Técnicas cromatográficas UNAM

Universidad Nacional Autnoma de Mxico
Facultad de Qumica Qumica Analtica Instrumental II
Tcnicas Cromatogrficas
Diciembre de 2007
Introduccin a los mtodos de separacin
Captulo 1. Introduccin a los mtodos de separacin

1.1 Introduccin a la cromatografa
En 1906, el botnico Ruso M. Tswett realiz un experimento que condujo al descubrimiento de lo que hoy conocemos como cromatografa. Coloc un extracto de pigmentos vegetales en la parte superior de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio (CaCO3). Al agregar ter, observ que la mezcla original se separaba en diversas bandas coloridas que descendan a travs de la columna a diferentes velocidades. Un rasgo caracterstico de la cromatografa es la presencia de dos fases; dispuestas de tal manera que mientras una permanece estacionaria dentro del sistema (fase estacionaria), la otra se desplaza a lo largo de l (fase mvil). La clave de la separacin en cromatografa es que la velocidad con la que se mueve cada sustancia depende de su afinidad relativa por ambas fases (equilibrio de distribucin). En el experimento de Tswett, la separacin de los pigmentos vegetales se logr gracias a que cada uno de ellos tena una afinidad diferente por las fases. En general, los componentes ms afines a la fase estacionaria avanzan lentamente (ms retenidos) mientras que los ms afines a la fase mvil (menos retenidos) se mueven con mayor rapidez. Por consecuencia, el medio cromatogrfico (columna, placa o papel) funciona como un controlador de la velocidad de cada sustancia que constituye la mezcla, logrando as su separacin y mediante el uso de un detector, su caracterizacin qumica. Aunque los principios fundamentales son los mismos, se acostumbra clasificar los mtodos cromatogrficos segn el estado fsico de la fase mvil: Cromatografa lquida. La fase mvil es un disolvente o mezcla de disolventes y la fase estacionaria un slido que interacta con las sustancias que se desea separar (cromatografa lquido-slido), o bien un lquido inmiscible con la fase mvil, depositado en la superficie de un slido (cromatografa lquidolquido). Esta forma de cromatografa puede realizarse con diferentes arreglos experimentales: en columna, en capa delgada o en papel. En el primer caso, la fase estacionaria se encuentra rellenando un tubo; en el segundo, se dispersa sobre una lmina de vidrio o aluminio formando un lecho de espesor uniforme; en la cromatografa en papel, la fase estacionaria es la solucin acuosa contenida en el interior de las celdas formadas por las fibras de la celulosa, y es por tanto una forma de cromatografa lquidolquido. Captulo 1 1

Cromatografa de gases. En este caso la fase mvil es un gas inerte (helio o nitrgeno) y la fase estacionaria es un slido (cromatografa gas-slido) o un lquido sostenido por un slido inerte (cromatografa gas-lquido). Este tipo de cromatografa siempre es en columna, ya que es la nica manera de que la fase mvil gaseosa se mantenga fluyendo, confinada dentro del sistema. La columna puede estar rellena con la fase estacionaria, en forma semejante a la cromatografa lquida, o bien la fase estacionaria puede depositarse sobre las paredes de un tubo muy delgado (0.25mm de dimetro) y largo (hasta 100m). Este tipo de columnas se conocen como columnas capilares y proporcionan la mayor capacidad de separacin. De acuerdo con el mecanismo de retencin, la cromatografa se puede clasificar en los siguientes tipos: adsorcin (normal, de fase reversa) particin lquido-lquido intercambio inico permeacin sobre gel de afinidad
Las reas de aplicacin son muy diversas y abarcan prcticamente todas las actividades en las que interviene la qumica, por ejemplo: se emplea en: El anlisis de drogas y frmacos en fluidos biolgicos como la saliva, la sangre, la orina; Seguir la transformacin de las sustancias responsables de la transmisin neurolgica; Determinar la presencia de contaminantes en el medio ambiente; Descifrar la composicin de los combustibles fsiles; Realizar el control de calidad de los productos qumicos y farmacuticos manufacturados; en fin, la lista de ejemplos es interminable.
1.2 Cromatografa en papel

La cromatografa en papel es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar anlisis cualitativos ya que pese a no ser una tcnica potente no requiere de ningn tipo de equipamiento. La fase estacionaria est constituida simplemente por una tira de papel de filtro. La muestra se deposita en un extremo colocando pequeas gotas de la disolucin y evaporando el disolvente. Luego el disolvente empleado como fase mvil se hace ascender por capilaridad. La separacin se realiza en funcin de la afinidad de los solutos con las dos fases, las ms solubles en agua se quedarn cerca del punto donde se aplic la muestra, y las menos solubles en agua y ms solubles en el disolvente llegarn ms lejos. Las sustancias separadas se identifican mediante diversos procedimientos fsicos o qumicos
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La cromatografa en papel es una tcnica utilizada para anlisis inorgnico cualitativo, permite llevar a cabo la separacin e identificacin de iones, trabajando con cantidades mnimas de sustancia. Pertenece al tipo de Cromatografa de particin se fundamenta en que las sustancias problema, pueden tener diferentes coeficientes de reparto en dos disolventes de inmiscibilidad limitada, uno permanece fijo en la superficie del papel fase estacionaria generalmente en agua, la fase mvil constituida generalmente por una mezcla de disolventes parcialmente miscibles en ella. Hay varios tipos de cromatografa, la ascendente (papel hacia arriba), descendente (papel invertido), radial y de separacin de zonas y sectores.
Al entrar en contacto con los disolventes empieza su fase de movilidad lo que produce unas manchas caractersticas sobre el papel, generalmente, estas no son coloreadas y se revelan con una lmpara fluorescente, los contornos se marcan con lpiz. Como medida en cromatografa sobre papel se emplea el Rf (Retention factor), el cual se define como el cociente de dividir el recorrido de la sustancia por el disolvente, esto es, la distancia media desde el origen hasta el centro de la mancha (X) dividida por la distancia que media desde el origen hasta el frente del disolvente (S). =

[1]
En la cromatografa en papel se utiliza como fase estacionaria una hoja de papel de celulosa de elevada pureza recubierta de una capa de agua asociada a las fibras de celulosa. La fase mvil, en la que ir disuelta la muestra, se forma por disolventes cuya naturaleza se elige en funcin de los componentes que se pretenden separar.
1.3 Cromatografa en capa fina

La cromatografa en capa fina se basa en la preparacin de una capa, uniforme, de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales son, pues, un adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensin, otro para Captulo 1 3

aplicar la capa de adsorbente, y una cmara en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es preciso tambin poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas. La fase mvil es lquida y la fase estacionaria consiste en un slido. La fase estacionaria ser un componente polar y el eluyente ser por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad sern los menos polares. Polaridad de los compuestos orgnicos en orden creciente: hidrocarburos < olefinas < flor < cloro < nitro < aldehdo aldehdo < ester < alcohol < cetonas < aminas < cidos < amidas La cromatografa en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros mtodos cromatogrficos (en columna, en papel, en fase gaseosa) ya que el utillaje que precisa es ms simple. El tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la separacin es generalmente mejor. Pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre papel destruiran el cromatograma. El mtodo es simple y los resultados son fcilmente reproducibles, lo que hace que sea un mtodo adecuado para fines analticos. Al realizar la eleccin del adsorbente se debe tener en cuenta el tamao de las partculas del adsorbente, cuanto ms finamente dividido est mayor ser su adhesin al soporte, aunque tambin se le puede aadir un adherente. En la eleccin del eluyente influyen varios factores:

Precio. Pureza. No utilizar mezclas de eluyentes
No utilizar compuestos muy voltiles. Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores).
(reproducibilidad). La eleccin del eluyente se realiza de forma emprica. Hay que estudiar la polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez menos polares.
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Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados con los componentes orgnicos (con tonos amarillo-marrn), pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente sealar las manchas aparecidas. Otro reactivo revelador bastante utilizado es el cido sulfrico, que reacciona con los componentes orgnicos produciendo manchas negras. Sin embargo debe tenerse en cuenta que el tamao de las manchas no est relacionado con la cantidad de componente separado.
1.4 Cromatografa de permeacin en gel

La cromatografa de permeacin en gel, tambin conocida como cromatografa de exclusin es una variante de la CLAE que consiste en una columna cromatogrfica empacada de tal manera que las partculas de dicho empacamiento tienen diferentes tamaos de poros o de redes de poros con el fin de que las molculas de soluto sean retenidas o excluidas basndose en su forma y tamao y no en el peso molecular. Bajo este entendido, las molculas de mayor tamao no caben dentro de los poros y son arrastrados alrededor de la fase estacionaria, por lo que son excluidas y eluyen en el volumen de cama de vaco de la fase mvil. Por el contrario, las partculas de menor tamao eluyen hasta el final porque tiene ms espacio de columna que recorrer debido a un fenmeno de difusin haca los poros que tienen accesibles. Las molculas de tamaos intermedios tardan diferentes tiempos en eluir, debido a la cantidad de poros por los que puedan pasar. Empaquetamientos de columna. Existen distintos tipos de empacamientos columna. Entre ellos estn los polmeros macromoleculares semirgidos, los entrecruzados, las slices rgidas las de poro controlado. Los materiales semirgidos se hinchan ligeramente se debe tener cierto cuidado en su uso ya que se limitan a una presin de 300psi. Las cuentas de poliestireno parcialmente sulfonado que tienen un tamao usual de 5m, son buenas para usarse con sistemas acuosos mientras los no sulfonados son compatibles con sistemas no acosos. Captulo 1 5

Otro tipo de empacamiento hidroflico poroso es preparado mediante una polimerizacin por suspensin de metacrilato de 2-hidroxietilo con dimetacrilato de etileno. Estos empacamientos resisten presiones de hasta 3000psi y pueden ser usados con sistemas acuosos y una amplia gama de disolventes orgnicos polares. Disolventes. La cromatografa de exclusin requiere un solo disolvente durante el anlisis en el cual se pueda disolver la muestra. El nico inconveniente que pude presentarse con los disolventes es la relacin de viscosidades. Cuando la viscosidad de la muestra inyectada difiere mucho con la viscosidad de la fase mvil se pueden dar, una distorsin en los picos cromatogrficos y cambios anmalos en los tiempos de retencin.
1.5 Cromatografa de exclusin de iones

Una variante de la cromatografa de permeacin en gel o cromatografa de exclusin, es cuando se realiza para la exclusin de iones. Mediante esta modificacin, se tienen separaciones que dependen de factores como tamao de partcula de la resina, forma inica e incluso distribucin de ismeros. Esto permite separar especies que de otra forma eluiran al mismo tiempo. Las separaciones se llevan a cabo en resinas de intercambio con base en poliestireno de alta capacidad como eluyentes, cidos minerales diluidos. Mucho del trabajo en la industria de alimentos y bebidas (vino, cerveza, jugo de frutas, etc.) o de muestras fisiolgicas en donde la mayora de los cidos del ciclo de Krebs estn presentes, puede ser hecho fcilmente mediante el uso de una columna de exclusin aninica. El uso de las columnas de exclusin aninica, en su modalidad con iones de calcio, se extiende a la separacin de oligosacridos usando agua como eluyente a una temperatura de 90C, aplicando tambin la separacin por exclusin estrica.
1.6 Cromatografa de intercambio inico

La cromatografa de intercambio inico se lleva a cabo con empaques de columna que tiene grupos funcionales cargados unidos a una matriz polimrica. Los grupos funcionales enlazados permanentemente y asociados con contraiones de carga opuesta. El mecanismo de retencin ms comn es el intercambio simple de los iones de la muestra y de la fase mvil con el grupo cargado de la fase estacionaria. En el caso de empaques cargados negativamente sirven para intercambiar especies catinicas. Los ms comunes son los sulfnicos, los cuales son fuertemente cidos y tiene las propiedades de los Captulo 1 6

cidos fuertes cuando est en la forma H. los empaques cargados positivamente se utilizan para el intercambio con especies aninicas. Los ms comunes son las aminas cuaternarias, las cuales son fuertemente bsicas y en su forma OH presentan las propiedades de una base fuerte. Ambos grupos funcionales estn totalmente disociados. As, sus propiedades de intercambio son independientes del pH de la fase mvil. La cromatografa de intercambio inico puede efectuarse con alguno de los varios tipos de empaques. El tipo pelicular consiste en un recubrimiento de resina, alrededor de 1-2m de espesor, sobre una cuenta de vidrio con dimetro de 30-40m. Las resinas superficialmente porosas se obtienen recubriendo cuentas de vidrio con un lecho delgado de microesferas de slice en el que se impregna o enlaza un intercambiador de iones. Para ambos tipos de empaques la capacidad de intercambio es baja: 0.01- 0.1 meq/g. El intercambiador puede tambin estar enlazado a macropartculas de slice por medio de reacciones de sililacin o polimerizado dentro de los poros de un gel suficientemente poroso. El proceso primario en la cromatografa de intercambio inico involucra la adsorcin/desorcin de materiales inicos cargados en la fase mvil con una fase estacionara permanentemente cargadas (de signo contrario). Ejemplo, una resina ionizada, inicialmente en forma H, en contacto con una solucin que contiene iones K+, existe un equilibrio: resina, H + K+ resina, K+ + H+
Las diferencias de retencin estn gobernadas esencialmente por las propiedades fsicas de los iones solvatados. La fase de resina presenta preferencia por: 1. El ion de carga mayor. 2. El ion con menor radio solvatado. 3. El ion que tenga mayor polarizabilidad. Aplicaciones de intercambio catinico: Los cationes inorgnicos se pueden determinar en alimentos, tales como los alimentos dietticos bajos en sodio, y en muestras de orina. Aplicaciones de intercambio aninico: Se pueden separar los cidos HCN, carbnico, silcico y brico de los cidos fosfrico, sulfrico y clorhdrico. Los metales que forman complejos cloruro y floruro. Captulo 1 7
1.7 Cromatografa de fluidos supercrticos

La temperatura crtica de una sustancia es la temperatura por encima de la cual no puede existir en la fase lquida independientemente de la presin. La presin crtica es la presin de vapor de una sustancia a su temperatura crtica. Una sustancia a temperaturas y presiones por encima de su temperatura y de su presin crtica (punto crtico) se denomina fluido supercrtico. Los fluidos supercrticos tienen densidades, viscosidades y otras propiedades que son intermedias entre las caractersticas de esa sustancia en estado gaseoso y en estado lquido. Comparacin de las propiedades de los fluidos supercrticos con las de gases y lquidos. (Los datos slo indican el grado de magnitud).
GAS Densidad (g/cm3) Coeficiente de difusin (cm2/s) Viscosidad (g cm-1 s-1) (0,6-2)*10-3 (1-4) * 10-1 (1-3)* 10-4
FLUIDO SUPERCRTICO 0,2- 0,5 10-3 10-4 (1-3) * 10-4
LQUIDO 0,6- 2 (0,2 2)* 10-5 (0,2- 3)* 10-2
Las propiedades seleccionadas son aquellas que son significativas para la cromatografa de gases, lquidos y fluidos supercrticos, as como la extraccin de fluidos supercrticos. Una propiedad importante de los fluidos supercrticos, que est relacionada con sus densidades elevadas (de 0,2 a 0,5 g/cm3), es su notable capacidad para disolver molculas grandes no voltiles. Por ejemplo, el dixido de carbono supercrtico disuelve fcilmente n- alcanos que poseen entre 5 y 30 tomos de carbono. Una segunda propiedad notable de los fluidos supercrticos es que los analitos disueltos en ellos pueden ser fcilmente recuperados por el procedimiento simple de permitir que las disoluciones se equilibren con la atmsfera a temperaturas relativamente bajas. Otra ventaja de los fluidos supercrticos es que son baratos, inocuos y no son sustancias txicas, por lo que se pueden dejar evaporar libremente en la atmsfera sin efectos ambientales dainos. La cromatografa de fluidos supercrticos (SFC) es una modalidad hbrida entre la cromatografa de gases y de lquidos que combina algunas caractersticas de cada una de ellas. Esta tcnica es una de los tres tipos importantes de cromatografa en columna, sta permite la separacin y determinacin de compuestos que no son manipulados ni por la cromatografa de gases ni por la de lquidos: compuestos no voltiles o trmicamente lbiles para los que la cromatografa de gases es inaplicable y (2) los
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compuestos que tienen grupos funcionales que no son detectables por las tcnicas espectroscpicas o electroqumicas empleadas en cromatografa de lquidos. Los equipos instrumentales para la cromatografa de fluidos supercrticos son bastante parecidos en lo referente a los componentes instrumentales a los equipos de HPLC. Existen, sin embargo, dos diferencias importantes: (1) Es necesario un horno, similar para mantener la columna termostatizada y adems proporcionar un control preciso de la temperatura de la fase mvil; (2) un restrictor o un dispositivo de contrapresin, que se utiliza para mantener la presin en la columna en el nivel deseado y para convertir el eluyente, de fluido supercrtico en un gas, y arrastrarlo al detector. Las variaciones de presin en cromatografa de fluidos supercrticos tienen un efecto muy marcado sobre el factor retencin o de capacidad, k. Este efecto es una consecuencia del incremento de la densidad de la fase mvil a medida que aumenta la presin. Tal incremento de la densidad origina un aumento de la capacidad disolvente de la fase mvil, lo cual acorta los tiempos de elucin. La mayora de los perfiles de presin utilizados en cromatografa de fluidos supercrticos son: presin constante (isobrica) para un perodo de tiempo dado seguida de un aumento lineal o asinttico de la presin hasta alcanzar el valor de la presin final. Fases estacionarias. En SFC se emplean tanto las columnas abiertas como las columnas rellenas, aunque las primeras son las ms empleadas. Las columnas abiertas son similares a las columnas de slice fundida con recubrimientos internos de varios tipos de siloxanos enlazados y de enlaces cruzados. Las columnas tienen una longitud de 10 a 20 m y un dimetro interno de 0,05 a 0.10 mm. El espesor de la pelcula vara entre 0.05 1 micrmetro. Fases mviles. La fase mvil ms utilizada en SFC es el CO2. Es un disolvente excelente par un conjunto de molculas orgnicas no polares. Adems, es una sustancia transparente en el ultravioleta, es colora, no txica, fcilmente disponible y muy barata cuando se compara con otras fases mviles cromatogrficas. La temperatura crtica del CO2 ES 31 C y su presin crtica 72,9 atmsferas, lo cual permite jugar con una banda amplia de temperaturas y presiones sin superar las condiciones de operacin de un equipo de HPLC moderno. Sustancias como etano, butano, xido nitroso, diclorodifluorometano, ter dietlico, amonaco y tetrahidrofurano han sido utilizadas como fases mviles de cromatografa de fluidos supercrticos. Detectores. La principal ventaja de la SFC frente al HPLC es que se pueden utilizar como en la cromatografa de gases, detectores de ionizacin de llama. Este detector es de respuesta universal a compuestos orgnicos, de elevada sensibilidad. Los espectrmetros de masas tambin se pueden Captulo 1 9

adaptar como detectores ms fcilmente para SFC que para HPLC. Otros detectores utilizados son de absorcin en el ultravioleta y en el infrarrojo, de emisin de fluorescencia, termoinico y fotomtrico de llama. La cromatografa de fluidos supercrticos se ha aplicado a la separacin de un amplio conjunto de sustancias, entre los que se cuentan productos naturales, frmacos, alimentos, pesticidas y herbicidas, tensoactivos, polmeros, aditivos de polmeros, combustibles fsiles y explosivos y propelentes.
1.8 Cromatografa de afinidad

La cromatografa de afinidad separa las protenas (analitos) en funcin de su especificidad de fijacin de ligandos. Los ligandos de afinidad son molculas polimricas que sirven de soporte porque estn unidas covalentemente sobre la columna cromatogrfica o matriz inerte que debe de tener una estructura de poro abierta y estabilidad en condiciones de cambio de pH, detergentes y agentes disociantes, para as, retener y adsorber especficamente a las protenas, la fase estacionaria es slida. Estos ligandos se clasifican segn su naturaleza qumica o su selectividad para la retencin de analitos, esta ltima se clasifica en ligandos especficos (anticuerpos) y generales (como las lecitinas). Cuando las protenas no especficas se han lavado a travs de la columna, se eluye la protena ligada con solucin que contiene ligando libre. Despus se introduce una nueva fase mvil que se desactiva, generalmente por el acoplamiento o alteracin de los sitios activos inhibidor-ligando, para que esto pueda ser posible, se necesita un cambio en el pH, la fuerza inica o la polaridad, debido a que estas condiciones modifican las caractersticas de los sitios activos, la finalidad de este proceso es hacer fluir a la protena para continuar con la regeneracin de la columna cromatogrfica. La cromatografa de afinidad tiene la ventaja de ser altamente selectiva para la retencin de protenas afines a la columna, para ello, emplea sistemas de baja presin, columnas cortas y un campo restringido para la separacin. Esquema de cromatografa de afinidad: En el primer vaso, se encuentra una mezcla de protenas que se aaden a la columna, la cual contiene un ligando especfico ligado al polmero, para la protena de inters. En el segundo matraz se encuentra una solucin de ligando, el cual se aade a una probeta para que eluya a la protena de inters. La bureta de en medio indica que las protenas deseadas se lavan a travs de la columna. Los puntos rojos representan la protena de inters, los negros, el ligando y las bolas beige unidas a los puntos negros, representan el ligando acoplado con el polmero. Captulo 1 10
1.9 Cromatografa de lquidos de alta resolucin

La cromatografa de lquidos de alta eficacia es la tcnica analtica de separacin ms ampliamente utilizada. Las razones son la sensibilidad, su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas, es ideal para la separacin de especies no voltiles o termolbiles y por su gran aplicabilidad a sustancias que son de inters en la industria. Algunos ejemplos son: aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, frmacos, terpenoides, plaguicidas, antibiticos, esteroides, especies organometlicas y gran variedad de sustancias inorgnicas. La fase mvil es un lquido y la fase estacionaria es una columna que puede ser de acero inoxidable.
1.10 Electroforesis
Los orgenes de sta tcnica se remontan a los trabajos de Tiselius en 1973, quien logr separar mezclas de protenas (micelas cargadas elctricamente) por su distinta movilidad en un soporte poroso al que se aplicaba un campo elctrico. Posteriormente se ha aplicado a la separacin de cualquier especie cargada o alrededor de una doble capa elctrica. El fundamento de la tcnica consiste en depositar sobre un medio poroso una mezcla de especies cargadas. Por aplicacin de un campo elctrico entre los extremos del soporte poroso las especies se separan en funcin de sus cargas y su movilidad inica en ese medio. Cuanto ms elevado sean el voltaje y la intensidad en menos tiempo se produce la separacin; sin embargo valores altos de estas variables provocan un aumento de temperatura, con la consiguiente evaporacin del disolvente y acumulacin de sales del tampn, lo cual es indeseable. Para favorecer el paso de corriente se utilizan disoluciones fondo conductoras (electrolitos) que son disoluciones reguladoras en las que se empapa previamente el soporte poroso, debidamente escogidas para que no formen precipitados con las especies del problema. Como soportes se han utilizado almina, lana de vidrio, almidn, agar-agar, gel de slice, etc. Captulo 1 11

Electroforesis capilar La seccin transversal del aparato de electroforesis se puede reducir se forma drstica al realizar la electroforesis en el interior de un tubo capilar de dimetro interno menor a 0.1mm y una longitud de 50cm a 1m. Es efectivo llevar de sta forma la tcnica porque la resistencia elctrica de la disolucin es tan alta que la corriente se mantiene baja, en consecuencia se pueden mantener voltajes ms altos sin calentamiento excesivo. La tcnica tiene gran poder de resolucin y se han desarrollado mtodos para llevar a cabo la electroforesis incluso en molculas neutras no inicas. Adems, las zonas de analitos separados por electroforesis capilar se pueden detectar de igual modo que en una cromatografa en columna. El inconveniente de utilizar un capilar es que el volumen de muestra debe ser de alrededor de un nanolitro o menos, y despus de la separacin, cada uno de los analitos est en volmenes inferiores al nanolitro. Con volmenes de lquido tan pequeos, muy pocos mtodos de deteccin se pueden usar eficazmente. Fig. 1. Diagrama de las partes bsicas de un instrumento de electroforesis capilar con deteccin espectroscpica. La muestra penetra por la parte de la izquierda introduciendo el final del capilar en la disolucin de la muestra y cargndolo, bien hidrodinmicamente, bien electrocinticamente. Toda la unidad de la ilustracin funciona a temperatura constante. El capilar est enrollado alrededor de un soporte. Durante el anlisis los niveles de las dos disoluciones tampn deben ser iguales como se indica con la lnea punteada) para evitar el flujo de masa debido a una diferencia de presin.
1.11 Bibliografa
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http://www.monografias.com/trabajos13/sepal/sepal.shtml
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Parmetros cromatogrficos
Captulo 2 Parmetros cromatogrficos

2.1 Glosario
Anchura de base: suele ser el intervalo de longitud de frecuencia de un pico; el intervalo pasa por un separador de banda. Banda: Es una situacin ideal, es una distribucin gausiana. La cantidad de compuesto que sale de cromatografico o de una columna electrofortica. Coeficiente de difusin: Medida de la movilidad de una especie en unidades de cm2/s. Coeficiente de reparto: constante de equilibrio que describe la distribucin de un soluto entre dos fases, para definir el coeficiente de particin solo se utiliza una forma de un soluto (kD). Coeficiente de selectividad: medida de la sensibilidad de un mtodo para un interferente dado en comparacin con su sensibilidad para el analito (KA,I). Cola: prolongacin final de un pico cromatogrfico, generalmente debida a la presencia de lugares muy activos en la fase estacionaria. Constante de disociacin: constante de equilibrio de una reaccin en la que un complejo metal- ligando se disocia para formar un in metlico libre y un ligando (kD). Constante de equilibrio: K Constante que se basa en las concentraciones molares al equilibrio, su valor numrico de K depende de la fuerza inica del medio. Cromatografa: separacin en la que los solutos se distribuyen entre fase mvil y estacionaria. Cromatografa gaseosa: tcnica cromatogrfico en la que la fase mvil es un gas. Cromatograma: registro de la seal de deteccin en funcin del tiempo de elusin o del volumen. Eficiencia de la columna: medida del grado de ensanchamiento de una banda cromatogrfico, se suele expresar en trminos de la altura H, de los platos o del nmero N de platos tericos. En la medida en que la distribucin del analito dentro de la banda es gausiana, la altura de los platos est dada por la varianza dividida entre la longitud de la columna del empacado.
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Ensanchamiento de banda: aumento de la anchura de base de un soluto a medida que se desplaza desde el punto de inyeccin al detector. Factor de capacidad: medida de la fortaleza con la que la fase estacionaria retiene en soluto dado (k). Factor de selectividad: cociente de los factores de capacidad de dos solutos que muestra la selectividad de la columna para uno de ellos (). Factor de separacin: medida de la eficacia de una separacin en lo que se refiere a la separacin entre el analito y el interferente. Fase estacionaria: fase extractante que permanece en posicin fija. Fase mvil: fase extractarte que se desplaza a travs del sistema. Nmero de platos tericos: caracterstica de una columna cromatogrfica que se emplea para medir su eficiencia. Plato terico: medio cuantitativo para evaluar la eficacia de una columna y que consiste en tratar una columna, como si estuviera compuesta de pequeas zonas o platos, en las que tiene lugar el reparto entre las fases mvil y estacionaria Relacin de distribucin: cociente que expresa la concentracin total de soluto en una fase en relacin con una segunda fase; en su definicin participan todas las zonas del soluto (D). Resolucin: separacin entre dos bandas cromatogrficas (R). Selectividad: Medida de la ausencia de interferencia de un mtodo que se mide ante el cociente de selectividad del mismo. Tiempo de retencin: es el tiempo entre la inyeccin en una columna cromatogrfica y la llegada a un pico de analito al detector. Tiempo muerto: tiempo necesario para que una especie no retenida pase a travs de la columna.
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Un parmetro es una cantidad que puede tener distintos valores y que caracteriza un proceso, una operacin o un resultado. La parametrizacin de datos en cromatografa, como en otros mtodos facilita la tabulacin y la comunicacin de dichos datos. Se puede parametrizar la forma, la posicin y la resolucin de las bandas de una cromatografa. Estos pueden correlacionarse satisfactoriamente con descripciones de los procesos moleculares que tienen lugar durante la separacin.
2.2 Constantes de Distribucin

Al encontrarse un soluto disperso en una fase que entra en contacto con otra, ocurre un fenmeno de distribucin, en el cual dicho soluto puede tener mayor afinidad a alguna de las dos fases. De esta manera, se genera un equilibrio entre la cantidad de soluto que existe en una fase y en otra. La constante asociada es la llamada constante de distribucin, que se define para un soluto A como: =
1 2
donde [A]1 y [A]2 son la concentracin de A en la fase 1 y 2 respectivamente. Concretamente, en cromatografa la fase 1 es la fase estacionaria y la fase 2 es la fase mvil y el soluto A es el analito de inters. Esta constante es especfica para cada compuesto con cada determinada fase estacionaria y fase mvil.
2.3 Factores de influencia en la retencin

