MICROBIOLOGA

PARA BIOQUMICOS

GUIA DE TRABAJOS PRCTICOS GUA N 1

Observacin de clulas vivas y teidas Cultivo de microorganismos Separacin de colonias en placa Tincin de Gram Movimiento bacteriano en medio slido
Modificado de la gua del curso de Microbiologa para la carrera de Bioqumica dictado por la profesora Marcela Wilkens.

REGLAS GENERALES DEL TRABAJO PRACTICO

El alumno llevar obligatoriamente un delantal blanco, fundamentalmente para proteger su ropa del material infeccioso y de reactivos de tincin. Registre cuidadosamente sus observaciones a medida que las realice. REGLAS DEL LABORATORIO Antes de comenzar y despus de terminar, limpie la superficie del mesn con una solucin de etanol 70%. Mantenga su mesn libre de materiales no esenciales en el momento y djelo ordenado al terminar. Ponga el material slido sucio en bolsas de plstico o en un envase de vidrio, especialmente el material contaminado con microorganismos. Debido a que muchos de los microorganismos con los cuales Ud. trabajar son potencialmente patgenos, Ud. debe trabajar usando tcnicas aspticas en el manejo y transferencia del material. Si se derrama algn lquido contaminado, limpie con cloro la superficie. Evite llevarse las manos a los ojos, boca o mojar con la lengua.

Por razones de seguridad de cada uno, como asimismo para lograr un mejor resultado en los diferentes experimentos, est PROHIBIDO fumar, comer o beber en la sala de trabajos prcticos.

El mesn debe mantenerse limpio y ordenado. Los microscopios deben dejarse limpios. Avise inmediatamente cualquier accidente, tales como cortaduras, quemaduras o derrames al ayudante o profesor.

Antes de cada trabajo prctico, lea la gua correspondiente y planifique el trabajo que deber realizar cuidadosamente. Averige cmo se realizan y qu principios bsicos estn detrs. Se iniciar cada trabajo prctico con una pequea explicacin por parte del ayudante o profesor. Consulte sus dudas.

EL MICROSCOPIO

La microbiologa es una ciencia que estudia los organismos vivos demasiado pequeos para ser observados mediante el ojo desnudo. Revise sus apuntes de laboratorios de Biologa sobre los fundamentos de microscopa y el manejo de ste. Los conceptos que son importantes que conozca son: qu es un microscopio simple y uno compuesto magnificacin que se logra del objeto observado objetivo en seco y objetivo de inmersin (con aceite) ajustes macro y micro microscopio de fase microscopa de contraste de fase brillante microscopa de contraste de fase oscura microscopa electrnica, microscopa electrnica de transmisin, microscopa de barrido

PRECAUCIONES
Para mantener el microscopio limpio: Nunca toque los lentes. Si los lentes se ensucian, lmpielos con papel suave. Nunca deje un portaobjeto en el microscopio si no lo est usando. Siempre remueva el aceite de inmersin del objetivo luego de su uso. Si el lente se seca con aceite de inmersin, lmpielo con xilol. Cuidado: demasiado xilol disuelve el pegamento que une los lentes. Cuando el microscopio est desocupado, mantenga la luz apagada.

PAGINAS RELACIONADAS CON MICROSCOPA

Microscopa confocal y de fluorescencia http://www.itg.uiuc.edu/technology/atlas/ Curiosas microfotografas con microscopa de barrido y posibilidad de manejar virtualmente uno de estos microscopios http://www.denniskunkel.com/ Completa coleccin de tcnicas de tincin, http://www.nottingham.ac.uk/pathology/default.html Manual de tcnicas de preparacin de muestras y tincin http://bris.ac.uk/pathandmicro/cpl/lablinks.html Una de las mejores pginas sobre microscopa, con amplios textos sobre los diversos tipos de microscopios y su funcionamiento. Numerosos tutoriales en java sobre el manejo de distintos microscopios. Se puede descargar un completo manual sobre microscopa en formato Acrobat. http://micro.magnet.fsu.edu/primer/index.html Descripcin y funcionamiento del microscopio electrnico de barrido y galera de imgenes http://www.mos.org/sln/sem/ Fundamentos del microscopio electrnico de barrido, descripcin del funcionamiento con numerosos esquemas. Galera de imgenes http://www.mse.iastate.edu/microscopy/home.html Descripcin y fundamento de los http://www.unl.edu/CMRAcfem/em.htm microscopios electrnicos de transmisin y barrido bsicos con sus correspondientes protocolos

