LIGBCM

Laboratorio de Ingeniera Gentica y Biologa Celular y Molecular

UNQ Dto. de Ciencia y Tecnologa Ingeniera Gentica Aplicada

Antisense
Marcela G. Pilloff Laura Migliori P. Daniel Ghiringhelli

Unidad 7

LIGBCM
(Laboratorio de Ingeniera Gentica y Biologa Celular y Molecular)

Ruta central del metabolismo de las macromolculas DNA

Transcripcin

La desregulacin en la produccin de ciertas protenas puede derivar en un estado patolgico

RNA
Traduccin

Protenas

En 1978, Zamecnik y Stephensen demostraron que un oligonucletido de 13 residuos inhiba la replicacin de RSV

Esto dio comienzo a un nuevo esquema experimental para inhibir la expresin gnica, actualmente llamada Tecnologa antisense

Qu es un antisense ?

En este punto son Uds. los que tienen que pensar y hablar

Qu es un Antisense?
-Molculas de DNA o RNA pequeas -Diseadas para unirse a un mRNA blanco Sntesis de pequeos oligonucletidos complementarios a la secuencia del mRNA de la protena blanco Introduccin en las clulas

La metodologa antisense implica la inhibicin de la expresin de un gen especifico al nivel post-trascripcional utilizando oligonucletidos pequeos, complementarios al RNA blanco, denominados oligonucletidos especficos antisentido o ASO

Inhibicin de la sntesis de la protena blanco

Funcin bloqueo o inactivacin de la funcin de un mRNA blanco vas diferentes (bloqueo de la traduccin, bloqueo del splicing, activacin de la RNasa H, activacin de RNAsa L por 2-5A antisense, RNA interferencia ).

Aplicaciones
Estudios en cultivo de tejidos (funciones de distintas protenas en las clulas) Estudios en animales completos Supresin estratgica del splicing del mRNA para promover la expresin de una forma especfica o alterada de la protena blanco. Bloqueo de la traduccin de genes especficos tanto in vivo como in vitro (se investiga su utilizacin como agentes teraputicos en el tratamiento de infecciones virales, cncer y enfermedades inmunogenicas, adems de los estudios de rutas metablicas en diferentes sistemas).

Ventajas del uso de antisense

Para el diseo de drogas basadas en antisense basta con conocer la secuencia nucleotdica del gen blanco. Los oligonucletidos tienen una alta especificidad siendo capaces de inhibir una sola isoforma perteneciente a una familia de protenas muy cercanamente relacionadas El comportamiento farmacocintico y la toxicidad de los oligonucletidos a utilizar como drogas se basan en la qumica de los oligos y no en su secuencia de bases Con la culminacin del proyecto genoma humano se dispone de mucha informacin de secuencia.

Se ha comprobado la actividad farmacolgica de los oligonucletidos antisense en modelos animales de enfermedades humanas. En el ao 2002 haba 12 oligos en prueba en fase clnica y el nico hasta ese momento aprobado por la FDA era vitravene que sirve para el tratamiento de la retinitis causada por CMV en pacientes con SIDA. TEJIDO CARDIOVASCULAR Existen cascadas de transduccin de seales asociadas con la hipoxia, la apoptosis y la homeostasis cardiovascular en las que los oligonucletidos antisense han probado ser muy tiles para su estudio.

Antisense
Sin actividad cataltica propia Con actividad cataltica propia

Antisense propiamente dichos 2-5A antisense RNAsa H antisense RNA de interferencia

Ribozimas Hammerhead Hairpin RNAsa P

Reglas generales de la Tecnologa antisense

Estabilidad qumica Estabilidad termodinmica Especificidad Eficiencia Permeabilidad celular

Consideraciones para el diseo

- Afinidad - Especificidad por el mRNA blanco - Parcialmente resistentes a exonucleasas (3 y 5) y a endonucleasas - Las clulas y tejidos de inters deben tomar el oligonucletido en las cantidades requeridas para la actividad biolgica in vivo - No deben unirse fuertemente a protenas del suero, complemento, etc. - En general, 15-20 nt de largo