La retencin que ocurre del soluto en la fase estacionaria, se debe generalmente a la diferencia de polaridades entre las fases estacionaria y la mvil, promoviendo que el soluto se reparta entre ellas segn su coeficiente de distribucin. De esta manera, al separarse una mezcla que contenga solutos con polaridad distinta, y por lo mismo coeficientes de distribucin distintos, la retencin ser diferente para cada uno. En la cromatografa de gases, el to, es evaluado convenientemente a partir del tiempo de retencin del pico de aire. En la cromatografa de lquidos, cualquier compuesto no retenido puede usarse como muestra para medir el to. El tiempo muerto de la columna puede usarse para determinar el llamado tiempo de retencin ajustado o corregido, tR. t'R = tR to
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Una medida conveniente y til de la retencin del soluto est dada por el factor de capacidad (o factor de retencin), k = 0
FIG. 1. Cromatograma que muestra diferentes picos con tiempos de retencin diferentes, as como el tiempo muerto.
Los valores de k no tienen un significado simple en un gradiente de elucin o en temperatura programada, y usualmente no son reportados cuando esos procedimientos son usados. Los valores de k pueden ser determinados a partir del tiempo de retencin, tR. En los modos de retencin de cromatografa se tiene: k > 0, que significa que no hay bandas eluidas antes del tiempo muerto, to. A menudo es til expresar el tiempo de retencin o el volumen en trminos del factor de capacidad, k. tR = to (1+ k) VR = Vm (1 + k) La retencin del soluto en la fase estacionaria depende de la afinidad, y de los factores que puedan afectar a la misma. El fenmeno de adsorcin depende fuertemente de la temperatura, a mayor sea sta se fomentar la desorcin, y debe por tanto controlarse dependiendo de la naturaleza del anlisis.
2.4 Retencin y Equilibrio en Cromatografa

El soluto se encuentra en un equilibrio de distribucin entre la fase mvil y la estacionaria, y dependiendo del desplazamiento de dicho equilibrio es la retencin del mismo. Una separacin cromatogrfica tpica se muestra en la figura 2. La separacin est fuertemente afectada por la proximidad de bandas adyacentes en el cromatograma. Captulo 2 17
Una importante medida de la proximidad de bandas es el llamado factor de separacin, , donde dos bandas adyacentes, teniendo los valores k1 y k2: = k2 / k1 El factor de separacin, , es usualmente identificado con la selectividad del sistema cromatogrfico, es decir, la habilidad del sistema a prever diferentes tiempos de retencin para dos compuestos especficos. Dicho factor debe tener un valor mayor a uno, pues esto significara que no hay separacin, pero es recomendable que sea menor a dos puesto que tiempos de retencin muy largos se traducen en tiempo desperdiciado durante la operacin experimental. Los valores de depende de los dos solutos y de 1) La composicin qumica de la fase estacionaria. 2) La composicin qumica de la fase mvil (excepto en cromatografa de gases). 3) La temperatura. En cromatografa de fluidos supercrticos, la presin tambin puede afectar a al cambiar la densidad de la fase mvil.
FIG. 2. Separacin de una muestra de un compuesto nitrado con 10 componentes por cromatografa de lquidos .
2.5 Eficiencia de separacin de una columna

Las columnas cromatogrficas consisten en un nmero de zonas adyacentes en cada una de las cuales hay suficiente espacio para que un analito est en equilibrio entre dos fases. Cada una de estas zonas se conoce con el nombre de plato terico (de los que hay N en cada columna). La longitud de una columna contiene una altura del plato, H, que tiene unidades de longitud, normalmente en micras. El Captulo 2 18
valor numrico de N y H para cada columna en particular es expresado en referencia a cada analito. La altura del plato est relacionada con la anchura del pico del analito y la distancia que recorre dentro de la columna, X: = 2 X
donde es un estndar de desviacin de la banda gaussiana. Para los picos gaussianos simtricos la anchura de la base es igual a 4 y la anchura del pico al punto de inflexin, i es igual a 2. Por lo tanto el valor de H puede ser calculado desde el cromatograma midiendo la anchura del pico. El nmero de platos tericos en la columna entera viene dado por: = donde L es la longitud de la columna. Si consideramos la posicin del pico a X = L con el hecho de que la anchura del pico en su base es , obtenida de las tangentes dibujadas desde los dos puntos con ms pendiente del pico, es igual a 4, la ecuacin anterior se convierte en = 16 2 W2 = 2
Si en lugar de medir L y en unidades de longitud se hace en tiempo, la ecuacin quedar: = 16

2
La medicin del ancho del pico es ms confiable cuando se realiza a la mitad de la altura del pico, con lo cual se puede utilizar = 5.545 1/2
2
Tambin puede hacerse en funcin de la altura y rea del pico = 2

2
Es importante que tanto , W W1/2 se expresen en las mismas unidades ya que N es adimensional. Captulo 2 19
Para que un sistema sea eficiente, se necesitan fases poco viscosas, espesores de pelcula delgados y columnas de poco dimetro, para que se favorezca la transferencia de masa. La velocidad promedio de la fase mvil tambin afecta la altura del pico, por lo que hay una velocidad ptima para obtener el mximo de eficiencia. Generalmente se trabaja a flujos mayores de ste para no perder demasiado tiempo en anlisis.
2.6 Procesos de ensanchamiento de banda

El nmero de platos de una columna (eficiencia, N) es una medida del ensanchamiento de la banda cromatogrfica. Cuando inyectamos un pequeo volumen de analito en una columna forma una banda estrecha en su inicio, pero a medida que el analito migra la banda se va ensanchando. La anchura de pico aumenta con la raz cuadrada de la longitud que la banda ha recorrido. Segn la ecuacin de Van Deemter = + +
A representa el trmino de caminos mltiples. Esto es porque las molculas no siguen nicamente un camino, hay multicanales, que se deben a la densidad de empacado de la fase estacionaria y afecta segn el tamao y forma de la partcula. B representa la difusin axial, la cual depende de la movilidad de las molculas en las fases. El soluto se difunde desde la zona central que es la ms concentrada hacia las regiones ms diluidas. En esto influye la velocidad v , pues a velocidades muy altas no se alcanza a difundir y predomina el trmino A. Para encontrar la velocidad ptima puede trazarse una curva de Van Deemter al graficar H en funcin de v. Por ltimo, C representa la resistencia a la transferencia de masa. Es necesario ste trmino porque en realidad los fenmenos que ocurren estn fuera del equilibrio. Esto es porque las corrientes de la fase mvil como la capa de fase estacionaria tienen una anchura determinada. Por lo que las molculas de analito necesitan primero migrar desde el centro de ellas hasta la interfase donde ocurre la transferencia, y este retraso temporal se traduce en ensanchamiento de bandas.
2.7 Resolucin
La separacin relativa de dos bandas a menudo se refiere a su resolucin, Rs. La resolucin se define como
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= 2 1 1 ( + 2 ) 2 1
Aqu, t1 y t2 se refieren a los tiempos de retencin (tR) de la primera y la segunda banda, y W1 y W2 son el ancho de dichas bandas. La figura 3 ilustra la separacin de dos bandas adyacentes como una funcin de sus valores de Rs y su tamao relativo. Se observa que la separacin mejora sistemticamente a mayores valores de Rs, y la separacin es generalmente mejor para dos bandas de igual tamao (y el mismo valor de Rs.). Esto es, mayores valores de Rs se requerirn normalmente para la separacin de las bandas desiguales.
Fig 3. Separacin de dos bandas como una funcin de la resolucin (Rs) y el tamao relativo de banda.
La resolucin depende de la retencin y selectividad de manera proporcional. A mayor selectividad y retencin k, mayor resolucin. Para tener una buena separacin se recomienda utilizar k > 2, y generalmente se trabaja con 1. Para el anlisis cuantitativo es deseable (pero no siempre prctico) alcanzar la resolucin de al menos Rs = 1.5, desde que esto corresponde a la separacin a la lnea base de bandas de tamao similar. La separacin de la lnea base hace que los sistemas de datos midan el tamao de cada banda apropiadamente y esto significa una cuantificacin fiable. Una resolucin pobre puede deberse a que el mtodo utilizado no es apropiado, pues no discrimina entre los solutos, o que hay mucha muestra en proporcin a la columna cromatogrfica. Captulo 2 21
2.8 Cuantificacin en cromatografa

Para llevar a cabo un anlisis cuantitativo, es necesario que los datos obtenidos sean confiables, tanto para la construccin de la curva de calibracin como para el tratamiento del analito mismo. Primero es necesario llevar a cabo un anlisis cualitativo, en el cual se encuentren las condiciones ptimas. Para evaluar esto, se calculan los parmetros cromatogrficos de cada ensayo que sirven como referencia. De sta manera se eliminan fuentes de error, pues se trabaja en las mejores condiciones posibles, acercndose a resultados reproducibles y por tanto precisos, y lo ms exactos que sta tcnica nos permite. Si no se obtiene una buena resolucin, primero debe repetirse el ensayo con menor cantidad de muestre, sino puede probarse utilizando una fase mvil distinta, y si esto no ayuda, puede utilizarse otra fase estacionaria. En caso de que la selectividad no sea buena, debe revisarse la temperatura de trabajo, y analizar la naturaleza qumica de las distintas fases as como solutos, para probar con otra fase sea estacionaria o mvil. No debe perderse de vista, que a menor tiempo de operacin mejor, y que una vez encontradas las mejores condiciones, no deben alterarse. Para realizar la curva de calibracin puede usarse el mtodo de estndar externo o interno, siendo el segundo apropiado para eliminar posibles errores de operacin.
2.9 Resumen
La cromatografa es una tcnica de separacin que se basa en la diferencia de distribucin que existe entre dos componentes de una mezcla en las fases estacionaria y mvil. As, cada soluto tendr un tiempo de retencin distinto y podrn analizarse por separado. Los parmetros cromatogrficos son claves para el diseo de un anlisis, pues son herramientas que ayudan a evaluar las condiciones en las que se est llevando a cabo. Cada soluto tendr asociado un tiempo de retencin distinto que se puede expresar como el factor de capacidad, y la relacin de los tiempos de retencin o factores de capacidad de los solutos nos indicar si la selectividad del sistema es buena. Al calcular la resolucin se podr evaluar si la separacin entre los tiempos de retencin se los solutos es suficiente o excesiva. El clculo de los platos tericos nos indicar la eficiencia del sistema. Una vez evaluados los parmetros cromatogrficos, se podr determinar si el cromatograma obtenido es aceptable, o si es necesario modificar alguna condicin para optimizarlo. Captulo 2 22
2.10 Bibliografa
Heftmann, E. Chromatography: Fundamentals and Applications of chromatography and related differential migration methods, Elsevier Science Publishers B.V,5a. edicin, EUA, 1992, pp. 2-14 Rojo Callejas F., Manual de Qumica Analtica Instrumental II, Anexo III, Facultad de Qumica UNAM, Mxico 2002 http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/manchi/alim/Trabajo5.pdf http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apquim-an-instr14/skoog/26d.html
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Cromatografa en fase lquida a columna abierta
Captulo 3 Cromatografa en fase lquida a columna abierta

3.1 Procedimientos de empaquetamiento
En cromatografa de fase lquida, la fase mvil es un lquido y ste desciende a travs de la columna. La fase estacionaria es frecuentemente un lquido que recubre el interior de un tubo capilar o la superficie de partculas slidas empaquetadas dentro de la columna. Alternativamente, las mismas partculas slidas pueden ser la fase estacionaria (como se muestra en la figura 1, en cualquier caso, el reparto de solutos entre las fases mvil y estacionaria dan lugar a la separacin.
Fig 1. Representacin esquemtica de una separacin cromatogrfica. El soluto A, que tiene una mayor afinidad que el soluto B para la fase estacionaria, permanece en la columna ms tiempo.
Las columnas pueden ser empaquetadas o de tubo abierto. Una columna empaquetada se llena con partculas que contienen la fase estacionaria y los materiales ms usados para los tubos de las columnas son de acero inoxidable y de vidrio, siendo el primero preferido por la manipulacin ms fcil. Para el caso de la columna de tubo abierto, se trata de un capilar hueco estrecho con la fase estacionaria cubriendo las paredes interiores. En las columnas empaquetadas, el soporte debe ser un slido poroso con gran rea superficial, inerte y con una buena resistencia mecnica. Los compuestos empleados para empaquetamiento varan, entre los cuales podemos encontrar: tierra de diatomeas (ms empleado en CG), alminas, resinas de intercambio inico o compuestos de slice como SiO2 amorfo, sin embargo, ste debe de someterse a un tratamiento para hacerlo an ms inerte y que pueda ser empleado sin problemas. Es caracterstico que Captulo 3 Pgina 24

el tamao de las partculas y de los poros deben ser lo ms uniforme posible. El procedimiento del empaquetado es muy sencillo y se resume en los dos siguientes pasos: 1. Colocacin de la fase estacionaria y/o compuestos de empaquetamiento de manera uniforme y compacta en la columna (longitud y dimetro apropiados). 2. Verificacin de ausencia de espacios vacos en la columna (para evitar que los picos del cromatograma sean ms anchos y de menor eficiencia.
2.2 Aplicacin de la muestra

Una vez que la columna se encuentra correctamente empaquetada, se procede a la aplicacin de la disolucin de la muestra. Cuando se introduce en la columna cierta cantidad de muestra, sta se queda en una zona de cierta altura en la columna. Si entonces se introduce el disolvente, comienza el desplazamiento de la zona a lo largo de la columna. La parte superior de la zona se disuelve poco a poco y, empujado por la disolucin que se forma, el frente de la zona avanza hacia la base de la columna. Si el disolvente utilizado para la elusin es el mismo que la disolucin problema, los platos tericos comprendidos en la parte central de la zona, reciben una fase mvil en equilibrio con ellos y las concentraciones permanecen estacionarias. El movimiento de la zona slo es aparente en sus extremos por lo que su estudio se puede hacer sobre una zona que se supone no tiene ms espesor de un plato terico.
2.3 Procedimientos de elucin

La diferente capacidad de los distintos disolventes para eluir un determinado soluto es prcticamente independiente de la naturaleza del soluto. Se puede describir la elucin como el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente. Para el caso especfico de cromatografa de adsorcin, existe una ordenacin de los disolventes de acuerdo a su capacidad relativa para desplazar solutos de un determinado adsorbente, llamada serie eluotrpica. La fuerza eluyente es una medida de energa de adsorcin del disolvente, supuesto valor cero para el sistema pentano/slice pura. Cuanto ms polar es el disolvente, mayor es su fuerza eluyente respecto a la slice en cromatografa de adsorcin. Cuanto mayor es la fuerza eluyente del disolvente, tanto ms rpidamente se eluirn los solutos de la columna.
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La cromatografa de adsorcin sobre slice pura es un ejemplo de cromatografa de fase normal, que se caracteriza por usar una fase estacionaria polar y un eluyente menos polar. Un disolvente ms polar tiene fuerza eluyente mayor. La cromatografa de fase inversa, que es la ms utilizada, se caracteriza porque la fase estacionaria es no polar o dbilmente polar y el disolvente es ms polar. Un disolvente menos polar tiene mayor fuerza eluyente. La cromatografa de fase inversa elimina las colas de los picos porque la fase estacionaria tiene pocos puntos que adsorban con fuerza a ningn soluto originando colas. La cromatografa de fase inversa tambin es menos sensible a impurezas polares (como el agua), que pueda haber en el eluyente.
2.4 Elucin isocrtica y gradiente

La elucin isocrtica se lleva a cabo con un nico disolvente (o una mezcla de disolventes fija). Si un disolvente no permite una elucin suficientemente rpida de todos los componentes, se puede usar una elucin gradiente. En este caso, se van aadiendo cantidades crecientes del disolvente B al disolvente A, produciendo un gradiente contino.
Fig 1. Las molculas del disolvente y las molculas del soluto compiten entre s en su reaccin con los puntos activos de la fase estacionaria. Cuanto mayor es la fuerza del eluyente, ms fcilmente se desplaza el soluto.
2.5 Cromatografa de absorcin y de particin de columna

Estas son dos tcnicas de anlisis cromatogrfico, la diferencia entre ellas es que la retencin del analito en la columna depende de la naturaleza de su interaccin con la fase estacionaria. En el dibujo de abajo, observamos las diferentes formas en que interacciona el soluto, nuestro analito, con la fase estacionaria, en la de absorcin, vemos que de pega a la superficie, mientras que en la de particin de columna, el analito se disuelve dentro de la fase estacionaria.
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2.6 Cromatografa de adsorcin

La absorcin es un fenmeno de superficie, por lo tanto fsico, en el cual diversas sustancias son atrapadas en la superficie de un material, es decir, se acumulan en una determinada superficie interfacial, formndose una pelcula del material retenido en la superficie del cuerpo adsorbente, sea slido o lquido, aunque este proceso implica una interaccin de diferentes fuerzas, sean estas fsicas o qumicas, por ello se habla de fisisorcin, cuando la naturaleza de las fuerzas que retienen al material es solo fsica, y quimisorcin, cuando la retencin implica enlaces con el adsorbente. As pues, en la cromatografa de adsorcin, se aprovecha esta propiedad del analito que queremos separar, dado que si es en una mezcla, cada componente de la mezcla se adsorbe con distinta fuerza, lo cual origina que el analito se retenga en la fase estacionaria, es decir, se adsorba, y los dems componentes se eliminen. Durante la separacin, se filtra una solucin a travs de una columna de adsorbente, que es la fase mvil, esta es adsorbida en la superficie de la fase estacionaria slida, formando una cama de partculas que se dividen de modo que el rea de absorcin sea mxima, o sea, se distribuyen a lo largo del slido para atrapar la mayor cantidad posible del analito, estos se llaman sitios de absorcin. El equilibrio entre la fase estacionaria y mvil permite la separacin del analito. Si vemos la ilustracin de abajo, los puntos negros representan el analito, y la mancha gris con protuberancias es la fase slida, los huecos en ella son los sitios de absorcin, donde el analito interacciona con la fase estacionaria y se retiene. Como fase estacionaria se han usado muchos materiales, aunque generalmente encontramos la Hidroxiapatita (Ca3(PO4)2.Ca(OH)2), alumina (Al2O3) y carbonato de magnesio.
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Aplicaciones. Esta es una de las tcnicas cromatogrficas mas antiguas, su uso depende del
tipo de compuesto que estemos separando, o sea de su naturaleza qumica, en particular se usa para la separacin de compuestos isomricos, especies no polares, hidrocarburos alifticos, y para compuestos con grupos funcionales capaces de formar puentes de hidrgeno fuertes, por ello es utilizada para separar azcares, especialmente azucares aminados y glicoproteinas as como oligosacridos, y tambin se ha usado para obtener protenas biliares.
2.7 Cromatografa de particin de columna

Esta tcnica se basa en la retencin del analito en una columna slida como granos de fibra o cualquier otro material inerte qumicamente, sobre la cual hay distribuida una capa fina de un disolvente afn al analito; y una fase mvil liquida o gaseosa; cuando la fase mvil pasa a travs de la columna, el equilibrio entre esta y la estacionaria esta mediado por el analito, que se reparte entre ambas y queda al final disuelto en la fase estacionaria. En el dibujo de abajo, vemos las flechas, que son el flujo de la fase mvil y que llevan el analito, pasan por la fase estacionaria, los crculos, alrededor de los cuales hay una capa donde se quedan retenidos los analitos, esta capa es de un material que interacciona con el analito, donde este se disuelve.
Las molculas del analito se equilibran entre la fase estacionaria y la mvil, a esto se le llama particin puesto que se distribuyen, o sea se reparten dependiendo de la fisicoqumica del sistema, entre las dos fases. La retencin depende de la solubilidad del analito con la capa de sorbente adherida a la matriz slida, y de que tanto la fase mvil pueda arrastrarlo al fluir, en el dibujo de abajo, vemos como el analito, los puntos negros, se quedan disueltos en la superficie de la fase estacionaria, dentro de la capa Captulo 3 Pgina 28

de solvente adherida a la matriz slida, y como vemos tambin, el analito se distribuye entre la capa de solvente de la fase estacionaria y otra entre la fase estacionaria, a esto se le llama reparto, y como esta sobre una columna, por ello se le llaman particin de columna.
La solubilidad en ambas fases esta dada por el coeficiente de particin, KD: =
Eso se debe a que el analito tiene diferentes afinidades para las dos diferentes fases, o sea tiene diferentes preferencias por estar en una u otra fase, de esta forma, la separacin del analito de la mezcla se logra por migracin diferencial de este, y dada la afinidad que tiene el analito pro el disolvente de la columna, el reparto en esta ser mayor que en la fase mvil.
Aplicaciones.
inmiscibles.
Esta tcnica se usa para separa sustancias en la misma fase, o lquidos
2.8 Cromatografa en gel.

La separacin basada en el tamizado molecular se puede llevar a cabo en sustancias sin carga durante una migracin osmtica a travs de geles. La filtracin en gel es el mtodo de separacin que consiste en la separacin de molculas basado en el tamao relativo de las mismas. En la cromatografa en gel, la fase estacionaria es una matriz porosa polimrica cuyos poros se llenan con el solvente que se usar en la fase mvil. El flujo de la fase mvil provocar que molculas mayores pasen a travs de la columna libremente, sin penetrar la matriz del gel, mientras que partculas ms pequeas tardarn ms tiempo en salir dependiendo de la penetracin que tengan sobre el gel. Los componentes de una mezcla emergen de la columna de acuerdo a masa molecular relativa.
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El volumen total de la columna, Vt es la suma del volumen del lquido afuera de la matriz de gel (V0, volumen de la fase mvil que eludir a una molcula completamente excluida ), el volumen del lquido dentro de la matriz (Vi) y el volumen de la matriz de gel (Vm). El volumen de elusin (Ve) se puede relacionar con V0 y Vi: Ve V0 K d Vi Kd es el coeficiente de distribucin volumtrica: K d (Ve V 0) / Vi Kd caracteriza el comportamiento de retencin del soluto. Representa la fraccin del volumen del gel que es accesible a la molcula en cuestin. Si Kd se grafica contra el logaritmo del peso molecular se una serie de solutos similares en forma y densidad molecular, se obtiene:
En un rango pequeo de Kd, el rango de fraccionamiento, la curva se aproxima a una lnea recta:
K d A B log M
La separacin por cromatografa en gel est influenciada por las propiedades de los poros de la red tridimensional, y la naturaleza del material que forma el poro. Se distinguen dos tipos de material para el gel: xerogeles y aerogeles. Los xerogeles son geles simples; consisten en polmeros
entrecruzados que se engrosan en contacto con el solvente para formar un medio porosos relativamente suave. Los aerogeles son slidos porosos que son penetrados por el disolvente; algunos ejemplos es el vidrio y silica porosos. El nombre de los geles ms comnmente utilizados: Sephadex, Strygel, Biogel Captulo 3 Pgina 30
Aplicaciones. Desalinizacin: Largas molculas de origen biolgico son separadas de especies

ionizables o inorgnicas. Un ejemplo en la separacin de la hemoglobina y NaCl en un gel Sephadex. La cromatografa en gel se utiliza para separar protenas, pptidos, cidos nuclicos, polisacridos, enzimas, hormonas y los qumicos en polmeros, para determinar distribuciones de pesos moleculares en mezclas de polmeros.
2.9 Cromatografa de intercambio inico.

El intercambio inico es un proceso donde una solucin de un electrolito se pone en contacto con una resina de intercambio inico y los iones activos de la resina son remplazados por las especies inicas de carga similar del analito. Ocurre un intercambio de iones de signo igual entre una solucin y un slido esencialmente insoluble en contacto con la solucin. Las resinas cambiadoras de iones estn constituidas por una red tridimensional de cadenas polmeras entrelazadas con cadenas cortas que tienen grupos funcionales ionizables. Se tiene una fase insoluble con sitios inicos fijos de una sola carga, muestra que las especies de carga contraria se mueven libremente a su alrededor se pueden sustituir por otros iones de la misma carga, a condicin de que se mantenga la electroneutralidad. Una resina tpica se prepara por polimerizacin de estireno y divinilbenceno. Cambiadores catinicos. Los grupos funcionales cidos se pueden introducir fcilmente, tienen el protn disociado, pero no libres para abandonar la resina, excepto cuando se sustituyen por otros iones positivos. Cambiadores aninicos. Si se introducen grupos funcionales bsicos, la resina intercambia aniones. Los cambiadores aninicos se preparan con aminas, obtenindose in grupo amonio, y por tanto, un medio bsico. Las propiedades ms importantes que determinan el funcionamiento de una resina: o o o o Tamao de las partculas velocidad de intercambio y permeabilidad de la columna. Naturaleza de los grupos funcionales tipo de los iones intercambiables. Fuerza de los grupos funcionales coeficiente de distribucin. Nmero de grupos funcionales capacidad de la resina.
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A partir de la sustitucin de cantidades equimolares de iones de cargas iguales, se obtienen equilibrios de intercambio. Se aplica la ley de accin de masa, donde K(coeficiente de selectividad), es la constante de equilibrio del sistema. Y donde el coeficiente de distribucin KD:
KD
K [ HR] [H ]
Efecto del pH del eluyente. La carga elctrica de una especie se puede aumentar, disminuir o invertir por cambio del pH. Disponemos de un medio para influir sobre la relacin de distribucin o evitar un intercambio total. El efecto del pH sobre la elusin:
Efecto de agentes complejantes. Los aniones complejan muchos iones metlicos dando iones complejos de carga negativa. En esta forma, los cationes metlicos que se separen mal en cambiadores catinicos, se pueden complejar y separar en cambiadores aninicos.
Aplicaciones.
Eliminacin de iones. Un agua completamente desionizada se obtiene pasndola a
travs de un cambiador de cationes, y despus a travs de un cambiador de aniones. Separacin de aminocidos. La naturaleza anftera de este grupo permite cambiar el signo de su carga o eliminar la carga neta, de modo que un cido determinado se puede intercambiar en una resina aninica, en una resina catinica o en ninguna de las dos, mediante control de pH de la solucin.
2.10 Cromatografa covalente

Es un sistema especial de cromatografa, el cual es altamente selectiva la fase estacionaria, en el que se forma un enlace covalente reversible entre la fase estacionaria y la biomolcula a separar, las separaciones se basan en el acoplamiento llave-cerradura tpico de la biologa molecular; por lo cual es muy utilizado en esta rea, adems de tener un pequeo inconveniente de que al ser tan selectiva, solo se puede separar un solo analito.
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2.11 Conformacin de la cromatografa covalente

a) Ligandos: Se trata de biomolculas que se encuentran en una base slida, siendo estas las responsables de la adsorcin especfica de los solutos-analitos. Los ligandos se pueden clasificar de 2 maneras: Ligandos especficos, como los anticuerpos, que se enlazan reversiblemente a un solo soluto, y los ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioqumicos, como las lectinas y nucletidos. b) Soportes: Es la superficie en donde se establece el enlace covalente con el ligando de afinidad Debe poseer propiedades como tener una gran superficie, porosidad controlable, carcter suficientemente hidroflico para evitar adsorciones no especficas de protenas u otras molculas, estabilidad mecnica, en especial para trabajar a alta presin, estos soportes generalmente geles orgnicos derivados de los polisacridos como la agarosa (sepharosa), polmeros de acrilamida, fractogel TSK y slices CPG.
2.12 Fundamento de la cromatografa de afinidad

Un volumen no excesivamente grande de muestra de naturaleza biolgica se introduce en la columna que contienen un soporte polimrico inerte que retienen a la sustancia activa enlazado covalentemente y que se denomina ligando de afinidad. Slo existe interaccin especfica entre este ligando y un soluto-analito (protena) de la muestra insertada que queda retenido. Se procede a la elusin de los dems componentes de la muestra mediante una primera fase mvil que no influye en el acoplamiento. A continuacin se introduce una nueva fase mvil que desactiva el acoplamiento por alteracin reversible de los sitios activos del inhibidor-ligando, del soluto (protena) o de ambos; generalmente se utiliza un cambio de pH que modifica las caractersticas de los sitios activos de esta manera se eluye el soluto de inters. Una vez finalizada la separacin, se procede a la regeneracin de la columna, lo que generalmente se hace mediante el empleo de la primera fase mvil siendo una etapa rpida.
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2.13 Cromatografa Flash

