TCNICAS PARA LA CARACTERIZACIN DE LINFOCITOS Y RESPUESTA EFECTORA La caracterizacin de los linfocitos y otras clulas implicadas en respuesta inmunitaria requiere

de la separacin e identificacin de las subpoblaciones celulares separadas. -Los linfocitos pueden aislarse a partir de sangre, de mdula, rganos linfoides, epitelios o sitios donde se haya producido una reaccin inflamatoria: Los linfocitos se pueden separar de sangre perifrica tratada con heparina medinte un gradiente de Ficoll (mezcla de polmeros de carbohidratos) y metrizamida. (Figura 2.22). La centrifugacin de la sangre diluida depositada sobre el Ficoll-Hypaque permite la separacin de los eritrocitos, polimorfonucleares y granulocitos (que van al fondo) de las clulas mononucleares de sangre perifrica (PBLs) que incluyen linfocitos y algunos monocitos que quedan en la interfase. En animales de experimentacin y ocasionalmente en humanos se pueden separar linfocitos a partir de otras locacalizaciones (bazo, timo, mdula osea, ganglios linfticos, tejido linfoide asociado a mucosas). Sin embargo, normalmente el estudio de las poblaciones de linfocitos se hace en sangre perifrica. -Obtencin de poblaciones de linfocitos con especificidades homogeneas: El estudio de la funcin efectora de clulas T depende en buena medida de contar con poblaciones monoclonales de clulas T (especificidad nica). Esto se puede alcanzar de varias formas: 1-Como en el caso de los hibridomas B, clulas T especficas para un ag pueden fusionarse con lneas celulares derivadas de linfomas de clulas T para generar hbridos T. Estos hbridos son excelentes herramientas para el anlisis de la especificidad, sin embargo no se pueden utilizar para el estudio de la proliferacin de clulas T en respuesta a un ag especfico puesto que estn continuamente dividiendo. Por esta razn, el estudio de las funciones efectoras de clulas T requiere de la utilizacin de clones de clulas T. Son clones de clulas T derivadas de una sola clula con especificidad nica, a partir de cultivos heterogneos denominados lneas de clulas T, cuyo crecimiento depende de la reestimulacin por ag periodica as como de la adicin de factores de crecimiento (Figura 2.31). La obtencin de los clones de clulas T se obtiene mediante clonacin por el mtodo de dilucin lmite. Cuando se lleva a cabo esta dilucin lmite de una mezcla heterognea de clulas T, algunos pocillos no recibirn ninguna clula T especfica de un ag determinado, otras una otras 2 etc. Las clulas T en los pocillos son activadas con APCs, ag y factores de crecimiento. Despus de varios das en cultivo (necesarios para su crecimiento y diferenciacin) las clulas de cada pocillo son testadas en cuanto a su respuesta frente al ag (produccin de citoquinas , funcin efectora etc). -Marcadores de diferenciacin: Marcador: cualquier caracterstica funcional o estructural que permite definir un tipo o poblacin de clulas e incluso separarlas fsicamente de las dems. El desarrollo de anticuerpos monoclonales y tecnologas, como la citometra de flujo, que permite una deteccin rpida de las clulas reconocidas por esos anticuerpos monoclonales, ha permitido el conocimiento de un gran nmero de ags. de superficie celular que son tiles como marcadores de diferenciacin. Algunos de estos antgenos son exclusivos de

un determinado linaje celular y otros se expresan en un determinado estadio de diferenciacin y sirven para saber el estado de madurez de un determinada clula. Estas molculas han sido incluidas en un sistema de nomenclatura conocido como CD (Se conocen ms de 120 CDs diferentes). La distribucin de las subpoblaciones linfocitarias en sangre perferica humana en base a la expresin de determinados marcadores puede caracterizarse de esta forma (Figura 2.23). La herramienta ms poderosa para la caracterizacin de poblaciones celulares heterogneas es sin duda la citometra de flujo -Citometra de Flujo: Es una tcnica analtica que permite la caracterizacin multiparamtrica e individualizada de una poblacin heterognea de clulas. Permite no solo la cuantificacin de diversos parmetros de la clula, sino que lo hace en poco tiempo (en minutos se pueden analizar miles de clulas) e incluso se pueden separar fisicamente las poblaciones elegidas por el operario. Componentes