Estabilidad qumica El principal enemigo de la Tecnologa antisense son las RNasas Cmo podemos minimizarlo? En este punto son Uds. los que tienen que pensar y hablar

Estabilidad qumica

Una alternativa, introducir modificaciones qumicas en: los extremos (5 y/o 3) el esqueleto carbonado

Estabilidad qumica

Modificaciones en los extremos (5 y/o 3)

Adicin de un CAP en el extremo 5 Adicin de un poliA en el extremo 3

Estabilidad qumica
Modificaciones qumicas en el esqueleto carbonado
Modificaciones menores
Fosfotioatos Metilfosfonatos Fosfoamidatos 2 fluororribonucletidos 2 propoxyrribonucletidos (2-O-propil) 2 metoxyetilrribonucletidos (2-MOE) PNA (peptide nucleic acid) MMI (metiliminorribonucletidos) 2-5A-linked

Modificaciones mayores
Morfolino oligonucletidos

Estabilidad qumica
Fosfato Fosfotioatos Metilfosfonato Fosfoamidato

Resistentes a nucleasas Menor Tm (hay que disearlos ms largos 17, 20 ms residuos de longitud; y utilizarse a grandes concentraciones) No invaden RNA doble cadena Tienen cierta citotoxicidad

Debido a las limitaciones biolgicas de los oligos fosfotioato, se desarroll una segunda generacin de oligos modificados qumicamente.
Aumentar la actividad Reducir la toxicidad Aumentar la estabilidad y resistencia Disminuir las uniones inespecficas Aumentar la biodisponibilidad Reducir los efectos no-antisentido asociados a los oligos fosfotioato.

Adiciones al carbono 2 de la ribosa: 2- fluoribonucletidos 2- propoxiribonucletidos 2- O - metoxietilribonucletidos (2-MOE) Estas modificaciones son resistentes al clivaje mediado por Rnasa H, lo cual limitara su uso

Estabilidad qumica 2 metoxyetilrribonucletidos (2-MOE)

Resistentes a nucleasas Tienen cierta citotoxicidad Resistentes a RNasa H

Estabilidad qumica Locked nucleic acid (LNA)

Resistentes a nucleasas Tienen cierta citotoxicidad Resistentes a RNasa H

Estabilidad qumica Peptide nucleic acid (PNA)

Resistentes a nucleasas Tienen cierta citotoxicidad Resistentes a RNasa H Dificultad para ingreso en la clula

Estabilidad qumica Cyclohexene nucleic acid (CeNA)

Resistentes a nucleasas Tienen cierta citotoxicidad Resistentes a RNasa H Dificultad para ingreso en la clula

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Estabilidad qumica Morfolino fosfoamidato (MF, neugenes)

Resistentes a nucleasas Resistentes a RNasa H Neutros (menos inespecificidad) Dificultad para ingreso en la clula

Estabilidad qumica Tricyclo-DNA (TcDNA)

Resistentes a nucleasas Resistentes a RNasa H Dificultad para ingreso en la clula

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Otras modificaciones:

Metilfosfonato

Fosforoamidato

Peptide nucleic acids

Tambin: Conjugados de oligonucletidos Boranofosfato Metilen (metilimino) (MMI) Derivados 3-metilen Morfolino

Oligos MMI, PNA y con modificaciones amida son resistentes a nucleasas y proteasas y tienen mayor afinidad por el mRNA que los fosfotioatos, pero no permiten la degradacin mediada por RNAsa H. PNA y morfolino no son tomados por las clulas in vivo.

Oligonucletidos quimricos o gapped

Es una estrategia para superar los problemas y limitaciones asociados con una modificacin qumica en particular.