Es un mtodo cromatogrfico, el cual nos permite separar de una manera rpida, fiable y econmica; principalmente utilizada para la separacin y purificacin de protenas. La Cromatografa Flash consiste en una bomba y una columna que permita resistir alta presin para la separacin puede llevarse a cabo con relativa rapidez. El sistema incluye dos bombas de flujo continuo en la depuracin de las columnas (variables por el usuario), una bomba peristltica puede utilizarse para deposito en la columna, seguido de la radiacin ultravioleta para detectar las biomolculas en la columna, un mezclador para producir un gradiente de elusin, las vlvulas de motor puede ser utilizados para ayudar en la inyeccin de la muestra, la seleccin de la columna o corriente de inversin, y un controlador con una funcin de integracin computadorizada, en el cual se muestran los resultados de el anlisis.
Aplicaciones.
En farmacia la cromatografa lquida rpida de protenas (FPLC) se utiliza para la
depuracin de grandes cantidades de diferentes biomolculas (es decir, las protenas y el ADN).
2.14 Resumen
Las columnas pueden ser empaquetadas o de tubo abierto. Una columna empaquetada se llena con partculas que contienen la fase estacionaria y la columna de tubo abierto, es un capilar hueco estrecho con la fase estacionaria cubriendo las paredes interiores. El procedimiento del empaquetado consta de dos sencillos pasos: a) colocacin de fase estacionaria y/o compuestos de empaquetamiento, y b) Verificacin de compactacin (no espacios vacos). El desplazamiento de la muestra a travs de la columna, depende de la afinidad por sta y del disolvente empleado para el proceso.
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La elucin es el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente. Existen dos tipos de elusiones: Elusin por gradiente (cambio continuo de la composicin del eluyente en sentido de aumento de fuerza eluyente) y elusin isocrtica (un solo disolvente). Cromatografa de adsorcin: esta tcnica aprovecha el fenmeno de la absorcin de sustancias en una superficie para separar analitos de mezclas al hacerlos pasar por una columna con un material adsorbente, que retiene el analito cuando este pasa a travs de su superficie. Cromatografa de particin de columna: sta tcnica permite separar analitos al hacerlos pasar por una columna sobre la cual hay una capa fina de un disolvente qumicamente similar al analito, en el que este queda disuelto y retenido cuando pasa la fase mvil, se separa cuando se da un reparto entre las fases, en el que se espera que la mayor parte se quede en el disolvente de la columna. Cromatografa en gel: consiste en la filtracin en gel que consiste en la separacin de molculas basado en el tamao relativo de las mismas. El flujo de la fase mvil del sistema provocar que molculas mayores pasen a travs de la columna libremente, sin penetrar la matriz del gel, mientras que partculas ms pequeas tardarn ms tiempo en salir dependiendo de la penetracin que tengan sobre el mismo. Los componentes de una mezcla emergen de la columna de acuerdo a masa molecular relativa. Cromatografa de intercambio inico: el intercambio inico es un proceso donde una solucin de un electrolito se pone en contacto con una resina de intercambio inico y los iones activos de la resina son remplazados por las especies inicas de carga similar del analito. Se tiene una fase insoluble con sitios inicos fijos de una sola carga, muestra que las especies de carga contraria se mueven libremente a su alrededor se pueden sustituir por otros iones de la misma carga. Cromatografa covalente: las separaciones se basan en el acoplamiento llave-cerradura tpico de la biologa molecular; por lo cual es muy utilizado en esta rea, adems de tener un pequeo inconveniente de que al ser tan selectiva, solo se puede separar un solo analito. Permite la separacin de anticuerpos y enzimas. Cromatografa Flash: consiste en una bomba y una columna que permita resistir alta presin para la separacin puede llevarse a cabo con relativa rapidez. Es una tcnica muy utilizada en el rea de bioqumica ya que nos permite separar biomolculas y protenas.
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2.15 Bibliografa
BERMEJO, F. - Qumica Analtica General, Cuantitativa e Instrumental - Vol 1. - Ed. Paraninfo 7ma edicin, Madrid 1991. HARRIS, D. - Anlisis Qumico Cuantitativo - Ed. Revert - 2 edicin - Espaa, 2001. SKOOG, WEST, HOLLER, CROUCH - Qumica Analtica - 7 ed - McGraw Hill Mxico, 2001. ROUESSAC - Mtodos y tcnicas instrumentales modernas. Anlisis Qumico - McGraw Hill USA, 2003. SHARON, N. - Complex Carbohydrates: their chemistry, Biosntesis and Functions - Addison-Wesley - New York, 1975. PECSOK, Robert Mtodos Modernos de Anlisis Qumico Editorial Limusa Mxico, 1981. BRAITHWAITE, SMITH Chromatografic Methods 4 edicin - Chapman & Hall UK, 1994. http://www.srigc.com/2003catalog/cat-86.htm http://holivo.pharmacy.uiowa.edu/separation/chromatography.pdf http://www.che.utexas.edu/cache/newsletters/spring2001_chemmicro.pdf http://www.resonancepub.com/chromtutorial.htm www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/ www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes www.gmi-inc.com/Products/PharmaciaFPLC.htm
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Cromatografa de gases
Captulo 4 Cromatografa de gases

Esta tcnica permite el anlisis rpido y exacto de gases, vapores lquidos; permite identificar los componentes individuales de las mezclas gaseosas. Iniciada a finales de 1952, se ha desarrollado notablemente en separacin, identificacin y determinacin de compuestos voltiles (gases y lquidos) de puntos de ebullicin de hasta 350-400C. El mtodo tiene las ventajas de ser sensible, rpido y sencillo, y si se maneja con suficiente cuidado, suministra informacin cuantitativa exacta con cantidades muy pequeas de muestra. En cromatografa de gases (GC) la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de un fase mvil de un gas inerte a diferencia de los otros tipo de cromatografa, la fase mvil no interaccionan con la molculas del analito; su nica funcin es la de transportar el analito a travs de la columna.Existen dos tipos de cromatografa de gases:la cromatografa Gas-Slido (GCS) y la cromatografa gas liquido (GLC).La cromatografa gas liquido tiene gran aplicacin en todos los campos de la ciencia y su denominacin se abrevia normalmente como cromatografa de gases (GC). En la cromatografa gas slido se produce la retencin de los analitos de una fase estacionaria como consecuencia de la absorcin fsica. La cromatografa gas slido ha tenido una aplicacin limitada debido a la retencin semipermanente de las molculas activas o polares y a la obtencin de picos de elusin con colas muy significativas (como consecuencia del carcter no lineal del proceso de absorcin), de modo que esta tcnica no ha encontrado una gran aplicacin excepto para la separacin de ciertas especies gaseosas de bajo peso molecular. La cromatografa gas lquido se basa en la distribucin del analito entre una fase mvil gaseosa y una fase lquido inmovilizada sobre la superficie de un slido inerte.
4.1 Instrumentacin
Los componentes bsicos de un instrumento para la cromatografa de gases se muestran a continuacin, el caudal de gas se divide antes de entrar en la columna, este tipo de disposicin se utiliza cuando el detector empleado mide un cambio en las propiedades de la corriente de gas por la presencia de las molculas de analito.
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Gas portador. Entre los gases portadores
deben ser qumicamente inertes, se encuentran el
helio, nitrgeno y el hidrogeno, con el suministro de gas se encuentran asociados los reguladores de presin, manmetros y medidores de caudal. Adems el sistema de gas portador contiene a menudo un tamiz molecular para eliminar el agua u otras impurezas. Los caudales se controlan normalmente mediante un regulador de presin de dos niveles colocando en el cilindro de gas, y algn tipo de regulador de presin o regulador de flujo instalado en el cromatgrafo.
Sistema de inyeccin de muestra.
La eficacia de la columna requiere que la muestra
sea de un tamao adecuado y que sea introducida como un <tapn> de vapor, la inyeccin lenta de la muestras demasiado grandes provoca un ensanchamiento de la bandas y una pobre resolucin .El mtodo mas comn de inyeccin de muestra implica el uso de una micro jeringa para inyectar una muestra liquida o gaseosa a travs de un diafragma o <septum> de goma de silicona en una cmara de vaporizacin instantnea situada en la cabeza de la columna (la cmara demuestra normalmente esta unos 50C por encima del punto de ebullicin del componente menos voltil de la muestra.
Configuracin de la columna y del horno para la columna. En cromatografa de

gases se usan dos tipos generales de columnas, las rellenas, y las abiertas o capilares. Hasta la fecha la mayor parte de las cromatografa de gases se ha realizado con columnas rellenas. Sin embargo, en la actualidad esta situacin est cambiando rpidamente y parece probable que en un futuro prximo, Captulo 4 38
excepto para ciertas aplicaciones especiales, las columnas de relleno sean sustituidas por columnas abiertas ms eficaces y rpidas. Las columnas cromatogrficas varan desde menos de 2 hasta 50m de longitud o ms. Estn construidas con acero inoxidable, vidrio, slice fundida o tefln. La temperatura de la columna es una variable importante para que un trabajo preciso ha de regularse a las dcimas de grado, por ello la columna normalmente se introduce dentro de un horno de temperatura controlada , la temperatura optima de la columna depende del punto de ebullicin de la muestra y del grado de separacin requerida.
Sistemas de deteccin. El detector ideal para cromatografa de gases tiene las siguientes
caractersticas. 1.- adecuada sensibilidad 2.- buena estabilidad y reproducibilidad 3.-respuesta lineal para los solutos que se extienda a varios rdenes de magnitud 4.-intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente hasta al menos 400C 5.-tiempos de respuesta cortos que sean independientes del caudal 6.-alta fiabilidad y manejo sencillo 7.-respuesta semejante para todos los soluto s o por el contrario una respuesta selectiva y altamente predecible para uno o ms tipos de soluto 8.-no destructivo de la muestra.
Resolucin (Rs). Existe una magnitud que expresa el poder de resolucin de la columna y
que se denomina resolucin de la columna y se define: = 2 2 1 1 + 2
Si se toma W como el ancho medio de los picos, la ecuacin queda: = 2 2 1
Para los picos que estn prximos entre s Wb1 y Wb2 sern lo suficientemente parecidos como para que baste medir slo uno.
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Como lo muestra la figura, la resolucin 1.5 nos da una separacin prcticamente completa de los solutos, mientras que una resolucin de 0.75 no lo hace. A una resolucin de 1, la zona X contiene casi 4% de Y y viceversa, a una resolucin de 1.5 la superposicin es de aproximadamente 0.3%. Para el mismo tipo de empaque, la resolucin puede mejorarse alargando la columna y por lo tanto aumentando el nmero de platos tericos.
Tipos de Columnas. Existen dos tipos de columnas, principalmente, de relleno y capilares o

semicapilares. Contiene la fase estacionaria y en ella tiene lugar la separacin cromatogrfica Las columnas de relleno suelen ser de cobre, acero inoxidable, aluminio, vidrio y tefln; con un dimetro interior entre 2 y 4 mm y una longitud entre 2 y 3 m. La eficacia est en torno a 1.000-2.000 (platos tericos/m). Suelen emplearse para muestras poco complejas, mximo 10 componentes. La columna est rellena de un material slido (soporte), finamente dividido y homogneo; recubierto, por una capa de 0,05-1 m de espesor, de fase estacionaria lquida. Est configurada en forma helicoidal, con un dimetro de unos 15 cm, para poder ser instalada en el horno termostatizado
Fase estacionaria. Eleccin de la fase estacionaria de una columna cromatogrfica ha de reunir

una serie de requisitos como: Baja volatilidad, su punto de ebullicin debe de ser por lo menos 100 C superior a la temperatura mxima de operacin de la columna. Estabilidad trmica. Captulo 4 40
o
Inercia qumica. Los valores del factor de capacidad (k) y del factor de selectividad () de los analitos deben estar dentro de los intervalos aconsejados. La separacin en cromatografa gas-lquido se debe a los diferentes coeficientes de reparto del analito entre la fase mvil y la fase estacionaria y tiene que haber un cierto grado de solubilidad de los compuestos con la fase estacionaria. Por ello, una caracterstica muy importante de la fase estacionaria es la polaridad. Siguiendo el principio de "semejantes disuelven a semejantes" los solutos se retienen ms en las fases lquidas de polaridad parecida, lo que permiten obtener mejores separaciones. Las fases estacionarias compuestas de hidrocarburos y de dialquilsiloxanos son poco polares, las compuestas por polister son muy polares. En cuanto a posibles compuestos objeto de separacin, los alcoholes, cidos y aminas son polares; los steres cetonas y aldehidos tienen polaridas intermedia; y son de baja polaridad los hidrocarburos saturados. Otro factor a tener en cuenta son los lmites de temperatura que puede soportar la fase estacionaria, el lmite inferior ser el punto de fusin o temperatura a la que la viscosidad de la fase lquida es muy elevada, lo que hara disminuir la eficacia. El lmite superior es la temperatura a la que la presin de vapor de esta fase sea 0,1 mm Hg (250 C inferior al punto de ebullicin) por encima de esta temperatura se produce arrastre de la fase lquida, lo que lleva consigo efectos en el detector (ruido, suciedad), interferencias con los solutos y en suma, deterioro de la columna. En una fase lquida cualquiera, una serie homloga se eluye segn orden creciente de nmero de tomos de carbono. Si la fase es no polar, los solutos no polares eluyen segn orden creciente de punto de ebullicin. En una fase polar se retendrn ms los solutos polares que los no polares a igualdad de puntos de ebullicin. Otro aspecto a desarrollar, relacionado con la fase estacionaria, es el soporte slido empleado en las columnas de relleno; el objetivo es el de proporcionar una superficie elevada donde depositar la fase lquida en forma de pelcula muy fina para proporcionar una mayor superficie de contacto entre fase mvil y fase estacionaria. Las caractersticas de los soportes slidos son, una elevada superficie especfica (1m /g); una superficie homognea; estabilidad trmica; geometra adecuada; baja dispersin de tamao de las partculas, entre 150-250 m; dureza mecnica; inercia qumica y naturaleza porosa. Captulo 4 41
2 o
Los soporte, ms generalizados, son los de silceo como las tierras de diatomeas o sintticos; de vidrio y de polifluorocarbonados (tefln). Los soportes de diatomeas estn constituidos por residuos de algas unicelulares diatomceas que se unen formando filamentos. Hay unas 10.000 especies de diatomeas con esqueletos diferentes, pero parecida estructura. Tienen una superficie especfica de 1 m /g. El constituyente mayoritario es de anhdrido silcico SiO (90%),
2 2
tratado con un fundente alcalino a 1.600 C se obtiene el producto comercial conocido como Chromosorb W de superficie poco adsorbente por lo que es muy til para separar compuestos polares. Otro soporte es el de polvo de ladrillo refractario conocido como Chromosorb P, C-22 y Sterchomel, tiene mayor resistencia mecnica y superficie especfica que el anterior, pero es muy activo y no se puede utilizar con compuestos polares. Los soportes de silicatos en columnas de relleno y en las paredes interiores de slice fundida, en las columnas capilares, provocan adsorciones no deseadas de analitos polares, lo que da como resultado picos cromatogrficos distorsionados. Se ha demostrado que este fenmeno se debe a los grupos silanol (-SiOH) que se forman en la superficie de los silicatos debido a la humedad. El silanol tiene gran afinidas por las molculas orgnicas polares. Este proceso puede desactivarse por sililacin con dimetilclorosilano , Cl Si(CH ) , que elimina el
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H del silanol formando ClH.
Columnas capilares. Las columnas capilares son de dos tipos bsicos: WCOT,
de pared recubierta y SCOT, de soporte recubierto. Las WCOT son simplemente tubos capilares donde la pared interna se ha recubierto con una finsima capa de fase estacionaria. Las columnas SCOT tienen en su parte interna una fina capa de material adsorbente como el empleado en las columnas de relleno donde se ha adherido la fase estacionaria. Las ventajas de las SCOT frente a las WCOT es la mayor capacidad de carga de esta ltima, ya que en su fabricacin se emplean mayores cantidades de fase estacionaria, al ser la superficie de intercambio mayor. Por orden de eficacia, en primer lugar estn las WCOT, luego las SCOT y por ltimo las columnas de relleno. Las columnas WCOT se fabrican a partir de slice fundida, conocidas como columnas tubulares abiertas de slice fundida o FSOT. Estas columnas se fabrican a partir de slice especialmente pura, sin Captulo 4 42
apenas contenido de xidos metlicos. Debido a la fragilidad inherente a este material, en el mismo proceso de obtencin del tubo se recubre con una capa de poliamida, de esta forma la columna puede enrollarse con un dimetro de unos pocos centmetros, ya que la longitud de estas columnas es varia de 2 a 50 metros, por lo que se tiene la necesidad de enrollarlas en una forma helicoidal con dimetros de 10 a 30 cm, dependiendo del tamao del horno.. Estas columnas, con propiedades como baja reactividad, resistencia fsica y flexibilidad, han sustituido a las WCOT clsicas. Las columnas FSOT tienen dimetros internos variables, entre 250 y 320 m y 150-200 m para columnas de alta resolucin. Estas ltimas requieren menor cantidad de analito y un detector ms sensible, al eluir menor cantidad de gas. Existen asimismo columnas macrocapilares con dimetros de hasta 530 m, que admiten cantidades de analito comparables a las de relleno pero con mejores prestaciones. En estas columnas existe un problema debido a la adsorcin del analito sobre la superficie de la slice fundida, adsorcin debida a la presencia de grupos silanol, los cuales interaccionan fuertemente con molculas polares orgnicas. Este inconveniente se suele solventar inactivando la superficie por sililacin con DMCS. La adsorcin debida a los xidos metlicos se ve paliada en gran parte por la elevada pureza de la slice empleada.
4.2 Cromatografa gas-slido

En la cromatografa gas-slido se produce la retencin de los analitos en una fase estacionaria slida como consecuencia de la absorcin fsica. La cromatografa gas-slido ha tenido una aplicacin limitada debido a la retencin semipermanente de las molculas activas o polares y a la obtencin de picos de elusin con colas muy significativas (como consecuencia del carcter no lineal del proceso de adsorcion), de modo que esta tcnica no ha encontrado una gran aplicacin excepto para la separacin de ciertas especies gaseosas de bajo peso molecular. La cromatografa gas-slido se basa en la adsorcion de sustancias gaseosas sobre superficies slidas. Los coeficientes de distribucin son generalmente mucho mayores que en el caso de la cromatografa gas-liquido. En consecuencia la cromatografa gas-slido es til para la separacin de especies que no se retienen en columnas de gas-liquido, tales como los componentes del aire, sulfuro de hidrogeno, disulfuro de carbono, xidos de nitrgeno, monxido de carbono, dixido de carbono y gases nobles. Captulo 4 43
La cromatografa gas-slido se lleva a cabo tanto en columnas de relleno como en columnas abiertas. En estas ltimas, se fija en las paredes del capilar una delgada capa del adsorbente; estas columnas a veces se denominan columnas abiertas de pared porosa, o columnas PLOT. Se encuentras dos tipos de adsorbente: los tamices moleculares y los polmeros porosos.
4.3 Tamices moleculares.

Los tamices moleculares son intercambiadores de iones de silicato de aluminio, cuyo tamao de poro depende del tipo de catin presente. Los preparados comerciales de esos materiales estn disponibles en tamaos de partcula de 40/60 mesh a 100/120 mesh. Los tamices se clasifican segn el dimetro mximo de las molculas que pueden penetrar en los poros. Los tamices moleculares comerciales ser encuentran con tamaos de poro de 4, 5, 10 y 13 amstrongs. Las molculas ms pequeas que las dimensiones anteriores penetran en el interior de las partculas donde tiene lugar la adsorcion, para estas molculas el rea de la superficie disponible es enorme cuando se compara con el rea disponible para las molculas ms grandes. Por ello, los tamices moleculares se pueden utilizar para separar las molculas pequeas de las grandes. Por ejemplo, un relleno de 5 amstrongs y 183 cm de largo, a temperatura ambiente, separar fcilmente una mezcla de helio, oxigeno, nitrgeno, metano y monxido de carbono en ese orden. En la primer figura de la siguiente hoja se muestra un tpico cromatograma obtenido con tamices moleculares. En esta aplicacin se utilizan dos columnas de relleno: una es una columna de gas-liquido ordinaria y la otra es una columna de tamices moleculares. La primera retiene solamente el dixido de carbono y deja pasar los restantes gases a una velocidad que corresponde a la velocidad del portador. Cuando el dixido de carbono eluye de la primera columna, un conmutador desva el flujo de la segunda columna para evitar la adsorcion permanente del dixido de carbono en los tamices moleculares. Una vez que la seal de dixido de carbono ha vuelto a cero el flujo se reconduce a traves de la segunda columna, y de este modo se produce la separacin y elusin del resto de los componentes de la muestra.
4.4 Polmeros porosos:

Las bolitas de los polmeros porosos de tamao uniforme se fabrican a partir de estireno polimerizado con divinilbenceno. El tamao de poro en estas bolitas es uniforme y se controla por el grado de polimerizacin. Los polmeros porosos han encontrado una gran aplicacin en la separacin de especies polares gaseosas tales como sulfuro de hidrogeno, xidos de nitrgeno, agua, dixido de carbono, metanol y cloruro de vinilo. Captulo 4 44
En la segunda figura de la siguiente hoja se muestra una aplicacin caracterstica de una columna abierta revestida con un polmero poroso (columna PLOT).
4.4 Aplicaciones.
Se sabe que los cidos grasos trans incrementan el colesterol LDL y disminuyen el colesterol HDL en sangre. Consecuentemente una ingesta excesiva de cidos grasos trans aumenta el riesgo de enfermedad cardiovascular. La aumentada preocupacin por los cidos grasos trans requiere de mtodos precisos y convenientes para el anlisis de productos comerciales. Los mtodos analticos disponibles actualmente incluyen: cromatografa de gases,
espectroscopia de infrarrojo, y cromatografa de gases de capa fina (AgNO3- TLC- GC, por sus siglas en ingls). Dentro de estos mtodos la cromatografa de gases se ha usado preferencialmente dado su conveniencia y su sensibilidad. Bis cianopropil polisiloxano o bis cianopropilsiloxano polisilfenileno son las fases estacionarias comnmente usadas en el anlisis de cidos grasos trans en correspondencia a la necesidad por una alta resolucin entre los picos de los metil- esteres de los cidos grasos (FAME). Existen varios mtodos analticos oficiales utilizando estas fases estacionarias tales como los mtodos del AOAC (Asociacin Oficial de Qumicos Agricultores) y AOCS (Asociacin Americana de Qumicos y Aceites) (por sus siglas en ingls). A pesar de que el mtodo de AOCS es muy preciso tiene varias desventajas, tales como: un tiempo de anlisis mayor debido a la longitud de la columna (100 m), la dificultad en la identificacin de los picos debido a su fase estacionaria de bis cianopropil polisiloxano y los grandes costos econmicos debidos a el uso de un estndar caro. Por lo tanto debe buscarse un mtodo ms conveniente de GC, particularmente para el propsito de control de calidad.
Captulo 4
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Mtodo 1 Columna Fase estacionaria Longitud Dimetro interno Grosor de pelcula Temperatura Inj/Det Gas acarreador Split Volumen inyectado Tiempo de corrida
3
Mtodo 2
Mtodo 3 SP-2560
TC- 70
TM
(GL- Science)
TM
(Supelco Inc.)
bis cianopropilsiloxano polisilfenileno 30m 0.25mm 0.25m 190C 250C/260C 1 ml/min Helio 100:1 1l 18min 40 min 60m
bis cianopropil polisiloxano 100m 0.25mm 0.20m 180C

2
250C/250C 1 ml/min Helio 100:1 1l 74min
Tabla 1. Ejemplo del trabajo hecho por determinacin de cidos grasos trans
Shirasawa y colaboradores para encontrar un mejor mtodo de
1) Prueba control: AOCS celh-05 2) 180C (60 min)- (10C/min)- 220C (10 min) 3) 1% del aceite en hexano. Por otro lado, derivados de las anfetaminas tales como: 3,4-metilendioxi(MDA), 3,4 metilendioxietilanfetamina (MDEA) y 3,4- metilendioximetilanfetamina (MDMA) constituyen un grupo de estimulantes del sistema nervioso que producen efectos cardiovasculares y del comportamiento bien identificados. El abuso de estas drogas es especialmente problemtico entre la poblacin joven y a pesar de que las intoxicaciones agudas han sido ampliamente documentadas el potencial de toxicidad por lapsos mayores de tiempo para el sistema nervioso es el tema de muchas controversias. MDMA se excreta en la orina generalmente sin cambio alguno junto con otros derivados de las anfetaminas como HHMA, HHA, HMMA y HMA. La cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas es la tcnica instrumental ms comnmente empleada en el anlisis de anfetaminas y sus derivados. La derivatizacin es requerida para mejorar la cromatografa, en cuanto a la sensibilidad y reproducibilidad de aminas primarias y secundarias.
Captulo 4
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Tabla 2. Ejemplo del trabajo de Pirnay y colaboradores en la cuantificacin de derivados de anfetaminas en orina por GC-MS
4.5 Resumen
La cromatografa de gases constituye un poderoso instrumento en la determinacin de los componentes de una muestra, al permitir tanto la separacin de stos como su deteccin individual. Una gran ventaja de este mtodo es la rapidez y su lmite de deteccin, un requisito indispensable para el anlisis es que la muestra debe ser voltil. Dependiendo de la fase estacionaria utilizada la cromatografa de gas se subdivide en: gaslquido y gas slido. En el caso de la cromatografa de lquidos, los parmetros dependen del poder del eluyente (la polaridad de este); para la cromatografa de gases, los parmetros dependen de la temperatura a la cual se est trabajando y del flujo del gas de arrastre. Las partes esenciales de un equipo de cromatografa son: fuente de gas portador, sistema de regulacin de caudales, bloque termostatado de inyeccin de las muestras, columna termostatada, detector termostatado, con amplificador de seal y registro grfico y caudalmetro de precisin.
4.6 Bibliografa
http://www.upct.es/~sait/_sit/html/recursos_masas_y_gases.htm http://instrumental.uprh.edu BERMEJO, Francisco. BERMEJO, Pilar. BERMEJO, Adela. Qumica Analtica generla, cuantitativa e instrumental. Vol. 2. 6ta. Edicin. Ed. Paraninfo. Madrid 1991. SKOOG, Douglas A. y Leary, James J. (1994), Anlisis Instrumental,Madrid: McGraw-Hill. Pirnay et al. Sensitive Gas Chromatography Mass Spectrometry Method for Simultaneous Measurement of MDEA, MDMA, and metabolites HMA, MDA, and HMMA in human urine. Drug Monitoring and Toxicology. Clinical Chemistry 52:9. 1728-1734. (2006). Shirasawa et al. A Rapid Method for Trans- Fatty Acid Determination Using a Single Capillary GC .Journal of Oleo Science. J. Oleo Sci. 56 (2) 53- 58. (2007) Rubinson, Kenneth. Analisis Instrumental. Editorial Pearson Education, Madrid 2001. pps 680700. 47
Captulo 4
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
Captulo 5 Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)

La cromatografa es un mtodo fsico de separacin, basado en la distribucin de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una estacionaria y otra mvil. En cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una columna que contiene a la fase estacionaria. La cromatografa lquida se lleva a cabo en una columna de vidrio. Despus se coloca la muestra por la parte superior y se hace fluir la fase mvil a travs de la columna por efecto de la gravedad. Para aumentar la eficiencia en las separaciones, en la cromatografa de alta resolucin; el tamao de las partculas de fase fija se disminuye hasta los micrones, usando altas presiones para lograr que la fase mvil pueda fluir.
5.1 Tipos de cromatografa en HPLC y aplicaciones

La Cromatografa de lquidos, es una tcnica de anlisis qumico ampliamente utilizada, la cual permite separar fsicamente y cuantitativamente los distintos componentes de una solucin por la absorcin selectiva de los constituyentes de una mezcla, consta de dos fases, una fija que suele llamarse fase estacionaria, y una mvil (fase mvil) que fluye permanente durante el anlisis, y que en este caso es un lquido. La tabla 1 nos muestra los tipos de cromatografa lquida que existen as como su separacin cromatogrfica.
Nombre Particin Adsorcin Papel Capa delgada Gel Intercambio inico Tipo de fase mvil Lquido Lquido Lquido Lquido Lquido Lquido Tipo de fase estacionaria Lquido Slido Lquido Lquido o slido Lquido Slido Mtodo de fijacin de la fase estacionaria Adsorbida en un slido poroso sostenido en una columna tubular Sostenida en una columna tubular Sostenida en los poros de un papel grueso Slido finamente dividido sostenido sobre una placa de vidrio: el lquido puede absorberse sobre las partculas Sostenido en los intersticios de un polmero slido Resina de intercambio inico finamente dividida en una columna tubular
Tabla1.- Clasificacin de las separaciones cromatogrficas
Captulo 5
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5.2 Cromatografa de adsorcin

Es la tcnica ms usada para la separacin de compuestos orgnicos neutros, es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas moleculares inferiores a 5 000. Se basa en la afinidad de adsorcin, su fase estacionaria es la superficie de un slido finamente dividido. El soluto compite por los sitios sobre la superficie del slido con el disolvente utilizado como eluyente; la retencin es el resultado de la adsorcin. Las nicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografa son la slice y la almina, siendo la primera la preferida. La eleccin de la fase mvil es fundamental para el xito de una cromatografa lquido-slido; variando el disolvente, si este presenta una alta fuerza de elucin eluir las especies absorbidas ms rpidamente que uno que tenga un valor ms bajo. La cromatografa de capa fina (TLC) es un ejemplo especial de cromatografa por adsorcin en la cual la fase estacionaria es un plano, en la forma de un soporte slido en un plato inerte.
Aplicaciones:
se utiliza para compuestos no polares con masas <5000,
muestras solubles en
disolventes no polares y es capaz de diferenciar entre compuestos ismeros. Es particularmente adecuada para el anlisis de molculas no ionizantes, insolubles en agua y relativamente simples, que frecuentemente son ismeros o compuestos muy relacionados. Se utiliza en la separacin de la vitamina D3 y sus metabolitos las vitaminas A, D y E (y compuestos muy relacionados a estas vitaminas), muchas drogas de abuso (LSD, por ejemplo), antidepresivos tricclicos, bloqueadores beta y los PTHaminocidos. Los aceites naturales y los extractos de esencias se analizan fcilmente y lospigmentos menos polares de las plantas, tales como los carotenoides y las porfirinas, La tendencia a ser adsorbido disminuye en el siguiente orden: cido>alcohol>carbonilo>ster>hidrocarburo. A continuacin se muestra una cromatografa de absorcin.
Figura 1.- Cromatografa de Adsorcin
Captulo 5
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5.3 Cromatografa de particin

Cromatografa lquido-lquido La separacin de las sustancias se logra por migracin diferencial de los solutos. La fase estacionaria de la cromatografa de particin es un lquido soportado en un slido inerte, el ms usado es el cido silcico o gel de slice. La fase mvil puede ser un disolvente puro o una mezcla de disolventes, la polaridad puede ser notablemente diferente al la del lquido estacionario. Esta consiste en aplicar una gota de la solucin con la mezcla de substancias a separar en la parte inferior de una tira de papel o en una delgada capa de un material inerte, como silicagel o celulosa, el papel o material inerte (los denominaremos soportes) se colocan en un recipiente con un solvente, de manera que, este los vaya impregnando; el disolvente se elige de manera tal que uno de ellos se adsorba ms al soporte que el otro; a medida que el disolvente avance a lo largo del soporte los lquidos suben espontneamente por capilaridad, aquellos componentes de la muestra que sean ms solubles en el lquido que queda adsorbido sern retenidos, y los que tengan mayor afinidad por el que no se adsorbe sern arrastrados por este.
Aplicaciones:
es un poderoso instrumento para la separacin de sustancias estrechamente
relacionadas. Ejemplos tpicos son la resolucin de los numerosos aminocidos formados en la hidrlisis de una protena, la separacin y anlisis de alcoholes alifticos y la separacin de derivados de azucares.
Fig. 2 Separacin de molculas pequeas por cromatografa de particin.

