Estructura y Funcin de los cidos nucleicos Estructura de los acidos nucleicos

Diferencias estructurales del ADN y el ARN

Porque Timina en el ADN y uracilo en el ARN?
H20 La Citosina se deamina espontaneamente formando Uracilo Las enzimas reparadoras reconocen estas "mutaciones" y reemplazan Us por Cs NH3 Si no hubiera Timina (5-metil-U) como distinguir las U normales de las resultantes de deaminacin?

Estructura secundaria del ADN: Caractersticas Principales

Dos cadenas polinucleotdicas enrrolladas en una doble hlice dextrgira Las hebras son antiparalelas Los esqueletos azucar-fosfato en el exterior de la doble hlice Pares de base planares a trav s de puentes de hidrgeno, en el centro de la estructura A T (2 H) GC (3H) Pares de base separados 3.4 A. Una v uelta de hebra (3.4 nm) tiene aprox. 10 pares de base La posicin de los esqueletos azucar-fosfato definen surco mayor y menor.

Porque 2-dideoxi en el ADN ?

Dos grupos OH en el ARN lo hacen ms suceptible a hidrlisis. El ADN sin OH en 2 es ms estable a hidrlisis.

Odio ser una molcula de ADN!! Hay tanta informacin que debo recordar!! Flujo de informacin en la clula

Reglas de sntesis de molculas informativas

Acidos nucleicos y protenas Formados por un nmero limitado de subunidades Las unidades son agregadas secuencialmente formando cadenas lineales Cada cadena tiene un punto de inicio, avanza en una nica direccin y tiene un punto de finalizacin Los productos de la sntesis primaria son modificados previamente a cumplir su funcin

Reconocimiento de ADN por protenas

Seales en el ADN

Seales

Donde comienza y termina un gen? Donde comienza y termina una protena?

Como leer estas seales? Legibilidad

Legibilidad de secuencias de ADN

Accesibilidad a la secuencia
(surcos mayor y menor)

La estructura de los cidos nucleicos no es rgida

Enlaces mvil es
Enlace N-glicosdico Enlace Fosfo-di-ster

Variacin con
movimientos de pares de base Formas alternativas del ADN

Movilidad de las bases

dependiendo de la secuencia v ara el ngulo entre los pares de base Ladeado Abertura

Giro

Propulsor

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Propiedades fisico-qumicas de los cidos nucleicos Formas alternativas del ADN

forma A
condiciones de baja humedad hbridos ADN- ARN ARN- ARN 11pb/vta bases inclinadas surco mayor profundo surco menor angosto, mas expuesto

forma Z
alternancia de purinas y pirimidinas (CGCGCG) lev gira 12 pb/vta surco mayor muy profundo y cerrado surco menor muy expuesto

1. Desnaturalizacin de los cidos nucleicos

Desnaturalizacin Parcial del ADN necesaria para procesos de copiado Experimental Por temperatura Se analiza mediante espectroscopa Aumento de Temperatura Disociacin cooperativa de las hebras Aumento de Temperatura Regiones ricas en AT se disocian primero

Separacin de hebras y formacin de ovillos Tm : un reflejo de la composicin promedio de un ADN

Depende del contenido de GC Tm 11 12 Temperatura de disociacin T a la que la mitad del ADN est disociado

Denaturalizacin de los cidos nucleicos: Tm

Tm : un reflejo de la composicin promedio de un ADN
Se analiza mediante espectroscopa Depende del contenido de GC Tm Temperatura de disociacin T a la que la mitad del ADN est disociado

2. Renaturalizacin del ADN

Reaccin Bimolecular
Encuentro de hebra complementaria Zipping de complementarias depende del tiempo y de la concentracin de reactantes

Aplicaciones
Complejidad del genoma Bsqueda de secuencias especficas

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Reasociacin de ADN: complejidad del genoma

Permite analizar complejidad de un genoma
Secuencias repetidas reasocian rapidamente Secuencias nicas reasocian lentamente

Cintica de reasociacin del ADN genmico humano

Co t1/2 = 1 / k 2 k 2 = constante de segundo orden Co = concentracin de ADN t1/2 = tiempo medio de reaccin Fracciones obtenidas: reasociacin rpida reasociacin intermedia reasociacin lenta

rpido(repetidos) intermedio (repetido)

% DNA reasociado

50

Cot1/2 Cot1/2 Cot1/2

lento (copia nica)

0 % DNA reasociado

rpido(repetidos) intermedio (repetido)

Fracciones obtenidas: reasociacin rpida reasociacin intermedia reasociacin lenta

50

Co t1/2 Co t1/2

lento (copia nica)

100

100 log Cot 15

Co t1/2

log Co t

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3. Hibridacin de cidos nucleicos 3. Hibridacin de cidos nucleicos