MOE + PS

Por los 2 tomos de O, la cadena MOE no puede rotar libremente; esto produce un efecto estrico evitando que las nucleasas cliven el enlace fosfodiester. Adems se obtiene una afinidad aumentada por el mRNA target + La modificacin fosfotioato permite la degradacin del target por Rnasa H + Tiene alta estabilidad metablica

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Obviamente, todo lo anterior se refiere a antisenses sintticos

Para los antisenses polimerizados in vivo las nicas protecciones posibles son las modificaciones en 5 y 3

Estabilidad termodinmica
Usualmente, los oligonucletidos a emplear tienen de 15 a 30 residuos de longitud La Tm debe ser tal que favorezca la formacin y el mantenimiento del hbrido antisense:blanco (debe ser mayor cuando se pretende un impedimento estrico y menor cuando se pretende el reciclado)

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Especificidad y Eficiencia
Deben comprobarse experimentalmente El efecto citotxico debe ser nulo o mnimo Dependiendo de la patologa puede ser til que la eficiencia no sea la mxima

Permeabilidad celular
Como oligonucletidos libres, algunos de los modificados qumicamente tienen problemas Dependen del sistema de delivery Se pueden utilizar distintos sistemas para el delivery de los sintticos; o los diferentes sistemas plasmdicos o virales para la generacin in vivo

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Antisense propiamente dichos

Bloquean la traduccin mediante impedimento estrico Generalmente dirigidos a la regin leader 5 del mRNA

Antisense propiamente dichos

Bloqueo de la traduccin
El antisense unido al extremo 5-cap del mRNA puede bloquear estricamente la traduccin
La molcula antisense se une al extremo 5 Se bloquea la entrada del mRNA al ribosoma, evitando la sntesis de proteica. C2 u otros oligos que se unan al mRNA con alta afinidad (no hay reduccin del mRNA blanco)

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Antisense propiamente dichos

Splicing alternativo
El antisense unido a sitios de splicing puede alterar el splicing de un pre-mRNA blanco, va unin a sitios aceptores o donores de splicing
Si ocurre splicing alternativo, se selecciona una forma particular de la protena blanco. Unin a sitios de splicing aberrantes expresin proteica) Restauracin del splicing apropiado (incremento de la

El oligonucletido debe entrar al ncleo y unirse al pre-mRNA Oligonucletidos que no favorezcan degradacin por RNAsaH

La ruta antiviral inducida por el interfern es un mecanismo propio de las clulas de mamferos y es la plataforma en la que estn basados muchos de los usos teraputico de las tcnicas antisense.

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2-5A antisense
Las bases moleculares: Cuando una clula animal es infectada por un sistema viral con genoma de RNA, en algn momento del ciclo viral existe RNA de doble cadena La presencia de RNA de doble cadena activa la respuesta mediada por interfern y la 2-5A sintetasa Cuando los niveles de 2-5A son suficientemente altos, se activa una RNasa latente, la RNasa L, que degrada los RNAs celulares

2-5A antisense
El dsRNA se acumula en el citoplasma de las clulas infectadas por virus. Estos dsRNA pueden activar a las 2-5 A sintetasas, una familia de enzimas cuya expresin es inducida transcripcionalmente luego de la exposicin de las clulas al interfern. Una vez activadas, las 2-5 A sintetasas catalizan la formacin de oligmeros de 25 A utilizando ATP. La nica funcin conocida que adjudica al 2-5 A es la activacin RNAsa L latente, lo que resulta degradacin generalizada del intracelular. se le de la en la RNA

Rol del 2-5 A en la respuesta antiviral.

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2-5A antisense

Accin de la quimera 2-5A-ASO sobre el mRNA target

La molcula 2-5A quimrica est compuesta por un componente especfico antisense y una unidad del activador 2-5A. La porcin antisense est dirigida contra una secuencia complementaria del mRNA target, mientras que el componente 2-5A recluta y activa a la RNAsa L. Una vez activada, la RNasa L degrada el mRNA target, siendo liberado el complejo antisense-2-5 A que podr unirse a otras molculas de mRNA target.

Estructura de una quimera 2-5 A antisense

El fosfato 5 es requerido para la activacin de la RNasa L y el fsfotioato para la inhibicin del clivaje fosfatdico.

El componente 2-5 A se une o recluta y activa a la RNasa L.

La porcin antisense se une a la secuencia del RNA complementario intracelular por tanto orientando a la RNAsa L activada para clivar el mRNA target . Este componente de la quimera tiene unos 15-20 nucletidos.