Completo tutorial de digitalizacin de imgenes, donde se explican los http://www.library.cornell.edu/preservation/tutorial-spanish/contents.html Muestra imgenes desde la galaxia hasta los quarks. http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/scienceopticsu/powersof10/

trminos

CONCEPTOS CLAVES Estructura bacteriana Gram positivo y Gram negativo - Tincin Movimiento bacteriano Colonia clon Separacin de colonias Medio de cultivo lquido y slido

OBSERVACIN DE BACTERIAS VIVAS

Las bacterias vivas de muchas especies son altamente mtiles. Las bacterias observadas directamente al microscopio son difciles de ver por el bajo contraste entre las bacterias y el ambiente que las rodea.

PROTOCOLO
1.-

Preparacin de una muestra lquida de bacterias.

Prepare una muestra de los cultivos lquidos de Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus y Enterobacter cloacae desde medio lquido poniendo un loop del asa en un portaobjetos de cada uno de los cultivos. Cubra esta gota con un cubreobjetos cuidadosamente sin presionar. Observe la motilidad usando el objetivo de inmersin, teniendo cuidado de no aplastar el cubreobjeto.

2.-

Preparacin de una gota colgante .

(a) Ponga stick fix (pegamento) a dos trozos pequeos de fsforo y pguelos en un portaobjeto a una distancia menor al de un cubreobjeto. (b) Usando el asa, transfiera aspticamente una gota de cultivo al centro de un cubreobjetos. (c) Ponga en forma invertida (con la gota abajo) el cubreobjeto sobre los trozos de fsforo. Presione suavemente para pegar el cubreobjeto con la vaselina. (d) Para examinar la gota colgante, primero localice una orilla de la gota usando el objetivo de menor aumento y disminuya drsticamente la intensidad de la luz. Cambie al objetivo de inmersin (poner aceite de inmersin) y re-enfoque la orilla de la gota. La bacteria dentro de la gota estar aproximadamente en foco y podr observar el movimiento por el contraste entre la bacteria y el medio en que est suspendida. Se debe diferenciar el movimiento bacteriano del movimiento Browniano.

Suspensin bacteriana
Fsforo Cubreobjeto

Portaobjeto

(b)

RESULTADOS OBSERVADOS
MOVIMIENTO BACTERIAS Pseudomonas aeruginosa Bacillus cereus Enterobacter cloacae Protocolo 1 Protocolo 2

CUESTIONARIO
1. Por qu se debe primero enfocar la orilla de la gota y no directamente la bacteria suspendida en la gota? 2. No todos los microorganismos mtiles poseen flagelos. Qu otros tipos de movimientos puede describir? 3. Qu es el movimiento Browniano? .......................................................................................................................... .......................................................................................................................... .......................................................................................................................... .......................................................................................................................... .......................................................................................................................... .......................................................................................................................... .......................................................................................................................... ..........................................................................................................................

OBSERVACIN DE CLULAS TEIDAS

Los objetivos de bajo aumento generalmente no son usados para estudiar las bacterias, debido a su pequeo tamao. Ellas deben ser observadas mediante el objetivo de inmersin. Esta actividad le dar experiencia para el uso del objetivo 100X y adems podr realizar un estudio comparativo de la morfologa y agrupacin de las bacterias teidas. Adems, podr comparar el tamao de una bacteria con el de una levadura (eucarionte).

