11.

PLEGAMIENTO DE PROTEINAS

Vernica Gonzlez Nez Universidad de Salamanca

ESQUEMA. Plegamiento de protenas

1. Introduccin & consideraciones previas 2. Fuerzas que estabilizan la conformacin proteica 3. Importancia del plegamiento de protenas 4. Enfermedades relacionadas con mal plegamiento de las protenas 5. Hiptesis sobre el plegamiento espontneo de las protenas 6. Los chaperones moleculares en el plegamiento de las protenas - Protenas de choque trmico (HSP) y chaperoninas - Otras protenas implicadas en el plegamiento

INTRODUCCION. CONSIDERACIONES PREVIAS (I)

Estructuradelasprotenas
1.Estructuraprimaria: secuenciaaminoacdica 2.Estructurasecundaria: hlice, lmina, codos, coiled-coil 3.Estructuraterciaria: formacindedominiosproteicos 4.Estructuracuaternaria: asociacinconotrosmonmeros,cofactoresy gruposprostticos Consideraciones sobre la estructura de las protenas - Las protenas no son estructuras lineales, aunque estn formadas por una cadena lineal de aminocidos - La estructura proteica es clave para su funcionalidad - Las diferentes propiedades qumicas de los son las responsables de las interacciones entre ellos

Introduccin. Consideraciones previas (II)

- El plegamiento comienza durante la traduccin - Las protenas tienden a adoptar espontneamente la conformacin de mnima energa (<10 Kcal/mol) en base a su secuencia de aminocidos para ello, los residuos hidrfobicos se entierran en un ncleo interior - Las estructuras secundarias ms frecuentes son la -hlice y la -lmina Causa: son las estructuras que ms aumentan el nivel de compactacin - Las protenas suelen interaccionar con iones y otras cadenas polipeptdicas para formar multmeros

Introduccin. Consideraciones previas (III)

A veces las protenas no pueden plegarse per se, y necesitan de otras protenas Proteinas tutoras o los chaperones moleculares (HSP60 & HSP70) Los chaperones moleculares colaboran junto con otras protenas en el plegamiento de las protenas recin sintetizadas, evitando que se plieguen de forma incorrecta La mayora de las modificaciones y el plegamiento de las protenas suelen tener lugar en ER y en la mitocondria

FUERZAS QUE ESTABILIZAN LA CONFORMACION PROTEICA

Interacciones no covalentes Puentes de hidrgeno Interacciones electrostticas Fuerzas de Van der Waals (dipolo dipolo) Interacciones hidrofbicas Puentes disulfuro interaccin covalente La interaccion hidrofbica es la fuerza ms importante que dirige el plegamiento de las protenas Las interacciones moleculares que estabilizan una protena pueden ser alteradas por la temperatura, pH y fuerza inica Desnaturalizacin de protenas El plegamiento y la desnaturalizacin de protenas son procesos cooperativos

IMPORTANCIA DEL PLEGAMIENTO DE LAS PROTEINAS (I)

Una protena sin estructura nativa - es afuncional - tiende a agregarse con otras cadenas polipeptdicas - suele ser degradada - consume recursos celulares (materia y ) Amiloidosis Enfermedades relacionadas con plegamientos anmalos de las protenas Encefalopatas espongiformes causadas por priones Enfermedades neurodegenerativas hereditarias dominantes Creutzfeldt-Jakob (CJD), Gerstmann-Strussler-Sheinker (GSS) Insomnio familiar fatal (FFI) Enfermedades neurodegenerativas adquiridas Kuru, variante del Creutzfeldt-Jakob (vCJD)

Importancia del plegamiento de las proteinas (II)

Enfermedad de Alzheimer Depsitos de -amiloide, formando las placas neurticas Enfermedad de Parkinson Depositos de -sinuclena, formando los cuerpos de Lewy Enfermedad de Huntington Inclusiones de huntingtina mal plegada Enfisema hereditario La 1-antitripsina se pliega muy lentamente, por lo que no puede bloquear la accin de su diana, la elastasa, y sta ultima destruye el tejido pulmonar Anemia falciforme La hemoglobina alterada HbSC promueve la agregacin de la Hb dentro de los eritrocitos, disminuyendo su flexibilidad y provocando que adopten una forma de hoz

PRIONES (I)
Prion Proteinaceous infectious particle (PrP) El nombre procede del scrapie (enfermedad ovina)