El nucletido invertido en el 3 inhibe la accin de las 3-exonucleasas aportando una estabilidad adicional.

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2-5A antisense
5 (2p5A)3-Bu2-N(19-30) 3 Ejemplo: 5 (2p5A)3-Bu2-GCGCGGGGAGCAAAAGCAC 3 1. No requieren de la activacin de la 2-5A sintetasa 2. Aprovechan la respuesta cataltica mediada por la Rnasa L. 3. El modelo 2- 5 A antisense constituye un medio efectivo para la degradacin selectiva de los RNAs celulares o virales. 4. La degradacin del blanco es altamente especfica y amplifica la potencia del antisense unas 20 veces.

RNAsa H antisense

Las bases moleculares: La RNasa H es especfica de cidos nucleicos doble cadena hbridos RNA:DNA (cliva el RNA) En este caso, los antisense deben ser de DNA Pueden utilizarse oligonucletidos de DNA y apelar a la activacin de la RNasa H endgena, o puede conjugarse covalentemente la RNasa H al oligonucletido de DNA

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RNAsa H antisense
Degradacin mediada por RNAsa H Degradaci
El mRNA blanco unido al antisense puede ser clivado por una RNAsaH permitiendo la degradacin del mensajero
Esqueleto carbonado: fosfotioato Los oligonuclotidos pueden ser reciclados La RNAsa H cliva la cadena de RNA de un hbrido DNA:RNA, el producto contiene extremos 5 y 3 expuestos permitiendo la degradacin por exonucleasas

DISEO:

1. 2. 3.

Seleccin de la secuencia blanco Seleccin del tipo de modificacin qumica Ingreso del oligo a las clulas o tejidos deseados

1- Seleccin de la secuencia blanco: Selecci

Se sintetizan y se evalan aprox. 15 a 20 oligos que estn dirigidos a distintas secuencias a lo largo de todo el gen blanco.
GEN X

CONSIDERACIONES: Las secuencias deben tener alta Tm sin regiones autocomplementarias. Debe evitarse el uso de palndromos y dinucletidos GC para evitar potenciales efectos sobre el sistema inmune

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2- Eleccin del tipo de modificacin qumica: Elecci modificaci qu

Una vez determinada la modificacin qumica oligonucletido, se debe evaluar su actividad. 1) Estudios para ver dosis-respuesta 2) Determinar si el descenso en la expresin ocurre slo para la protena blanco 3) Usar oligonucletidos mismatch como controles negativos (no debera verse afectada la expresin de la protena blanco) que tendr el

3- Ingreso a las clulas y retencin: c retenci

En cultivo se utilizan lpidos catinicos como Lipofectin que transportan al oligo hasta el ncleo donde ejercer su efecto. Se ha observado un 80 % de reduccin de la expresin y 24-48 hs de duracin. En animales a partir de la inyeccin en el torrente sanguneo, los oligos se distribuyen rpidamente a varios rganos como hgado, rion, mdula sea, msculo esqueltico y piel.

identificaci mol Controles e identificacin de una molcula antisense til identificacin molcula til
Ejemplo Inhibicin de la expresin de una fosfatasa humana

Fosfatasas (Ppasas) Poca especificidad de sustrato in vitro Familia de ~20 protenas relacionadas estructuralmente clasificadas en 4 grupos ( PP1, PP2A, PP2B y PP2C). PP1 : en humanos, 4 isoformas (PP1, PP1, PP11, y PP1 2). Comparten 89% de identidad a nivel de secuencia aminoacdica y son codificadas por 3 genes distintos (PP11 y PP12 son producidas por splicing alternativo a partir del mismo transcripto primario) Inhibidores: inhiben una familia entera, por lo que no se puede distinguir la funcin de una isoforma de PP1.

Objetivo Estudiar la funcin de PP11 utilizando oligonucletidos antisentido de 2da generacin, va degradacin del mRNA con RNAsaH

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Oligonucletidos utilizados:
Tamao de 20 pb Composicin: 8 residuos centrales de fosfotioato (oligodeoxy gap) flanqueados por 6 residuos 2-O-(2metoxy) en ambos extremos.

