Carlos

Vilela Desposorio, Luis A. Rodrguez Delfn, Amaro Castro Pomape

Deteccin del virus del papiloma humano mediante reaccin en cadena de la polimerasa y su relacin con los resultados del Pap convencional
Detection of the human papillomavirus by polymerase chain reaction and its relation with the results of the conventional Pap
Carlos Vilela Desposorio1, Luis A. Rodrguez Delfn2, Amaro Castro Pomape3
RESUMEN Con el objeto de implementar la tcnica de Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) para detectar y tipificar los VPH de alto riesgo y bajo riesgo ms frecuentes en nuestra poblacin y saber cul es la relacin entre los resultados del Papanicolaou (Pap) convencional y los obtenidos mediante la PCR, se estudiaron 60 pacientes, a quienes se les hizo un extendido citolgico para Papanicolaou y tambin se les tom muestra fresca para deteccin de VPH mediante PCR. Nuestros resultados fueron: a) El VPH de alto riesgo ms frecuente en nuestro grupo de estudio fue el VPH tipo 16. b) Los tres casos de LAG, confirmados con biopsia, fueron VPH genrico positivo, de los cuales dos fueron VPH 16 positivo. c) Los tres casos de LBG, confirmados por biopsia, fueron VPH genrico positivo, de los cuales uno fue VPH 16 positivo. d) El 85% (51 casos) de los Paps fueron negativos, y de estos, el 86,27% (44 casos) fueron VPH genrico positivo. e) El 72,5% (37 casos) de los Paps negativos fueron VPH 16 positivos. f) En ningn caso se encontr VPH tipo 18, ni tipo 6, ni tipo 11. En conclusin, nuestros hallazgos sugieren que el VPH es muy frecuente aun en mujeres con Papanicolaou negativo y que el uso de la PCR puede reducir el nmero de mujeres que van a desarrollar cncer, pues ayuda a detectar los virus de alto riesgo y la infeccin en una etapa ms temprana, complementando de esta manera el estudio citolgico.

Palabras clave: Papanicolaou, PCR, papilomavirus.

ABSTRACT With the intention of implementing the technique of Polymerase Chain Reaction (PCR) to detect and to typify the more frequent HPV of high risk and low risk in our group of studies and to know which is the relation between the results of the Papanicolaou (Pap) conventional and the obtained ones by means of the PCR; there were 60 patients studied, to whom a cytological smear for Pap was done and also fresh sample was taken for detection of HPV by means of PCR. Our results were: a) The HPV of high risk, more frequent in our training group, was the HPV type 16. b) The three cases of LAG, confirmed by biopsy, were generic HPV positive, of which two were 16 VPH positive. c) The three cases of LBG, confirmed by biopsy, were generic HPV positive, of which, one was 16 HPV positive. d) 85% (51 cases) of the Paps were negative, of these 86,27% (44 cases) were positive generic HPV. e) 72,5% (37 cases) of the Paps negative were HPV 16 positives f) In none of the cases were found HPV type 18, neither type 6, nor type11. In conclusion, our findings suggest the HPV is very frequent even in women with negative Pap and that the use of the PCR can reduce the number of women who are going to develop cancer detecting the virus of high risk and the infection in earlier stage, complementing this way the cytological study.

Key words: Papanicolaou, PCR, papillomavirus.

1 Facultad de Ciencias Mdicas, Universidad Nacional de Trujillo. Departamento de Patologa del Hospital Beln de Trujillo. 2 Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Unidad de Biologa Molecular, Instituto de Medicina Tropical e Infectologa, Universidad Nacional de Trujillo. 3 Servicio de Ginecologa Oncolgica del Hospital Beln de Trujillo.