El disolvente por lo general es agua y las especies a separar son iones, es muy utilizada en la qumica inorgnica, tambin se usa para la separacin de aminocidos y otros cidos y bases orgnicas. Est basada en la atraccin entre iones del soluto y puntos cargados que existen en la fase estacionaria. El intercambio inico es un proceso en el cual ocurre un intercambio de iones de signo igual entre una solucin y un slido esencialmente insoluble en contacto con la solucin. La fase estacionaria es una resina de intercambio inico que contiene grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones); la Fase Mvil es generalmente una solucin amortiguadora de pH. Captulo 5 50

Dentro de los intercambiadores encontramos: arcillas y las ceolitas, as como resinas sintticas. Estas ltimas pueden ser usadas para intercambio de cationes se usan: resinas cidas fuertes las cuales contienen grupos de cidos sulfnico y resinas cidas dbiles con grupos de cido carboxlico. En el caso de intercambiadores aninicos, contienen grupos funcionales bsicos adheridos a la molcula de polmero generalmente son aminas. La Fase Estacionaria es una resina de intercambio inico que contiene grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones); la Fase Mvil es generalmente una solucin amortiguador de pH.
Aplicaciones: encuentra mucho uso en los analizadores para aminocidos, se ha aplicado a una gran
variedad de sistemas orgnicos y bioqumicos incluyendo frmacos y sus metabolitos, sueros, conservantes de alimentos, mezclas de vitaminas, azcares y preparaciones farmacuticas.
Figura 3.-Cromatografa Inica (a) Separacin de aniones en una columna de intercambio aninico. (b) separacin de iones alcalinotrreos en una columna de intercambio catinico .
5.5 Cromatografa en gel

Es una tcnica de caracterizacin de polmeros que proporciona la distribucin completa de pesos moleculares de una muestra y sus distintos promedios. El fraccionamiento se basa, por lo menos en parte, en el tamao y la forma molecular de las especies de la muestra, tambin se le conoce como cromatografa de permeacin en gel, cromatografa de exclusin y cromatografa de tamizado molecular. Se efecta en una columna por el mtodo de elusin. La fase fija est formada por partculas polimricas o de slice que contienen una red uniforme de poros por los que pueden penetrar las molculas de pequeo tamao. Las molculas de tamao grande se excluyen totalmente y son eluidas en primer lugar, mientras que las de pequeo tamao tienen acceso a todo el volmen poroso y son las ltimas que se eluyen, los factores que determinan la separacin de las molculas son el tamao del poro, el tamao de la partcula y el flujo de elucin. Los diferentes tipos de partculas usadas deben ser estables, mecnica y qumicamente, tener bajo contenido en grupos inicos, uniformidad de poro y Captulo 5 51

tamao. Los compuestos pueden ser derivados de dextranos (Sephadex), derivados de agarosa (Sepharosa), derivados de acrilamidas (Biogel P) y esferas de vidrio. Hay diferentes tamaos de partcula para un gel: a menor tamao mayor resolucin y menor gasto en la columna.
Aplicaciones: Este tcnica se emplea en la separacin de protenas de alimentos, determinacin de

glucosa y fructosa en zumos de fruta, as como para la separacin de compuestos de alto peso molecular- protenas y polmeros, cidos grasos, azucares. Cambios de buffers, despus de cromatografas de intercambio inico, afinidad o de interaccin hidrofbica; desalado, protenas, polisacridos, polipptidos etc. pueden ser desalados antes de ser concentrados o liofilizados; eliminacin de fenol de las preparaciones de cidos nuclicos; eliminacin de compuestos de bajo peso molecular marcados. I125, FITC de las soluciones de marcaje de protenas; para reacciones entre macromolculas y reactivos de bajo peso molecular; eliminacin de productos, cofactores, inhibidores, etc. de las enzimas; Purificacin de macromolculas; determinacin del peso molecular de las protenas.
Figura 4.- Cromatograma Sephadex G-200 superfine. Peaks: 1. catalase; 2. aldolase; 3. Bovine serumalbumin; 4. ovoalbumin; 5 chymotrypsinogen A; 6 ribonuclease A.
5.6 Cromatografa plana

La separacin se produce sobre una capa de un slido finamente dividido que se ha fijado sobre una superficie plana, es un mtodo notablemente simple y de bajo costo. Tcnica de separacin en la que la fase estacionaria est en forma de plano o sobre un plano, ste puede ser un papel, que est impregnado con una sustancia que acte de fase estacionaria o una capa de partculas slidas extendida sobre un soporte, tal como una placa de vidrio. A veces a la se la llama Cromatografa de Lecho Abierto. La cromatografa plana tiene como fase mvil un lquido y como fase estacionaria un lquido o un slido dispuestos sobre una superficie plana; existen tres tipos, cromatografa en papel, donde una hoja o tira de papel de filtro sirve como fase estacionaria y medio de separacin; cromatografa en capa fina, en la que la separacin se produce sobre una capa de slido finamente dividido que se ha fijado Captulo 5 52

sobre una superficie plana; y la electroforsis. La fase mvil se mueve a travs de la fase estacionaria por capilaridad, a veces es ayudado por gravedad o por potencial elctrico.
Aplicaciones:
se utiliza para separar e identificar los componentes de pequeas muestras de se usa en determinadas aplicaciones con una
substancias inorgnicas, orgnicas y bioqumicas,
finalidad didctica, tambin para la separacin de muestras clnicas y bioqumicas as como en otras aplicaciones analticas generales por su gran sencillez y bajo costo.
5.7 Cromatografa en papel

Se utilizan papeles especiales de elevada pureza, Es una tcnica muy sencilla, se utiliza una tira de papel de filtro (Whatman n 1 por ejemplo) como soporte para la separacin. El mecanismo que interviene en la separacin fundamentalmente de reparto. La fase estacionaria esta constituida por el agua absorbida sobre las molculas de celulosa del papel. El papel utilizado puede ser papel de filtro estndar o papel, La fase mvil se selecciona empricamente, se emplean mezclas consistentes en compuestos orgnicos, agua y otras especies (cidos, bases, agentes complejantes) que modifiquen la solubilidad de los compuestos de la muestra.
5.7 Cromatografa en capa fina

Se realiza en placas de vidrio o plstico recubiertos con una capa delgada de partculas finamente divididas contenidas en la fase estacionaria. El mecanismo predominante es la adsorcin. Los materiales ms usados han sido: gel de slice, almina, celita, poliamidas. La fase mvil el disolvente a utilizar debe reunir una serie de caractersticas: inerte frente a los componentes de la muestra y de la fase estacionaria, elevada pureza, adecuada viscosidad y tensin superficial, bajo punto de ebullicin para facilitar el secado de las placas, econmico y baja inflamabilidad y toxicidad.
Figura 5.- Cromatograma en capa fina bidimensional (gel de slice) de algunos aminocidos. Disolvente A: tolueno/2- cloroetanol/piridina. Disolvente B: cloroformo/alcohol bencilico/cido actico. Aminocidos: (1) cido asprtico, (2) cido glutmico, (3) serina, (4) f3-alanina, (5) glicina, (6) alanina, (7) metionina, (8) valina, (9) isoleucina y (10) cistena.
Captulo 5
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El HPLC se utiliza para: deteccin y cuantificacin de sacarina benzoatos, cafena y aspartame en refrescos; deteccin de ciclomato en jugos de fruta; separacin de esteres de cidos grasos por fase inversa y con argentacin de columnas( Silicato de Al con Ag); separacin de triglicridos por la longitud de la cadena y el grado de instauracin por fase inversa y detector de dispersin luminosa, para el estudio de aceites y grasas adulteradas; determinacin del contenido de Vit A y sus precursores ( y caroteno) en margarina y aceites de hgado por fase inversa; determinacin del contenido en Vit D en leche en polvo y cereales por fase normal.
5.8 Instrumentacin.
Un equipo para HPLC puede ser representado por la siguiente figura 6
Figura 6.-Esquema de los componentes de un HPLC
La fase mvil puede ser un disolvente puro o una mezcla de disolventes; algo importantes es que deben ser grado HPLC, esto implica un 99% o mas de pureza para evitar contaminantes que puedan interferir en la elucin de la muestra o bien que contengan algunas pequeas partculas que puedan tapar la columna; por lo que es necesario filtrarlos antes de que entren a la columna. Dependiendo del equipo, cuando se trata de una mezcla de disolventes; se puede o no programar la bomba para que tome las cantidades adecuadas de cada disolvente o bien, algunas otras bombas (las ms antiguas) no tienen la capacidad de realizar esta mezcla y por lo tanto esta se tiene que preparar por nosotros. Cuando durante toda la separacin se usa el mismo disolvente, se denomina isocrtica. La bomba enva el disolvente hacia la vlvula inyectora que es una vlvula de seis vas que permite introducir al disolvente, la muestra contenida en el loop de volumen calibrado. Luego de que se produzca la separacin en la columna, los componentes de la mezcla pasan al detector. El cual da una seal elctrica proporcional a la cantidad de materia; esta seal es enviada al registrador que a su vez da un cromatograma de intensidad en funcin del tiempo (figura 7); en el cual, lo ideal es obtener picos gaussianos los cuales corresponden cada uno a un componente diferente de la muestra.
Captulo 5
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Figura 7.- Cromatograma tpico obtenido por un HPLC En HPLC existen dos tipos bsicos de detectores:

Los basados en una propiedad de la disolucin. Los basados en una propiedad del soluto Algunos de los detectores ms usados son: detectores de absorbancia, detectores de
fluorescencia, detectores de ndice de refraccin, detector de dispersin de luz, detectores electroqumicos, detectores por espectrometra de masas. El integrador calcula el rea de cada pico, la cual se puede relacionar con la concentracin del componente si se tiene una curva patrn; si no se cuenta con ella, slo sera cualitativa. Debido a que los detectores que se usan en estos equipos no son destructivos, es posible recuperar los productos que salen de l, y de esta manera realizar otro tipo de separaciones (por ejemplo) analticas (tambin depende del tamao del loop, de la columna y del tipo de bomba).
5.9 Volumen y tiempo de retencin

El volumen de fase mvil (o tiempo para Tr) necesario para transportar la banda de soluto desde el punto de inyeccin a travs de la columna, hasta el detector, en el punto mximo del pico del soluto se define como volumen de retencin (Vr). El volumen muerto (V0) representa lo que se conoce como espacio muerto o volumen de retraso de la columna, incluye las contribuciones efectivas del volumen del inyector, tubera, conexin, columna y detector.
Captulo 5
55
5.10 Factor de capacidad (K)

Actualmente, se conoce como factor de retencin (k). El factor de retencin es un parmetro experimental importante que se utiliza para describir las velocidades de migracin de los solutos en columnas. Para el soluto A, el factor de retencin, kA se define como: =
donde KA es la constante de distribucin del soluto A, Vs es el volumen del soluto en la fase estacionaria y Vm el volumen del soluto en la fase mvil (Skoog y cols., 2001).
5.11 Selectividad
El factor de selectividad de una columna para dos solutos, A y B, se define como la relacin de la constante de distribucin del soluto retenido con ms fuerza, B, y la constante de distribucin del soluto retenido con menos fuerza, A: =
donde KB es la constante de distribucin de la especie retenida con ms fuerza, especie B, y KA es la constante de la especie retenida con menos fuerza, es decir, la especie A, que eluye ms rpido. De acuerdo con esta definicin, siempre es mayor que la unidad (Skoog y cols., 2001).
5.12 Eficiencia
La eficiencia de una columna cromatogrfica depende del ensanchamiento de banda que ocurre cuando un compuesto pasa a travs de la columna. Para las mediciones cuantitativas de la eficiencia de las columnas cromatogrficas se emplean dos trminos: (1) altura del plato H y (2) cantidad de platos o nmero de platos tericos N. Los dos estn relacionados por la ecuacin: =
donde L es la longitud del empaque de la columna (en cm). La eficiencia de las columnas cromatogrficas aumenta a medida que es mayor el nmero de platos N y la altura H es menor. Se observan grandes diferencias en la eficiencia de las columnas como resultado de las diferencias en el tipo de columna y de las fases mvil y estacionaria. En trminos de nmero de platos tericos, la eficiencia puede variar desde unos centmetros hasta varios cientos de miles; la altura de los platos vara desde unas dcimas hasta milsimas de centmetro y son comunes incluso mas pequeas (Skoog y cols., 2001). Captulo 5 56
5.13 Resolucin cromatogrfica

Es una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos A y B. la resolucin de cada columna queda definida como: = 2 2 = + +
Se puede mejorar la resolucin para una fase estacionaria determinada alargando la columna, lo que incrementa el nmero de platos. Sin embargo, una consecuencia adversa de aadir platos es un incremento en el tiempo necesario para la separacin de los componentes (Skoog y cols., 2001).
5.14 Nmero de platos tericos

Expresada como una cantidad adimensional, refleja el nmero de veces que el soluto se reparte entre las dos fases durante su paso a travs de la columna.
5.15 Asimetra (AF)

El factor de asimetra del pico (AF, de asymetry factor) se define como la razn de las mitades del ancho del pico a una altura dada. Conforme se mida ms abajo la asimetra del pico AF es mayor, debido al ruido del detector, un compromiso aceptable es medir AF en 10% de la altura del pico.
SF=A/B
Representacin esquemtica del factor de asimetra. Skoog, 2001
Captulo 5
57
5.16 Instrumentacin
Los componentes bsicos de un sistema para HPLC son: A) B) C) Depsitos para la fase mvil (disolventes) Sistema de bombeo para proporcionar presin a la fase mvil Sistema de inyeccin de muestras
D) Columna cromatogrfica E) F) Termostatos para las columnas Detectores
G) Sistema para el tratamiento de datos y registrador
Componentes bsicos de un sistema para HPLC. Hernndez, 2002.
Como algunas de las fases mviles usadas en HPLC pueden ser qumicamente activas como cidos, bases o lquidos corrosivos, es esencial que los componentes del sistema estn fabricados con materiales resistentes, por lo que la mayora de las partes en contacto con la fase mvil suelen estar fabricadas con acero inoxidable (Hernndez L. 2002). Los disolventes ms usados en HPLC son agua, disoluciones tampn acuosas y disolventes orgnicos como el metanol. Deben ser espectroscpicamente puros, exentos de partculas slidas y degasificados, esto se lleva a cabo con un gas inerte muy poco soluble como el helio. Como fase estacionaria lo ms comn es usar partculas microporosas esfricas de slice muy puro, que son permeables al disolvente (Harris, D. 2001). Captulo 5 58

A) Los recipientes que se utilicen para almacenar la fase mvil tienen que ser inertes, es decir, el disolvente no deber extraer especie alguna del material con el que estn construidos. Suelen ser botellas de vidrio y tubos de tefln. Estn provistos de unos filtros, indispensables para eliminar los gases disueltos y partculas que pueda contener la fase mvil (Harris, . 2001). B) Debido a las elevadas presiones de trabajo y al pequeo tamao de las partculas de la fase estacionaria, se utiliza una bomba que es la encargada de introducir la fase mvil o disolvente a travs de la columna. Los sistemas de bombeo debern reunir las siguientes caractersticas: (Hernndez, L. 2002). Generar presiones superiores a 6000 psi. Capaces de cubrir un amplio rango de flujo entre 0,1 y 10 ml/min con una precisin del 0,5 % y que est libre de pulsaciones. Construidos con materiales inertes respecto a los disolventes empleados. Las bombas empleadas en HPLC son de tres tipos: Bombas recprocas o de vaivn, son las ms utilizadas. Estn formadas por una pequea cmara cilndrica que se llena y luego se vaca por oscilacin de un pistn de zafiro. El bombeo produce un flujo pulsado que despus debe amortiguarse. Sus principales ventajas son que se consiguen presiones elevadas y se suministra un caudal constante, pudindose adaptar a la tcnica de elucin con gradiente, debido a su pequeo volumen interno (Skoog, D. A. et al. 2001). Bombas neumticas o de presin constante, hacen uso de la presin de un gas aplicado al recipiente conteniendo la fase mvil. Son sencillas, no provocan pulsaciones pero estn limitadas a presiones relativamente bajas. (Hernndez, L. 2002). Bombas de desplazamiento o tipo jeringa, consisten en una cmara equipada con un mecanismo de tornillo. Suministran un flujo libre de pulsaciones pero con una capacidad limitada a unos 250 ml. (Harris,D.C. 2001) C) Los volmenes que se inyectan de muestra debern ser pequeos para evitar la sobrecarga de la columna. Hay varios tipos: El mtodo ms simple es la utilizacin de una jeringa de alta presin con un diafragma (septum) a la entrada de la columna. Est limitado a una presin mxima de operacin de 1500 psi.
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Las vlvulas de inyeccin con bucles de volumen conocido, es el mtodo ms utilizado (Harris, D. C. 2001). D) En las columnas cromatogrficas es donde se produce la velocidad diferencial de los solutos que permite su separacin (Harris, D. C. 2001). El material de las columnas cromatogrficas suele ser de acero inoxidable cuya longitud vara de 5 a 30 cm y un dimetro de 1 a 5 mm. La eficacia de las columnas aumenta al disminuir el tamao de las partculas de la fase estacionaria. El tamao tpico de las partculas es de 3-10 um (Harris, D. 2001).
Columna para HPLC. Fuente: P.V.G. Lab. 3-D, Facultad de Qumica, 2007
Las columnas son caras y se degradan con facilidad, por eso, se protege la entrada de la columna con otra ms corta, la precolumna, que retiene por adsorcin las impurezas de forma irreversible (Harris, D. 2001). E) No es necesario el control estricto de la temperatura de la columna, pero las separaciones resultan ms reproducibles cuando la temperatura se mantiene constante. Los instrumentos comerciales modernos estn equipados con calentadores que regulan la temperatura de la columna. F) El papel del detector es indicar los momentos de aparicin de los componentes, y proporcionar indicacin cuantitativa y cualitativa de los mismos. El detector utilizado depende de la naturaleza de la muestra y deber reunir una serie de caractersticas como son, tener una sensibilidad elevada, buena estabilidad y reproducibilidad. Amplio margen de respuesta lineal, insensible a cambios en la presin y la temperatura. Se pueden clasificar de la forma siguiente: (Hernndez, L. 2002) El detector se coloca al final de las columnas, responde a la concentracin del soluto y se registra en funcin del tiempo y obtenindose una serie de picos, generndose un grafico que se denomina cromatograma. La posicin de los picos en el eje del tiempo puede servir para identificar los componentes de la muestra. Captulo 5 60

Los detectores basados en una propiedad del soluto que no la suele presentar la fase mvil. Suelen ser muy selectivos y sensibles: Detectores de absorbancia ultravioleta, son los ms utilizados. Su fundamento es la espectrofotometra de absorcin de luz visible y ultravioleta de un componente a una determinada longitud de onda. Los ms potentes son los que utilizan un montaje de fotodiodos para registrar el espectro completo de cada soluto que pasa por el detector. Los datos de absorbancia se representan en funcin de la longitud de onda y del tiempo. Detectores de fluorescencia, son muy sensibles y selectivos, el principio de operacin se basa en la irradiacin con la luz UV al componente de inters y la posterior medida de la luz fluorescente emitida por ste.( Harris, D. C. 2001) Detectores electroqumicos, ofrece ventajas debido a su especificidad, sensibilidad y amplia aplicabilidad, especialmente para compuestos orgnicos. Responde a analitos que puedan oxidarse o reducirse. Es el ejemplo de fenoles, aminas, perxidos (pueden detectarse por oxidacin) y cetonas, aldehdos (detectados por reduccin). Las tcnicas electroqumicas ms utilizadas con esta finalidad son la amperometra, voltamperometra y culombimetra. Los detectores basados en una propiedad de la disolucin, responden a un conjunto amplio de solutos, pero suelen ser poco sensibles: Detectores de ndice de refraccin, est formado por una celda con dos compartimentos, en uno se introduce el disolvente puro y en el otro la muestra, se hace pasar luz visible paralela. Cuando entra en la celda soluto de distinto ndice de refraccin al disolvente el has se desva y vara la seal dada por la fotoclula (Harris, D. C. 2001). El principal inconveniente es que son muy sensibles a los cambios de temperatura y no resultan apropiados para trabajar con la modalidad de elusin con gradiente. Detectores de conductividad, son los ms utilizados cuando los solutos eluidos son inicos, como cidos y bases, as como cationes y aniones inorgnicos despus de su separacin por cromatografa de cambio inico. Tienen elevada sensibilidad, baratos y de larga duracin. Caractersticas de los detectores: Sensibilidad. Medida de la efectividad de un detector para convertir la muestra en una seal elctrica medible. Linealidad. Rango de masa concentracin de muestra sobre el cual el detector mantiene una sensibilidad constante sin una desviacin arbitraria. Captulo 5 61

El significado prctico de la linealidad del detector es el que le indica al analista la concentracin para la cual el detector es confiable. Hay dos lmites en la curva de linealidad: El lmite de concentracin inferior, que es dado por el lmite de deteccin. El lmite Superior, definido por un porcentaje de desviacin arbitrario de la curva de linealidad.
Rango Dinmico Lineal. Rango sobre el cual la sensibilidad del detector es constante. Ruido. Es cuantificado por el promedio de la amplitud pico-pico de la seal. El significado de conocer el nivel de ruido de un detector es un factor determinante en la determinacin de la cantidad mnima detectable y el lmite inferior del rango lineal. Lmite de Deteccin. Est definido como la mnima cantidad de sustancia que puede producir una seal que sea el doble del nivel de ruido. Corriente de Fondo. Seal constante de salida generada por el proceso en el que un detector est operativo sin que alguna sustancia pase a travs de l. Esta seal es muy importante, ya que permite diagnosticar el buen o mal funcionamiento del detector. La separacin efectuada se conserva en un registro individual llamado cromatograma. Un cromatograma es una imagen que traduce visualmente en una pantalla o en un papel la evolucin, en funcin del tiempo, de un parmetro que depende de la concentracin instantnea del soluto a la salida de la columna. Este grfico se obtiene gracias a un detector situado a la salida de la columna (Rouessac y Rouessac, 2003).
Montaje cromatogrfico y cromatograma (Skoog, A. D. Et. Al, 2001).
Captulo 5
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5.17 Bibliografa
BERMEJO, M. F. Qumica analtica general, cuantitativa e instrumental . Vol. 2. Ed. Paraninfo, S. A. Madrid. 1991. HARRIS, D. C. Anlisis qumico cuantitativo. Ed. Reverte, S. A. Barcelona. 2001. HERNNDEZ, L. y GONZLEZ, C. Introduccin al anlisis instrumental. Ed. Arial Ciencia. 2002. KIRK, R. S., SAWYER, R., EGAN, H. Compuestos y anlisis de alimentos de Pearson Ed. Continental, S. A. Mxico. 1996. LORO, J. F. Manual de cromatografa. Coleccin Textos Universitarios. 2001 ROUESSAC, F. y ROUESSAC, A. Anlisis qumico: Mtodos y tcnicas instrumentales modernas. Ed. Mc Graw Hill. 2003. SKOOG, D. A., WEST, D. M., HOLLER, F. J. Qumica analtica. Ed. Mc Graw Hill. 7 edicin. 2001. SKOOG, A y LEARY Anlisis instrumental. Ed. Mc Graw Hill. 1998
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Cromatografa lquida de alta resolucin II

5.18 Cromatografa en fase reversa
En esta tcnica una mezcla de agua/solvente orgnico es comnmente usada como fase mvil, y un slido de rea de superficie altamente no polar es empleado como fase estacionaria. La ltima es usualmente un empaque de alcanos adheridas a slice, por ejemplo, con grupos alquilo de 8 o 18 carbonos cubriendo la superficie de slice. RPC (reverse phase chromatography) es actualmente el mtodo ms popular de cromatografa en lquidos; mas del 70 % de todas las separaciones por HPLC son llevadas a cabo por este mtodo. La base de la retencin de soluto en RPC es aun algo controversial; algunos trabajadores prefieren un proceso de adsorcin, mientras que otros creen en la particin del soluto dentro de la fase estacionaria no polar. Probablemente ambos procesos son importantes para algunas muestras. La retencin de un soluto, X, por la adsorcin competitiva en la superficie de la fase estacionaria puede ser representado por: Xm + zMs Xz + zMm Donde M es una molcula de fase mvil. Los subndices m y s refirieren a las molculas en la fase mvil o estacionaria respectivamente. La ecuacin 1.1 asume que una competencia entre el soluto y las molculas de la fase mvil por un lugar en la superficie de la fase estacionaria existe. Esto es, una molcula adsorbida, X, desplazara un numero z de molculas M previamente adsorbidas. Las pruebas que favorecen un proceso de particiones en RPC son de varias clases: Primero, la retencin de una serie de alcanos sustituidos del tipo Cn-substituidos en el empaque de una columna, muestra una discontinuidad diferente cuando el soluto alquilo sustituido es igual en tamao con el grupo Cn de la fase estacionaria. Esto indica que los grupos n-alquilo en un soluto la molcula puede penetrar (particin) dentro de la fase estacionaria, mientras no sean demasiado largos
[1]
5.19 Cromatografa quiral

Los compuestos pticamente activos han atrado una gran atencin porque los sistemas de la vida son quirales. Protenas, cidos nucleicos y polisacridos poseen caractersticas quirales las cuales poseen una estrecha relacin con sus funciones. Captulo 5 64

Los estereoisomeros son ismeros con una constitucin idntica pero un arreglo espacial diferente. Los estereoisomeros se clasifican de acuerdo a si factor de de simetra en un carbono denominado el carbono quiral. Los enantiomeros tienen propiedades fsicas idnticas excepto por el signo de la rotacin ptica. Generalmente los enantiomeros se obtienen en una mezcla racemica, mezcla en la cual la cantidad de los enantiomeros es igual.
Modos de separacin. La separacin cromatografica de enantiomeros se puede conseguir

por varios mtodos; sin embargo, es siempre necesario el uso de un discriminador de enantiomeros o selector. Dos diferentes tipos de selectores pueden distinguirse: un aditivo quiral en la fase mvil o una fase estacionaria quiral. El mecanismo de separacin es dependiente del modo de separacin usado.
5.20 Cromatografa de derivados diastomricos.

Este el ms antiguo y ampliamente usado mtodo cromatogrfico para distinguir enantiomeros. La columna de derivacin de un soluto pticamente activo con otra molcula pticamente activa depende de la habilidad de separar a la molcula buscada. Un nmero importante de de grupos que desvan la actividad de los compuesto a separar se han estudiado entre ellos estn los grupos amino, (separados con amidas, carbamatos, ureas, tioureas, y sulfoaminas) grupos hidroxilo, (separados con esteres, carbonatos, y carbamatos) grupos carboxilo (esteres y amidas), epxidos (isotiocianatos), olefinas (con complejos quirales de platino), y tioles (con tioeteres). Las ventajas de esta tcnica son: 1. La metodologa ha sido ampliamente estudiada, haciendo que la aplicacin sea relativamente fcil y accesible. 2. La deteccin de los productos puede ser llevada a cabo mediante la seleccin adecuada del agente derivante (separante) con un fuerte cromoforo o fluoroforo. Las principales limitantes: 1. La sntesis de derivados diastomericos requiere del aislamiento de los compuestos necesarios para la separacin. 2. Las muestras se contaminan con el derivado diastomrico. 3. Los productos de inters pueden tener reacciones con los aditivos de la columna.
Captulo 5
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5.21 Separacin usando aditivos quirales a la fase mvil.

La separacin de compuestos enantiomericos se ha logrado a travs de la formacin de complejos diastoisomericos con una molcula quiral aadida a la fase mvil. La separacin quiral es posible dada la diferencia de los complejos diastoisomericos formados, la solvatacin en la fase mvil o la unin a la fase solida. Una visin general del fundamento de este mtodo ha sido publicada por Lindner y Pettersson [2]. Existen tres principales tipos de aditivos para la formacin de los complejos: A) Complejos de metales de transicin (intercambiadores de ligandos) B) Apareamiento de iones C) Inclusin molecular
5.22 Separacin usando aditivos quirales en la fase estacionaria.