PROTOCOLO
Examine las siguientes preparaciones: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Streptococcus pyogenes Candida albicans Salmonella typhi Escherichia coli Mezcla de Candida albicans con Bacillus subtilis Mezcla de Escherichia coli con Staphylococcus aureus.

Observe los tamaos y las formas que predominan y si puede observar cualquier estructura. Dibuje cada una de las preparaciones de un tamao lo suficientemente grande. Por ejemplo, un coco dibjelo con un pequeo crculo o elipsoide, no como un punto.

CUESTIONARIO
1.- Cmo se vera una preparacin teida bajo el objetivo de inmersin sin el aceite entre la preparacin y el lente objetivo? Por qu? Si no sabe, tome una preparacin y obsrvela en esas condiciones. 2.- Qu diferencias estructurales pudo observar en esta actividad? Pudo detectar la presencia o ausencia de estructuras en las clulas bacterianas similares a otras clulas? Por qu? ........................................................................................................................... ........................................................................................................................... ........................................................................................................................... ........................................................................................................................... ........................................................................................................................... ........................................................................................................................... ........................................................................................................................... ...........................................................................................................................

EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS
En la naturaleza los microorganismos existen como complejas poblaciones de muchos tipos diferentes. Nuestro conocimiento de la microbiologa se desarroll gracias al estudio de especies aisladas, creciendo en ambientes libres de contaminacin de otras formas de vida. Como todas las formas de vida, los microorganismos requieren de los nutrientes adecuados para crecer como tambin de un ambiente favorable. El medio de cultivo debe contener aquellos nutrientes esenciales para el crecimiento y este medio debe estar adems en las condiciones adecuadas para el crecimiento, esto es, factores como pH, presin osmtica, oxgeno, etc. Los medios de cultivo pueden ser de una o dos formas: lquido o slido. Ya que la mayora de los estudios en el laboratorio se realizan con cultivos puros, esto es, con un nico microorganismo, se deber estar capacitado para esterilizar un medio de cultivo y mantenerlo en condiciones estriles, libre de otras formas vivas. Al mismo tiempo, cuando se inocule el medio con el microorganismo en estudio, esto se deber hacer en condiciones libres de contaminacin. Esto ltimo se conoce como tcnica asptica. Debido a que los medios cuando son preparados contienen microorganismos provenientes de los ingredientes y de los utensilios, tiene que ser esterilizado, esto es, tratado con temperatura a presin u otros mtodos para destruir las clulas presentes. Los recipientes en donde se encuentra el medio de cultivo (tubo, matraz, frasco) debern ser tapados con tapones de gasa o tapas roscas sueltas, de manera de impedir la entrada de los microorganismos a los medios de cultivo, pero permite el intercambio gaseoso. Inoculacin.Para crecer un cultivo bacteriano en un medio estril, un nmero de clulas el inculo- debe ser transferido (inoculado) desde otro medio con las precauciones necesarias para mantener la pureza del cultivo. Este procedimiento se realiza con un asa microbiolgica (asa de nicrn), la que debe ser calentada a la llama hasta enrojecimiento y luego enfriarla antes de ponerla en contacto con el cultivo bacteriano. Con esta asa es posible realizar inoculaciones desde un cultivo bacteriano en medio lquido o desde colonias en un medio slido al medio estril. La cantidad de bacterias que es transferida es lo suficientemente grande en el asa que no es necesario agitarla en el medio lquido estril. En el procedimiento de inoculacin es muy importante calentar el asa hasta enrojecimiento, tanto antes como despus de la transferencia, lo que destruye cualquier forma de vida en la superficie del asa. Para ello debe sostener el asa hacia abajo en la llama, calentando todo el alambre y parte del portaasa (ver figura).