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INTRODUCCIN
El cncer del cuello uterino es la neoplasia ms frecuente y principal causa de muerte en mujeres del Per y el mundo(1). Existe suficiente evidencia que muestra al virus del papiloma humano (VPH) como principal agente etiolgico en el 90% de los casos(2,3). El VPH produce infecciones latente, subclnica y severa de las clulas mucocutneas y anogenitales(4). Tanto en el hombre como en mujeres es causante de tumores benignos y malignos(5). Se estima que el 80% de la poblacin adulta sexualmente activa est infectada subclnicamente por algn tipo de VPH(6). Ms de 80 tipos de VPH han sido reportados, y los que infectan al hombre se han clasificado en dos grupos: virus de alto riesgo oncolgico que lleva a Lesin Escamosa Intraepitelial (LEI) de alto grado (displasia moderada, severa y carcinoma in situ) y al cncer, representados por los tipos VPH 16, 18, 31, 33, 35, etc; y los virus de bajo riesgo asociado a LEI de bajo grado (displasia leve y coilocitosis) incluyen los tipos VPH 6, 11, 40, 42, 43, 54, etc.(2,3) Los despistajes de cncer de cuello uterino apoyados nicamente en la citologa exfoliativa no han logrado disminuir las altas tasas de incidencia del cncer en Trujillo y otras ciudades del pas(1). Experiencias recientes han demostrado el valor de la deteccin del ADN del VPH de alto riesgo como un mtodo complementario del Papanicolaou convencional (Pap) en programas de despistaje y prevencin del desarrollo del cncer del cuello uterino(7,8). Actualmente, la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) es la nica tcnica que presenta la mayor sensibilidad y especificidad en el diagnstico de innumerables enfermedades genticas, parasitarias, bacterianas y virales. En el caso del VPH, la PCR detecta el ADN del virus e identifica los tipos de alto y bajo riesgo(9). Tomando en cuenta que el VPH se trasmite por contacto sexual, y que la infeccin es asintomtica, Trujillo es la ciudad con mayor incidencia de cncer cervical en el pas, aun mayor que Lima. As pues, frente a las limitaciones de diagnstico preventivo del examen Pap, nos propusimos implementar la prueba de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) para la deteccin del VPH y la tipificacin de los tipos de VPH 16 y 18 (alto riesgo) y PVH 6 y 11 (bajo riesgo) en muestra fresca del ectocrvix y endocrvix de pacientes que acuden al servicio de Ginecologa del Hospital Beln.

entre enero y diciembre del 2005, se estudiaron 60 mujeres cuyas edades variaron entre 19 y 57 aos. Toma de muestras La toma de muestras fue realizada en la siguiente secuencia: primero, las muestras fueron tomadas de la regin ectocervical usando la esptula de Ayre seguida de fijacin inmediata en alcohol al 96% (parte de la muestra fue guardada para el estudio molecular); segundo, las muestras del endocrvix fueron tomadas con hisopo, y luego el hisopo se coloc en el tubo colector para estudio molecular. Finalmente, el examen colposcpico fue realizado previa aplicacin de cido actico al 4%. Papanicolaou Los extendidos citolgicos tomados del cuello uterino fueron coloreados con la tcnica convencional de Papanicolaou y ledos en el servicio de citologa del Departamento de Patologa del Hospital Beln. Las lesiones fueron clasificadas de acuerdo al Sistema Bethesda(10). Anlisis histolgico La interpretacin histolgica de las biopsias cervicales teidas con hematoxilina-eosina se hizo de acuerdo a los criterios de la OMS(11). Examen colposcpico La inspeccin ocular del cuello uterino permiti buscar lesiones acetoblanquecinas donde se sospecha la presencia de infeccin por VPH. En estos casos y en aquellos donde se sospech malignidad, se procedi a la toma de biopsia para el examen histolgico. Extraccin de ADN Las muestras conservadas a -10 C fueron descongeladas y concentradas en microtubos de 1,5 ml a 8 000 rpm a -5 C por 8. El kit MagneSil Genomic Fixed Tissue System, Promega R, fue usado para extraer el ADN de cada muestra. Tipificacin del VPH EL ADN del papilomavirus se identific mediante la Reaccin en Cadena de Polimerasa (PCR). Las reacciones enzimticas fueron realizadas en volmenes de 50 l conteniendo: 1X buffer, 1,5 mM MgCl2, 2,5 mM dNTPs, 2,5 U ADN polimerasa y 100 pmol de cada cebador. A cada microtubo se coloc 5 l de ADN de cada paciente. Cada muestra fue sometida a 35 ciclos de 95 C por 45, 58 C por 60 y 72 C por 45.
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MATERIAL Y MTODOS
Pacientes De un total de 90 mujeres a quienes se les tom muestra para Papanicolaou (Pap), en los servicios de Ginecologa y Ginecologa Oncolgica del Hospital Beln de Trujillo