A diferencia del mtodo anterior en este mtodo los complejos se forman en la fase estacionaria, donde los aditivos se encuentran ya fijados. El enlace que se forma con uno de los enantiomeros hace posible la separacin de estos mismos. Existen 5 tipos principales de sistemas usados en esta tcnica. 1) Es los complejos soluto fase estacionaria son formados por interacciones atractivas, puentes de hidrogeno, interacciones pi, dipolos instantneos, etc., entre el soluto y la fase estacionaria. 2) El mecanismo para la formacin de complejos soluto-fase estacionaria es a travs de interacciones atractivas en donde la inclusin de complejos juega un papel importante. 3) El soluto entra dentro de cavidades quirales en la fase estacionaria para formar los complejos incrustados. 4) El soluto es parte de un complejo metlico diastomrico. 5) La fase estacionaria es una protena y el complejo soluto-fase estacionaria se basa en combinaciones e interacciones hidrofbicas y polares.
Aplicaciones.
Las principales aplicaciones e encuentran en la industria farmacutica donde
los compuestos quirales tienen diferentes actividades biolgicas en un organismo, la adecuada separacin de estos compuestos es de vital importancia en esta industria [3].
Captulo 5
66

Se utiliza principalmente para la separacin de iones o de una sustancia fcilmente ionizable, en donde una de los principales factores que facilitan la retencin, es la atraccin electrosttica entre los iones de la fase mvil y aquellos situados en la fase inerte estacionaria. En este tipo de cromatografa los iones del analito se separan basndose en las diferencias entre sus afinidades relativas por la fase estacionaria (iones de la fase inerte), contra aquellos que se encuentran en la fase mvil, de forma tal, que se establece un continuo intercambio de cargas en donde los iones de la matriz son reemplazados por los de la muestra a su paso por la columna. Los iones que se intercambian ms frecuentemente son cationes como NH4+, metales grupo I y II, NO2-, NO3-, PO42-, haluros, SO42-.
Fundamento
Es un proceso en el que una solucin de un electrolito es puesta en contacto con una resina intercambiadora, en donde los iones activos de la resina son reemplazados por aquellos iones de la misma carga presentes en el analito.
5.24 Intercambiadores catinicos y aninicos

Un intercambiador catinico es aquel en el que los iones activos sobre la matriz son cationes y el proceso de intercambio involucra cationes, entre los ms comunes se encuentran: -SO3H, -CO2H, -OH, -PO4H3 Los grupos ms comunes en una resina aninica son grupos amino terciarios y cuaternarios y se intercambian de manera anloga a una resina catinica.
Resinas.
Inicialmente
la
fase
estacionaria
constaba
de
resinas
preparadas
por
policondensacin, de fenoles ya minas aromticas con formaldehdo. Algunos grupos inorgnicos eran introducidos por condensacin de formaldehdo con sulfo o carboxil derivados. Actualmente estas se han reemplazado por materiales basados en estireno (poliacrilatos y divinilbencen derivados) los cuales pueden ser modificados para adaptar el tamao de partcula, as como para mejorar la selectividad y la capacidad de retencin de la columna.
Captulo 5
67

Las resinas se preparan por copolimerizacin de estireno con divinilbenceno, de la cual se origina una maya tridimensional que puede ser modificada con gradientes de concentracin para obtener diferencias en el tamao de poro y as aumentar la selectividad. Para las resinas aninicas, se realiza una clorometilacin de la matriz polimrica seguida de un tratamiento con la correspondiente amina.
Resinas catinicas de cido fuerte. Intercambian iones positivos (cationes). Funcionan

a cualquier pH. Es la destinada a aplicaciones de suavizado de agua, como primera columna de desionizacin en los desmineralizadores o para lechos mixtos. Elimina los cationes del agua y necesitan una gran cantidad de regenerante, normalmente cido clorhdrico (HCl).
Resinas catinicas de cido dbil.
Tienen menor capacidad de intercambio. No son
funcionales a pH bajos. Elevado hinchamiento y contraccin lo que hace aumentar las prdidas de carga o provocar roturas en las botellas cuando no cuentan con suficiente espacio en su interior. Se trata de una resina muy eficiente, requiere menos cido para su regeneracin, aunque trabajan a flujos menores que las de cido fuerte. Es habitual regenerarlas con el cido de desecho procedente de las de cido fuerte.
Resinas aninicas de base fuerte.
Intercambian iones negativos (aniones). Es la
destinada a aplicaciones de suavizado de agua, como segunda columna de desionizacin en los desmineralizadores o para lechos mixtos. Elimina los aniones del agua y necesitan una gran cantidad de regenerante, normalmente sosa (hidrxido sdico - NaOH).
Resinas aninicas de base dbil. Se trata de una resina muy eficiente, requiere menos
sosa para su regeneracin. No se puede utilizar a pH altos. Pueden sufrir problemas de oxidacin o ensuciamiento. Propiedades de las resinas: 1. 2. 3. Poseer grupos intercambiadores monofuncionales Un tamao de partcula pequeo Factor de retencin elevado
Tamao de la partcula Estos se basan en los requerimientos estndares (50 mesh)
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100-200 mesh: separaciones a macroescala; cuantitativa 50-100 mesh: preparativas 14-50 mesh: separaciones a escala industrial
Capacidad intercambiadora. Es la medida de la habilidad de la resina para intercambia

un nmero determinado de iones o de carga por gramo de resina. Est determinada por la accesibilidad del grupo que se desea intercambiar, la concentracin del eluyente, fuerza inica, pH, tamao de partcula y la fuerza de la unin resina-analito Para una resina catinica, esta cantidad se define como la capacidad de intercambiar H+, mientras que para una resina aninica esta capacidad esta e funcin de la cantidad de iones Cl- que pueda intercambiar.
Selectividad de la Resina.
La afinidad entre la resina y la partcula a intercambiar, es
funcin de la resina y de los iones. Esto se puede expresar como un equilibrio de la siguiente forma: n(R- H+ ) + Mn+1 ( R- )n Mn+ + n H+ Donde R representa la matriz y puede establecerse la constante de equilibrio como se muestra: Kd = [Mn+]r [H+]n / [M m+] [H+]n r Donde el ltimo trmino representa las concentraciones de los iones. Entre mayor sea el valor se Kd mayor ser la afinidad de la partcula por la resina intercambiada y en consecuencia aumentar la capacidad de intercambio.
Naturaleza de la Resina. El coeficiente de selectividad Kd est determinado por algunos

de los factores de capacidad de la resina; la selectividad se afecta de acuerdo al grado de fuerza relativa en el enlace ion-resina. Los pequeos tamaos de partcula excluyen en su totalidad a aquellas de mayor tamao, aumentando la selectividad de la resina; as como la temperatura. La afinidad de los cationes de las resinas e solucin acuosa se incrementa caudno la carga se incrementa; para cationes de la misma carga, la afinidad es inversamente proporcional al radio del ion hidratado. Algunas secuencias de afinidad se muestran a continuacin: 1. 2. 3. Captulo 5 Na < Ca < Al < Th Li < Na < NH < K < Ag Mg < Cu < Sr < Ba 69

Para las resinas aninicas el intercambio depende del grado de polarizabilidad del anin por el intercambiador; en la medida en la que la polarizacin sea mayor, mayor ser la fuerza con la cual se desplaza el ion de la matriz por el ion de la muestra. En general los iones polivalentes tienen una mayor afinidad que los monovalentes; y para los aniones de la misma carga el ion de mayor tamao tendr una afinidad: F- < HCO3- < Cl- < HSO3- < CN- < Br- < NO3- < I- << SO4 2En general:
Parmetro Observaciones La fuerza del solvente incrementa la fuerza inica y en consecuencia la selectividad se ve afectada La retencin disminuye en la resina catinica y se incrementa en la resina aninica cuando se modifica el pH a valores a mayores Elevando la temperatura se aumenta el grado de intercambio entre la fase mvil y la fase estacionaria Pude aumentar el valor de Kd cuando se modifica la fase estacionaria .
[4]
Fuerza inica
pH
Temperatura
Buffer
5.25 Aplicaciones
Esta tcnica tiene una de sus aplicaciones primordiales en el campo del anlisis clnico, en donde se utiliza comnmente para la determinacin de la presencia de desrdenes metablicos cuando se separan aminocidos y otras aminas de importancia fisiolgica de las muestra de las pacientes. En condiciones normales, los aminocidos se separan en su forma protonada como cidos, utilizando diferentes combinaciones de buffers de citratos y boratos. Posteriormente estos aminocidos pueden ser caracterizados por medio de tcnicas como espectroscopia UV y fluorescencia. En la separacin de carbohidratos, en las cuales se utilizan ligantes sobre un resina polimrica, con algunos metales como Ca2+ (recomendado para alcoholes) y Ag+ (para estructuras oligomericas), utilizando agua destilada o una mezcla de solventes orgnicos como fase mvil. La retencin en este caso se ve determinada por la atraccin electrosttica entre grupos electronegativos (OH-) y electropositivos (Ca2+) y adems por el impedimento estrico entre grupos [5].
Captulo 5
70
5.26 Cromatografa de apareamiento inico

La cromatografa inica, que es una versin de cromatografa de intercambio inico de alta eficacia, se ha convertido en el mejor mtodo de anlisis de iones. Por ejemplo se usa en la industria de semiconductores para controlar niveles de 0.1 ppm de aniones y cationes en agua desionizada. La cromatografa de pares inicos utiliza una columna HPLC de fase inversa, en lugar de una columna de intercambio inico. Para separar una mezcla de cationes se aade a la fase mvil un surfactante aninico, como n-C8H17-SO3. El surfactante se aloja en la fase estacionaria convirtindola eficazmente en un intercambiador inico. Cuando los cationes del analito pasan a travs de la columna se pueden unir a la fase estacionaria por atraccin electrosttica con los aniones del surfactante. El mecanismo de retencin es una mezcla de interacciones con fase inversa y de intercambio inico. Para separar los analitos aninicos se pueden aadir a la fase mvil sales de tetrabutilamonio, como reactivo de par inico. La cromatografa de pares inicos es ms compleja que la cromatografa de fase inversa, por que el equilibrio del surfactante con la fase estacionaria es lento, la separacin es ms sensible a variaciones de temperatura y pH, y la concentracin del surfactante no afecta la separacin. El disolvente a elegir es el metanol debido a que los surfactantes inicos son mas solubles en mezclas metanol/agua que en mezclas acetonitrilo/agua. Las estrategias para el desarrollo de un mtodo dependen de las variaciones en el pH y la concentracin de surfactante, para una concentracin de metanol y temperatura fija. Dada la lentitud del equilibrio entre el surfactante y la fase estacionaria, no se recomienda una elucin gradiente en cromatografa de pares inicos. Figura 1. Fundamento de la
cromatografa de pares inicos. EL surfactante octamonosulfato sdico aadido a la fase mvil se une a la fase estacionaria no polar. Los grupos sulfonato negativos, que sobresalen de la fase estacionaria, actan como puntos activos de intercambio inico frente analitos catinicos, como bases orgnicas protonadas, BH+ [6]
Captulo 5
71
5.26 Cromatografa de exclusin de tamao

La cromatografa de exclusin, tambin llamada cromatografa de permeacin en gel es un modo de separacin no interactivo. Las partculas del empaque de la columna tienen varios tamaos y estructuras de poro, de forma que las molculas son retenidas o excluidas con base en su volumen molecular hidrodinmico; estos es, su tamao y forma. Estrictamente, la separacin en cromatografa de exclusin no se basa en el peso molecular. Conforme la muestra pasa por la columna las molculas del soluto se ordenan. Las molculas muy grandes no pueden entrar en muchos de los poros e incluso penetran menos en las regiones comparativamente abiertas del empaque. Las molculas muy pequeas difunden hacia dentro de todos o muchos de los poros accesibles a ellas. Con un mayor volumen de la columna a su disposicin, las molculas pequeas tardan ms en salir de la columna.
Empaques de la columna.
Los empaques para la columna pueden ser semirrgidos
(polmeros macromoleculares entrecruzados) o rgidos (vidrios o slices de tamao de poro controlado). Los primeros estn limitados para una presin mxima de 300 psi. Las perlas de poliestireno parcialmente sulfonadas son compatibles con los sistemas acuosos y las no sulfonadas con los no acuosos. Los vidrios y slices porosos cumplen una amplia gama de tamaos de poro. A continuacin se presentan unos ejemplos y los correspondientes intervalos de operacin. Dimetro del poro (nm) 4 10 25 55 150 250 Intervalo de operacin (daltons) 1 000 8 000 1 000 30 000 2 500 125 000 11 000 350 000 100 000 1 000 000 200 000 1 500 000
Estos empaques son qumicamente resistentes a valores de pH menores de 10 y pueden usarse con disolventes acuosos y orgnicos polares.
Captulo 5
72
Disolventes.
Se requiere de un solo disolvente en el que se disuelve y cromatografa la
muestra. Si la diferencia en la viscosidad entra una muestra inyectada y la fase mvil es muy grande, puede producirse la distorsin del pico y anomala en los tiempos de elusin.
Detectores.
Los detectores ms utilizados son el refractmetro diferencial y los
espectrofotomtricos que operan en las regiones ultravioleta e infrarroja. Un detector de dispersin de luz laser de ngulo bajo (LALLS) hace posible la determinacin directa de los pesos moleculares ya que responde al peso molecular del analito, no nicamente a la concentracin. Un detector de infrarrojo proporciona informacin sobre la composicin del copolmero, ramificacin y tacticidad, esta se refiere a la estereorregularidad que se encuentra en ciertos tipos de polmeros.
Comportamiento de la retencin.
El comportamiento esencial de un soluto y la
caracterstica de los empaques de las columnas se puede describir en trminos muy simples. Si se supone que el tiempo que toma un soluto para difundirse dentro de un poro es pequeo con respecto al tiempo que la molcula est en la vecindad del poro, entonces el proceso de separacin es totalmente independiente del proceso de difusin, esto se representa de la siguiente forma (coeficiente de distribucin:
VR VM VS
Se puede enunciar como la fraccin interna del volumen de poro que es accesible al soluto. Donde VR (volumen de retencin): es el volumen de eluyente que fluye de una columna entre la inyeccin de la muestra y su salida en el eluyente; VM: es el volumen ocupado por la fase mvil (esto es, en los intersticios entre las partculas porosas llenas de disolvente), que s e estima con la elucin de un soluto totalmente excluido; VS: es el volumen interno acumulado dentro de los poros de las partculas y disponible para un soluto totalmente incluido o para las molculas del disolvente. Las molculas totalmente excluida eluyen en un volumen vaco, esto es, VR=VM y por lo tanto K=0. Para las molculas pequea que pueden entrar en todos los poros del empaque, VR=VM+VS y, por lo tanto, K=1. Las molculas de tamao intermedio eluyen entre estos dos lmites y K se encuentra en el intervalo de 0 a 1.
Captulo 5
73
5.27 Aplicaciones
Mucho del trabajo en la industria de los alimentos y las bebidas o en muestras fisiolgicas en las que la mayora de los cidos del ciclo de Krebs estn presentes, se realiza con facilidad con columnas de exclusin de aniones. Vino, cerveza, jugo de fruta y muchos productos lcteos se analizan rpidamente con una preparacin mnima de la muestra (generalmente slo filtracin o centrifugacin). Otra aplicacin es la separacin de oligosacridos y azcares de alcohol con una columna de exclusin de aniones en la forma inica de calcio con agua como eluyente y una temperatura de 90C. La maltotriosa y otros oligosacridos superiores se separan del mono y los disacridos por efectos de exclusin estrica. En bioqumica la separacin de pptidos, protenas y dems molculas biolgicas es importante y se puede separar efectivamente por este mtodo [7].
5.28 Cromatografa lquido-lquido

Los empaques de columna ms utilizados ms ampliamente para cromatografa de reparto lquido-lquido, son aquellos con fases estacionarias orgnicas enlazadas. Reemplazan a los empaques clsicos en los que el lquido estacionario recubre un material de soporte. El reparto ocurre entre la fase enlazada y una fase mvil lquida.
Preparacin de soportes con fase enlazada
Los soportes con fase enlazada se
preparan uniendo covalentemente a la superficie de la slice una especie orgnica de hidrocarburo. Los soportes incluyen geles de slice de poro grandes, cuentas con lechos porosos y micropartculas. El siloxano se ha convertido en el estndar de las fases enlazadas comerciales. Es poco probable que la porcin hidrocarbonada de octilo u octadecilo se extienda totalmente dentro de la fase mvil. Las fases monomricas responden rpidamente a los cambios en la composicin de la fase mvil, cuando son mojadas por ellas. La falta de mojado causa una eficiencia pobre, presentndose adsorcin en la interfase o entrecara adsorbente-disolvente en adicin al equilibrio de reparto lquido lquido esperado. Una fase enlazada popular es un hidrocarburo de cadena lineal. El grupo alquilo puede ser de diversas longitudes, normalmente es un grupo etilo (C-2), octilo (C-8) u octadecilo (C-18). Este ltimo puede utilizarse para las aplicaciones donde se requiere un mximo de retencin.
Captulo 5
74
5.29 Cromatografa lquido-liquido de fase normal

Utiliza una fase estacionaria polar (frecuentemente hidroflica) y una fase mvil menos polar. Para seleccionar una fase ptima, es mejor empezar con una fase mvil de un hidrocarburo puro como el heptano. Si la muestra se retiene fuertemente, la polaridad de la fase mvil debe aumentarse, quiz aadiendo pequeas cantidades de metanol o de dioxano.
5.30 Cromatografa de fase inversa

Utiliza un empaque enlazado hidrofbico, usualmente con un grupo funcional octadecilo (C-18) u octilo(C-8) y una fase mvil polar, frecuentemente una fase mvil parcial o totalmente acuosa. Conforme aumenta el carcter hidrofbico de los solutos, la retencin aumenta. El agua es el eluyente ms dbil. El metanol y el acetonitrilo son disolventes populares porque tienen baja viscosidad y son fciles de conseguir con excelente pureza. En cromatografa de fase inversa la fuerza de la retencin no es la interaccin favorable del soluto con la fase estacionaria, sino el efecto del disolvente de la fase mvil para forzar al soluto hacia dentro de la capa hidrocarbonada enlazada.
Aplicaciones de cromatografa de fase inversa
La tcnica de fase inversa en sus varias
formas es el modo ms ampliamente utilizado en HPLC e incluye cerca de la mitad de los mtodos de cromatografa lquida. Esta tcnica es la que probablemente proporcionar retencin y selectividad ptimas cuando los compuestos no tienen grupos para enlaces de hidrgeno o no tienen un carcter predominantemente aliftico o aromtico. El mtodo es muy apropiado para separar solutos con base en el tamao y estructura de los grupos alquilo. En qumica clnica cada vez se realiza con ms frecuencia el anlisis cuantitativo de las drogas de abuso por medio de esta tcnica. Los productos farmacuticos que se analizan en forma rutinaria incluyen a los barbitricos, drogas antiepilpticas, analgsicos y sedantes. Aplicaciones adicionales de los mtodos de fase inversa son los preservativos alimentarios, herbicidas y azcares. En el campo farmacutico ha venido en aumento el uso de esta tcnica a costa de la cromatografa de adsorcin. Un amplio espectro de biomolculas, lipoflicas o inicas, pequeas o grandes, pueden ser cromatografiazas debido a que el contenido de agua en la fase mvil puede variar desde el 100% hasta porcentajes muy bajos o ninguno en absoluto. Los compuestos lipoflicos, tal como los triglicridos, que tienen una solubilidad muy pobre en los disolventes acuosos de la fase inversa, con Captulo 5 75

frecuencia pueden separarse con una fase inversa no acuosa utilizando una columna empacada con octadecilo y disolventes orgnicos polares como el acetonitrilo o el tetrahidrofurano[7].
Bibliografa
[1]
L. R. Snyder. (1992). Chromatography, Part A: fundamentals and techniques. 5th edition. Editado
por E.Haftman Del Journal of Chromatography Library, p. A25-A26.

[2] [3]
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New York.
[4] [5] [6]
Baithwaite. Chromatographic methods. Chapman & Hall U.K., 1977 Poole. Chromatography Today. Elsevier U.K., 1991 Harris Daniel C., (2001), Anlisis Qumico Cuantitativo, 2da Edicin, Editorial Reverte, Espaa,
pp.740-743.
[7]
Willard. (1991) Mtodos instrumentales de anlisis Edit. Iberoamrica S.A. de C.V. Mxico.
Captulo 5
76
Tcnicas acopladas
Captulo 6 Cromatografa y tcnicas espectroscpicas acopladas

Los mtodos de acoplamiento combinan las capacidades de separacin de la cromatografa con las de deteccin cuantitativa y cualitativa de los mtodos espectrales tales como infrarrojo, resonancia magntica nuclear y masas, entre otros. A estas tcnicas se les denomina en ocasiones tcnicas hifenadas. En los primeros mtodos de esta categora los eluyente de la columna cromatogrfica se recogan como fracciones separadas en una trampa fra, despus de lo cual se usaba un detector no selectivo ni destructivo para la identificacin de su presencia. Posteriormente, se investigaba la composicin de cada fraccin por espectroscopia de resonancia magntica nuclear, infrarroja, masas o con medidas electroanalticas. Una importante limitacin de esta aproximacin era la pequea cantidad (usualmente de micromoles) de soluto contenida en las fracciones. Sin embargo, hoy da muchos mtodos hifenados monitorizan el efluente de la columna cromatogrfica de manera continua, con mtodos espectroscpicos dando como resultado una combinacin de dos tcnicas, que basadas en principios distintos, permiten lograr una enorme selectividad.
Caractersticas y requerimientos de las tcnicas acopladas

6.1 Cromatografa HPLC acoplada a Espectroscopia de Masas (MS)
Aunque la espectroscopia de masas es una poderosa herramienta para la identificacin de compuestos puros, la complejidad de los espectros de masas dificulta enormemente el anlisis de mezclas, incluso simples. Por ello para el anlisis de muestras complejas se emplean acoplamientos de esta tcnica con tcnicas potentes de separacin, como es la cromatografa lquida. As el acoplamiento Cromatografa Lquida-Espectroscopia de Masas (GL-MS), es una herramienta ms poderosa al alcance de los qumicos para el anlisis de muestras complejas. En este caso se efectan los espectros de masas de los compuestos que salen de la columna de cromatogrfica. Es necesaria una interfase entre ambos instrumentos que tiene como misin fundamental eliminar el eluyente (fase mvil) antes de la introduccin de los analitos en el espectrmetro.
Captulo 6
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Tcnicas acopladas
Estos acoplamientos permiten reunir las ventajas de una tcnica poderosa de separacin con una herramienta poderosa de identificacin. Pueden registrarse espectros de masas a lo largo de toda la separacin cromatogrfica. As pueden registrarse inequvocamente los picos y comprobar incluso su pureza, es decir si la separacin ha sido completa o se ha producido en algn momento la co-elucin de dos compuestos.
Espectroscopia de Masas acopla a Cromatografa Lquida de Alta Resolucin
Tal vez una de las desventajas de esta tcnica es que los espectros de masas de los compuestos orgnicos analizados por esta tcnica, dependen de las condiciones de anlisis, principalmente del tipo de fase mvil y del potencial de ionizacin aplicado; ya que comnmente a partir del espectro de masas se obtiene normalmente el in molecular y fragmentos que proporcionan a su vez el peso molecular del compuesto. En tanto que en la tcnica del HPLC-MS, el in molecular forma fragmentos con el disolvente empleado en la fase mvil y por tanto, no corresponden directamente con el peso molecular del compuesto analizado. Razn por la cual, se hace necesario inyectar disoluciones patrn que contengan los compuestos objetos del anlisis, en las mismas condiciones experimentales (eluyente potencial y ionizacin), para conocer el espectro de masas caracterstico del compuesto en cada caso. Sin embargo pese a ello esta tcnica resulta extremadamente til en el anlisis de ultratrazas (ng/kg) de compuestos orgnicos. Donde un anlisis de tan bajos niveles de concentracin (ultratrazas) puede resultar necesario cuando se trata de compuestos de muy altos niveles de toxicidad y que se cumula en los organismos vivos. Es el caso de las dibenzoparadioxinas policloradas (PCDDs), los dibenzofuranos policlorados (PCDFs), o los bifenilos policlorados. Se analizan en los suelos y organismos vivos principalmente ya que se acumulan en la materia orgnica del suelo.
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Tcnicas acopladas
Otra de las aplicaciones de esta tcnica, es la identificacin de analitos desconocidos, ya sea como productos secundarios de sntesis, anlisis de herbicidas y pesticidas, impurezas de drogas comerciales, la identificacin inequvoca de sustancias de estructura similar, para las que un simple espectro masas es insuficiente; cabe mencionar que el acoplamiento HPLC-MS es una herramienta muy selectiva que se emplea hoy da permite la identificacin de algunos pptidos y protenas.
Equipo de HPLC acoplado a MS
6.2 Cromatografa HPLC acoplada a Ultravioleta (UV)

El Detector de Ultravioleta Visible es el ms comn acoplado a HPLC, se usa cuando los componentes absorben radiacin UV- visible, como los compuestos aromticos, alquenos, molculas con enlaces C-O, C-N, C-S. Pueden ser de longitud de onda fija o variable (arreglo de diodos).
La deteccin UV-visible no es destructiva, es estable en el tiempo y se afecta poco por la temperatura, por lo que se puede colectar los componentes por separado. Se considera a la deteccin UV como selectiva ya que se elige la longitud de onda de mayor absorbancia de acuerdo con la sustancia que se desea conocer, pero debe tenerse en cuenta que en el rango del UV lejano (190-220nm) la mayora de los compuestos est en el orden de los nanogramos (ng), lo que posibilita el anlisis de cantidades trazas. Captulo 6 83
Tcnicas acopladas
El detector de UV-visible es de longitud de onda variable o espectrofotomtrico es el ms usado ya que ofrece como ventaja la libre seleccin de longitud de onda de trabajo sin necesidad de cambiar filtros o lmparas. Permite trabajar desde 190 hasta 700 u 800nm debido a que utiliza una red de difraccin consistente en un prisma que posibilita, mediante su rotacin, seleccionar la longitud de onda de trabajo de forma continua y no discreta como los detectores fotomtricos. Estos detectores utilizan tambin como fuente de luz una lmpara de deuterio o halgeno, que en algunos modelos puede ser intercambiada por una de tungsteno para la deteccin en el rango visible. Al ser constructivamente ms complejos que los detectores fotomtricos son algo menos sensibles y ms costosos. La espectroscopia de ultravioleta (UV) es de mucho valor, especialmente en HPLC. El espectro UV es muy utilizado para corroborar la identidad, ya que la identificacin basada en una sola longitud de onda del rango UV puede presentarse a interferencias. En los detectores de arreglo de diodos (DAD) el espectro UV puede ser registrado en computadora y comparado con el del compuesto sospechosos para corroborar su variedad As mismo en la industria lctea el HPLC acoplado a UV se emplea para la determinacin de vitamina D3 en determinacin de productos derivados de la leche y en premezclas vitamnicas. Esto debido a que la vitamina D3 es una vitamina liposoluble normalmente presente en la leche y sus derivados en cantidades muy bajas. Por esta razn, industrialmente se adiciona la misma a algunos productos lcteos para mejorar sus propiedades nutritivas. Por ello la determinacin del contenido de vitamina D3 por HPLC acoplado a UV a 264nm constituye parte del control de calidad del producto lcteo terminado. Otra de las aplicaciones de esta tcnica es la determinacin de sulfonamidas, nitrofuranos y cloranfenicol en leche. Esto debido a que los residuos de antibiticos y otros quimioteraputicos inhibidores del crecimiento bacteriano en la leche traen aparejadas serias dificultades al procesamiento industrial de la misma, adems de ser nocivos para la salud humana, entre otras causas, por la aparicin de cepas de microorganismos patgenos resistentes a los mismos. El control de estas sustancias se basa en la extraccin selectiva de los residuos de sulfonamidas, nitrofuranos y cloranfenicol presentes en la leche con una mezcla cloroformo-acetona. El extracto se evapora hasta sequedad a presin reducida y se redisuelve en buffer fosfato de potasio 0.1M desgrasndose por particin con hexano. La fase acuosa (buffer) contendr los residuos de sulfonamida,
Captulo 6
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Tcnicas acopladas
nitrofuranos y cloranfenicol. El extracto se filtra por membrana e inyecta al cromatgrafo de lquidos de alta resolucin con deteccin de UV-visible y columna de fase reversa (C18). As mismo en la industria lctea el HPLC acoplado a UV se emplea para la determinacin de vitamina D3 en determinacin de productos derivados de la leche y en premezclas vitamnicas. Esto debido a que la vitamina D3 es una vitamina liposoluble normalmente presente en la leche y sus derivados en cantidades muy bajas. Por esta razn, industrialmente se adiciona la misma a algunos productos lcteos para mejorar sus propiedades nutritivas. Por ello la determinacin del contenido de vitamina D3 por HPLC acoplado a UV a 264nm constituye parte del control de calidad del producto lcteo terminado. Otra de las aplicaciones de esta tcnica es la determinacin de sulfonamidas, nitrofuranos y cloranfenicol en leche. Esto debido a que los residuos de antibiticos y otros quimioteraputicos inhibidores del crecimiento bacteriano en la leche traen aparejadas serias dificultades al procesamiento industrial de la misma, adems de ser nocivos para la salud humana, entre otras causas, por la aparicin de cepas de microorganismos patgenos resistentes a los mismos. El control de estas sustancias se basa en la extraccin selectiva de los residuos de sulfonamidas, nitrofuranos y cloranfenicol presentes en la leche con una mezcla cloroformo-acetona. El extracto se evapora hasta sequedad a presin reducida y se redisuelve en buffer fosfato de potasio 0.1M desgrasndose por particin con hexano. La fase acuosa (buffer) contendr los residuos de sulfonamida, nitrofuranos y cloranfenicol. El extracto se filtra por membrana e inyecta al cromatgrafo de lquidos de alta resolucin con deteccin de UV-visible y columna de fase reversa (C18).
6.3 Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC) acoplada a RMN

El acoplamiento de HPLC y RMN requiere el ajuste de los sistemas de anlisis. El flujo de la fase mvil lleva a un perodo de exposicin limitada (m) para los ncleos de clulas de la corriente. El tiempo (m) es definido como la proporcin del volumen de deteccin de la velocidad de flujo. Por otra parte, el estado de equilibrio se alcance en un tiempo ms corto permitiendo un rpido tiempo de la tasa de repeticin de la exposicin de un espectro y, por tanto, un aumento en la sensibilidad. En la tcnica de HPLC la mayora de las separaciones se realizan con materiales de fase invertido usando mezclas binarias de disolventes como acetonitrilo / agua, acetona / agua o metanol / agua como mvil fases. La eleccin de la fase mvil debe ser adaptada a la espectroscopa de RMN. Una ventaja evidente es la de obtener un nmero pequeo de seales del disolvente en el espectro de RMN, ya que el disolvente puede ocultar las seales de la muestra espectros. En general, las condiciones en Captulo 6 85
Tcnicas acopladas
cromatografa HPLC-RMN los experimentos son los mismos que en la cromatografa convencional, pero el agua se sustituye por agua deuterada. El uso de disolventes deuterados orgnicos en general es demasiado caro. Para un ajuste correcto del receptor de la ganancia RMN instrumento, la intensidad de las seales de disolvente debe reducirse a la altura de la muestra mediante la aplicacin de una tcnica de represin del disolvente. La combinacin de tcnicas de separacin cromatogrfica con espectroscopa de RMN es uno de los ms poderosos y los mtodos de ahorro de tiempo para la separacin y la determinacin estructural de compuestos desconocidos y mezclas. Especialmente para la elucidacin de la estructura de sustancias sensibles a la luz y el oxgeno, por ejemplo cidos de lpulo amargo y estereoismeros de carotenodes.
6.4 Cromatografa HPLC acoplada a espectroscopa de IR