Durante la transferencia, sostenga el tubo con la mano izquierda y tome el tapn con el dedo meique de la mano derecha o entre los dedos (no es fcil al comienzo, pero se logra con la prctica). Mantenga el tubo lo ms horizontal posible durante la inoculacin, pero por el mnimo tiempo posible. Las bocas de los tubos tanto del que se toma el inculo como del que se inocula, debern ser flameadas a la llama antes y despus. La llama crea una corriente de conveccin disminuyendo la probabilidad de contaminacin (ver fugura).

Como es de gran importancia el trabajo con cultivos puros, es necesario que estas tcnicas aspticas sean dominadas. Despus de la inoculacin, el cultivo bacteriano deber ser incubado en un ambiente adecuado para el crecimiento. Crecimiento significa el desarrollo de una poblacin de clulas a partir de una o pocas clulas. Esta masa de clulas hijas se hace visible al ojo desnudo por la turbidez en un medio lquido, o por una poblacin aislada una colonia- en un medio slido. La apariencia del crecimiento bacteriano es una forma de diferenciacin entre las especies microbianas. Una forma de preparar un medio slido de cultivo es agregando un agente solidificante a un medio de cultivo, el que en fro se solidifica. El ms comn es el agar, sustancia obtenida de un alga marina y que se comercializa en forma de polvo seco. Qumicamente, el agar es un galactano, un carbohidrato complejo compuesto por molculas de galactosa y no es metabolizado (degradado) por la mayora de las bacterias. Se usa generalmente a una concentracin de 1,5%, cuando se siembra sobre su superficie. Otros agentes utilizados para solidificar los medios de cultivo son: la gelatina a una concentracin de 12 15%, que es lquida a temperatura sobre 25 C y que es hidrolizada por algunas bacterias; la slica gel, una sustancia usada para el cultivo de auttrofos, para los cuales la materia orgnica debe estar ausente. Las siguientes actividades tienen como objetivo familiarizarse con el material usado en microbiologa, con los diferenes tipos de medios de cultivo y con las tcnicas aspticas en el aislamiento y transferencia de cultivos puros.

Cultivo bacteriano
Una forma simple de manipular bacterias es crecindolas en un tubo de ensayo con medio de cultivo. Existen numerosas recetas de medios de cultivo y su seleccin depender de la bacteria que quiera crecer. El crecimiento podr ser observado de diferentes maneras: 1. Turbidez Esta condicin es enturbamiento, ms o menos denso. 2. Formacin de una pelcula Una pequea masa de clulas flotan en la parte superior del cultivo. 3. Sedimento Un depsito de clulas decantan en el fondo del medio de cultivo, pero suben cuando se agita homogenizndose. 4. Mucoide Si las clulas no se separan cuando suben desde el fondo.

PROTOCOLO
I. Tome 4 tubos con medio nutritivo. 1. Marque un tubo como control y djelo sin inocular. No remueva la tapa o tapn. 2. Remueva la tapa o tapn de otro tubo y agrguele una pequea cantidad de suciedad de un material. Vuelva a poner el tapn. 3. Despus de flamear el asa y la boca de un tercer tubo con medio de cultivo, inoclelo con un cultivo puro de Escherichia coli. Repita el procedimiento con un cuarto tubo con Bacillus subtilis. 4. Incube los 4 tubos a 30 C hasta el otro prctico.

OBSERVACION
Examine si hubo crecimiento en los tubos, sin agitar, anotando su observacin. Observe si se form una pelcula o sedimento o tiene un aspecto mucoide.

CUESTIONARIO 1. Cundo es necesario aplicar la tcnica asptica para inocular suciedad a un tubo con caldo nutritivo? 2. Por qu algunos microorganismos crecen en un tipo de pelcula caracterstica? Qu factores ambientales afectaran la formacin de la pelcula? .......................................................................................................................... .......................................................................................................................... .......................................................................................................................... ......................................................................................................................... ......................................................................................................................... .......................................................................................................................... .........................................................................................................................