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Los cebadores para los VPH fueron: MY09, 5-cgtccmarrgcgwactgattg-3, MY11: 5-gcmcagggwcataaaatgg-3, PVH 16: 5-cctaatatatatgaatctttgc-3, PVH 18: 5-tgccttaggtccatgcatac-3, PVH6/11R: 5-acatcatctacagcagcagt-3 PVH 16: 5-atataattagtgagtataggacata-3, PVH 18: 5-gatatcacaacatagctggc-3, PVH 6/11F: 5-gccatgttgtgcaagagtat-3, La calidad de las extracciones de ADN de cada muestra se evalu usando como control de ausencia de inhibidores de PCR, la amplificacin de parte del gen de la hemoglobina, con los cebadores: GH20: 5-gaagagccaaggaaggta-3 y PCO4: 5-caacttcatccacgttcacc-3, en las mismas condiciones de temperatura. Electroforesis Los productos amplificados por PCR fueron observados en gel de poliacrilamida al 6% (20:1) y coloreados con solucin de nitrato de plata y documentados.

positivo), tres fueron LAG, dos LBG, uno CEASI y 21 fueron Papanicolaou negativo. Solo en un caso, en el cual no se realiz la colposcopa, el Pap fue informado como LBG (Tabla 2). Tabla 2. Resultados de la colposcopa y su relacin con el Papanicolaou y la PCR
IVAA Papanicolaou LAG LBG CEASI Negativo CEASI Negativo LBG CEASI Negativo 3 2 1 21 1 7 1 1 23 60 PCR HPV 16 PGM09/11 + + 3 2 1 15 1 7 1 1 22 0 0 0 6 0 0 0 0 1 2 0 1 11 1 7 1 1 19 1 2 0 10 0 0 0 0 4

Positivo 27 Negativo 8 NA 25 Total 60

35(88,33)

43(71,66)

IVAA: Inspeccin visual con cido actico. LAG: Lesin escamosa intraepitelial de alto grado. LBG: Lesin escamosa intraepitelial de bajo grado. CEASI: Clulas escamosas atpicas de significado no determinado. PCR: Reaccin en cadena de la polimerasa. NA: no se aplic cido actico.

RESULTADOS
De un total de 90 mujeres estudiadas entre enero y diciembre del 2005, en 60 de ellas se realizaron los estudios de Pap, PCR y solo en 35 de ellas se efectu colposcopa. La poblacin estudiada tuvo una edad promedio de 34,9 aos, oscilando entre 19 y 57 aos. El mayor nmero de mujeres examinadas estuvo entre los 21 y 40 aos (Tabla 1). Resultado de la colposcopa De las 60 mujeres estudiadas, 27 mostraron lesiones acetoblanquecinas, 8 no mostraron lesin alguna y en 25 casos no se efectu la colposcopa. De los 27 casos que mostraron lesiones acetoblanquecinas en la colposcopa (inspeccin visual por cido actico positiva, IVAA Tabla 1. Distribucin de las pacientes por grupo etreo.
Grupo etreo 19 20 21 30 31 40 41 50 51 60 Total
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Anlisis del Pap y de la PCR De las 60 mujeres estudiadas, 52 (86,66%) resultaron positivas para algn VPH, 43 (71,66 %) con VPH 16 y ninguna con VPH 18. Solo en 44 casos se efectu PCR para los tipos 6 y 11, siendo en todos los casos negativo. Por el mtodo convencional de Pap, solamente 3 mujeres fueron positivas para LAG (5%), 3 para LBG (5%) y 3 para CEASI (5%) (Tabla 3). Los 3 casos informados como CEASI favorecieron cambios reactivos. Es importante destacar que en ningn caso se reportaron Paps insatisfactorios. Un Pap es insatisfactorio cuando la muestra no es confiable para la deteccin de clulas epiteliales anormales(10). Los 6 casos que fueron Pap positivo, confirmados con biopsia, fueron VPH genrico positivo. Mientras que de Tabla 3. Frecuencia de los subtipos de VPH y PCR genrico en relacin con los resultados del Pap
Pap (n) LAG (3) LBG (3) CEASI(3) Negativo(51) Total (60) PGM09/11(%) + 3 3 3 44 0 0 0 7 PCR HPV18(%) HPV16(%) + 3 3 0 54 2 1 3 37