Identificacin de oligos activos

Capacidad de suprimir la expresin de mRNA de PP1 en clulas A549 (por Northern Blot) Se ensayaron diferentes tipos de oligonucletidos (unin en distintas zonas)
Clulas al ~70% de confluencia se incubaron con medio DMEM que contena los oligonucletidos + Lipofectin (15 ug/ml DOTMA/DOPE) Luego de 24 hs, se lisaron las clulas y se realiz el Northern blot para determinar los niveles de mRNA de PP11 usando una sonda de cDNA especfica.

Posicionamiento relativo de las zonas predichas de hibridacin dentro del mRNA de PP11

Niveles de mRNA de PP11 del anlisis de Northern blot expresados

Northern blot. Identificacin de los nucletidos antisense que inhiben la expresin de PP11.

Inhibicin de PP11 por ISIS 14435.

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Cuantificacin de los niveles de mRNA de PP11 luego de la normalizacin con GADPH luego del tratamiento con ISIS 14435 o 14439

Anlisis por Western blot de los niveles de protena PP11

Cuantificacin de los niveles de protena PP11 luego del tratamiento con concentraciones crecientes de ISIS 14435

Anlisis por Western blot de los niveles de protena PP11 luego del tratamiento con ISIS 14435

Evaluacin de la especificidad de los oligonucletidos para el mRNA de PP11

ISIS 14435 ISIS 14439

Northern Blot para verificar que ISIS 14435 no afectaba la expresin de enzimas relacionadas a PP11 o de enzimas no relacionadas como GAPDH

RPA (RNAse Protection assay) para ver la cantidad de mRNA de cada una de las isoformas

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Uso como agentes teraputicos

Oligont de fosfotioato y su uso para enfermedades de la piel. Ventajas: estables contra nucleasas, pueden ser incorporados a muchos tipos celulares, fcilmente hibridables con el mRNA blanco. Ej reversin de hiperproliferacin epidermal en soriasis. Los mismos tambin aumentan la supervivencia de ratones infectados con el virus de la gripe A por administracin intravenosa (genes PB2 y PA) Phenoxazine contra RNA de SV40. Caractersticas: actividad dosisdependiente, secuencia-especfica, blanco-selectiva. PNAs como herramienta de inhibicin de expresin gnica (episoma y cromosoma) en parsitos de importancia mdica ej Entamoeba histolytica, agente causal de amebiosis (afecta a 500 millones de personas) 5-aza-2-deoxicitidina como agentes inhibidores de transferasas metlicas, anlisis de silenciamiento por metilacin de la isla CpG y supresin de expresin de oncogenes.

Algunas aplicaciones teraputicas:

1) Terapia contra el virus del sincicio respiratorio (RSV), causa principal de enfermedades en el tracto respiratorio en infantes, paciente inmunocomprometidos y ancianos, particularmente los institucionalizados. Tratamiento del cncer gstrico. Target: survivin, un miembro nuevo de la familia de inhibidores de apoptosis (IAPs), expresado durante el desarrollo embrionario humano y en la mayora de los tejidos tumorales. Tratamiento de la leucemia mieloide crnica (CML). Target: genes bcr/abl (genes fusionados que codifican para una tirosn kinasa implicada en el desarrollo de CML) Tratamiento de los gliomas malignos. Target: componente RNA de la telomerasa, una enzima ribonucleproteicaexpresada en, aproximadamente, el 90 % de los tumores malignos

2)

3)

4)

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En clnica, los oligos modificados han pasado la fase I/II, y en algunos casos, ensayos de la fase III. Un obstculo significativo para el desarrollo ms intensivo de estas terapias es que si bien se obtiene un efecto antisense determinado, el mecanismo molecular es habitualmente desconocido o especulativo

Riiiiiiiiing!

Bueno, vamos a hacer un intervalo

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Ribozimas
cidos nucleicos capaces de clivar un mRNA especifico Hay dos clases de ribozimas: grandes y pequeas que difieren en tamao y mecanismos de accin.

