BIOTECNOLOGA TRABAJO PRACTICO DE N 2 EL MICROSCOPIO

TITULAR: ING. LETICIA CABALLERO JTP: ING. MARIELA DIAZ ALUMNO: CSAR ZALAZAR

Date: 13/09/2011.
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ndice 1. ejercicio 1 1.1. Localice las siguientes partes del microscopio y rotularlas en la Figura. 1.2. Explique brevemente las funciones de cada parte. 2. Ejercicio 2 2.1. Ordene de mayor a menor tamao las siguientes estructuras. 3. Ejercicio 3 3.1. Qu son objetivos secos? 3.2. Qu son objetivos de inmersin? 3.3. Para qu se utiliza el aceite de cedro, cuando usamos el objetivo de inmersin? 4. Ejercicio 4 4.1. Indicar si las siguientes armaciones son verdaderas (V) o falsas (F): 5. Ejercicio 5 5.1. Dos objetos separados por: 3 m? 5.2. Dos objetos separados por 0.3 m? 5.3. Dos objetos separados por 300 m? 6. Ejercicio 6 6.1. Investigue sobre el funcionamiento de los diferentes microscopios electrnicos y establezca diferencias entre ellos. 6.2. Por qu los microscopios electrnicos poseen mayor resolucin que los pticos? 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 7

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ejercicio 1

Figura 1.1. PARTES DEL MICROSCOPIO 1.1. Localice las siguientes partes del microscopio y rotularlas en la Figura. 1.2. Explique brevemente las funciones de cada parte. BASE: Sirve como base del microscopio y tiene un peso suciente para dar estabilidad al aparato. En l se integra la fuente luminosa. BRAZO: Es una columna perpendicular al pie. Puede ser arqueado o vertical y une al pie con el tubo. TUBO: Es una cmara oscura unida al brazo mediante una cremallera. Tiene el revolver con los objetivos en su parte inferior y los oculares en el extremo superior. PLATINA: Es una plataforma horizontal con un oricio central, sobre el que se coloca la preparacin, que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminacin situada por debajo. Dos pinzas sirven para retener el portaobjetos sobre la platina y un sistema de cremallera guiado por dos tornillos de desplazamiento permite mover la preparacin de delante hacia atrs o de izquierda a derecha y viceversa. En la parte posterior de uno de los laterales se encuentra un nonius que permite jar las coordenadas de cualquier campo ptico; de esta forma se puede acudir a el cuando interesa. REVOLVER: Es un sistema que coge los objetivos, y que rueda para utilizar un objetivo u otro. TORNILLOS MACRO Y MICROMTRICO: Son tornillos de enfoque, mueven la platina hacia arriba y hacia abajo. El macromtrico lo hace de forma rpida y el micromtrico de forma lenta. Llevan incorporado un mando de bloqueo que ja la platina a una determinada altura.
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FUENTE DE ILUMINACIN: Se trata de una lmpara halgena de intensidad graduable. Esta situada en el pie del microscopio. Se enciende y se apaga con un interruptor y en su supercie externa puede tener una especie de anillo para colocar ltros que facilitan la visualizacin. CONDENSADOR Y DIAFRAGMA: El condensador es un sistema de lentes situadas bajo la platina su funcin es la de concentrar la luz generada por la fuente de iluminacin hacia la preparacin. En el interior del condensador existe un diafragma (iris) cuya funcin es limitar el haz de rayos que atraviesa el sistema de lentes eliminando los rayos demasiado desviados (regula la cantidad de luz y ajusta la Apertura Numrica). OCULARES: Estn colocados en la parte superior del tubo. Se denominan as, porque estn muy cercanos al ojo. Su funcin es la de captar y ampliar la imagen formada en en los objetivos. En los modernos microscopios hay dos oculares (microscopios binoculares) que estn unidos mediante un mecanismo que permite ajustar la distancia interpupilar. En general los ms utilizados son los de 10X ( producen un aumento de 10 veces ). OBJETIVOS: Estn colocados en la parte inferior del tubo insertados en una pieza metlica, denominada revolver, que permite cambiarlos fcilmente. Generan una imagen real, invertida y aumentada. Los ms frecuentes son los de 4, 10, 40, y 100 aumentos. Este ltimo se llama de inmersin ya que para su utilizacin se necesita utilizar aceite de cedro sobre la preparacin. En la supercie de cada objetivo se indican sus caractersticas principales, aumento, apertura numrica, y llevan dibujado un anillo coloreado que indica el nmero de aumentos (rojo 4X, amarillo 10X, azul 40X y blanco 100X). 2. Ejercicio 2