Bsqueda de secuencias especficas en mezclas complejas de cidos nucleicos En soportes slidos
Southern Blot Northern Blot Dot blot Micro-arrays ADN ARN

En solucin En soportes slidos

Southern Blot Northern Blot Dot blot Micro-arrays ADN ARN
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Estructura terciaria de los cidos nucleicos: palndromes, horquillas y cruciformes

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Acidos nucleicos monocatenarios: Estructura secundaria y terciaria

Los ARN suelen adoptar distintas conformaciones, muchas de ellas estables y mantenidas por regiones autocomplementarias

Topologa y funcin
Superenrrollamiento necesario para la compactacin del ADN y su funcin In vivo la mayora del ADN est superenrrollado negativamente Esto favorece la disociacin local de las hebras, importantes durante la duplicacin y transcripcin Enzimas topoisomerasas regulan los niveles de superenrrollamiento celular Es posible que se formen estructuras alternativas debido a desenrrollamientos locales generados por superrollamiento

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Estructuras complejas de ARN

Topologa del ADN

Como hace el ADN para caber en los limitados volumenes intracelulares? Superenrrolamiento Asociacin con protenas El ADN relajado en forma B tiene 10 pb/vta. Un ADN superenrrollado tiene mas o menos pb/vta. (superenrrollamiento positivo o negativo)

Torsin (Twist) Superenrrollamiento o Retorcimiento (Writhe) Topoismeros

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Torsin y superenrrollamiento
Al superenrrollar el ADN se genera tensin, que se expresa en un desenrrollamiento local del ADN (v ariando la torsion). Al separar las hebras, se genera tensin que se resuelv e enrrollando sobre si misma la molcula de ADN (v ariando el superenrrollamiento).

Organizacin del material hereditario

Necesidad de compactacin Volumen limitado Neutralizacin de cargas del ADN

Lk = Tw + Wr
Ligazn (Linking number) Torsin (Tw ist) Superenrrollamiento o Retorcimiento (Writhe)

Organizacin funcional del ADN mecanismos de segregacin en duplicacin accesibilidad de protenas reguladoras de la expresin gnica

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El nucleoide bacteriano
El genoma bacteriano incluye un cromosoma circular y molculas pequeas circulares (plsmidos) No existe ncleo definido ADN en regin nucleoide
10,000 nm

El ncleo eucariota

El genoma nuclear humano comprende 46 molculas de ADN lineales El largo sumado de este ADN es mas de 1.5 metros El dimetro del ncleo es aprox. 10 nm

Varios dominios de 40-80 Kb superenrrollados asociado a ARN y protenas

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El nucleo interfsico

El ciclo celular
Durante la divisin se visualizan cromosomas individuales

Cromatina complejo compuesto por ADN y protenas Eucromatina zonas menos condensadas Heterocromatina zonas ms condensadas

Los cromosomas metafsicos son la forma ms condensada de la cromatina

Toda la cromatina se condensa previamente a la divisin celular

Los cromosomas son herramientas de segregacin del material hereditario Cules son los pasos de compactacin?

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La cromatina: microscopa
A partir de ncleos aislados se puede aislarse cromatina Al microscopio electrnico se observan fibras de 30 nm y collar de cuentas de 10 nm

La cromatina: bioqumica
Anlisis bioqumico Cantidades similares de ADN y protenas Digestin de ADN con nucleasas repetidos de 160-200pb Protenas bsicas HISTONAS

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Las histonas
Protenas bsicas pequeas Altamente conservadas Centro globular y colas ricas en Lys y Arg Sitios de acetilacin de Lys en colas N terminales (+) Sitios de fosforilacin en Ser en colas de H1

El octmero de histonas
Las histonas H2A y H2B forman un dmero
H1

Dos H3 y dos H4 forman un tetrmero Dos dmeros H2A-H2B y un tetrmero H3-H4 forman un octmero con forma de disco aplanado
hlice

H2A

H2B

variable

H3
Histone Fold H2A/H2B Dimer handshake

H4

conservado

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El nucleosoma
Sobre el octmero se enrrolla el ADN Cada octmero organiza 145 pb en 1 vuelta 48 nm ADN en un disco de 6x11nm Sitios distantes en el ADN se aproximan (accesibilidad) Otros sitios quedan cubiertos (en la cara interna)

Las colas de las histonas del core

Cargadas positivamente Pasan entre las vueltas de ADN Contactan con el ADN adayente y del octmero prximo

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La histona H1

El solenoide

No forma parte del octmero Organiza el ADN a la entrada y salida del octmero

Hlice nucleosomal 6 nucleosomas por vuelta

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Correlacin estructura funcin

La modificacin de histonas es VITAL en la expresin gnica La acetilacin y desacetilacin de histonas es cclica