En esta tcnica de acoplamiento se presenta un problema importante que la diferencia de la CGIR: la mayora de los disolventes (y solutos) empleados como fase mvil en HPLC presenta una considerable absorcin en la zona infrarroja del espectro por lo que la caracterizacin de los analitos se hace ms problemtica. Existen dos tipos de acoplamiento: 1.- Acoplamiento directo: parecido al de CG-IR, se emplea un tubo lumnico que acta de clula de flujo. Los interferogramas obtenidos durante todo el proceso cromatogrficos son almacenados y posteriormente se ofrecen los espectros IR convencionales de los analitos cuando el ordenador ha sustrado en los mismos las bandas de absorcin correspondientes a la fase mvil. Para evitar un bloqueo excesivo del espectro por parte del disolvente se reducen las dimensiones de la clula (el paso de la luz de 0.1 a 0.2 mm y el volumen entre 3 y 12 L) y aun as existen inconvenientes: no se puede usar gradiente de elucin no se puede obtener informacin segura de la zona del espectro en el que el disolvente absorbe fuertemente algunos disolventes ofrecen dificultades especiales para la sustraccin la sensibilidad es veinte veces menor a la de CG-IR, comparable a la que se obtiene con un detector de ndice de refraccin convencional. 2.- Acoplamiento con eliminacin del disolvente (previa a la identificacin IR): debe cumplirse la condicin de que los analitos sean mucho menos voltiles que los componentes de la fase mvil para lograr una volatilizacin selectiva. Se usa un muestreador con varios pocillos que contienen mg de KCl Captulo 6 86
Tcnicas acopladas
soportados sobre una placa metlica. El efluyente cromatogrfico es rociado en un tubo concentrador, usando nitrgeno que evaporara un 90 % del disolvente; al entrar un pico a dicho tubo se abre una vlvula y se vierte el contenido en los pocillos del muestreador (se vierte de pozo en pozo al cerrarse y abrirse la vlvula). La deteccin se realiza por reflectancia difusa.
6.5 Cromatografa de gases acoplada a Espectrometra de Masas (CG-MS)

El espectrmetro GC/MS es un equipo de gran importancia en los laboratorios analticos debido a su gran sensibilidad (lmite de deteccin de picomoles), el compuestos al que se realice el anlisis por GC/MS, debe ser trmicamente estable (no descomponerse) a las temperaturas de la columna, y debe ser lo suficientemente voltil como para estar en fase gaseosa en el proceso de separacin cromatogrfica (punto de ebullicin < 250C). En la tcnica de GC/MS se utiliza la espectrometra de masas (que no se debe confundir con espectroscopia, ya que no hay absorcin o emisin de radiacin) como mtodo de deteccin para identificar los analitos separados en la columna cromatogrfica. El espectrmetro de masas est acoplado de modo hermtica y directamente a la salida de la columna cromatogrfica a travs de un capilar. El cromatograma, que registra los picos de elucin de los analitos a su salida de la columna y sus tiempos de retencin. Esta informacin es de especial inters en series homlogas (compuestos de la misma familia que se distinguen entre s slo por la longitud de la cadena aliftica, por ejemplo, la serie homloga de los alcoholes ya que permite hacerse una idea sobre el peso molecular de la especie. El espectro de masas correspondiente a cada pico de elucin, que permite identificar el pico con un compuesto determinado. La espectrometra MS consiste en la ionizacin de molculas en fase gaseosa y la separacin de los iones resultantes de acuerdo a su relacin masa/carga (m/z). Un haz de electrones colisiona con las molculas que entran en la cmara de ionizacin del espectrmetro de masas y, paradjicamente, les arranca un electrn, dando lugar a diversos fragmentos cargados positivamente. Estos fragmentos son acelerados en un campo electromagntico y llegan al detector.
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Tcnicas acopladas
Los instrumentos de CG/MS se han utilizado para la identificacin y caracterizacin de sabores, olores en los alimentos, identificacin de contaminantes en el agua, llevar a cabo diagnostico medico basado en componentes del aliento y estudio sobre los metabolitos de drogas.
6.6 Cromatografa de gases acoplada Infrarrojo (CG-IR)

Una ventaja sustancial de esta hibridacin es que la fase mvil cromatogrfica no absorbe en la zona de IR, por lo que no es precisa su separacin previa de los analitos., adems del carcter no destructivo del detector acoplado. Este acoplamiento puede llevarse a cabo mediante dos planteamientos tcnicos diferentes: Discontinuo , cuando no se dispone de un instrumento IR-TF(IR-Transformada de Fourier) Continuo , mediante una interfase ,lo que exige la mayor sensibilidad y alta velocidad de barrido del instrumento (IR-TF) a) En la figura se muestran un diagrama de bloque de combinacin CG-IR. La muestra se inyecta en el cromatgrafo de gases y los analitos se separan en la columna capilar .El efluyente cromatogrfico se dirige a una cedula de flujo especial denominada tubo lumnico que constituye la interfase de la hibridacin. Despus el fluido regresa al cromatgrafo donde realiza la deteccin continua convencional b) Tubo lumnico, est cubierto de oro en su interior para reflejar la luz, y calentado elctricamente. Se sita alineado axialmente a la radiacin de IR modulada incidente. Sus extremos so de material transparente a esta radiacin, generalmente KCl. El flujo gaseoso entra y sale mediante dos orificios.
Para obtener la informacin del acoplamiento: 1. Se obtiene el cromatogrma ordinario a travs del detector de CG puede o no ser destructivo 2. El espectrmetro IR pude realizar varias misiones una vez aplicado el algoritmo y obteniendo el espectro de IR convencional: (a) proporcionar espectros IR de cada pico (b) proporcionar un Captulo 6 88
Tcnicas acopladas
cromatogrma (c) comprobar la pureza de espectral. (d) Comparar los espectros obtenidos con los almacenados para identificar a los analitos.
Muestra representativa de una determinacin de herbicidas en los sedimentos de una plata industrial
6.7 Cromatografa de Gases acoplada a Espectroscopia Atmica (CG-EAA)

Se trata de las combinaciones ms simples, ya que las correspondientes interfases son atomizadores comerciales, con escasas variaciones. La facilidad y sencillez de los montajes aumenta en el siguiente sentido Hornos de grafito< llamas < plasmas. Los plasmas ICP, DCP, MIP y los atomizadores de llama pueden acoplarse directamente con el efluyente de un cromatgrafo de gases debido a que el caudal cromatogrfico es generalmente compatible con el de introduccin a estos atomizadores. En el caso de los plasmas, el argn o helio deben ser los gases portadores usados en el cromatgrafo. Las ventajas del uso de emisin atmica en plasma son: Mayor sensibilidad, posibilidad de multideteccin atmica con instrumentos comerciales, mayor campo de aplicacin. El acoplamiento de un cromatgrafo de gases con la espectroscopia de absorcin atmica con una llama como interfase puede ser directo, aun que la mejor alternativa es utilizar un tubo de cuarzo o de cermica calentando en la llama a travs del cual circula el efluyente gaseoso. En general los diferentes diseos descritos tienen por objetivo aumentar el tiempo de los tomos en la zona de absorcin lumnica. Los analitos ms frecuentemente determinados mediante estas hibridaciones instrumntales son compuestos rgano metlicos procedentes de su introduccin como contaminantes a partir de productos comerciales (estabilizadores de plsticos aditivos de gasolina, diacidas o de alquilacin en Captulo 6 89
Tcnicas acopladas
procesos naturales). Pese a que estas tcnicas presentan una gran sensibilidad (generalmente el lmite de deteccin es inferior al ng), siempre son necesarias tcnicas de preconcentracin debido a que se encuentran en niveles sumamente bajos en la naturaleza. Lo limites de deteccin alcanzados para compuestos organometlicos de plomo son 250pg Pb/m3 para tretrametilplomo y 375pg Pb/m3 para tetraetilplomo.
Figura: Una de dichas tcnicas presente dos etapas: En la primera tiene lugar la retencin de los analitos en un tubo de absorcin de polmetro poroso. La segunda etapa la desorcion-determinacin contina con la hibridacin CGEAA. Se utiliza una corriente adicional de hidrogeno y un tubo de cuarzo sobre la llama.
6.8 Cromatografa (HPLC) acoplada a Espectroscopia Atmica (CG-EAA)

El caudal de aspiracin de las muestras en los plasmas es de 1y 2 mL/min. Lo que los hace compatibles con los caudales de los efluyentes cromatogrficos lquidos. Cuando el disolvente de la fase mvil es fundamentalmente acuoso (en cromatografa de lquidos en fase invertida, cromatografa de intercambio inico) un nebulizador convencional es la interfase CG-EAE. Cuando los disolventes son hidrocarburos o compuestos orgnicos halogenados, debe unirse un nebulizador especial de impacto. Los plasmas de microondas (MIP) no son recomendables para ser hibridados en HPLC. Los mtodos atmicos de llama tienen un caudal entre 3 y 6 mL/min, superior el de los caudales usuales de salida en HPLC por lo cual puede usarse un flujo adicional un que los analitos sufres una dilucin excesiva, una solucin interesante es la propuesta por Slavin que se basa en la formacin de una gota a la salida del efluyente. Cuando esta alcanza un determinado tamao (100 se desprende y l) cae sobre un micro embudo de tefln conectado directamente al nebulizador. Las interfases ms complejas son las que se necesitan para acoplar un HPLC con un espectrofotmetro de absorcin atmica con vaporizacin electrotrmica. Esto se debe a la
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Tcnicas acopladas
discontinuidad implcita de la deteccin por la necesidad de establecer ciclos precisos de incrementos de temperatura para cada medicin por eso todo acoplamiento de este tipo debe ser de modo discontinuo Otra posibilidad es HPLC-EAA (cmara de grafito); en general constan de dos vlvulas de apertura/cierre, una mltiple de desvi y otra de inyeccin cuyo funcionamiento controlado por un secuenciador es clave. Este secuenciador controla adems el funcionamiento de la bomba a alta presin, los ciclos de temperatura en la atomizacin y el funcionamiento del EAA .La vlvula de inyeccin introduce alcuotas a travs de u capilar de tntalo. Las dos vlvulas de apertura/cierre permanecen cerradas durante el periodo de calentamiento programado del tubo de grafito y posteriormente son abiertas cuando se realiza la inyeccin de la siguiente muestra, Estas vlvulas tambin pueden permanecer abiertas y as la mayor parte del efluyente no es enviado al instrumento de de medida, inyectando alcuotas despus de cada ciclo de calentamiento. Una posibilidad mas es de conectar HPLC con EAA (cmara de grafito) se utiliza un muestreador comercial adaptado a la absorcin atmica con cmara de grafito. El eluyente cromatogrfico puede ser recogido en su totalidad en los pocillos a intervalos regulares de tiempo o bien puede programarse de tal forma que el eluyente valla alternativamente a los pocillos receptores y al desecho segn lo programado. Estas interfases son ms complejas respecto a las que origina un atomizador de llama, pero la vaporizacin electrotrmica origina sensibilidades superiores, de ah su atractivo.
6.9 Resumen
El acoplamiento instrumental se define como la combinacin a travs de una interfase adecuada de dos tcnicas analticas independientes, que genera informacin nica e integral de la composicin de la muestra, la cual se caracteriza por ser ms completa que la informacin alcanzada independientemente por cada tcnica. La razn es que se combinan el elevado poder de separacin de la cromatografa para una amplia mezcla de analitos y el elevado poder de discriminacin e identificacin que poseen estas tcnicas determinativas. En general todas las tcnicas de acoplamiento constan de una interfase entre los dos instrumentos que constituyen la conexin que produce el fluido que emerge de la columna cromatogrfica y el sistema de deteccin. Es imprescindible el control coordinado del funcionamiento de ambos instrumentos (separativo y determinativo). Captulo 6 91
Tcnicas acopladas
La gran cantidad de datos generada exige un sistema de almacenamiento, tratamiento, interpretacin y presentacin de resultados. Hoy las tcnicas acopladas son una gran herramienta para los qumicos y la ciencia en general y son por este orden las ms usadas: Espectrometra de masas (EM), Espectroscopia de Absorcin Infrarroja con transformada de Fourier (IR-TF), Tcnicas Espectroscpicas Atmicas de Emisin (ICP) Absorcin Atmica (EAA) y Resonancia Magntica Nuclear (RMN).
6.10 Bibliografa
Revisiones de los Mtodos combinados en C.L. Wilkins, Science. 1983.222, 251; Anal. Chem., 1989, 59, 517A. Thomson, Skoog, West, Holler y Crouch. Fundamentos de Qumica Analtica. Intenational Thomson Editores S. A. de C.V., 8 Edicin, Mxico, p.p. 970, 2005. http://www.analytical-tech.com/productos/HPLC_MS.html Hirschmugl, C.J. Frontiers in infrared spectroscopy at surfaces and interfaces. Surf. Sci. 500, 577-604 (2002 http://www.quimica.izt.uam.mx/Docencia/DocenciaQA/CursoCromatografia2005.pdf Noa P. M., Prez Fl. N., Daz G. G., Vega L. S. Cromatografa de gases y de lquidos de alta resolucin. Divisin de Ciencias Biolgicas y de la salud. Depto. de produccin agrcola y animal. UAM, unidad Xochimilco. 1 edicin. Mxico D.F. pp.165-169, 175, 299,.2005. Varcrcel M., Gomz H. Tcnicas Analticas de Separacin. Editorial Reverte S.A. Capitulo22. 1994. Duglas A., Leary J., Skoog. Anlisis Instrumental. Editorial McGraw Hill, 4 ta. Edicin. p.p.722-727.1992. Captulo 6 92
Detectores para cromatografa de gases y lquidos
Captulo 7 Detectores para cromatografa de gases y lquidos

Una parte importante de la cromatografa de gases y lquidos son los detectores, Un detector es un dispositivo para revelar la presencia de las sustancias eludas a la salida de la columna cromatogrfica. El Detector es un dispositivo capaz de convertir una propiedad fsica, no medible directamente, en una seal elaborable y ofrecernos informacin sobre la naturaleza y magnitud de la propiedad fsica. En cromatografa un detector funciona comparando una propiedad fsica entre el eluyente puro y el mismo eluyente llevando cada uno de los componentes que previamente se han separado en la columna, esta accin se traduce en una seal tipo elctrica, que posteriormente se amplificar mediante un registrador grfico integrador permitiendo indicar el momento que salen de la columna los componentes.
7.1 Clasificacin de los detectores

Detectores segn su Grado de Selectividad. Universales. Responde a la mayora de los solutos que pasan por l. Especficos Selectivos. Exhibe una gran respuesta a un grupo particular de substancias con un mnimo de respuesta a otras. Detectores Destructivos y No destructivos. Esta clasificacin, obviamente, es en referencia a si la muestra es destruida o no. Detectores segn su Modo de Respuesta: Dependientes del Flujo Msico. Producen una seal que es proporcional a la cantidad de soluto que pasa a travs de l en la unidad de tiempo pero es independiente del volumen de gas portador requerido para la elucin. Dependiente de la Concentracin. Dan una seal proporcional a la cantidad de soluto por unidad de volumen de gas portador que pasa a travs de l. Detectores segn el proceso de deteccin Ionizacin, ptico-espectroscpico, Electroqumico, etc.
7.2 Caractersticas de los Detectores

Sensibilidad. Medida de la efectividad de un detector para convertir la muestra en una seal elctrica medible. Captulo 7 93

Linealidad. Rango de masa concentracin de muestra sobre el cual el detector mantiene una sensibilidad constante sin una desviacin arbitraria. El significado prctico de la linealidad del detector es el que le indica al analista la concentracin para la cual el detector es confiable. Hay dos lmites en la curva de linealidad: Lmite de concentracin inferior, que es dado por el lmite de deteccin y, lmite Superior, definido por un porcentaje de desviacin arbitrario de la curva de linealidad, normalmente se toma un 5% de desviacin. Rango Dinmico Lineal. Rango sobre el cual la sensibilidad del detector es constante. Ruido. Es cuantificado por el promedio de la amplitud pico-pico de la seal. El significado de conocer el nivel de ruido de un detector es un factor determinante en la determinacin de la cantidad mnima detectable y el lmite inferior del rango lineal. Lmite de Deteccin. Est definido como la mnima cantidad de sustancia que puede producir una seal que sea el doble del nivel de ruido. Corriente de Fondo. Seal constante de salida generada por el proceso en el que un detector est operativo sin que alguna sustancia pasa a travs de l. Esta seal es muy importante, ya que permite diagnosticar el buen o mal funcionamiento del detector.
7.3 Detectores en Cromatografa de Gases

Detector de Conductividad Trmica (DCT). Mide la conductividad trmica del gas portador, ocasionada por la presencia de substancias eludas. El funcionamiento del DCT esta basado en el hecho que la velocidad de prdida de calor de un cuerpo caliente para un cuerpo ms fro es proporcional, entre otros factores, a la conductividad trmica del gs que separa estos cuerpos. Un filamento metlico muy delgado (de W, Au o aleacin W-Re) es calentado por el pasaje de una corriente elctrica constante. Este filamento est colocado dentro de un orificio en un bloque metlico (celda), calentado a una temperatura ms baja que aquella del filamento, por donde el gas de arrastre proveniente de la columna pasa continuamente (Fig.1). Mientras pasa gas de arrastre puro por la celda, la proporcin de prdida de calor del filamento para el bloque es constante y la temperatura del filamento no vara. Cuando un componente es eluido de la columna, este sale mezclado con el gas de arrastre y pasa por el detector. Si la conductividad de esta mezcla es diferente de aquella del gas de arrastre puro, el filamento pasa a perder calor para el bloque en una proporcin diferente de aquella del equilibrio. Por ejemplo, si la proporcin de prdida de calor disminuye, el filamento se calienta cuando la muestra es eluida. El calentamiento del filamento causa una variacin en Captulo 7 94

su resistencia elctrica y la resistividad de un metal aumenta con la temperatura. El filamento es montado en un circuito puente de Wheatstone, que transforma la variacin en resistencia elctrica del filamento en una variacin de voltaje, que es colectada en un registrador generando el cromatograma.
Figura 1. Celda de un detector de conductividad trmica.
El DCT es un detector universal, sensible a la concentracin del soluto en el gas de arrastre. Generalmente, cuando se usa DCT, el gas de arrastre es He o H2. Por el hecho de que estos gases tienen conductividades trmicas altas, las mezclas gas de arrastre ms soluto siempre tendrn conductividades trmicas menores que la del gas de arrastre puro, lo que impede seales negativas, adems de obtenerse factores de respuesta ms grandes. Sin embargo, es considerado un detector poco sensible. La CMD de un modelo moderno, para propano, es de 400 pg/ml de gas de arrastre, con un rango lineal de 106. A pesar de eso, el hecho de ser universal, barato y de funcionamiento simple, lo hace extremamente til para anlisis que no necesitan de alta sensibilidad. Detector de Ionizacin a la Llama. Basado en la medida de las variaciones de la corriente de ionizacin en una llama oxgeno-hidrgeno debido a la presencia de substancias eludas. Bsicamente es un quemador de hidrgeno/oxgeno, donde se mezcla el efluente de la columna (gas portador y analito) con hidrgeno. Inmediatamente, este gas mezclado se enciende mediante una chispa elctrica, producindose una llama de alta temperatura. La mayora de compuestos orgnicos al someterse a altas temperaturas pirolizan y se producen iones y electrones, que son conductores elctricos. Este hecho se aprovecha estableciendo una diferencia de potencial de unos centenares de voltios entre la parte inferior del quemador y un electrodo colector situado por encima de la llama. La corriente generada es baja (del orden de los 10-12 A), por lo tanto debe ser amplificada mediante un amplificador de alta impedancia (Fig. 2). El proceso de ionizacin que se da en la llama es complejo, pero se puede aproximar el nmero de iones producidos al nmero de tomos de carbono transformados en la llama. Esto produce que sea
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un detector sensible a la masa (al nmero de tomos de carbono que salen de la columna) ms que a la concentracin, por lo tanto no le afectan demasiado los cambios en el flujo de salida. Existen algunos grupos funcionales que no dan respuesta en este detector, como el carbonilo, alcohol, halgeno o amina, y tampoco responden gases no inflamables como el CO2, SO2, agua y xidos de nitrgeno. Este hecho, ms que limitar el mbito de aplicacin de este detector, permite el anlisis de muestras contaminadas con alguno de los compuestos mencionados.
Fig. 2. Detector de ionizacin de llama.
Ventajas:
Alta sensibilidad, del orden de 10
-13
g/s.
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Amplio intervalo lineal de respuesta, 10 unidades. Bajo ruido de fondo (elevada relacin seal/ruido). Bajo mantenimiento, fcil de fabricar.
Desventajas:
Destruye la muestra (la piroliza).
Detector de Captura Electrnica. Basado en la electronegatividad de las substancias eludas, y su habilidad para formar iones negativos por captura de electrones. El detector de captura electrnica es sensible en particular a las molculas que contienen halgeno, carbonilos conjugados, nitrilos, nitrocompuestos y compuestos organometlicos, pero es relativamente insensible a los hidrocarburos, alcoholes y cetonas. El gas portador o el complementario tiene que ser o N2 o Ar con un 5% de metano. La humedad disminuye la sensibilidad. El gas que entra en Captulo 7 96

el detector se ioniza por electrones de gran energa ("rayos beta") emitidos por una lmina que contiene
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Ni radiactivo. Los electrones as formados son atrapados por un nodo, produciendo una pequea
corriente continua. Cuando llegan molculas de analito de gran electroafinidad captan algunos electrones. El detector responde modificando la frecuencia de los impulsos de voltaje entre el nodo y el ctodo para mantener constante la corriente. Cuando estos compuestos se difunden a la estratosfera, catalizan la descomposicin de las molculas de ozono Detector de Fotometra a la Llama. Basada en la medida de la intensidad de la emisin molecular de la fluorescencia de heterotomos en las molculas orgnicas. La fotometra de llama se emplea para determinar el sodio y el calcio en una muestra biolgica, debemos conseguir que ese sodio, en la forma que este en la muestra, pase a estar en forma de tomo de sodio libre en fase gaseosa. Debe producirse la activacin de ese tomo pasando el electrn de valencia del nivel fundamental a niveles excitados, al volver de ese nivel al fundamental emite energa, se trata de cuantificar la intensidad de la energa emitida por los electrones al volver a su nivel fundamental. Necesitamos: Fuente de radiacin, monocromador, detector. La fuente de radiacin que provoca la activacin de los tomos es una llama. El monocromador ser en aparatos complejos filtros interferenciales y en aparatos sencillos redes de bajo poder de resolucin. Los detectores podrn ser clulas fotovoltaicas o fototubos, pueden medir intensidades relativamente altas. Detector de Ionizacin de Llama Alcalina. El detector de nitrgeno fsforo, tambin llamado detector de llama alcalina, es un detector de ionizacin de llama modificado, que es especialmente sensible a compuestos que contienen nitrgeno y fsforo (pero que, en general, responde tambin a hidrocarburos.) En particular, tiene inters en anlisis de medicamentos, pesticidas y herbicidas. Cuando estos elementos se ponen en contacto con una bola de vidrio, que contienen Rb2SO4 y que est en la punta de un mechero, producen iones que crean una corriente que se puede medir. Desde luego, no se puede usar N2 como gas portador, si se analizan muestras que contienen nitrgeno. Otros detectores de cromatografa de gases: Fotmetro de llama: ciertos elementos muy concretos, como P, S, Sn, Pb. De fotoionizacin: compuestos aromticos e insaturados. De quimiluminiscencia de azufre: S Captulo 7 97

De quimiluminiscencia De nitrgeno: N De emisin atmica: la mayora de los elementos (seleccionados individualmente). Espectrmetro de masas: la mayora de los analitos Espectrmetro de infrarrojos: la mayora de los analitos Un detector fotomtrico de llama mide la emisin ptica procedente del fsforo, azufre, plomo, estao, y algn otro elemento concreto. Cuando el eluato pasa por una llama de H2-aire, anloga a la de un detector de ionizacin de llama, los tomos excitados emiten luz caracterstica. Las emisiones del fsforo a 536 nm y del azufre a 394 nm se pueden aislar con un filtro interferencial de banda estrecha y detectar con un tubo fotomultiplicador. El detector de fotoionizacin utiliza una fuente ultravioleta de vaco para ionizar compuestos aromticos y no saturados, pero apenas responde a hidrocarburos saturados. Recoge y mide los electrones producidos por ionizacin de estos compuestos. Un detector de quimiluminiscencia de azufre recoge los productos que salen de un detector de ionizacin de llama, entre los que se puede encontrar SO producido por oxidacin de azufre, y lo mezcla con ozono, formndose SO2 en estado excitado, que emite luz azul y radiacin ultravioleta. La intensidad de emisin es proporcional a la cantidad de azufre eluido, independientemente del compuesto de que procede, con una sensibilidad 107 veces mayor que la que tiene frente al carbono. Un detector de quimiluminiscencia de nitrgeno funciona de forma semejante. El eluato se quema a 1800 C, para transformar el nitrgeno en NO, que al reaccionar con el O3, produce un producto quimiluminiscente. As mismo, la sensibilidad frente al nitrgeno es 107 veces mayor que frente al carbono. Un detector de emisin atmica conduce el eluato a un plasma de helio generado en una cavidad de microondas. Todos los elementos de la Tabla Peridica producen emisin atmica caracterstica que se puede detectar con un policromador de fila de fotodiodos. Se puede sintonizar el detector para observar casi cualquier elemento presente en el analito que emerge de la columna. Por ejemplo, observando la emisin del selenio se pueden identificar trazas de compuestos de selenio, que dan el caracterstico olor a ajos. El contenido total de selenio de ajos naturales es slo de 0,28 g de selenio por gramo de ajos.
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7.4 Detectores en Cromatografa de Lquidos

Los tipos de detectores en cromatografa de lquidos se clasifican en:
Detectores basados en una propiedad de la fase mvil. Detectores basados en una propiedad de la sustancia a separar.
Los detectores ms utilizados en cromatografa de lquidos son:

Detector UV. Hay bsicamente tres tipos: Detector de Longitud de Onda Fija Detector de Longitud de Onda Variable Detector de Arreglo de Diodos
El detector ms comn en HPLC es el detector de ultravioleta, que utiliza una celda de flujo como la que se muestra en la figura 3, porque muchos solutos absorben luz ultravioleta. Los sistemas ms simples utilizan la intensa raya de emisin a 254 nm de una lmpara de mercurio. Los instrumentos ms verstiles tienen lmparas de deuterio, xenn o volframio, y un monocromador, con el que se puede elegir la longitud de onda ptima, de ultravioleta o visible, para detectar los analitos estudiados. El sistema de la figura 4 utiliza una fila de fotodiodos, para registrar todo el espectro de cualquier soluto que pasa por el detector. Los detectores de gran calidad tienen intervalos de escala completa desde 0,0005 a 3 unidades de absorbancia. En la escala ms sensible, una absorbancia de 0,0005, dara una seal del 100%, con un nivel de ruido del 1 %, de fondo de escala. El intervalo lineal cubre ms de cinco rdenes de magnitud de concentracin de soluto (que es otra manera de decir el intervalo en que se cumple la ley de Beer). Los detectores de ultravioleta estn indicados para elucin gradiente, y para disolventes que no absorben a la longitud de onda de trabajo. Detector de ndice de Refraccin. Existen muchos diseos de estos detectores, pero solamente existen ahora dos tipos:

Tipo Deflexin Tipo Fresnel 99
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Fig. 3. Camino ptico de una microcelda de un detector espectrofotomtrico. Una celda ordinaria contiene un camino ptico de 0,5 cm y contiene slo 8l de lquido.
Fig. 4. Detector ultravioleta de fila de diodos para HPLC.
Un detector de ndice de refraccin responde a casi cualquier soluto, pero su lmite de deteccin es aproximadamente 1000 veces peor que el de un detector de ultravioleta. El detector del tipo de deflexin, que se muestra en la figura 5, tiene dos compartimientos triangulares de 5 a 10 l: a travs de uno pasa disolvente puro, y a travs del otro eluato. Para eliminar la radiacin infrarroja (que calentara la muestra), se hace pasar luz visible colimada (paralela) a travs de la celda, con disolvente puro en los dos compartimientos, y se dirige a la fotoclula mediante la placa de deflexin. Cuando entra en la celda soluto de diferente ndice de refraccin, el haz se desva, y vara la seal dada por la fotoclula. Los detectores de ndice de refraccin no sirven en elucin gradiente, porque es imposible ajustar exactamente la muestra y la referencia mientras vara la composicin del disolvente. Los detectores de ndice de refraccin son sensibles a las variaciones de presin y temperatura (~0,01 C). Debido a su baja sensibilidad, los detectores de ndice de refraccin no sirven en anlisis de trazas. Tienen intervalos Captulo 7 100

pequeos de linealidad, que se extiende slo en un factor de 500 de concentracin de soluto. La principal ventaja de este detector es que es casi universal, respondiendo a todos los solutos, incluso a aquellos que no absorben en el ultravioleta.
Fig. 5. detector de ndice de refraccin de tipo de deflexin.
Detector de dispersin de luz. Responde a todos los solutos que son claramente menos voltiles que la fase mvil. Como se ve en la figura 6, el eluato entra en este detector por la parte superior. En el nebulizador, el eluato se mezcla con nitrgeno, y se le fuerza a pasar por un capilar, a cuya salida forma una fina dispersin de gotitas. El disolvente se evapora en un tubo caliente que se le hace recorrer, dejando una nube de finas partculas slidas, que entran en la zona de deteccin por la parte inferior. Las partculas se detectan por la luz que procede de un diodo lser y llega al fotodiodo por dispersin. El detector de dispersin de luz responde a la masa del analito, no a su estructura o peso molecular. Si se observa un pico grande y uno pequeo, se puede estar seguro de que el pico pequeo corresponde a menos cantidad que el pico grande. Con un detector de ultravioleta, una pequea cantidad de un analito que absorbe mucho da una seal ms intensa que una cantidad grande de un analito que absorbe poco. La respuesta de un detector de dispersin de luz no es lineal, de modo que frecuentemente se recurre a polinomios para construir la curva de calibrado. El detector de dispersin de luz es compatible con una elucin gradiente. Adems, no hay picos asociados con el frente del disolvente, y as no se dan interferencias con los picos que se eluyen al principio. Captulo 7 101