2.1. Ordene de mayor a menor tamao las siguientes estructuras. Ribosomas (0,1-1 m); Clula vegetal (0,02mm); Membrana (0,005-0,01 m); Ameba (100000nm); Hemoglobina (50 ), e indique con qu tipo de microscopio las identicara. (deber unicar unidades) De mayor a menor: 1. Ameba (100000nm)=100 m microscopio ptico. 2. Clula vegetal (0,02mm)= 20 m- microscopio ptico. 3. Ribosomas (0,1-1 m)- Microscopio de campo claro. 4. Membrana (0,005-0,01 m)- microscopio electrnico. 5. Hemoglobina (50 )= 0,005 m- microscopio electrnico. 3. 3.1. Qu son objetivos secos? Ejercicio 3

3.2. Qu son objetivos de inmersin? Los microscopios generan una imagen real, invertida y aumentada. Los ms frecuentes son los de 4, 10, 40, y 100 aumentos. Los tres primeros se denominan objetivos secos o de lente seca, en cambio el ltimo de los aumentos se llama de inmersin ya que para su utilizacin se necesita utilizar aceite de cedro sobre la preparacin 3.3. Para qu se utiliza el aceite de cedro, cuando usamos el objetivo de inmersin? La lente de inmersin debe sumergirse en aceite de cedro u otro medio cuyo ndice de refraccin sea prximo al del vidrio
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Ejercicio 4

4.1. Indicar si las siguientes armaciones son verdaderas (V) o falsas (F):. 1. A mayor poder de resolucin, menor es el lmite de resolucin. V 2. A mayor poder de resolucin, mayor es el lmite de resolucin. F (menor lmite de resolucin) 3. A menor poder de resolucin, menor es el lmite de resolucin. F (mayor limite de resolucin) 4. El lmite de resolucin es inversamente proporcional a la apertura numrica del objetivo. V 5. El lmite de resolucin es directamente proporcional a la longitud de onda de la fuente de energa empleada. F ( si aumento la lonta el poder de resolucngitud de onda aumenta el poder de resolucin y en consecuencia disminuye el lmite de resolucin)

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Ejercicio 5

Usando un microscopio ptico de un poder de resolucin de 0.3 m, lentes oculares 10X y objetivo de inmersin 100X. Usted sera capaz de discernir, 5.1. Dos objetos separados por: 3 m? Los Objetivos Separados A 3M Con La Resolucin Optica De 0,3 M Del Microscopio Si Se Puede Discernir Claramente. 5.2. Dos objetos separados por 0.3 m? Para Dos Objetivos Separdos A 0,3 M El Microscopio No Puede Discernir Entre Ellos, Se Los Observa Como Un Solo Punto. 5.3. Dos objetos separados por 300 m? Para El ltimo Caso De Dos Objetivos Separados 300 M Con El Microscopio Se Los Diferecia Muy Claramente.