% (n) 3,33 (02) 33,34 (20) 30,00 (18) 28,33 (17) 5,0 (03) 100 (60)

1 2 0 14

53(88,33) 7(11,66) 60(100)

43(71,66) 17(28,3)

LAG: Lesin escamosa intraepitelial de alto grado. LBG: Lesin escamosa intraepitelial de bajo grado CEASI: Clulas escamosas atpicas de significado no determinado. PCR: Reaccin en cadena de la polimerasa.

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los Paps negativos (51 casos), la gran mayora (86,27%) fue VPH genrico positivo.

DISCUSIN
En la actualidad existe evidencia de que ciertos tipos del virus del papiloma humano son necesarios para el desarrollo del cncer de cuello uterino(6,12). A este grupo de virus se le denomina VPH de alto riesgo y son los tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58, etc.(2). As mismo, se estima que el 75% de los casos de cncer de cuello uterino se asocia con los VPH 16, 18, 31 y 33(13). De estos, en el presente estudio se ha buscado la presencia de los tipos 16, 18, 6 y 11, por ser el primero el ms frecuente del epitelio escamoso y el VPH 18 el ms agresivo y frecuente del epitelio endocervical(14). Adicionalmente, en 44 casos tambin se buscaron los VPH tipos 6 y 11, por cuanto se ha reportado que cuando dos o ms virus estn infectando a una misma paciente, el riesgo de contraer cncer es mayor, aun cuando estos sean de bajo riesgo(15). En el presente grupo de estudio encontramos que el VPH de alto riesgo ms frecuente fue el VPH tipo 16, lo cual coincide con lo reportado por otros autores(7,10,15,16). Respecto a los 6 casos de Pap positivo informados como lesin escamosa intraepitelial: tres de alto grado y tres de bajo grado, todos fueron VPH genrico (PGM09/11) positivo. Solo dos de los casos de LAG y uno de los casos de LBG fueron VPH 16 positivo, lo cual indica que algn otro VPH que no es ni 18, ni 6, ni 11 est infectando a estas pacientes. En el anlisis de 11 estudios, de casos y controles, efectuado por Muoz et al.(2), ellos encuentran, en orden de frecuencia, primero VPH 16, segundo VPH 18, en tercer lugar el VPH tipo 45 y el ms frecuente en el Per, el VPH tipo 5217. Ahora en Amrica Latina son ms frecuentes los tipos 31 y 35(2). As mismo, de los 51 casos (85 %) en los que el Pap fue negativo, el 86,27% (43 casos) fue VPH genrico positivo y el 72,54% (37 casos) fue VPH 16 positivo. Es indudable que el considerable porcentaje de casos que fueron VPH genrico positivo y VPH 18, 6 y 11 negativos indica que existen otros tipos de VPH que no nos ha sido posible identificar. De otro lado, el alto porcentaje de Paps negativos indica que la infeccin precede largamente a las lesiones y que los cambios morfolgicos pueden ser tan sutiles que fcilmente pasan desapercibidos, lo cual se explica porque en etapas iniciales las lesiones causadas por la infeccin del VPH son planas y si no se usa cido actico son completamente invisibles; claro que hay otras lesiones como la metaplasia, que tambin son acetoblanquecinas, lo cual agrega un factor de error a la colposcopa. Es

