water For Injection) usam loops de recirculao de gua quente (maior que 80C) para matar bactrias. De acordo com Mittleman (1986), quando estes sistemas so usados continuamente, bactrias plantnicas so mortas e o desenvolvimento de biofilme reduzido. Biofilmes so ainda encontrados em gua quente (80C). Sanitizao com gua quente peridica pode tambm ser usada para destruir bactrias no biofilme, mas de acordo com Collentro (1995) isto requere uma temperatura de 95C por um perodo em excesso de 100 minutos. Isto no seria prtico em um sistema de gua potvel animal!

Remoo mecnica De Mittelman: Biofilmes pesados no podem ser removidos das paredes do tanque de estocagem pelo uso apenas de reagentes; raspagem ou esfregamento mecnico, spray de alta presso, ou uma combinao tambm exigida. A remoo mecnica do biofilme dos sistemas de distribuio no vivel. Para manuteno de sistemas OR (Osmose Reversa), ns no esfregamos rotineiramente tanques de estocagem, mas geralmente h um baixo nvel de cloro contnuo na gua estocada, assim biofilmes pesados no se desenvolvem.

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Resistncia ao biocida
Diferente dos antibiticos usados para combater bactrias associadas s doenas humana, animal e vegetal, as bactrias no desenvolvem o mesmo tipo de resistncia aos biocidas industriais. A diferena entre antibiticos e biocidas industriais que enquanto um antibitico pode ter um pequeno nmero de locais de alvo provvel ou clula bacterial, todos os biocidas oxidantes tem uma grande quantidade de locais de alvo em potencial. Cloro, por exemplo, capaz de ter mais que uma centena de locais de alvo provvel ou microorganismos. virtualmente impossvel os microorganismos desenvolverem uma resistncia geral a tais compostos (Mittelman 1986). Entretanto, bactrias em um biofilme podem resistir aos biocidas porque so protegidos no lodo.

Recuperao de biofilme (Redesenvolvimento)

As bactrias associadas aos biofilmes so muito mais difceis de matar e remover das superfcies do que organismos plantnicos. De acordo com Characklis (1990), vrios investigadores e operadores de fbrica observaram uma rpida retomada de resduo biolgico imediatamente aps o tratamento com cloro. A remoo incompleta do biofilme permitir o rpido retorno ao seu estado de equilbrio, causando ressalto na contagem de placa total aps a sanitizao.

A figura 13 (Mittelman 1986), mostra um tpico redesenvolvimento aps a sanitizao. Inicialmente, a contagem de bactrias no volume de gua cai para zero aps a sanitizao, mas foi seguida por um aumento gradual em nmeros at nveis ou abaixo dos nveis de prtratamento. Neste exemplo, o redesenvolvimento comeou aps 2 dias e voltou aos nveis de equilbrio aps 20 dias. Este um resultado semelhante aos resultados vistos no teste de sanitizao em laboratrio nas Indstrias Edstrom.

A figura 13 (Mittelman 1986), mostra um tpico redesenvolvimento aps a sanitizao. Inicialmente, a contagem de bactrias no volume de gua cai para zero aps a sanitizao, mas foi seguida por um aumento gradual em nmeros at nveis ou abaixo dos nveis de pr-tratamento. Neste exemplo, o redesenvolvimento comeou aps 2 dias e voltou aos nveis de equilbrio aps 20 dias. Este um resultado semelhante aos resultados vistos no teste de sanitizao em laboratrio nas Indstrias Edstrom.