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Ejercicio 6

6.1. Investigue sobre el funcionamiento de los diferentes microscopios electrnicos y establezca diferencias entre ellos. En el microscopio electrnico, un haz de electrones incide sobre una muestra y de la interaccin de estos electrones con los tomos de la misma, surgen seales que son captadas por algn detector o bien, proyectadas directamente sobre una pantalla. Dentro de la familia de microscopios electrnicos, se encuentran el microscopio electrnico de transmisin (TEM) y el microscopio electrnico de barrido (SEM). Cada uno de ellos, permite el estudio de diferentes caractersticas de una muestra. El SEM provee informacin sobre morfologa y caractersticas de la supercie, mientras que con el TEM podemos observar la estructura interna y detalles ultra estructurales. Un gran avance se ha alcanzado con la incorporacin de tcnicas de procesamiento de imgenes para revelar detalles especcos de inters, algunos de ellos ligados a la ultra estructura de la muestra.
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Figura 6.1. MICROSCOPIO ELECTRNICO DE TRANSMISIN 6.1.1. MICROSCOPIO ELECTRNICO DE TRANSMISIN. EL INSTRUMENTO: El sistema ptico-electrnico del microscopio electrnico de transmisin est constituido por las siguientes partes: Can de electrones Sistema de lentes Pantalla uorescente Estos componentes estn ensamblados en una columna vertical la cual se encuentra en alto vaco. El can de electrones, es la fuente emisora del haz de electrones. Se encuentra ubicado en la parte superior de la columna. Est constitudo por un lamento (ctodo), un cilindro con una apertura central, llamado cilindro de Wehnelt que rodea al lamento y tiene un potencial ligeramente ms negativo que ste. El nodo se encuentra por debajo del cilindro de Wehnelt. El lamento es calentado por el pasaje de corriente (alrededor de 2800 K). Los electrones emitidos termoinicamente por el ctodo son acelerados hacia el nodo, pasan por la apertura circular central de ste y un haz de alta energa es emitido hacia la columna del microscopio. El sistema de lentes est formado por lentes condensadores objetivo, intermedia y proyectora. Las lentes condensadoras, en los microscopios, ms modernos son dos. La primera, proyecta la imagen punto de entrecruzamiento demagnicada (spot size), mientras que la segunda controla su dimetro y el ngulo de convergencia en que incide sobre la muestra. limita al haz que incide sobre la muestra. La lente objetivo forma la primera imagen, localizada debajo del especmen. Es considerada el componente ms importante del microscopio electrnico. Cualquier defecto en sta, ser magnicado y transmitido al resto del sistema ptico. Por lo tanto, de ella dependen, en gran medida, la resolucin nal y la correccin de las aberraciones. Las lentes intermedia y proyectora son las encargadas de amplicar la imagen dada por la lente objetivo y proyectarla sobre la pantalla uorescente. La pantalla del microscopio electrnico de transmisin est recubierta por una pintura de uoruros
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de Zn y Cd, que uoresce cuando es bombardeada por electrones, generando una imagen en el rango de las longitudes de onda del visible. Mediante el microscopio electrnico de transmisin podemos estudiar la ultraestruacura de un material orgnico o inorgnico. Para esto, existen diferentes formas de operacin que posibilitan el estudio de una caracterstica en particular. Entre las aplicaciones del TEM para el estudio de materiales no- biolgicos y biolgicos podemos nombrar : 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. Determinacin de estructura cristalina en minerales, metales, etc. Estudio de catalizadores. 3. Determinacin de impurezas, precipitados,etc. Identicacin de bordes de grano e interfaces en metales. Estudio de fases y zonas cristalinas en polmeros. Determinacin de tamao de partcula en catalizadores, minerales,etc. Identicacin de planos cristalinos. Cambios estructurales de materiales sometidos a diferentes tratamientos trmicos. Realizacin de estudios de histoqumica para identicxar compuestos especcos. Estudios de ultraestructura de tejidos vegetales y animales. Reconocimiento de virus. Estudios de citoqumica. Estudios de estructuras moleculares.