TUBOS CON AGAR

Agar Tendido
Un agar tendido corresponde a un tubo de ensayo que contiene un medio slido puesto en un ngulo durante el enfriamiento. De esta forma es ms fcil inocular en su superficie. Este tipo de agar es conveniente para el cultivo de microorganismos aerbicos y anaerobios facultativos, como tambin para observar la formacin de pigmentos. Tambin es til para mantener cultivos stock.

Agar en pinchadura
El agar en pinchadura corresponde a un tubo de ensayo que contiene un medio slido fundido y que se enfra en posicin vertical. La bacteria se inocula pinchando el centro del agar hasta el fondo.

PROTOCOLO
1. Funda el agar nutritivo de 3 tubos en un bao mara. Enfrelos en posicin inclinada. 2. Cuando el medio est fro y slido, inocule la superficie con Escherichia coli, usando un asa. Mueva el asa sobre el agar desde el fondo hacia arriba, teniendo cuidado de no enterrar el asa. Inocule un segundo tubo con Pseudomonas aeruginosa. Use un tercer tubo como control sin inocular. 3. Incube los 3 tubos a 37 C hasta el siguiente prctico.

OBSERVACIN
Examine el crecimiento en la superficie. Observe las diferencias en el crecimiento de E. coli crecidas en medio slido en relacin a cuando se crece en medio lquido (prctico anterior).

CUESTIONARIO
1. 2. 3. 4. Por qu es importante no enterrar el asa de inoculacin en el agar? Cundo ser necesario enterrar el asa hasta el fondo? Por qu las bacterias (especialmente las que son mtiles) no crecen a travs del agar en un medio que contiene 97% de agua? Cuando se usa agar tendido para estudiar las caractersticas de cultivo, es preferible utilizar un asa en punta, ms que un asa con loop para inocular. Por qu?

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TECNICAS DE CULTIVO PURO

Al agregar una sustancia solidificante a un medio lquido las clulas bacterianas quedan atrapadas en forma individual en un lugar. Producirn una colonia fija que crece como una masa visible. Si las clulas originales quedan atrapadas lo suficientemente separadas, cada clula viable se desarrollar en una colonia separada y distinta. Este hecho es de gran importancia, porque permite trabajar con cultivos puros obtenidos a partir de una colonia, ventaja que no ofrece el cultivo lquido. Para la separacion de colonias a partir de un cultivo liquido, primero las clulas son separadas por dilucin y fijadas en un medio slido para formar colonias, las cuales se pueden despus aislar en tubos con medio de cultivo en forma separada. Posteriormente se realizan diluciones. Si stas se miden cuidadosamente y se deposita en el medio slido un volumen conocido, es posible cuantificar el nmero de bacterias viables presentes en la muestra inicial. Las colonias varan en tamao, forma, textura y color entre los diferentes microorganismos; por lo tanto, la apariencia de la colonia es una pista valiosa en la identificacin de un cultivo y principalmente en la confirmacin de su pureza.

SEPARACION DE COLONIAS EN PLACA

Se describe dos mtodos para separar colonias mediante siembra en placa (ver figuras). Se aplica el cultivo de bacterias sobre la superficie del agar y se distribuye sobre todo el agar con el asa en una lnea.