bsicos de un citmmetro: (Figura) -Sistema hidralico: rodea la suspensin celular en flujo, con una vaina externa, formada por un fluido libre de partculas, que mueve la muestra a velocidad constante y controlada. Produce el enfoque hidrodinmico de la muestra: la suspensin de clulas se inyecta en un embudo en el que sea su vez se inyecta una corriente de tampn a diferente presin. La diferencia de presioenes crea un efecto hidrodinmico que hace que el tampn envuelva la suspensin de clulas y consiga que las clulas de la suspensin se alineen una a una verticalmente. -Sistema de iluminacin: La fuente de luz es una haz de laser (normalmente de argon) que incide sobre la corriente de clulas alineadas. -Sistema ptico: Enfoca la iluminacin de las partculas de la muestra de tal forma que cuando el laser no incide sobre una clula no se registra ninguna seal por el aprato. Sin embargo, cuando el laser incide sobre una clula, est prodece una dispersin de luz en todos los ngulos. -Sistema electrnico: La luz dispersada es recogida y amplificada por fotodetectores (fotomultiplicadores) situados en la misma direccin de incidencia del laser y en 90 con respecto al ngulo de incidencia. Estas seales, recogidas en forma de pulsos son registradas y almacenadas por un ordenador. Qu parmetros se pueden medir? La cantidad de luz dispersada en la misma direccin del laser y con la misma longitud de onda del haz incidente es proporcional al volumen de la clula y por tanto esta medida nos permite cuantificar el tamao de las clulas. (Figura) La luz dispersada por las clulas en un angulo de 90 (Figura) con una longitud de onda igual a la del laser de excitacin tambin es proporcional al volumen de la clula pero tambin es afectada por la topografa de la clula (rugosidades, relacin nucleo:citoplasma, homogeneidad del citoplasma-presencia y tamao de vacuolas etc). Este parmetro se denomina complejidad. Por ejemplo: linfoctios y neutrfilos con tamao similar tendran diferentes seales de light scatter (complejidad) (90). Pero adems de estos parmetros, si las clulas van marcadas con un fluorocromo (por ejemplo un anticuerpo conjugado con un fluorocromo especfico para un marcador de superficie CD de la clula), el haz de laser excita el fluocromo y se produce una emisin de fluorescencia (diferente longitud de onda a la luz incidente y dependiente del fluorocromo utilizado) que es proporcional a la cantidad de fluocromo y por tanto a la cantidad de marcador que se est investigando. Por tanto, la luz recogida

en 90 con una longitud de onda superior a la de excitacin permite la cuantificacin de las seales procedentes de los fluorocromos. Teniendo en cuenta que existe un elevado nmero de fluorocromos que se excitan en un rango de longitudes de onda parecido y que emiten en un rango muy diferente de longitudes de onda (Tabla), es posible llevar a cabo el marcaje simultaneo de diferentes marcadores celulares diferentes mediante la utilizacin de anticuerpos conjugados a diferentes fluorocromos. El citmetro, mediante una combinacin de espejos y filtros (Figura) es capaz de separar las seales de emisin de cada uno de los fluorocromos y registrar y cuantificar por tanto la presencia del marcador celular respectivo. Anlisis de los resultados: El software del equipo permite llevar a cabo un anlisis posterior de las seales registradas. Se puede llevar a cabo un anlisis mono o multiparamtrico, puesto que conocemos todos los parmetros que hemos analizado (volumen, complejidad y cada una de las fluorescencias analizadas de todas y cada una de las clulas de la poblacin). Se obtienen as diagramas mono o multiparamtricos (Ensear grficas) y en cualquier caso el equipo nos informa de la la cuantificacin de cada una de las seales as como del porcentaje exacto de la poblacin heterogennea con determinadas carctersticas (si es + o para un determinado parmetro). Pero adems, determinados tipos de citmetros de flujo nos permiten llevar a cabo la separacin fsica de las poblaciones analizadas (FACS-citmetros separadoreslo vemos ahora). -Separacin de poblaciones celulares: 1-FACS: Determinados citmetros con capacidad de separacin son capaces de cargar positiva o negativamente las gotas que contienen clulas individuales