6.1.2. MICROSCOPIA ELECTRONICA DE BARRIDO (SEM). El microscopio electrnico de barrido (SEM) es similar al microscopio electrnico de transmisin. Ambos tienen ciertas caractersticas comunes tales como un can de electrones donde se genera el haz de electrones, lentes condensadoras y objetivo, sistema de vaco. La diferencia principal entre ellos es la manera en que forman y magnican la imagen. Esto hace que la informacin que se obtenga de cada uno sea distinta. Mientras el TEM permite el estudio de la ultraestructura de muestras delgadas, el SEM posibilita conocer la morfologa supercial. En el microscopio electrnico de barrido, el haz electrnico, atraviesa la columna y llega a la muestra. Un generador de barrido es el responsable de producir el movimiento del haz , de manera que barra la muestra punto a punto. De la interaccin entre los electrones incidentes con los tomos que componen la muestra se generan seales, las cuales pueden ser captadas con detectores adecuados para cada una de ellas. El detector capta una seal y las convierte en una seal electrnica que es proyectada en un tubo de rayos catdicos (CRT). El barrido del haz est sincronizado con el barrido del CRT y produce una relacin uno a uno entre puntos de la muestra y puntos en el CRT. Un esquema del SEM se muestra en la siguiente gura. Mediante el SEM se estudian: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Morfologa supercial de minerales, catalizadores, etc. Electrodepsitos Adherencia bra-matrz en polmeros. Cambios morfolgicos de materiales sometidos a tratamientos qumicos. Formas de cristalizacin de minerales. Control de calidad de catalizadores industriales. Morfologa supercial interna de partculas polimricas. Morfologa de tejidos u rgano animales y vegetales.
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Figura 6.2. MICROSCOPIO ELECTRNICO DE BARRIDO (SEM) 9. Estudio de molculas 10. Reconocimiento de fsiles. 6.1.3. INTERACCION HAZ INCIDENTE - MUESTRA EN EL SEM.. Naturaleza de la interaccin: Cuando el haz de electrones choca contra la muestra, ocurren interacciones entre dichos electrones y los tomos que componen la muestra. De all surgen seales tales como: electrones secundarios, electrones retrodifundidos, rayos x caractersticos, electrones Auger, catodoluminiscencia. Todas estas seales se producen simultneamente pero cada una de ellas son captadas por detectores diferentes. Uno de los detectores ms comunes es el de electrones secundarios. Los mismos son emitidos desde la muestra como consecuencia de las ionizaciones surgidas de las interacciones inelsticas. Por esta razn, poseen baja energa (50 ev). Ellos brindan una imagen de la morfologa supercial de la muestra. 6.1.4. UNIDADES DE MEDIDA EN MICROSCOPIA. La unidad que se usa en microscopa de luz es el micrn () que es la milsima parte del milmetro. En microscopa electrnica la unidad ms conocida es el angstrom (), denido como la diez millonsima parte del milmetro. Tambin se emplea el nanometro (nm), que es la millonsima parte del micrn. 1 mm = 103 = 106 nm = 107 As, por ejemplo, la resolucin de un microscopio de luz es 0.25 2500 ; y la de un microscopio electrnico de 2.5
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6.2. Por qu los microscopios electrnicos poseen mayor resolucin que los pticos? 6.2.1. COMPARACIN ENTRE MICROSCOPIOS DE LUZ Y ELECTRNICO. Los microscopios de luz y electrnico son esencialmente, idnticos. Tanto uno como otro nos permiten amplicar aquellos objetos que son indistinguibles a nuestro ojo. La diferencia fundamental entre los dos es la fuente de iluminacin. Mientras el microscopio de luz utiliza un haz de luz en el rango de las longitudes de onda del visible, el microscopio electrnico emplea un haz de electrones de muy corta longitud de onda que permite obtener una mayor resolucin. Una tabla comparativa, entre ambos microscopios se muestra a continuacin. Cabe destacar que la misma, involucra caractersticas generales de los microscopios electrnicos y no considera las diferencias particulares entre TEM y SEM. de los microscopios electrnicos y no considera las diferencias particulares entre TEM y SEM. MICROSCOPIO DE LUZ MICROSCOPIO ELECTRNICO Iluminacin Haz de luz Haz de electrones Longitud de onda 2000 - 7500 0.037 - 0.086 Lentes Vidrio Electromagnticas Medio Atmsfera Vaco Resolucin 2000 3 Magnicacin 10 x - 2000 x 100 x - 450000 x Focalizacin Mecnica Elctrica Contraste Absorcin - Reexin Scattering El concepto de resolucin est relacionado con la capacidad de distinguir detalles nos en una imagen. En otras palabras, es la distancia mnima r1 a la cual podemos distinguir, claramente, dos puntos como entidades separadas. La resolucin terica del microscopio electrnico es: 6.2.2. NATURALEZA DE LAS ONDAS DE ELECTRONES. De Broglie mostr que una partcula movindose a una velocidad cercana a la de la luz tena una forma de radiacin asociada con ella. Esta relacin est expresada por: donde es la longitud de onda, h la constante de Plank, m la masa de la partcula y v su velocidad. Si la partcula es un electrn y su velocidad 1/3 de la velocidad de la luz, = 0.05 A. que es 100.000 veces ms corta que la luz verde. Por lo tanto, la resolucin de un microscopio que emplee este tipo de radiacin ser mucho mejor que la de un microscopio de luz. La naturaleza precisa de estas ondas de electrones es difcil de entender en trminos de la fsica clsica y su descripcin se hace mediante la mecnica cuntica. Las ondas de electrones se pueden pensar como un quantum o paquete de radiacin que acompaa a cada electrn en su trayectoria, es parte de l y permanece con l. Las caractersticas de estas ondas dependen de la posicin exacta de un dado electrn en el espacio y en el tiempo; puede expresarse como la probabilidad de encontrar al electrn en esa posicin. Las ondas de electrones no deben confundirse con radiacin electromagntica, como la que se produce cuando un haz electrnico interactua con la materia, pierde
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energa y produce una radiacin cuya longitud de onda pertenece al espectro electromagntico.
Avda. Rotter s/n, Plaza Huincul, Neuqun, Argentina. Facultad Regional del Neuqun. Universidad Nacional Tecnolgica. E-mail address: zalazar_cesar@yahoo.com.ar-zalazarxcesar@gmail.com