El objetivo inmediato es producir colonias de bacterias lo suficientemente separadas desde una suspensin muy concentrada de bacterias. Al comienzo de la inoculacin habr una gran concentracin de bacterias que estarn muy juntas, pero a medida que la lnea de siembra contina, cada vez menos bacterias quedarn en el asa. Estas ltimas formarn colonias lo suficientemente separadas. En ambas tcnicas se comienza con una gota de cultivo en un borde de la placa. En la primera tcnica, se flamea el asa y se enfra apoyndola en la tapa de la placa o en una zona del agar del borde. Con el asa as esterilizada, se toma el cultivo bacteriano y se inicia la siembra en lnea desde un borde de la placa y realizando lneas de un extremo a otro con lneas paralelas hacia Ud. y cuidando de no pasar por la estra anterior. Una vez que llegue a la mitad de la placa, grela en 180 y contine con las lneas alejndose de Ud. La segunda tcnica, se inicia con una gota y se realizan 2 3 estras paralelas en un borde de la placa. Se flamea el asa, se enfra y se realizan 2 3 estras en un ngulo recto con las primeras lneas y pasando una vez por las estras anteriores. Repita 1 2 veces ms, y en la ltima cubra completamente la placa. Es importante flamear entre cada ngulo el asa para eliminar el exceso de bacterias.

COLONIAS SEPARADAS

PROTOCOLO
1.- Se le entregar 4 tubos con m/m 15 mL de agar nutritivo y un tubo con agar MacConkey. En un bao mara funda el agar y una vez fundido, vierta su contenido en una placa de Petri estril. Espere a que est solidificado (aljelo del mechero con cuidado). 2.- Tome con el asa la mezcla de cultivo bacteriano (Escherichia coli + Staphylococcus aureus) entregado por los ayudantes y realice la separacin de colonias en dos de las placas de agar nutritivo mediante las dos tcnicas descritas. Aydese marcando en el vidrio de la placa la orientacin de la siembra. 3.- Ahora que conoce el principio del plaqueo en estras, disee su propia tcnica en la tercera placa de agar nutritivo. 4.- La cuarta placa la puede ocupar para experimentar lo que Ud. desee, pero no repita lo de sus compaeros. Ejemplos, sembrar en un tercio o la placa completa una muestra de saliva o suelo o agua del WC, o pasar el pelo, etc, y luego con el asa separe las posibles bacterias en el caso de muestras altamente contaminadas. Tambin es bueno comprobar la presencia de las bacterias y otros microorganismos en el aire del laboratorio, dejando una placa abierta por un perodo de tiempo sobre el mesn. En este ltimo caso, no debe separar colonias. NOTA: Siempre marque las placas con su nombre o iniciales, la fecha y una identificacin del contenido. 5.- Despus de la incubacin (siguiente prctico), estudie el crecimiento de colonias en sus placas. Observe las diferencias del tamao de las colonias, la forma y su apariencia. Fue efectiva la tcnica diseada por Ud.?

Dibuje el resultado de su separacin de colonias. Anote la apariencia de las diferentes colonias. Use flechas para indicar cul fue el recorrido de sus estras. 1. 2. 3. 4. Cuntos tipos de colonias observa en el medio nutritivo? Qu caractersticas tiene el medio agar MacConkey? Qu creci en ese medio? (utilice tincin de Gram). Averige cmo se prepara el medio de cultivo slido. Qu significado tiene la presencia de una colonia?

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Dibuje la apariencia del crecimiento de las colonias y describa las diferencias entre las colonias. Descripcin de las colonias. ......................................................................................................................... ......................................................................................................................... ......................................................................................................................... En las placas con demasiadas colonias, stas crecen como colonias pequeas, juntndose de modo que el creciminento aparece como turbidez. En las placas en que hay una buena separacin de colonias, stas crecen grandes, con una forma, color y textura caractersticos y distintivos. Las bacterias mtiles se pueden desplazar sobre la superficie del agar, por lo que las colonias son dispersas y con mayores tiempos de incubacin, las colonias se agrandan sobre la superficie.