generadas en el flujo hidrodinmico con determinadas caractersticas (presencia de CD4 por ejemplo o presencia simultanea de varios parametros CD3, CD44, tamao). Ests gotas, al pasar por un condensador son separadas en funcin de la carga (hacia el polo + o -) y recogidas en placas multipocillo o frascos de cultivo. Aunque el FACS es la tcnica de eleccin para una separacin con elevado grado de pureza, cuando se trata de separar linfocitos de forma rpida y una pureza elevada se pueden utilizar mtodos mecanicos de separacin. En muchas ocasiones se utilizan estos mtodos como pasos previos al FACS. 2-Separacin magntica: Consiste en la utilizacin de bolas magnticas conjugadas con anticuerpos monoclonales que reconocen CDs especficos de las clulas a separar. Las clulas se incuban con estas bolas y se hacen pasar por una columna que contiene material que atrae las bolas magticas en presencia de un campo magntico. Las clulas que unieron el Ac (las que se quieren separar) son retenidas en la columna cuando se amplica este campo magntico mientras que aquellas que no expresan el CD no se retienen. La retirada posterior del campo magntico permite la elucin y recogida de las clulas de inters. (Figura) 3-Panning: unin de Acs especfcos de CD a superficies plsticas; incubacin de las clulas en las placas; lavado de las placas; Las clulas que expresan el CD que quiero detectar son retenidas en las placas. 4-Eliminacin de las clulas no deseadas con anticuerpo ms complemento.

Medida de la activacin de linfocitos: Medida de proliferacin celular: Los linfocitos T cuando reconocen pptidos antignicos especficos se activan y proliferan antes de diferenciarse en clulas efectoras para dar lugar a un cln de clulas con la misma especificidad. Esta respuesta mitgena es acompaada de cambios morfolgicos hacia blastos. El grado de activacin o proliferacin de linfocitos in vitro en respuesta a un estmulo se puede evaluar determinando el pocentaje de blastos en cultivo o mediante la medida de incorporacin de un anlogo de nucletido radioactivo al DNA que se sintetiza de novo. De cualquier forma el anlisis de la proliferacin de linfocitos resulta esencial para el estudio de la respuesta celular. Activacin por mitgenos policlonales: Ciertas substancias estimulan la proliferacin de linfocitos in vitro de forma similar al antgeno pero independientemente de la especicidad de su receptor. A estas substancias se les denomina mitgenos mitgenos policlonales. Al contrario que el ag, que solo induce in vitro la proliferacin de aquellos clones especficos, estos mitgenos inducen la proliferacin de una mayora de la poblacin de linfocitos. Sin embargo, existe una adecuada correlacin entre la respuesta de linfocitos de un individuo a mitgenos (medida in vitro) y su status inmunolgico. Es por ello que estos mitgenos (Tabla 2.26 Janeway) se utilizan in vitro para evaluar la capacidad de proliferacin de linfocitos de sangre perifrica. Este ensayo se utiliza en clnica para testar la capacidad de los linfocitos de un paciente con sospecha de inmunodeficiencia. Los pacientes con deficiencias inmunitarias se detectan clnicamente por historias clnicas de infecciones recurrentes. Para determinar la competencia del sistema inmune de estos individuos, se somete al paciente a una serie de pruebas (Tabla 2.34 Janeway) entre las que se incluyen la medida in vitro de proliferacin celular en respuesta a mitgenos. Activacin de linfocitos dependiente de antgeno: Adems de medir in vitro la proliferacin de linfocitos en respuesta a mitgenos, se puede evaluar de la misma forma la respuesta de linfocitos a antgenoa especficos. Este test se puede utilizar para medir respuestas mediadas por clulas T despus de una inmunizacin (Figura 2.27 de Janeway). Cmo medir la proliferacin celular? -Ensayos de incorporacin de timidina tritiada. Las clulas que proliferan sintetizan DNA. Se incorpora al medio de cultivo un anlogo de nucletido como la timidina tritiada. Este anlogo solo se incorpora en clulas que estn dividiendo puesto que se une a DNA sintetizao de novo. Midiendo la radioactividad en clulas en presencia y ausencia de seal estimuladora se puede evaluar la proliferacin en funcin de las cuentas radioactivas incorporadas (Figura). Medida de respuesta efectora: La medida de la proliferacin celular nos da una idea de la capacidad de las poblaciones de linfocitos de activarse pero no informa sobre la capacidad funcinal de las mismas. Existen sin embargo modos de medir las funciones efectoras: 1-Lisis de la clulas diana: mediada por clulas citotxicas y NKs. Clulas citotxicas CD8 son capaces de lisar clulas que presenten el pptido especfcio asociado a su molcula de MHC de clase I. Se puede medir la actividad