Protenas no histonas en la cromatina

Eliminacin de histonas (Tratamiento con detergentes leves o altas concentraciones salinas) Matriz nuclear proteica y bucles de ADN unidos a la matriz

DNA loops

Colas cargadas + Se unen al ADN de nucleosomes adyacentes Alto nivel de histona H1

Colas acetiladas NO se unen al ADN Bajo nivel de histona H1

Matriz nuclear + 2M NaCl

NO es posible la transcripcin

Existe transcripcin gnica

histonas

Fibra de 30 nm

Cuentas 10 nm

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El andamiaje (scaffold)
Igual tratamiento en cromosomas metafsicos revela un esqueleto proteico del cromosoma (scaffold) del que salen bucles de ADN de 30 a 100 Kb La matriz nuclear proteica es el scaffold durante la interfase

Bucles de cromatina
Existen regiones de ADN que se unen al scaffold SARs (scaffold attachment regions) MARs (matrix attachment regions) SARs=MARs Loops of 30 90 kb

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Bucles como dominios de cromatina

Cada bucle fijado al scaffold puede presentar una estructura diferente, mas o menos condensada. Pueden ser dominios funcionalmente independientes

Visualizacin in vivo de niveles superiores de compactacin: cromosomas plumulados

A. Lampbrush chromosomes.
Cromosomas meiticos apareados parcialmente condensados y pausados durante la profase meitica para sintetizar ARNs y proteinas a ser almacenadas para el desarrollo temprano del huevo.

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Dominios condensados
Los bucles de ADN fijados al scaffold se pliegan formando una superhlice

El cromosoma metafsico
Forma de mxima compactacin de la cromatina Unidad estructural segregacional de la informacin hereditaria

radial loop chrosomosom e model Constriccin secundaria Regin organizadora nucleolar Con genes ribosomales

Cromosoma mittico

10 m

Centromero Constriccin primaria Sitio de unin de protenas que forman cinetocoro Brazos Porciones del cromosoma entre el centrmero y el telmero

1m
cromtide
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cromtide

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El cromosoma
Unidad funcional de la informacin hereditaria
Telmeros Regiones terminales de los cromosomas Secuencias repetidas particulares Mecanismo de duplicacin particular Funcin = Integridad cromosmica

Citogentica: tcnicas de estudio de los cromosomas

La CITOGENETICA analiza la cantidad y morfologa de los cromosomas Los cromosomas se pueden describir en base a la posicin del centromero Bandeo cromosmico Tratamiento desnaturalizante o enzimtico del cromosoma y posterior tincin Cada cromosoma revela un patrn especfico de bandas claras y oscuras,

Orgenes de replicacin ARS (secuencias de replicacin autnomas) Varios por cromosoma Funcin = replicacin Centrmero Constriccin primaria Rico en secuencias repetidas Sitio de unin de protenas que forman cinetocoro Funcin = segregacin

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Tcnicas de bandeo cromosmico

Revelan diferencias estructurales en la cromatina que constituye cada banda Tratamiento desnaturalizante o enzimtico y tincin Bandas oscuras y claras (1-10 Mb) Bandeo G tratamiento con tripsina Bandas claras zonas activas replicacin temprana Bandas oscuras zonas inactivas replicacin tarda Bandeo R patrn opuesto a Bandeo G Bandeo C heterocromatina constitutiva pericentromrica

Tcnicas de localizacin cromosmicas

FISH Hibridacin in situ sobre cromosomas con sondas fluorescentes

Cariotipo Espectral Multiple FISH con sondas especficas de cada cromosoma marcadas con un fluorocromo diferente

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Niveles de compactacin
mecanismos de segregacin en duplicacin

Correlacin estructura funcin

Dominios topolgicos independientes ( Regulacin independiente) Compactacin

Compactacin debida al scaffold / matriz nuclear Compactacin debida a histonas

Tamao compacto Ncleo (humano) Cromosma mittico Dominio de ADN Fibra de cromatina nucleosoma
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Represor transcripcional
DNA 12,000 Mbp 2x 130 Mbp 60 kbp 1200 bp 200 bp 1 bp longitud 4 m DNA 2x 43 mm DNA 20 m DNA 400 nm DNA 66 nm DNA 0.33 nm DNA compactado 400,000 x 10,000 x 35 x 35 x 6 - 11 x 1x
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Problemas neutralizacin de cargas del ADN Que sucede durante la duplicacin y la transcripcin?

2 x 23 = 46 cromosomas 2 cromtides, 1 m espesor Bucle de AND anclado

92 molculas ADN 2 molculas ADN 1 replicn ?

10 m esfera 10 m forma X 60 nm x 0.5 m 30 nm dimetro 6 x 11 nm 0.33 x 1.1 nm

approx. 6 nucleosomas por vuelta of 11 nm disco 1 vueltas de ADN (146 bp) + ADN linker

Par de bases