Si se usa un tampn en el eluyente, debe ser voltil, o de lo contrario se evaporara formando partculas slidas, que dispersaran la luz y no dejaran discernir la seal del analito. Se pueden usar tampones de baja concentracin a partir de cido actico, frmico o trifluoroactico, acetato de amonio, fosfato de diamonio, amonaco o trietilamina.
Fig. 6 Funcionamiento de un detector de dispersin de luz .
Detector de Fluorescencia. Este detector solamente puede detectar compuestos que tengan fluorescencia nativa o inducida. La fluorescencia se detecta por medio de un detector fotoelctrico colocado perpendicularmente respecto al haz de excitacin. Semejantes a los detectores de absorbancia. Son altamente sensitivos Detectores Electroqumicos. Pueden ser clasificados en tres tipos: Detector Amperomtrico, Detector Conductimtrico y Detector Potenciomtrico Se basan en mtodos electroqumicos (amperometra, voltamperometra, conductimetra y coulombimetra). Elevada sensitividad. El analito debe contener grupos susceptibles de sufrir procesos redox. Se deben tener algunas precauciones con los detectores electroqumicos para asegurarse anlisis reproducibles: Checar que estn conectados adecuadamente a tierra la bomba, el detector y registradorintegrador. Usar bombas reciprocantes de doble pistn Mantener en todo momento el flujo de la fase mvil en el detector. Operar con el voltaje adecuado Captulo 7 102

Monitorear la altura de los picos para observar cambios en la eficiencia que nos indique la necesidad de reacondicionar los electrodos. Tener electrodos de referencias extras en solucin 3M de NaOH y reemplazar el electrodo de referencia en la celda 1 2 veces a la semana. Desconectar el detector electroqumico cuando este limpiando las columnas. Utilizar agua, buffer y solventes orgnicos de alta pureza. Comparacin de detectores comerciales usados en HPLC:
Detector De ultravioleta De ndice de refraccin De dispersin de luz Electroqumico De fluorescencia De conductividad De espectrometra de masas De infrarrojos con transformada de Fourier lmite de deteccin aproximado (ng) 0,1-1 100-1000 0,1-1 0,01-1 0,001-0,01 0,5-1 0,1-I 1000
a
til en elucin gradiente? S No S No S No S S
7.5 Bibliografa
http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Gas.htm#detectores http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/hplc.htm http://www.chemkeys.com/esp/md/mds_7/cgced_1/edpct(_4/edpct(_4.htm http://es.wikipedia.org/wiki/Detector_de_ionizaci%C3%B3n_de_llama http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apquim-aninstr14/harris/c24b.html http://www.elergonomista.com/tecnicas/fotometria.htm http://webservmida.mida.gob.pa/CYTED/CYTED%20PDF/tallerhomonologacionpma/anexos/CROMATOG RAFIA%20LIQUIDA%20HPLC.pdf http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apquim-an-instr14/harris/c25b.html http://www.pucpr.edu/titulov/Q420/examen%203/Cap%2028.pdf
Captulo 7
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Procesamiento de datos cromatogrficos
Captulo 8 Procesamiento de datos cromatogrficos

Cromatogramas
Es la Representacin de la respuesta o seal del sistema de deteccin continuo (CLAR o CG) o discontinuo en funcin del tiempo, volumen del eluyente o distancia en el lecho Cromatogrfico. El cromatograma puede tomar varias diversas formas: un registro en la carta de un registrador o plotter, una mancha en cromatografa plana, o un nmero determinado de datos tomados por un microcomputador despus de la correspondiente transformacin. Segn el tipo de detector continuo, el cromatograma puede ser diferencial, cuando la seal solo se origina al pasar analito por el mismo, e integral, cuando la seal se acumula (Figura 1).
Figura 1. Tipos de Cromatogramas: (1) Diferencial, (2) Integral.
El cromatograma contiene la informacin analtica relativa a la muestra (complejidad: nmero de picos, deteccin cualitativa y/o cuantitativa de uno o varios componentes) o del funcionamiento del sistema cromatografico. Los parmetros que definen el comportamiento cromatogrfico de un soluto en un sistema cromatogrfico de elucin, y que sirve de base para los clculos analticos, que a continuacin se comentaran. Para ello se usar el esquema de la Figura 2.
Captulo 8
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Figura 2. Parmetros que definen un cromatograma .
Los aspectos termodinmicos y cinticos de la separacin cromatogrfica quedan reflejados en el cromatograma, es decir, en la situacin y forma del pico.
Ajuste de datos
El software realiza en primer lugar un ajuste de datos, con la finalidad de eliminar el ruido y permitir el correcto funcionamiento del algoritmo de integracin. Con tal finalidad, se probaron distintos mtodos optndose finalmente por splines de segundo orden con derivada primera continua. Este mtodo permiti una mejor identificacin del comienzo de pico y de los mximos, an en condiciones de alto ruido.
En la Figura 4 se muestra en detalle un trozo de cromatograma, en el que puede observarse la curva continua del ajuste y los datos con el ruido de la seal.
Integracin de los picos

El algoritmo de integracin del cromatograma es capaz de distinguir diferentes casos de picos cromatogrficos en los cuales la lnea de base se fija de distinta manera. Para ello se tiene en cuenta el valor de la seal, su derivada (D1) y su derivada segunda (D2). Picos simples: Se considera detectado el comienzo del pico cuando la derivada primera de la seal supera un valor prefijado (D1 > Ls) punto 2 de la Figura 5. Cuando la derivada pasa por cero siendo la derivada segunda negativa, se detecta el mximo (D1=0, D2<0) Punto 3 de la Figura 5. El final de pico se detecta cuando la derivada segunda es positiva y la derivada primera supera el valor prefijado (D1>Li) Punto 4 de la Figura 5. Los valores de Ls y Li pueden ser variables a lo largo del cromatograma, lo cual permite compensar el efecto de ensanchamiento de los picos. El tiempo de retencin que identifica al componente es aquel en el cual ocurre el mximo, punto 3 de la Figura 5. Captulo 8 105

La lnea de base es una recta que une los puntos 2 y 4, Figura 5. Para calcular el rea se resta el rea bajo la lnea de base del rea bajo la curva de la seal.
Figura 5 Principio para la deteccin de los picos.
Picos superpuestos: En el caso de dos o ms picos fusionados o superpuestos se traza una lnea de base entre el comienzo del primero y el fin del ltimo. El criterio usual es trazar rectas verticales desde los valles hasta la lnea de base comn y en base a esta divisin se asignan las reas.
Figura 6 Deteccin de picos superpuestos
Picos tangentes: Los picos pequeos montados sobre uno mucho mayor se denominan tangentes y su lnea de base se traza de manera especial. Para detectarlo un criterio comn es comparar alturas con la misma diferencia medida en el pico anterior, si este valor cae por debajo de un lmite prefijado, el pico ser considerado tangente.
Figura 7 Ejemplo de pico tangente
Coleccin y procesamiento de datos

Captulo 8 106

El procesamiento de datos en cromatografa incluye tres objetivos:
colectar y procesar la seal proveniente del detector de modo de producir un cromatograma y la informacin correspondiente como rea de los picos, tiempos de retencin y ancho de picos colectar y analizar los datos de modo de obtener informacin cualitativa y cuantitativa y generar los reportes correspondientes optimizar los parmetros cromatogrficos.
Deteccin
El Detector es un dispositivo capaz de convertir una propiedad fsica, no medible directamente, en una seal elaborable y ofrece informacin sobre la naturaleza y magnitud de la propiedad fsica. Es la parte del cromatgrafo que se encarga de determinar cundo ha salido el analito por el final de la columna. En cromatografa un detector funciona comparando una propiedad fsica entre la muestra a analizar y la sustancia portadora llevando cada uno de los componentes que previamente se han separado en la columna, esta accin se traduce en una seal tipo elctrica, que posteriormente se amplificar mediante un registrador grfico integrador permitiendo indicar el momento que salen de la columna los componentes. *Detectores segn su Grado de Selectividad : *Detectores segn el proceso de deteccin Ionizacin, ptico-espectroscpico, Electroqumico, etc. *Detectores segn su Modo de Respuesta: Caractersticas de los Detectores
Sensibilidad. Medida de la efectividad de un detector para convertir la muestra en una seal elctrica
medible.
o Linealidad. Rango de masa concentracin de muestra sobre el cual el detector mantiene una
sensibilidad constante sin una desviacin arbitraria. El significado prctico de la linealidad del detector es el que le indica al analista la concentracin para la cual el detector es confiable.
Rango Dinmico Lineal: Rango sobre el cual la sensibilidad del detector es constante. Ruido. Es cuantificado por el promedio de la amplitud pico-pico de la seal. El significado de conocer el
nivel de ruido de un detector es un factor determinante en la determinacin de la cantidad mnima detectable y el lmite inferior del rango lineal. Captulo 8 107

Lmite de Deteccin. Est definido como la mnima cantidad de sustancia que puede producir una seal
que sea el doble del nivel de ruido.

Corriente de Fondo. Seal constante de salida generada por el proceso en el que un detector est
operativo sin que alguna sustancia pasa a travs de l. Esta seal es muy importante, ya que permite diagnosticar el buen o mal funcionamiento del detector. El detector debe ser sensible a los efluentes de la columna y capaz de suministrar un registro de la cromatografa en la forma de un cromatograma. La seal del detector debe ser proporcional a la cantidad de cada soluto (analito). Con lo cual debe ser posible realizar un anlisis cuantitativo.
Registro e integracin
La seal proveniente del detector, se transmite a un sistema de registro e integracin, el cual genera un cromatograma que representa un registro del anlisis. Los datos obtenidos son procesados mediante un registrador e integrador sin ninguna o muy poca capacidad de procesamiento, o a travs de sistemas computarizados que incluyen un procesamiento posterior (post-run analysis) mas sofisticado y completo mediante el empleo de un software apropiado. En la mayor parte de los casos, el sistema integra
automticamente el rea de cada pico, realiza los clculos e imprime un reporte con los resultados cuantitativos y los tiempos de retencin.
Clculo de rea del pico (anlisis cuantitativo)

La cromatografa tuvo un gran crecimiento durante las anteriores cuatro dcadas, en parte a que se trata de una tcnica rpida, sencilla, de bajo costo y esencialmente a su gran aplicacin como herramienta de separacin. No obstante su gran xito se debe sin duda a que tambin proporciona informacin cualitativa acerca de las especies separadas. La cromatografa en columna cuantitativa tiene como principio la
comparacin de las alturas, o de las reas del pico del analito con la de uno o ms patrones, en la cromatografa en plano el rea ocupada por las especies separadas sirve como parmetro analtico, si las condiciones son controladas adecuadamente esos parmetros varan linealmente con la concentracin, es decir, que el rea del pico cromatografico es directamente proporcional a la concentracin del analito, as es fundamental para la confiabilidad del anlisis que el rea de los picos sea medida lo ms exacto y reproduciblemente posible. Los instrumentos cromatogrficos modernos estas equipados con integradores electrnicos digitales, los cuales permiten una precisa estimacin de las reas de los picos, si no se dispone de tales equipos tienen que hacerse una estimacin manual. Existen varias maneras de medir el rea de los picos cromatogrficos. Una de Captulo 8 108

esta tcnicas consiste en suponer que el pico se asemeja a un triangulo issceles, para lo cual se mide la altura del pico (h) y el ancho de la base del pico (Wb) o ya sea la mitad de la altura (Wh) y se calcula el rea del pico empleando la formula usada para el calculo del rea de un triangulo.
= =
Las limitantes de esta tcnica es que su utilizacin depende de la simetra y del ancho del pico. Otra tcnica utilizada para determinar el rea del pico es la llamada corte y pesada esta tcnica consiste en recortar el pico del cromatograma, luego se pesa en una balanza analtica y se determina su peso relativo al peso de un rea conocida de papel de registro. Dicho recorte y pesada depende mucho de la habilidad del operador, pueden introducirse errores por cambios en la humedad del papel, homogeneidad del papel, etc. Para la utilizacin de esta tcnica se recomienda utilizar una fotocopia del cromatograma para no destruir el original. En general las tcnicas de integracin manual proporcionan reas que son reproducibles a un nivel del 2 al 5 por 100; por el contrario los integradores digitales son al menos un orden de magnitud ms precisos. Como ya se menciona anteriormente los cromatgrafos modernos contienen integradores electrnicos los cuales son dispositivos que se basan en microprocesadores que colectan la seal cromatografica, digitalizndola, es decir, que transforma una seal elctrica en nmeros, detectan la presencia del pico y calcula su rea, los integradores son ms precisos y rpidos que cualquier mtodo manual para determinar el rea del pico cromatografico, aunque son dispositivos caros, cuando un anlisis requiere de rapidez en la produccin de resultados su uso es casi indispensable. Otra manera de obtener el rea del pico es sustituir el integrador por un computador el cual es un dispositivo que convierte la seal elctrica en nmeros que puedan guardarse en una memora (conversor analogo-digital) y que disponga de un programa para la realizacin del anlisis del cromatograma digitalizado, Captulo 8 109

el costo del computador con los accesorio necesarios para hacer el anlisis es por lo general inferior al de un buen integrador, adems con el computador se obtiene resultados ms confiables.
Desarrollo y optimizacin de mtodos Cromatografa de gases (rampas de temperatura)

El control de la temperatura de la columna es una de las formas ms sencillas y ms efectivas de influenciar la separacin de los componentes. La columna se fija entre un inyector mantenido a una temperatura de inyeccin, y un detector mantenido a una temperatura tambin predeterminada. Por lo tanto, se debe definir la temperatura a la que cada uno de los componentes opera. En general, caben dos posibilidades de modificacin de las condiciones de trabajo cromatogrficas. En cromatografa gaseosa, la temperatura debe ser mantenida por encima del punto de roco de la muestra, pero no por encima de su punto de ebullicin. (a) Modalidad Isocrtica, en la que las condiciones experimentales permanecen constantes durante el proceso cromatogrfico.
(b) Modalidad no Isocrtica, en la que durante el proceso de separacin cromatogrfica se varia de manera gradual y estrictamente controlada el parmetro de temperatura. La temperatura es una variable importante, ya que de ella va a depender el grado de separacin de los diferentes analitos. Para ello, debe ajustarse con una precisin de dcimas de grado. Dicha temperatura depende del punto de ebullicin del analito o analitos, y por lo general se ajusta a un valor igual o ligeramente superior a l. Si tenemos varios componentes con diferentes puntos de ebullicin, se ajusta la llamada rampa de temperatura con lo cual sta va aumentando ya sea de forma continua o por etapas. En muchas ocasiones, el ajustar correctamente la rampa puede significar separar bien o no los diferentes analitos. Es recomendable utilizar temperaturas bajas para la elucin, pero conforme la temperatura es mayor la elucin es ms rpida, pero corriendo el riesgo de descomponer el analito. Por ejemplo: Si al meter a eluir una muestra nos salen cuatro analitos con tiempos muy diferentes de elucin la temperatura adecuada para que eluyan todos se calcula con la rampa de temperatura: Captulo 8 110
Se toman los primeros 5 minutos como 60 C y a partir de estos 5 minutos cada minuto adicional se le aumenta 10C, por ello observamos en el primer pico 80C, ya que los primeros 5 minutos se toman como 60 ms 2 minutos se le suman 10C esto es precisamente 80C y as, se trabaja con los siguientes picos, tomando en cuenta la escala de temperatura.
Esto es muy importante ya que si en nuestra muestra solo se vieran dos picos uno en 11 minutos y otro en 20 la temperatura e elucin correcta seria una que estuviera entre estos dos puntos, con lo que se correra muy bien la muestra y no tendramos que esperar mucho entre a y otra.
HPLC (Cambios en la fase mvil.)

El proceso de elucin en cromatografa de adsorcin, el disolvente compite con las molculas de soluto por ocupar los sitios activos de la fase estacionaria. La diferente capacidad de los distintos disolventes para eluir un determinado soluto del adsorbente es independiente de la naturaleza del soluto. Se puede describir la elucin como el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente La fuerza eluyente (0 ) es una medida de la energa de adsorcin del disolvente, supuesto el valor de cero para el sistema pentano/ slice pura. Cuanto ms polar es el disolvente, mayor es su fuerza eluyente
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respecto a la slice en cromatografa de adsorcin. Cuanto mayor es la fuerza eluyente del disolvente , tanto ms rpidamente se eluirn los solutos de la columna. La cromatografa de adsorcin sobre slice pura es un ejemplo de cromatografa de fase normal, que se caracteriza por usar una fase estacionaria polar y un eluyente menos polar. Un disolvente ms polar tiene fuerza eluyente mayor. La cromatografa de fase inversa, que es la ms utilizada, se caracteriza por que la fase estacionaria es no polar o dbilmente polar y el disolvente es ms polar. Un disolvente menos polar tiene mayor fuerza eluyente. La elucin isocrtica se lleva a cabo con un nico disolvente (o una mezcla de disolventes fija). Si un disolvente no permite una elucin suficientemente rpida de todos los componentes, se puede usar una elucin en gradiente; en cual, hay un cambio continuo de la composicin del eluyente en sentido de aumento de fuerza eluyente. Para eluir solutos fuertemente retenidos hay que aumentar la fuerza eluyente del disolvente. En este caso, se van aadiendo cantidades crecientes del disolvente B al disolvente A, produciendo as un gradiente continuo el anlisis utilizando el mtodo de elucin por gradiente permite mantener una resolucin deseada y al mismo tiempo disminuir la duracin del anlisis. Por ejemplo en la figura 15 muestra el efecto de aumentar la fuerza eluyente de la elucin isocrtica de ocho componentes en una columna de fase inversa. En una separacin con fase inversa , la fuerza eluyente disminuye a medida que el disolvente se hace ms polar . El primer cromatograma (superior izquierda) se obtuvo con un disolvente que tena 90% de acetonitrilo y 10% de tampn acuoso. El acetonitrilo tiene una gran fuerza eluyente, y eluye todos los compuestos rpidamente. Se observan slo 4 picos por que los dems estn solapados. Es habitual llamar disolvente A al componente acuoso, y disolvente B al orgnico. El primer cromatograma se obtuvo con un 90% de B. Cuando se redujo la fuerza eluyente utilizando un disolvente con 80% de B, se consigue una separacin un poco mejor, observndose 5 picos. Con 60% de B, se empiezan a ver 6 picos. Con 40% de B se ven claramente 8 picos. Con 30% de B, todos los picos quedan bien resueltos, pero la separacin tarda demasiado (cerca de 2 horas). A partir de los datos obtenidos con las elusiones isocrticas de figura 13, se eligi el gradiente que se presenta en la figura 25.11, con el que se consigui resolver todos los picos en 38min. Primero se trabajo con 30% de B (B=acetonitrilo) durante 8 minutos, para separar los componentes 1,2,3. A continuacin se fue aumentando de forma continua la fuerza eluyente durante 5 minutos hasta alcanzar un 45% de B, y se mantuvo durante 15 minutos, para eluir los picos 4 y 5. Finalmente se modifico el disolvente hasta alcanzar un 80% de B en 2 minutos, mantenindose esa composicin para eluir los ltimos picos. Captulo 8 112
Figura 15. Separacin isocrtica en HPLC de una mezcla de compuestos aromticos en una columna Hypersil ODS (C18 sobre slice de 5m), de o.46 x 25cm, caudal de 1.0ml/min,temperatura ambiente ( 22C). (1) alcohol benclico, (2) fenol, (3)3,4-dimetoxiacetofenona, (4) benzona, (5) benzoato de etilo, (6) tolueno, (7)2,6-dimetoxitolueno, (8) ometixibifenilo.El eluyente estaba formado por un tampn acuoso (designado por A ) y acetonitrilo (designado por B). El tampn contena KH2PO4 25mM y 0.1 g/L de azida de sodio con el pH ajustado a 3.2 con HCl
Aplicaciones
La cromatografa es utilizada para anlisis del principio activo de un producto farmacutico, por ejemplo la determinacin de cafena y cido acetilsaliclico en cafiaspirina , los siguientes datos fueron obtenidos para determinar la cantidad de cafena y cido acetilsaliclico contenidos una tableta de cafiaspirina. En este caso se realizo el anlisis en HPLC Para tal anlisis se tomo como estndar las siguientes concentraciones de cafena y cido acetilsaliclico: Ccafena = 0.03mg/mL CAAS = 0.53mg/mL
Se realizo el anlisis y se obtuvieron los siguientes resultados.
Cromatograma de la inyeccin nmero 1 del estndar
Cromatograma de la inyeccin nmero 3 del estndar
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Cromatograma de la inyeccin nmero 4 del estndar Cafena Nm. Inyeccin 1 2 3 4 5 rea 149019 187639 162884 201409 184141 =177018.4
Cromatograma de la inyeccin nmero 5 del estndar cido Acetilsaliclico Nm. Inyeccin 1 2 3 4 5 rea 615352 784811 684670 874595 797979 =751481.4
A partir de estos datos se obtuvo el factor de respuesta para cada componente en estudio con la siguiente ecuacin A=FrC. Fr cafena = 177018.4 / 0.03 = 5900613.33 Fr AAS = 751481.4 / 0.53 = 1417889.43 Anlisis de la tableta de CAFIASPIRINA Posteriormente se analizo la tableta de Cafiaspirina (lote 7605H2, fecha de caducidad Julio 2009), obteniendo los siguientes datos.
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Cromatograma de la inyeccin #1 de la muestra problema
Cromatograma de la inyeccin #2 de la muestra problema
Cromatograma de la inyeccin # 3 de la muestra problema
Cafena Nm. Inyeccin 1 2 3 rea 177343 178856 182458 = 179552.3
cido Acetilsaliclico Nm. Inyeccin 1 2 3 rea 678496 717425 723643 = 706521.3
Con los datos de las reas y el factor de respuesta se obtuvieron la cantidad presente del de cafena y cido acetilsaliclico en cada tableta.
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C cafena = 179552.3 / 5900613.33 = 0.0304 0.0304 * 10/ 1 * 100 = 30.4 mg Cada tableta de cafiaspirina contiene 30.4 mg de cafena CAAS = 706521.3 / 1417889.43 = 0.4983 0.4983 * 10 / 1 * 100 = 498.3 mg Cada tableta de cafiaspirina contiene 498.3 mg de cido acetilsaliclico
Determinacin del grado alcohlico de una bebida

Conocer el contenido de etanol en muestras analizadas a partir del mtodo del estndar interno. Se analiza el tequila comercial Herradura, EtOH 40% Se trabajo a 70C y se realizaron corridas a diferentes concentraciones de EtOH (2, 4, 6, 8, 10%v/v) y una concentracin constante de Acetona (6%v/v; estndar interno. Para la curva patrn, las diferentes disoluciones se realizaron a partir de una solucin Stock de EtOH al 20%. En los cromatogramas aparecen 2 picos con 2 reas diferentes. El primer pico y rea corresponde a la acetona, ya que es el compuesto menos polar. El segundo correspondo al del EtOH. Los valores de rea para la curva patrn:
rea [Acet] 752578 394769 175540 Promedio [Acetona](%) 6 6 6 440962.3333 270166 251991 168917 Promedio 230358 183014 177426 6 6 6 6 6 rea [EtOH] 225296 125961 57133 [EtOH](%) 2 2 2 136130 198196 183560 142527 174761 207592 219475 6 6 4 4 4
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234651 Promedio 198363.6667 276769 145605 Promedio 211187 178488 168642 266046 Promedio 204392 6 6 6 6 6 6 282560 236542.3333 382117 228924 305520.5 341568 350407 486201 392725.3333 10 10 10 8 8 6
Curva Patrn - Estndar Interno

2.5 2
Ae/Aei
1.5 1 0.5 0 0 0.5 1 Ce/Cei 1.5 2 y = 1.2536x - 0.075 R2 = 0.9868
Frr=1.2536 Ae/Aei=Frr*(Ce/Ci) Tequila "Herradura" (EtOH 40%) E.I. rea [Acet] 250005 213666 Promedio 231835.5 [Acet] (%) 6 6 rea [EtOH] 300125 288804 294464.5 R=[EtOH] (%) 5.789146394 6.518217346 6.125112357
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Los resultados obtenidos en la tabla se obtuvieron con clculos de regresin lineal, de la misma manera que se realizaron para la muestra del destilado. Tomando en cuenta el factor de dilucin utilizado se encontrar la concentracin (%v/v) del etanol en la muestra de Tequila. Para hacer la dilucin de la muestra se tomaron 1.5ml del tequila, y se aforaron a 10ml para llevarlo a una concentracin del 6% (equivalente a la de la acetona, el estndar interno). E.I.: 6.12511 10ml 30.6255% 2ml Segn la informacin del producto, este indicaba que el porcentaje de etanol que contena es del 40%. El estudio cromatogrfico, encontr una concentracin del 30%. El estudio de la muestra a travs del estndar interno, disminuye el error caudado por la inyeccin es por ello que el resultado es confiable. La cromatografa tiene una gran aplicacin una de ellos es la determinacin del grado alcohlico de una muestra para comparar con el porcentaje reportado por el fabricante.
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RESUMEN Los cromatogramas. son la representacin de la respuesta o seal del sistema de deteccin continuo (CLAR o CG) o discontinuo en funcin del tiempo, volumen del eluyente o distancia en el lecho cromatogrfico. Contiene la informacin analtica relativa a la muestra (complejidad: nmero de picos, deteccin cualitativa y/o cuantitativa de uno o varios componentes) o del funcionamiento del sistema cromatogrfico. Los aspectos termodinmicos y cinticos de la separacin cromatogrfica quedan reflejados en el cromatograma, es decir, en la situacin y forma del pico. La coleccin y procesamiento de datos as como su anlisis se realiza con el fin de obtener
informacin cualitativa y cuantitativa y generar los reportes correspondientes, obtenindose los datos a partir de un detector; ste es un dispositivo capaz de convertir una propiedad fsica, no medible directamente, en una seal elaborable que ofrece informacin sobre la naturaleza y magnitud de la propiedad fsica. La seal proveniente del detector se transmite a un sistema de registro e integracin, el cual genera un cromatograma. Los datos obtenidos son procesados mediante un registrador e integrador. La cromatografa en columna cuantitativa tiene como principio la comparacin de las alturas, o de las reas del pico del analito con la de uno o ms patrones, en la cromatografa en plano el rea ocupada por las especies separadas sirve como parmetro analtico, el rea del pico cromatografico es directamente proporcional a la concentracin del analito, por lo cual es fundamental para la
confiabilidad del anlisis que el rea de los picos sea medida lo ms exacto y reproduciblemente posible. Existiendo as varias maneras manuales de medir el rea de los picos cromatogrficos; sin embargo, son los instrumentos cromatogrficos modernos equipados con integradores electrnicos digitales son los ms precisos y rpidos que cualquier mtodo manual para determinar el rea del pico cromatografico. Se ha logrado un desarrollo y optimizacin de mtodos a travs de ciertas modificaciones en las condiciones de trabajo tales como las rampas de temperatura utilizadas en cromatografa de gases en donde el control de la temperatura de la columna es una de las formas ms sencillas y ms efectivas de influenciar la separacin de los componentes. En general, caben dos posibilidades de modificacin de las condiciones de trabajo cromatogrficas. La modalidad Isocrtica, en la que las condiciones experimentales permanecen constantes durante el proceso cromatogrfico y la modalidad no Isocrtica, en la que durante el proceso de separacin cromatogrfica se varia de manera gradual y estrictamente controlada el parmetro de temperatura. Captulo 8 119

Otra modificacin en el caso de cromatografa de lquidos de alta eficiencia es cambios de composicin de la fase mvil. En donde s un disolvente no permite una elucin suficientemente rpida de todos los componentes, se usa una elucin en gradiente; en cual, hay un cambio continuo de la composicin del eluyente en sentido de aumento de fuerza eluyente. Para eluir solutos fuertemente retenidos hay que aumentar la fuerza eluyente del disolvente con el fin de producir anlisis manteniendo una resolucin deseada y al mismo tiempo disminuir la duracin de ste. La cromatografa es utilizada para anlisis del principio activo de un producto farmacutico, Otra de las aplicaciones de la cromatografa en este caso la de lquidos, es la determinacin del grado alcohlico de una bebida. Entre muchas otras ms. BIBLIOGRAFA M. Valcrcel Cases, A. Gmez Hens, Tcnicas analticas de separacin, Editorial Reverte, Espaa, 1990, pp778 Lucas Hernndez Hernndez, Claudio Gonzlez Prez, Introduccin al anlisis instrumental,1 Edicin, Editorial Ariel S.A, Barcelona, 2002. pp 456 Douglas A. Skoog, F. James Holler, Principios de Anlisis Instrumental, Quinta Edicin, Editorial Mc. Graw Hill, Espaa 2001, pp 753 Daniel C. Harris, Anlisis Qumico Cuantitativo, Segunda Edicin en Espaol, Editorial Reverte, Espaa 2001. http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Gas.htm
Captulo 8
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Determinacin de Azcares por CGL a travs del mtodo de derivados TMS