citotxica de una poblacin de linfocitos T. Se incuban las clulas diana con Na251CrO4. Las clulas vivas lo toman pero no lo liberan espontaneamente. Se lavan bien las clulas despus del marcaje y se incuban con las clulas citotxicas y al cabo de un tiempo se evalua la radioactividad en el sobrenadante, que ser directamente proporcional a la actividad citotxica de las clulas efectoras. Necesidad de establecer unos ratios de efectoras:dianas: (3:1/6:1/12:1) que dependen de la capacidad citotxica de la sclulas. (Figura). 2-La funcionalidad de linfocitos T CD4 implica la activacin por parte de estas clulas de macrfagos (en el caso de TH1) o de clulas B (en el caso de clulas TH2). Los efectos de las clulas T sobre macrfagos y LB estn mediados, en buena parte, por citoquinas producidas por LT cuando se reconoce especificamente el complejo MHCpptido. Estas citoquinas son diferentes y se producen en diferente cantidad dependiendo del tipo de clula efectora. Por esta razn, la funcionalidad de clulas TH se mide normalmente identificando y cuantificando las citoquinas producidas por estas poblaciones (Poner tabla de citoquinas producidas por distintas poblaciones Ts. -Deteccin y cuantificacin de citoquinas: Se puede realizar mediante ELISA o mediante RT-PCR. ELISA: se suele utilizar un ELISA en sandwich en el cual la citoquina se caracteriza por su capacidad de formar un puente entre dos anticuerpos monoclonales que reconocen diferente eptopos de la citoquina. Figura 2.29 Janeway: Se recubre la placa donde se hace el ensayo con anticuerpo anti IL-2 (se incuba la placa con el anticuerpo durante unas horas), se lava bien el exceso de Ac y se aade el fluido sobre el que se quiere cuantificar la citoquina; despus de un tiempo de incubacin se lava la placa y se aade el 2 anticuerpo acoplado a un sistema enzimtico de identificacin (mtodos colorimtricos) o acoplado a un fluorocromo (se detecta la fluorescencia emitida). RT-PCR: Una segunda opcin para cuantificar citoquinas es la valoracin de la cantidad de RNA mensajero especfico para la citoquina en cuestin. Se utiliza el mtodo de RTPCR. Este mtodo consiste en la obtencin de RNAm total a partir de las clulas que se quieren cuantificar y obtencin de cDNA total utilizando transcriptasa reversa. A partir de este cDNA total, se lleva a cabo una reaccin de PCR utilizando oligonucletidos especficos del gen de la citoquina que se quiere cuantificar. La cantidad de DNA amplificado ser proporcional a la cantidad de transcrito para esa citoquina. Explicar la reaccin de PCR (Figura) 3-Fagocitosis: Se puede evaluar la capacidad fagoctica de macrfagos o neutrfilos in vitro de varias formas. En cualquier caso, el ensayo se suele hacer en placas multipocillo, las clulas fagocticas se ponen en contacto con el microorganismo (bacterias, hongos..) durante unas ) durante un tiempo, en el medio de cultivo adecuado (p ejemplo RPMI 1640) y al cabo de ese tiempo se evala la fagocitosis: 1-Mediante tincin de Giemsa y observacin microscpica de los macrfagos. 2-Mediante citometra de flujo: se cuantificar la fagocitosis mediante la cuantificacin del burst oxidativo-aumento de la concentracin de perxido de hidrgenio y otros radicales de oxgeno. Las clulas fagocticas se tien con diacetato de diclofluorescena, que cuando entra en la clula sufre la accin de esterasas celulares. La diclorofluorescena, en presencia de perxido de hidrgeno (consecuencia del burst

oxidativo) sufre un proceso de oxidacin que lo transforma en un compuesto fluorescente. La fluorescencisa es proporcioanl al burst oxidaticvo y por tanto a la fagocitosis. Otra forma de cuantificar fagocitosis es marcar los microorganismos con compuestos fluorescentes y luego cuantificar seal de fluorescencia de los macrfagos en el citmetro.