indudable que muchas de estas infecciones iniciales an no mostraran transformacin celular aparente. Nuestros hallazgos indican que muchos de los extendidos citolgicos de cuello uterino morfolgicamente normales pueden ser VPH positivos, como tambin lo han demostrado otros autores(6,12,16), de los cuales el trabajo de Bauer et al.(16) reporta el ms alto porcentaje, con 69% de VPH positivo en mujeres jvenes saludables. Estos resultados no restan el valor predictivo del Papanicolaou, por cuanto es una prueba muy sencilla, rpida y econmica. Sin embargo, siempre que haya una duda o que existan factores de riesgo, ser necesario recomendar una prueba moderna y altamente sensible como es la PCR para la deteccin de VPH. De esta manera, se puede hacer un seguimiento selectivo de las pacientes, debido a que en un buen nmero de casos la infeccin del cuello uterino es morfolgicamente inaparente y por tanto latente. Esto tambin nos permite sugerir que el virus que es ms frecuentemente latente es el VPH tipo 16. Sin embargo, muchas de las infecciones latentes tambin son por virus diferentes al VPH 16, 18, 6 y 11. Es obvio que para poder encontrar VPH tipos 18 se necesita una casustica mayor. Un 10% de las pacientes haban sido histerectomizadas por un carcinoma in situ; por tanto, en ellas la presencia de VPH indica infeccin persistente. Las mujeres con infeccin viral persistente con tipos virales oncognicos son de alto riesgo para desarrollar lesin intraepitelial de alto grado y/o cncer (riesgo relativo de 116 veces con respecto a las mujeres que no tienen infeccin viral persistente)(18). La presencia de VPH de alto riesgo en forma persistente implica el seguimiento estricto de la paciente, aun en ausencia de lesin colposcpica y/o Pap negativo. El metaanlisis efectuado por Lorincz et al.(6) a 8 grupos de estudio que involucran a ms de 2 600 mujeres mostr que las pruebas moleculares tienen una sensibilidad mayor al 95% para la deteccin de VPH en lesiones precursoras y cncer. El agregado de la deteccin de tipos virales de alto riesgo al estudio citolgico con el Pap convencional permite aumentar considerablemente la identificacin de mujeres que estn en riesgo de desarrollar un cncer invasor, porque existe aproximadamente entre un 10 y 15% de resultados falsos negativos(14), y segn otros autores, 20 a 30% de Neoplasias Intraepiteliales Cervicales (NIC) 2/3 que no son detectadas por el Pap convencional(15). En nuestra serie, el Pap no detect 2 casos de lesiones intraepiteliales de alto grado. Claro que esto puede deberse no solamente a una baja sensibilidad del Pap sino tambin a una mala toma de muestra o a una deficiente calidad de la muestra, ya que en muchas mujeres y como parte de los cambios fisiolgicos del cuello uterino, la unin escamocolumnar tiende a avanzar en el canal endocervical.
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Aun cuando nuestros datos no son extrapolables debido a lo pequeo de la muestra, el alto porcentaje de VPH encontrado en Paps negativos nos permite plantear la necesidad de realizar estudios ms amplios en nuestro pas a fin de determinar con mayor precisin la prevalencia del VPH, que probablemente est aumentando. La extremada sensibilidad de la PCR muestra la posibilidad que dentro de este grupo hubiese falsos positivos por contaminacin de la muestra. Sin embargo, esta es una posibilidad que se minimiz poniendo nfasis en la escrupulosa manipulacin de la muestra, para lo cual se us material descartable y constante cambio de guantes. Sin embargo, nuestros resultados estn en relacin con la alta incidencia de cncer de cuello uterino que existe en nuestro medio(1). La PCR permite la deteccin del DNA viral aun antes que la clula presente cambios citopticos, lo cual ofrece la posibilidad de cubrir los resultados falsos negativos de la citologa en cualquier etapa de la vida, ms aun en mujeres