TINCION DE GRAM
La tincin de Gram, el mtodo de tincin ms utilizado en bacteriologa, es una tincin diferencial. Mediante este mtodo, es posible dividir las bacterias en dos grupos -Gram positivo y Gram negativo-. La diferencia en la tincin se cree que se debe a las diferencias en la pared celular de los dos tipos de clulas. Las Gram positivo poseen una gruesa capa de peptidoglicn que, al ser deshidratado con alcohol, impide la salida del complejo cristal violeta con yoduro. En cambio las bacterias Gram negativo poseen una delgada capa de peptidoglicn, insuficiente para retener el complejo del cristal violeta con el yoduro. La tincin de Gram requiere de 4 diferentes soluciones: el colorante bsico, un mordiente, un agente decolorizante y un colorante de contraste. El mordiente es una sustancia que aumenta la afinidad o la atraccin entre la clula y el colorante; es decir, fija el colorante a la clula de alguna forma. Ejemplos de mordientes estn cidos, bases, sales metlicas y yoduro. La clula se tie ms fuerte con el mordiente. As, es tambin ms difcil lavar la tincin. El agente decolorante es una sustancia que remueve el colorante desde una clula teida. Algunas clulas se decoloran ms fcilmente que otras y en la tincin de Gram, esta diferencia define los dos tipos de bacterias. La colorante de de contraste es un colorante bsico de un color distinto al colorante inicial. El propsito de la tincin de contraste es teir las clulas decoloradas (transparentes).

PROTOCOLO
Se debe usar cultivos frescos (18-24 hrs) que retengan las estructuras de la pared. Los cultivos viejos tienden a perder la capacidad de teirse Gram positivo. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Prepare una muestra de Bacillus cereus, Streptococcus pyogenes, y una mezcla de E. coli y Staphylococcus aureus. Fije las preparaciones con calor. Tia con cristal violeta por 3 min. Lave con un volumen pequeo de solucin de yodo y cbra la preparacin con la misma solucin. Mantngalo as por 1 min. Lave suave con agua. Decolore con alcohol:acetona (3:1) o etanol:agua (2:1), lavando con agua en forma intermitente hasta que no se desprenda ms colorante. Lave suave con agua. Tia con el colorante de contraste, safranina, djelo por 1 min. Lave suave con agua y seque con papel absorbente sin restregar la muestra. Examine la preparacin bajo el objetivo de inmersin (100X).

Qu ocurre en cada etapa del procedimiento? Si examinara bacterias Gram positivo y Gram negativo despus de cada una de las etapas, cmo se veran las bacterias? ......................................................................................................................... ......................................................................................................................... .........................................................................................................................

ETAPAS EN LA TINCION DE GRAM (llene la tabla)

Resultados Etapa Tincin inicial Mordiente Decolorizacin Tincin de contraste Dibuje lo que observ al microscopio, usando los colores apropiados para indicar la reaccin de Gram de cada cultivo. Procedimiento Gram + Gram -

Bacillus cereus

Streptococcus pyogenes

Cultivo mixto de Escherichia coli Staphylococcus aureus

CUESTIONARIO
1.2.3.4.Puede variar la tincin primaria y la tincin de contraste? Cul ser el efecto si se reemplaza el ioduro con otro agente oxidante? Cmo son otros alcoholes como agentes decolorantes? Cul es la influencia del pH en la reaccin de Gram?

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Movimiento bacteriano Swimming and swarming

Se analizar la motilidad bacteriana dependiente de flagelo. Este tipo de movimiento bacteriano puede ser mediado por rotacin dependiente de flagelo unipolar (swimming) o pertrico (swarming).

Protocolo
Inocule en el centro de una placa LB/agar 0,5% (swimming) 5 L de un inculo de Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris y Bacillus cereus, y deje secar la gota en campana o mesn. Deje la placa creciendo a 37C. Luego de 24 h de incubacin, evale crecimiento y movimiento de las clulas.

Investigue
a) Cules son las principales diferencias entre movimiento swimming y swarming? .. .. .. .. .. b) Por qu la clula bacteriana necesita moverse? Por qu tiene diferentes tipos de movimiento? .. .. .. .. c) Por qu se debe usar una concentracin de agar diferente a la normal para evaluar motilidad celular? .. .. .. .. .. ..