Este mtodo se recomienda para la identificacin y cuantificacin de los monosacridos y disacridos presentes en diversos alimentos frescos o industrializados, despus de la correspondiente derivatizacin de stos para su anlisis por CGL con detector FID. Fundamento del Mtodo. Se basa en la obtencin de derivados de trimetilsililados (TMS) de los carbohidratos presentes en el alimento para su posterior anlisis en CGL. La derivatizacin se realiza en 2 pasos: formacin de la oxima del azcar correspondiente con hidroxilamina clorhidrato en piridina y silanizacin con hexamil disilazano (HMDS) y cido trifluoroactico (TFA). La identificacin se efecta por los tiempos de retencin y la cuantificacin por el mtodo del estndar interno. Procedimiento. Para productos lcteos (yogur o leche) se debe liofilizar una alcuota de aproximadamente 100mg. Para vegetales frecos se extrae en bao de agua a 50C durante 1 hora con etanol 70%. El extracto se rotovapora a sequedad en evaporador rotatorio de vaco a 50C como mximo. Aadir a cada frasco de muestra 1 mL de solucin de estndar interno (2mg/mL de m-inositol o 1mg de xilosa) antes de liofilizar. Preparacin Estndar. Pipetear 1mL de cada solucin de estndares y estndar interno en etanol en un matraz de fondo cnico y boca esmerilada. Llevar a sequedad en el evaporador rotatorio a una temperatura no mayor de 40C. Derivatizacin. Se agrega a cada frasco de muestra liofilizada y a la mezcla de estndares 1mL de solucin de hidroxilamina clorhidrato lavando cuidadosamente el recipiente. Se trasvasa hacia un tubo de tapa rosca y se coloca durante media hora en bao de agua a 75-85C con agitacin ocasional. Se toman 100 L de la solucin de piridina de la muestra y se pasa a un vial ambar se aaden 150 L de HMDS y 1 gota de TFA, se deja reposar hasta la aparicin de precipitado blanco. Anlisis por CGL Condiciones operacionales Flujo de gas acarreador (nitrgeno): 35mL /min. Temperatura: Detector: 300C, Inyector: 250C, Horno (programado): 180C (2min) a 8C/min, hasta 250C. Se inyectar 1 L de la mezcla de estndares hasta obtener reproducibilidad en la respuesta del equipo. Es decir que el factor de respuesta (km) debe de ser mnima la variacin. Ajustar las dems
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condiciones de operaciones de tal forma que el estndar de glucosa brinde una seal aproximadamente igual a la mitad de la escala del registrador o el dispositivo de salida del cromatgrafo de gases. Los azcares se identifican por comparacin con los tiempos de retencin de cada estndar correspondiente. La concentracin se determina por el mtodo de estndar interno utilizando las frmulas siguientes. Para la inyeccin de la mezcla de estndares puros: (1) Donde: Km = Factor de respuesta para el azcar (ej glucosa) AM = rea del pico del estndar correspondiente (ej. Glucosa) Mi = Masa tomada del estndar interno utilizado (2mg para inositol o 1 mg para xilosa) Ai = rea del pico estndar interno MM = Masa tomada del estndar correspondiente (1mg de glucosa) Se calculan tantos valores de km como azcares se cuantifiquen. Para la muestra el peso de cada azcar se calcula por la siguiente frmula:
(2) Donde: MM = peso del azcar correspondiente en la muestra AM = rea del pico del azcar en la muestra (mm) Mi = masa del estndar interno aadido a las muestras (mg) Ai = rea del pico estndar interno aadido a las muestras (mm) Km = valor promedio obtenidos mediante la frmula (1) para el azcar correspondiente. Un cromatograma tpico de la separacin de algunos TMS derivados de azcar se muestra en la figura1.
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2. Se desea determinar el contenido de etanol en una bebida alcohlica. Para ello se realiz un anlisis cromatogrfico utilizando una curva de calibracin relativa. Preparacin de soluciones Solucin de estndar interno (EI). Solucin de acetona 10% Solucin patrn (SP). Solucin de etanol al 10% Empleando estas soluciones se prepar la siguiente curva de calibracin Tabla 2.
SP (mL) 0.1 0.5 1.0 1.5 2.0 EI (mL) 1 1 1 1 1 Volumen final (mL) 10 10 10 10 10
De cada concentracin de la curva se inyect 1L en el cromatgrafo. Preparacin de la muestra Se tomaron 5 mL de licor, se adicion 1mL de acetona (EI), se afor a 10ml con agua. La muestra se inyect en el cromatgrafo 5 veces (1L). Tr acetona = 0.79min y tr etanol = 1.38min Captulo 8 123

Condiciones cromatagrficas Cromatgrafo de gases integrado con inyector split/splitless, detector de ionzacin de flama y una columna de slice fundida SP 1000, fase polar (30m x0.32mm x 0.251m). Temperatura del inyector y detector 200C. Programa de temperatura: temperatura inicial 80C / 1.3 min, incrementandose a 20C/min hasta 130C y mateniendose a esa temperatura durante 5 min. Resultados Curva estndar (n=3) Tabla 3.
rea EtOH Promedio 29054.33 123820 243853.3 360023.3 468270 1 30556 109170 228380 321700 489390 2 25864 123050 247660 371000 481950 3 30743 139240 255520 387370 433470 1 290080 214770 241720 220850 261410 rea EI 2 249370 246810 263180 254990 261700 3 287220 266110 261540 265390 247950 Promedio 275556.6 242563.3 255480 247076.6 257020
Con respecto a estos resultados obtenidos se calculo el promedio de cada repeticin. Muestra (n=5) Tabla 4.
Inyeccin 1 2 3 4 5 Promedio rea de etanol 296800 290840 287960 285800 291010 29.0482 rea acetona 187150 185900 185880 183680 187180 186078
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Tomando en cuenta los promedios de las reas tanto de Etanol como del Estndar Interno (tabla 3.) as como la relacin entre stas y de las concentraciones tanto de la solucin patrn como la interna que se muestran en la tabla 2. Se grafica y se obtiene la pendiente que en este caso es el Frr (factor de respuesta relativo); en base a ste dato se puede determinar la concentracin de etanol en la muestra.
rea de Etanol 29054.33 123820 243853.3 360023.3 468270 rea EI 275556.6 242563.3 255480 247076.6 257020 AEtOH / AEI 0.1054 0.5105 0.9545 1.4571 1.822 [sp] /[EI] 0.1 0.5 1 1.5 2.0
Curva Patrn
2 y = 0.9114x + 0.0403 R2 = 0.9974
AEtOH / AEI
1.5 1 0.5 0 0 0.5 1 [sp] /[EI] 1.5 2 2.5
Por lo tanto tenemos que: m = Frr =0.9114 Y sabemos que:
Frr
AEtOH EI AEI EtOH
Por lo tanto despejando y tomando en cuenta los promedios de la tabla 4. con las respectivas reas de la muestra tenemos que:
EtOH
290,4820.1 0.1713 0.911 186078
[EtOH] v/v = 0.1713 x 100 = 17.13 % de Etanol por cada 100ml de bebida alcohlica en este caso licor.
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Estudio sobre los cidos grasos libres en queso blanco

Fundamento del mtodo. Los cidos grasos libres juegan un papel importante en el sabor de muchos quesos y se producen por la hidrlisis de los triglicridos de la grasa por las lipasas nativas de la leche, las lipasas microbianas y las lipasas de las clulas somticas. Tambin se liberan durante el metabolismo de los carbohidratos y aminocidos por las bacterias. Los cidos grasos de bajo peso molecular son consecuencia de la fermentacin bacteriana, mientras que los cidos grasos restantes son el resultado de la accin de la lipasa [1]. Se ha demostrado que los cidos grasos libres deben estar presentes dentro de un rango especfico y a un nivel ptimo de concentracin para un sabor deseable. Cantidades excesivas de cidos grasos libres se asocian con rancidez hidroltica y causan sabores desagradables. Procedimiento. Los cidos grasos libres (AGL) analizados fueron: butrico (C4), caproico (C6), caprlico (C8), caprico (C10), laurico (C12), miristico (C14), palmitico (C16), estearico (C18), oleico (C18:1) y linoleico (C18:2). Extraccin de los lpidos del queso. Se mezclaron 2 g de queso rayado con 6 g de sulfato de sodio hidratado para absorber la humedad y 0,6 ml de cido sulfrico 2,5 mol/l. Se procedi a la extraccin de los lpidos con 6 ml de eter/heptano (1:1 v/v) en un tubo de centrfuga de 75 ml mediante centrifugacin a 2.500 rpm/min por 2 min. Esta extraccin se repiti dos veces aadiendo la misma cantidad de eter/heptano (1:1 v/v) al residuo. Los tres extractos se mezclaron. Separacin de los cidos grasos libres. Se utiliz como estandar interno el cido pelargnico (C9) (0,043 mg) el cual se adicion al extracto lipdico antes de proceder al aislamiento de los cidos grasos libres. Para tal fin se utilizaron columnas aminoproplicas de 3 ml (Supelclean LC-NH2 de Supelco, Inc) acondicionadas con 2 ml de heptano. El volumen total del extracto se aplic a la columna con presin positiva. Los lpidos neutros fueron eludos con 3 ml de cloroformo/2-propanol 2:1 v/v. A continuacin los cidos grasos libres adsorbidos en la columna fueron eludos con 3 ml de dietil eter con 2% de cido frmico. El primer ml se descart por no contener cidos grasos libres. De los siguientes 2 ml eludos, con la totalidad de los AGL, se inyect 1 ml al cromatgrafo para su determinacin. Se realizaron 2 extracciones de cada muestra de queso y cada extraccin se inyect por duplicado al cromatgrafo [2,3]. Las condiciones de operacin en el cromatgrafo fueron: Temperatura inicial Tiempo Inicial Captulo 8 90C 1 min Variacin de temperatura Temperatura final 20C/min 220C 126

Tiempo final 10 min 250C 250C 20 ml/min Flujo de hidrgeno Flujo de aire Purga 30 ml/min 500 ml/min 1 min
Temperatura del detector Temperatura del inyector Flujo de helio
Cuantificacin de los AGL. Se utiliz un cromatgrafo de gas Hewlett Packard 5890 equipado con un detector de ionizacin de llama y una columna capilar de slica de 15 m x 0,53 mm (Nukol de Supelco, Inc.) calibrado con soluciones de referencia de los cidos grasos a analizar (Sigma) [6]. Se adapt inyeccin directa debido a las bajas concentraciones de los cidos grasos. La cuantificacin se realiz relacionando las reas de los picos con el rea del estndar interno (C9) mediante un integrador Hewlett Packard 3393A. la media y la desviacin estandar de todos los AGL. Resultados Se obtuvo
La Tabla 1 y las Figuras 1 y 2 muestran la composicin y los cromatogramas de los cidos grasos libres de los quesos Palmita y Semiduro. Se ha podido comprobar la presencia en los quesos de los AGL saturados del butrico (C4) al palmtico (C18), as como de los mono-insaturados y poliinsaturados, el cido oleico (C18:1) y linoleico (C18:2) en concentraciones muy diversas entre 2.3 g/g (C6) en el queso Palmita y 185.1 g/g (C18:1) en el queso Semiduro, con el predominio de los de mayor peso molecular, palmtico (C16) y oleico (C18:1), sobre los de menor peso molecular, entre los cuales resalta el butrico (C4). Captulo 8 120

Se observan amplias variaciones entre las muestras, debido posiblemente a la influencia de las diferentes condiciones del proceso de elaboracin en la composicin de los quesos, as como la manipulacin y almacenamiento durante el perodo de comercializacin. La columna utilizada proporcion excelentes resultados sin la necesidad de derivatizar para obtener los steres metlicos previo a su cuantificacin. Al disminuir una etapa del anlisis se evita una posible fuente de error y se consigue un ahorro de tiempo.
Estudio de validacin de la Metodologa para la determinacin de Vitamina A en Alimentos infantiles instantneos por HPLC
Fundamento. Los alimentos infantiles instantneos, en su gran mayora, son fortificados normalmente utilizando formulaciones especiales que mejoran su estabilidad y valor nutritivo, siendo la ingesta diaria recomendada de 400-700 g de vitamina A, para nios de 1-10 aos de edad 3. En ese sentido, y buscando una ptima metodologa de anlisis, en el presente estudio se realiz la validacin de la metodologa por HPLC para la determinacin de vitamina A contenida en alimentos infantiles instantneos. Procedimiento. Se utiliz un equipo de cromatografa lquida de alto rendimiento (HPLC), marca Shimadzu, modelo LC10A, con inyector automtico, bomba con sistema de degasificacin, con integrador o sistema de registro, software para el procesado de datos cromatogrficos, detector de arreglo de diodos (longitud de onda variable). La columna cromatogrfica fue de acero inoxidable LC-18 para fase reversa, de 25 cm x 4,6 mm de dimetro interno, 5 m de dimetro de partcula, y guarda columna con cartucho C18, Supelco. Las condiciones tpicas de operacin fueron: sistema isocrtico, flujo 1,2 mL/min, volumen de inyeccin 20 l, deteccin UV 242 nm, temperatura de horno, ambient y e, tiempo de corrida 7 min. La fase mvil fue metanol al 100% grado HPLC. Se pesaron 20 g de la muestra de alimento infantil en un baln de base plana, se coloc un magneto y se adicion 70 mL de etanol absoluto. Se colocaron los tubos de reflujo y se agit la mezcla hasta su ebullicin con corriente de nitrgeno. Luego, se adicion 20 mL de solucin de KOH al 50% y se saponific la mezcla por 30 minutos con agitacin moderada. Antes de finalizar esta etapa se enjuag el contenido con 50 mL de agua en 3 porciones. La solucin se enfri a temperatura ambiente y luego se filtr al vaco. Se coloc inmediatamente el contenido en una pera de separacin de 250 mL y se adicion 50 mL de hexano p.a. para proceder a la extraccin. Se agit la mezcla por 20 segundos y al separarse las fases se coloc la capa superior (fase orgnica) en un baln de 250 mL de base redonda Captulo 8 120

que contena aproximadamente 0,5 g de BHT cido ascrbico. Se efectu dos veces ms la extraccin y se juntaron los extractos en el baln de 250 mL. Se evapor a sequedad el solvente, haciendo uso de un rotavapor con bao de agua a 40C, se diluy inmediatamente con metanol grado HPLC el residuo, y se llev a volumen en un matraz volumtrico de 10 mL. Finalmente, se pas la solucin final por un filtro de 0,2 m, llenndolos en viales mbar de 2 mL para colocarlos en el inyector del cromatgrafo. Clculos:
Donde: Am (rea del pico de vitamina A en la muestra), As (rea del pico de vitamina A en el estndar), Cs (Concentracin de vitamina A en el estndar, mg/ml), D (Factor de dilucin), Wm (Peso de la muestra. Se analizaron muestras de papilla para cuantificar la vitamina A expresada en g/g. El analito se adicion a la matriz, disuelto en el mismo solvente usado para la extraccin, y se dej en contacto con sta por varias horas antes de la extraccin, para permitir su interaccin. Se tomaron 0,76 mL, 1,27 mL y 1,78 mL de una solucin estndar de 100 ppm de vitamina A y se adicionaron a 6 muestras de papilla por nivel. Se dej en contacto la solucin estndar con las muestras durante toda la noche bajo refrigeracin y, al da siguiente, se realiz el tratamiento y se hicieron las lecturas de los resultados de las 18 muestras. Resultados En la Figura 1 se muestran los cromatogramas representativos de dos concentraciones (mayor y menor) de vitamina A para la curva de calibracin. El tiempo de retencin de la vitamina A fue 3,91 0,5 min, siendo el tiempo total de anlisis para una muestra de 7 min. La respuesta de deteccin fue lineal en el rango de concentraciones de 5- 15 g/g Figura 2), ( obtenindose un coeficiente de correlacin r=0,99. El lmite de deteccin del mtodo en base a la seal / ruido (S/N) fue de 0,06 g/g y el lmite de cuantificacin de 0,58 g/g
Captulo 8
121
La recuperacin obtenida fue de 97,98%.
Determinacin de xido de etileno en aire. Mtodo de muestreadores pasivos por difusin / Cromatografa de gases
El oxido de etileno es una sustancia utilizada en la industria farmacutica para la esterilizacin de embases, viales, ampolletas, tapones etc. Utilizados en la fabricacin de inyectables. Toma de muestras. Para el muestreo personal colocar el muestreador pasivo 3M-3551 en la zona de respiracin. Una vez terminado el perodo de captacin desmontar la membrana y el aro de sujecin colocando en su lugar la tapa para la desorcin, asegurando la hermeticidad de sta y los tapones de la misma. Preparacin de la muestra. El muestreador se desorbe con 1,5 ml de la disolucin de 10% de cloruro de metileno en metanol por 30 min. Una vez realizada la desorcin se diluyen las muestras diez veces con la disolucin de 50% de acetonitrilo en tolueno. Calibracin. La disolucin patrn se prepara por triplicado, aadiendo una cantidad determinada de 2bromoetano a un volumen de disolucin desorbente de 10% de cloruro de metileno en metanol a fin de obtener una disolucin patrn de concentracin similar a la muestra a analizar. Dicha concentracin se debe expresar en mg/ml de disolucin desorbente. Desarrollo de una curva de calibrado. Para el desarrollo de la misma, se preparan cinco disoluciones de calibracin de los analitos de inters que cubran el intervalo de concentraciones de aplicacin del mtodo. Analizar los patrones en las mismas condiciones que las muestras. Se recomienda un mnimo de seis inyecciones. Calcular para cada concentracin y analito el promedio de las respuestas obtenidas y la desviacin tpica correspondiente. Las curvas de calibracin se construyen representando los intervalos Captulo 8 122

de los valores promedios 2 desviaciones tpicas, frente a las concentraciones en mg/ml de cada analito. Comprobar diariamente la curva de calibrado mediante el anlisis de uno de los patrones de calibracin. El valor obtenido para cada analito debe encontrarse dentro del intervalo asociado a ese patrn.
Las condiciones de trabajo para el cromatgrafo de gases equipado son las siguientes: Temperatura del inyector 200 C Temperatura del horno 120 C Temperatura del detector 250 C Clculos Se calcula el factor de respuesta del analito con los datos obtenidos mediante la expresin: Fz = m/A donde: m= es la cantidad de analito en las disoluciones patrn A es el rea promedio correspondiente al analito en las disoluciones patrn. La concentracin en miligramos por mililitro de analito en las disoluciones de desorcin de cada muestra, se determina segn la expresin: co = Ao x FR donde: co= es la concentracin de analito en mg/ml de disolucin. Ao= es el rea correspondiente al pico de analito en la muestra. FR= es el factor de respuesta. Calibracin multinivel. Leer la concentracin en miligramos por mililitro en la curva de calibracin realizada. Captulo 8 123 Gas portador nitrgeno 25 ml/min Gas auxiliar nitrgeno 50 ml/min

Conversin de la cantidad de 2-bromoetanol a su equivalente en xido de etileno Se realiza mediante la siguiente expresin: Ci = Co * 44.05/124.98 donde: ci= es la concentracin de xido de etileno en mg/ml de disolucin. 44,05 es el peso molecular de xido de etileno. 124,98 es el peso molecular de 2-bromoetanol.
Determinacin de la cantidad de xido de etileno presente en la muestra

Una vez determinada la cantidad de xido de etileno en la disolucin de desorcin, se calcula la cantidad en mg de compuesto mediante la siguiente expresin: ms = ci x Vd ms= es la masa de xido de etileno captada por el muestreador. Vd= es el volumen de desorcin (1,5 ml). Determinacin de la concentracin ambiental de xido de etileno Se calcula la concentracin de xido de etileno en aire muestreado, en miligramos por metro cbico, por medio de la siguiente ecuacin: = donde: Ci= es la concentracin ambiental del contaminante (mg/m3). ms= es la masa de contaminante captada (mg). SR= es el caudal de muestreo especfico para el xido de etileno (49,3 ml/min 760 mm Hg, 25 % Humedad relativa) . CR= es el coeficiente de recuperacin especfico para xido de etileno en tanto por uno (0,92). t es el tiempo de exposicin en minutos. La concentracin de xido de etileno en aire, expresada en mililitro por metro cbico (ppm), se calcula por medio de la siguiente expresin: Cppm = Ci (24.0/44.05)*(101.3/P)*(T+273.15/293.15) donde: P= es la presin del aire muestrado en kPa (103 N/m3). T= es la temperatura del aire muestreado en C. 44,05 = es el peso molecular de xido de etileno en g/mol. Captulo 8 120 106
Anlisis cuantitativos de los principales constituyentes qumicos de races de Echinacea purpurea y E. angustifolia producidas.
Fundamento. Se cuantific los fenilpropanoides libres: cido clorognico y cido cichrico, glicosdicos as como las alcamidas presentes en extractos de races de las plantas medicinales Echinacea purpurea y E. angustifolia. Procedimiento. Se recolectaron 300 g de material vegetal, fue macerada con una mezcla 80:20 de etanol al 95%: agua. Despus de realizar 3 maceraciones, el extracto hidroalcohlico fue concentrado en un evaporador rotativo a presin reducida y 45[grados]C, obtenindose 1,5 litros de extracto concentrado. Anlisis por cromatografa lquida de alta eficiencia (HPLC) La deteccin y cuantificacin de los fenilpropanoides libres y del fenilpropanoide glicosilado, se realiz por medio de un cromatgrafo lquido de alta eficiencia (HP 1090 A). Los fenilpropanoides fueron separados utilizando un gradiente lineal de fase mvil (20 min) de un 5% de acetonitrilo [agua.sup.-1] hasta un 25% de acetonitrilo. El flujo fue de 1,0 ml [min.sup-1]. Adems, la fase mvil contena un 1% (v/v) de cido fosfrico 0,1 N., para lograr una mejor resolucin de los picos presentes en el cromatograma. La separacin fue monitoreada a 330 nm. Las alcamidas fueron identificadas segn los tiempos de retencin y los espectros de masas de los picos obtenidos en los cromatogramas, comparados con los obtenidos con las disoluciones de sustancias puras, previamente analizados y almacenados en una base de datos. La cuantificacin se realiz con el mtodo de estndar externo empleando patrones en rango de concentracin de 0-1,5% en peso. Resultados La mayor concentracin de extractos de E. purpurea fue de 5,16% de la region de Santos y contiene 1,12% ms cido clorognico y cichrico que la muestra reportada de EE.UU. El anlisis por HPLC se obtuvo que los contenidos de metabolitos secundarios producidos tanto en Echinacea purpurea como en E. angustifolia, en condiciones de Costa Rica, son mayores que los reportados en los EE.UU., de donde es originaria esta planta. Se encontr que E. angustifolia, adems produce un equinacsido que no sintetiza E. purpurea y que es de suma importancia por ser uno de los principales compuestos para mejorar el sistema inmunolgico de los seres humanos.
Captulo 8
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Anfotericina b: determinacin en diversos fluidos biologicos por cromatografa lquida. Aplicacin a estudios farmacocinticos y de estabilidad qumica.
La anfotericina B (AnB), comercializada en el ao 1956, contina siendo el frmaco de eleccin para el tratamiento de las micosis sistmicas, aunque su utilizacin no est exenta de toxicidad. Procedimiento. Se determin analizando 10 veces dentro de la misma serie analtica, dos muestras, una de concentracin de AnB de 0.5 -g/mL y otra de 2.5 -glmL, preparadas a partir de un "pool'Lde sueros al cual le fue adicionado el frmaco. En este estudio se presenta un mtodo de determinacin de AnB en suero humano por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) en fase reversa y columna corta (30 mm). El desarrollo y puesta a punto de la tcnica se realiz en base a los mtodos de determinacin de AnB por HPLC previamente descritos y resumidos en la siguiente tabla.
Fase mvil 405 (1) Tampn Na2HPO4-KH2-PO4 1.6 mM, acetonitrilo (63/37, v7v) pH=7 Flujo 1.5 mL/min 382 (2) Na2EDTA 2.5 mM, Acetonitrilo (55/45, v/v) Flujo 1 mL/min 405 (3) Acetonitrilo, 25mM EDTA, metanol (30:20:50 v/v/v) Flujo 1.6 mL/min 405 (4) Metanolm tampn fosfato (10 mM KH2PO4, 5mM EDTANa2 pH=4) (80:20, v/v) Acetronitirilo, tampn 1-Amino-4 Nitronaftaleno Precipitacin proteninas sricas con 6.8 +NO NO EI 1-Amino-4-Nitro naftaleno Procedimiento de extraccin Precipitacin protenas stricas con Tr 5.5 min
metanol (lleva incorporado el estndar interno). Centrifugacin inyeccin directa sobrenadante. Extraccin protenicas sricas con metanol con acetronilo Na2EDTA 2.5 mM 6-7 min
(60/40/,v/v) Inyeccin del eluido Precipiatacin protenas sricas con 4 min
metanol. Centrifugacin inyeccin directa del sobre nadante
metanol (lleva incorporado el estndar interno). Centrifugacin Inyeccin directa del sobresedante.
0.5 min
8.4
+-
fosfato (10 mM KH2PO4, 5 mM EDTANa2 pH=4) (40:60, v/v)
0.5 min
Captulo 8
122

382(5) EDTA 0.01 M, acetronitrilo (60/40 v/v) pH=4.2 Flujo 1.5 mL/min Nacetilanfotericina B Si bilirrubinas > 3 mg/dL: Precipitacin pretenas sricas con 1-Amino-4 Nitronaftaleno Si bilirrubinas < + mg/dL: Precipitacin protenas sricas con 4.9 +-
0.8 min
metanol. Centrifugacin. Inyeccin directa del sobrenadante.
metanol. Extraccin en fseslida con columna SuperClean C18 (vacmetanol e inyeccin del eludo)
Resultados Se realiz una curva de calibracin, misma que se calcul por regresin lineal a partir de las reas de los picos correspondientes a los estndares, procesados en cada serie analitica. La concentracin de las muestras se obtuvo por interpelacin de su rea en la recta de calibracin. Se resenta un mtodo de determinacin de AnB en suero humano por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) en fase reversa y columna corta (30 mm). Para ello. se escogib una columna de octadecilsilano (C18), ms corta (30 mm x 4.6 mm ID) que en los mtodos de referencia (125 a 300 mm) (108,119,120,129,131), con el fin de obtener tiempos de retencin ms pequeos y se utiliz la fase mvil del mtodo descrito por Wang et al (131) (acetonitrilo y tampn EDTA ).
Bibliografia:
Sanchez Ma. Dolores. Venezuela. 2004. Estudio sobre los cidos grasos libres en queso blanco, Universidad de Los Andes. 46:2. Perez C. Ruth. Estudio de validacin de la Metodologa para la determinacin de Vitamina A en Alimentos infantiles instantneos por Cromatografa Lquida de alto rendimiento (HPLC). Rev. per. med. exp. salud publica, 2000, vol.17, no.1-4, p.26-29. ISSN 1726-4634. Serie Acadmicos CBS. Cromatografa de gases y de lquidos de alta resolucin Mxico 2000. pag. 215-231 255-305. Khoo SH, Bond J, Denning DW. Administering arnphotericin B-a practica1 approach. J Antimicrob Chemother 1994;33:203-13.
Captulo 8
123

Técnicas cromatográficas UNAM

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Facultad de Qumica Qumica Analtica Instrumental II

Introduccin a los mtodos de separacin

Captulo 1. Introduccin a los mtodos de separacin

Introduccin a los mtodos de separacin

1.2 Cromatografa en papel

Introduccin a los mtodos de separacin

1.3 Cromatografa en capa fina

Introduccin a los mtodos de separacin

Precio. Pureza. No utilizar mezclas de eluyentes

Introduccin a los mtodos de separacin

1.4 Cromatografa de permeacin en gel

Introduccin a los mtodos de separacin

1.5 Cromatografa de exclusin de iones

1.6 Cromatografa de intercambio inico

Introduccin a los mtodos de separacin

Introduccin a los mtodos de separacin

1.7 Cromatografa de fluidos supercrticos

FLUIDO SUPERCRTICO 0,2- 0,5 10-3 10-4 (1-3) * 10-4

LQUIDO 0,6- 2 (0,2 2)* 10-5 (0,2- 3)* 10-2

Introduccin a los mtodos de separacin

Introduccin a los mtodos de separacin

1.8 Cromatografa de afinidad

Introduccin a los mtodos de separacin

1.9 Cromatografa de lquidos de alta resolucin

Introduccin a los mtodos de separacin

Introduccin a los mtodos de separacin

Captulo 2 Parmetros cromatogrficos

2.2 Constantes de Distribucin

2.3 Factores de influencia en la retencin

2.4 Retencin y Equilibrio en Cromatografa

2.5 Eficiencia de separacin de una columna

Si en lugar de medir L y en unidades de longitud se hace en tiempo, la ecuacin quedar: = 16

Tambin puede hacerse en funcin de la altura y rea del pico = 2

2.6 Procesos de ensanchamiento de banda

2.8 Cuantificacin en cromatografa

Cromatografa en fase lquida a columna abierta

Captulo 3 Cromatografa en fase lquida a columna abierta

Cromatografa en fase lquida a columna abierta

2.2 Aplicacin de la muestra

2.3 Procedimientos de elucin

Cromatografa en fase lquida a columna abierta

2.4 Elucin isocrtica y gradiente

2.5 Cromatografa de absorcin y de particin de columna

Cromatografa en fase lquida a columna abierta

2.6 Cromatografa de adsorcin

Cromatografa en fase lquida a columna abierta

2.7 Cromatografa de particin de columna

Cromatografa en fase lquida a columna abierta

La solubilidad en ambas fases esta dada por el coeficiente de particin, KD: =

Esta tcnica se usa para separa sustancias en la misma fase, o lquidos

2.8 Cromatografa en gel.

Cromatografa en fase lquida a columna abierta

Cromatografa en fase lquida a columna abierta

Aplicaciones. Desalinizacin: Largas molculas de origen biolgico son separadas de especies

2.9 Cromatografa de intercambio inico.

Cromatografa en fase lquida a columna abierta

Eliminacin de iones. Un agua completamente desionizada se obtiene pasndola a

2.10 Cromatografa covalente

Cromatografa en fase lquida a columna abierta

2.11 Conformacin de la cromatografa covalente

2.12 Fundamento de la cromatografa de afinidad