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De acordo com Characklis (1990), a recuperao de biofilme pode ser devido a um ou a todos os seguintes fatores: 1. O biofilme remanescente contm suficientes organismos viveis que no tem fase de retardamento no redesenvolvimento. Alm disso, a recuperao de biofilme aps clorao por choque mais rpida que o acmulo inicial em uma tubulao limpa. 2. O biofilme residual na superfcie torna-a mais rugosa que a tubulao limpa. A rugosidade do depsito pode oferecer uma superfcie mais aderente a qual adsorve mais clulas microbiais e outros compostos da gua. 3. O cloro preferencialmente remove polmeros extracelulares e no clulas de biofilme, alm disso deixa as clulas de biofilme mais expostas aos nutrientes quando cessa a clorao. 4. Organismos sobreviventes rapidamente criam mais lodo (polmeros extracelulares) como uma resposta protetiva irritao por cloro. 5. H seleo para organismos menos suscetveis aos reagentes de sanitizao. Estes so geralmente os organismos que produzem excessivas quantidades de lodo como Pseudomonas. Estudo de Caso: Seleo de Sanitizao para Pseudomonas Quando vrios ratos em estudos a longo prazo morreram em 1996, esta instalao de laboratrio animal suspeitou que a causa foi Pseudomonas aeruginosa que foi encontrada em tubulaes rack manifold. Eles nunca tinham identificado Pseudomonas at aps eles sanitizarem com cloro seu sistema de recirculao de gua automatizado (AWS) pela primeira vez desde que o sistema foi instalado em 1982. Descrio do Sistema: OR com nenhum pr-tratamento seguido por um filtro de carbono e tanques de deionizao antes de encher 3 tanques de estocagem. Filtros DI e de Carbono mais provavelmente adicionam um monte de bactrias para gua OR. Nenhum cloro permitido na gua potvel animal devido aos estudos nutricionais conduzidos. Um tanque no recirculante e mantm por mais de 2 semanas o suprimento de gua para fluxo rack manifold no clorado. Os outros 2 tanques esto nos loops de recirculao alimentando o AWS. No h fluxo RDS e baixa virada de gua de tanque. Teste de Bactrias: A instalao faz testes regulares de gua potvel para bactrias. Eles regularmente obtm contagens totais de 10.000-50.000 cfu/ml dos tanques de estocagem OR e nunca tiveram qualquer problema de sade animal. Quando as contagens excederam 100.000 cfu/ml, eles decidiram fazer a primeira sanitizao do sistema. Sanitizao: 20 ppm de cloro por 4 horas de imerso com todos os racks animais removidos. As contagens de bactrias foram muito baixas por duas semanas, mas depois aumentaram (tpico redesenvolvimento seguinte a sanitizao). Especulao: A sanitizao por cloro seletivamente promoveu mais organismos resistentes ao cloro como Pseudomonas. Ele provavelmente esteve presente todo o tempo, embutido no biofilme agregado s paredes do tanque e tubulao. Uma sanitizao de uma vez com uma baixa concentrao como 20 ppm no matar 100% de Pseudomonas.
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Deteco e Enumerao de Bactrias

O monitoramento de rotina de nveis bacteriais uma parte essencial do monitoramento da qualidade de gua potvel animal de laboratrio. O modo clssico para enumerar bactrias em gua fazer uma contagem de placa que espalhar um volume conhecido de amostra na superfcie de um meio de laboratrio e contar o nmero de colnias visveis que se desenvolvem aps um perodo de tempo. Entretanto, deve ser reconhecido que a contagem de placa pode subestimar o nmero total de bactrias presentes em um sistema de gua.

A maioria das bactrias esto em biofilmes

Amostras de gua apenas coletam bactrias plantnicas ou de livre flutuao. Bactrias de livre flutuao em gua potvel animal so tambm descartadas do biofilme ou passam atravs da entrada da alimentao de gua. Se um teste de contagem de placa baixo, no se deve assumir que as bactrias no esto presentes no sistema de gua. Mais que 99% das bactrias nos sistemas de gua esto em biofilmes agregados s superfcies de tubulao. Se a integridade de um biofilme maduro no tiver sido rompido por recente fluxo ou sanitizao, ele pode no descartar muitas clulas na gua potvel, porm ainda est l. Como Smith (1987) coloca, Quando voc pega uma amostra de gua voc est apenas fazendo amostragem dos ocasionais e no o principal rebanho de bactrias no sistema.

Contagem de placa no detecta todas as bactrias viveis Contagens de placa so baseadas na capacidade das bactrias em uma amostra de se desenvolverem em um meio nutriente definido. Quando as bactrias crescem em um meio nutriente, elas formam colnias distintas. Teoricamente, uma colnia derivada de uma simples clula de bactria. Alguma subestimao de bactrias causada por grumos de bactrias que forma apenas uma colnia. Uma outra razo das contagens viveis serem muito baixas em gua purificada pobre em nutrientes que as bactrias esto em um estado de inanio e no podem se desenvolver em meio rico em nutriente. Meio rico em laboratrio so txicos para bactrias adaptadas a viver em sistemas de gua de alta pureza. Para conseguir recuperaes bacteriais mais altas de guas purificadas, meio especial (R2A Agar), temperaturas de incubao menores, e tempos de incubao maiores so s vezes utilizados.