de edad avanzada, en quienes el cncer es ms frecuente. En pases en desarrollo como el nuestro, se han encontrado canceres invasores en pacientes de 20 aos de edad o menores1. Por ello, el despistaje se lleva a cabo en pacientes entre las edades de 15 a 49 aos; a pesar de esto, existe una alta incidencia de cncer de cuello uterino(1), lo cual amerita la deteccin del DNA viral, debido a que esto predice el riesgo de enfermedad futura. Los casos positivos por PCR para los tipos de alto riesgo sin lesin citocolposcpica, que aparentemente son resultados falsos positivos de la PCR, deben ser seguidos en el tiempo para evaluar la tendencia evolutiva y poder definir el verdadero valor predictivo positivo del mtodo. Ante un PCR positivo para VPH y Pap exo-endocervical negativo, debe realizarse un minucioso examen colposcpico de todo el tracto genital y biopsiar imgenes colposcpicas de sospecha, aunque estas sean mnimas. Nuestros hallazgos sugieren que el VPH es muy frecuente aun en mujeres con Papanicolaou negativo. Por tanto, es importante llevar a cabo una deteccin del VPH a fin de hacer un seguimiento de las pacientes o llevar a cabo medidas profilcticas. La presencia del VPH es necesaria pero no suficiente para causar una lesin de alto o bajo grado. Los altos costos fueron un factor limitante para el procesamiento de las muestras. Sin embargo, este estudio podra ampliarse o seguir desarrollndose con la intencin de lograr el objetivo propuesto: la erradicacin de las lesiones precursoras del cncer cervical y la deteccin de cnceres invasores en la poblacin de la ciudad de Trujillo. En conclusin, el uso de la PCR puede reducir el nmero de mujeres que van a desarrollar cncer, detectando los virus de alto riesgo y la infeccin en etapa ms temprana, complementando de esta manera el estudio citolgico.
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Figura 1. Electroforesis en poliacrilamida al 4%, mostrando los productos amplificados del genoma del VPH con cebadores genricos MY09/11. Las columnas 1-7 y 9-13 corresponden a los extendidos citolgicos de pacientes en los que se amplific el ADN que permite la identificacin del virus del papiloma humano. La columna 8 corresponde a un extendido citolgico en la que no se detect ADN viral. Columna M patrn de peso molecular de 1 kb. La fecha indica el producto de PCR amplificado de 450-500 pb correspondiente al VPH.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Figura 2. Electroforesis en poliacrilamida al 4%, mostrando los productos amplificados del genoma del VPH 16. Las columnas 1-2, 4-8 y la 10 corresponden a los extendidos citolgicos de pacientes en los que se amplific el ADN VPH 16. Las columna 3 y 9 corresponden a extendidos citolgicos en los que no se detectaron ADN del VPH 16. La fecha indica el producto de PCR de 100 pb correspondiente al ADN viral. La columna M es el patrn de peso molecular de ADN de 1 kb.

CONCLUSIONES
1. La alta incidencia de infecciones con virus del papiloma humano se debe al tipo VPH 16. 2. La deteccin y tipificacin del virus del papiloma humano es ms eficiente mediante la tcnica de PCR

3. Existe una alta incidencia de falsos negativos por Pap respecto al anlisis de PCR.

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Recomendaciones Incrementar el nmero de casos en estudio a fin de que los resultados puedan ser extrapolables e incorporar la PCR como parte del protocolo ginecolgico. Implementar la PCR como mtodo complementario de los programas de despistaje del cncer de cuello uterino en pacientes con factores de riesgo, para lo cual es necesario dar a conocer las bondades de esta tcnica a los profesionales de la salud. Agradecimiento El presente trabajo fue subvencionado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa, debido a que fue ganador del Concurso Nacional 2004.
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