Ribozimas pequeas
Tienen un tamao de 30 a 150 nucletidos

A)Hammerhead B)Hairpin C)Hepatitis Delta Virus D)Varkud Satellite E) DNA zymas

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dominio cataltico 15 nt

dominio cataltico 50 nt

dominio cataltico 154 nt

dominio cataltico 15 nt

Seleccin del blanco

Hay pocos sitios accesibles porque el RNA tiene estructura secundaria compleja Los mejores sitios blancos son aquellos con estructura desestructurada, simple cadena y con alto contenido de G+C Para seleccionar el mejor blanco se usan programas computacionales mFold Program y ensayos in vitro con bibliotecas de ODN (oligodeoxinuletidos) y de ribozimas

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Estabilidad
Se modifica el 2`-OH de una ribosa y se sustituye el oxigeno por ejemplo con azufre que da el anlogo de base fosfotioato

Introduccin a las clulas

Liposomas catinicos Plasmidos Sistemas Virales Ribozimas asociadas a anticuerpos, ligandos o pptidos carrier

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Como se optimizan
1. PH 2. Correcta seleccin del sitio blanco 3. Concentracin de cationes divalentes 4. Temperatura

Algunas aplicaciones Infecciones virales Cncer (se dirigen contra oncogenes) Enfermedades cardiovasculares

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Ribozimas: tipo hammerhead

Fueron las primeras enzimas no proteicas Son las ribozimas ms pequeas (~40 residuos) Corresponden a sistemas virales Requieren cofactores (Mg+2) El clivaje es por ataque nucleoflico Blanco descripto: GUX (X= A, C, U no G)->intramolec. NUX (X= A, C, U no G)->intermolec.

Ribozimas: tipo hammerhead

Ribozima original

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Ribozimas: tipo hammerhead

5 3 Brazo 2 Brazo 3

Sitio de clivaje

Core cataltico
Brazo1 5 3

Ribozima modificada:
se abre el loop 3 los residuos recuadrados deben ser ribonucletidos el blanco es de secuencia variable (debe tener NUX)

Ribozimas: tipo hammerhead

Diseo de la ribozima:
seleccionar el blanco y obtener la secuencia de los brazos

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Ribozimas: tipo hammerhead

Cmo comprobamos que la ribozima es activa in vitro? Cmo comprobamos que la ribozima es activa en la clula blanco? Cmo comprobamos que la ribozima es especfica? Cmo comprobamos la eficiencia de la ribozima?

En este punto son Uds. los que tienen que pensar y hablar
(tienen 30 minutos para pensar y discutir)

Ribozimas: tipo hammerhead

El uso de ribozimas implica el conocimiento de secuencia (para el resto de los antisense tambin es una condicin) Esta es la situacin ideal o es una condicin sine qua non?

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Ribozimas: tipo hammerhead

Estamos en la siguiente situacin: Se produce una epidemia con alta tasa de mortalidad El agente etiolgico es un virus nuevo (emergente) con genoma de RNA simple cadena No se conoce nada de secuencia y hay que frenar la incidencia en la poblacin lo antes posible En este contexto, es posible obtener alguna de las mejores ribozimas para usar en terapia antiviral?

En este punto son Uds. los que tienen que pensar y hablar
(tienen 30 minutos para pensar y discutir)

Ribozimas grandes
El tamao es mayor 100 hasta 3000 nucletidos Generan productos con 3OH y 5fosfato libre Grupo I de intrones RNAsa P (300-400 nt)+ prot. 14kDa

Ataque nucleofilico de un 3OH de una guanosina al 5 de splicing

3OH libre de un exn ataque nucleofilico al 5 de splicing Ligan ambos extremos y se libera el intrn

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Para cualquiera de los casos anteriores

Cmo hacemos para producir los antisense in vitro? Cmo hacemos para producir los antisense in vivo? Cmo hacemos para producir los antisense en animal completo?

En este punto son Uds. los que tienen que pensar y hablar
(tienen 20 minutos para pensar y discutir)

Bueno, por hoy se acab, ahora espero las preguntas

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