Compreendendo mostradores de partculas Algumas vezes os resultados do teste de contagem de placa bacterial parecem muito errados. Amostras tomadas de um ponto no sistema podem variar de menos que 10 cfu/ml para TNTC (toonumerous-to-count muito numerosos para contar). Ou talvez as contagens so geralmente baixas, mas ocasionalmente uma contagem alta aprece. Algumas destas variaes podem ser explicadas compreendendo que biofilmes periodicamente proliferam causando contagens bacteriais altssimas. De acordo com Patterson (1991), Falha repentina da integridade do biofilme em locais especficos resultaro em bactrias e chuveiro de partculas que ocorrem randomicamente de tempos em tempos.

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Concluses
A situao, ento, que nem o nivelamento da superfcie, materiais de construo, nem longos atrasos nas velocidades de vazo evitam a formao de biofilme. (Meltzer 1994) As bactrias constituem uma muito bem sucedida forma de vida. Em sua evoluo, elas desenvolveram estratgias bem sucedidas para sobrevivncia que inclui agregao s superfcies e desenvolvimento de biofilmes protetivos onde elas se comportam muito diferentes das bactrias de livre flutuao. Suas estratgias bem sucedidas torna difcil o controle do desenvolvimento de biofilme em sistemas de gua automatizados.

Como bactrias de biofilme escapam s nossas tentativas de elimin-las:

Ns purificamos a gua para remover nutrientes e perguntamos Como algo poderia viver assim? Elas usam sua rede de polmeros para concentrar nutrientes. Elas vivem em nveis de nutrientes que no conseguimos nem medir. Ns lavamos as linhas de gua tentando limpar as tubulaes. Elas se agregam s superfcies com seus polmeros aderentes embaixo da camada laminar onde foras de corte so muito fracas para remove-las. Ns nivelamos as superfcies internas de conexes para que no possam se armazenar em fendas e fissuras. No importa. Elas se agregaro rapidamente e inevitavelmente mesmo assim. Ns sanitizamos a tubulao com cloro. Elas se protegem no lodo.

Ento qual a soluo?

Purificar mesmo assim! De alguma forma ir limitar os nutrientes, especialmente nutrientes para micrbios como bactrias redutoras de sulfato que causam problemas de corroso. gua RO pobre em nutrientes suportam menos bactrias do que gua tamponada. Isto significa um biofilme mais fino. Alm disso, os animais tero melhor qualidade de gua potvel. Lavar mesmo assim! Lavagem peridica com fluxo minimizar a espessura do biofilme. Biofilme mais fino tem menos zonas anaerbicas e reagentes sanitizantes tero uma distncia menor para se difundir para alcanar a superfcie da tubulao.

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Minimizar fendas mesmo assim!

Talvez o acabamento de superfcie no importa tanto quanto o acmulo total de biofilme, mas ao eliminar grandes fendas (como juntas o-ring) se elimina bolsas profundas de biofilme que so mais difceis de sanitizar e so mais corrosivas. Tambm, o eletropolimento ajudar na resistncia corroso.

Sanitizar mesmo assim!

Se dito que o biofilme redesenvolve 3 dias aps a sanitizao, retenha-o sanitizando a cada 1-2 dias. Isto pode ser feito por sanitizao automtica por cloro ou oznio. No h uma resposta fcil. A menos que um nvel de cloro contnuo seja permitido em um fornecimento de gua, ter que ser feita uma estratgia combinada. Porm, se usarmos cada arma que temos, isso deve resultar em uma qualidade de gua bacterial que satisfaa as necessidades de nossos clientes e os animais pesquisados.

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Referncias:
Artigo traduzido da literatura Biofilme - The key to understanding and controlling bacterial growth in Automated DrinkingWater Systems, Second Edition, by Paula H.Dreeszen - June 2003, Edstrom Industries, Inc.

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