Caractersticas de los priones - glicoprotena hidrofbica de 208 con un GPI-anchor - se localiza en la superficie de las neuronas - la alta hidrofobicidad determina la formacin de agregados y el depsito tipo placas de amiloide - es el producto del gen endgeno Prn-p sin funcionalidad aparente (estudios de knock-out en ratones) Se transcribe con igual intensidad en organismos sanos que enfermos

Priones (II)
Mecanismo de accin de los priones PrPsc (infeccioso) cataliza la transformacin del PrPc (celular) PrPsc

PrPc y PrPsc son qumicamente idnticas pero de conformacin diferente PrPc: 3% de -lmina y 42% de -hlice

PrPsc: 54% de -lmina y 21% de -hlice (Rogue conformer: modelo especulativo)

Fuente de la imagen: RCSB PDB. N. acceso: 1QM0

Estructura delaprotena prinica humana,fragmento 90 230

Priones (III)
Caractersticas de PrPsc - Insoluble - Resistente a la accin de proteasas - Tiende a formar agregados alteraciones autocatalticas en la conformacin tridimensional - Se deposita en vesculas citoslicas en vez de unir GPI - Parece que es una forma termodinmicamente ms estable

La proteina PrPscposee un ncleo de 26-30 KDa C-terminal resistente a proteasas y con estructura mayoritaria de -lmina que se agrega formando placas tipo amiloide, ltimas responsables de la degeneracin neuronal

HIPOTESIS SOBRE EL PLEGAMIENTO DE PROTEINAS (I)

Paradoja de Levinthal Debido a los grados de libertad de una cadena polipeptdica, encontrar el estado nativo de una protena mediante bsqueda aleatoria entre todas las configuraciones posibles llevara muchsimo tiempo, mientras que las protenas se pliegan en nanosegundos

Ejemplo Polipptido de 100 Si cada pudiera adoptar 2 conformaciones (rotacion de los angulos y ), sin tener en cuenta las conformaciones de las cadenas laterales: 2100 1030 conformaciones Si la interconversin entre dos conformaciones durase 10-12s: Tiempo para que ocurra el plegamiento: 1030 * 10-12 = 1018s 1010 aos

Hiptesis sobre el plegamiento de las protenas (II)

Consecuencia El plegamiento de protenas no puede tener lugar por un proceso de prueba y error (trial & error)

Solucin a la Paradoja de Levinthal El plegamiento de protenas est guiado por la formacin de interacciones locales entre aminocidos que actan como ncleos de plegamiento Prueba a favor de esta hiptesis Se han encontrado estados intermedios en el plegamiento de una protena

Hiptesis termodinmica. Dogma de Afinsen

Autoensamblamiento La estructura nativa de una protena viene determinada por su secuencia de aminocidos, es nica, estable y se corresponde con un mnimo de energa libre Hiptesis vlida para protenas globulares Ejemplo La ribonucleasa pancretica presenta 4 puentes disulfuro (Cys26 -Cys84, Cys58 - Cys110, Cys40 - Cys95 & Cys65-Cys72) DesnaturalizacinconureaymercaptoEtOH:sereducenlosenlacesdisulfuro

Renaturalizacin progresiva:seformanlosenlacesdisulfuro correctos

LaRNasa pancreticaserenaturaliza espontneamente

Hiptesis actual - Folding funnel (I)

Versin de la hiptesis termodinmica El estado nativo de una protena se corresponde con un mnimo de energa libre (G) Existen mnimos locales que se corresponden con estados parcialmente plegados que pueden actuar como trampas termodinmicas

Colapso hidrofbico hiptesis del glbulo fundido La fuerza motora que determina el plegamiento de una protena es la estabilizacin energtica que se logra secuestrando los residuos hidrofbicos en el ncleo interior de la protena Posteriormente, la G se minimiza mediante interacciones no covalentes entre las cadenas laterales cargadas y contactos polares con el solvente

Hiptesis actual - Folding funnel (II)

Inicio deformacin delahlice ycolapso

Glbulo fundido

Intermediarios en elplegamiento

Estructura nativa Mnimo aG

MnimoslocalesdeG Estadosparcialmenteplegados Trampastermodinmicas

% enlaconformacin nativa

Energa

Hiptesis actual - Folding funnel (III)

Glbulo fundido Al suceder el colapso hidrofbico, la protena adopta una estructura de glbulo fundido (molten globule) El glbulo fundido se corresponde con una conformacin con cierta estructura secundaria pero sin estructura terciaria El estado en glbulo fundido se corresponde con una serie de intermediarios en los que el colapso hidrofbico ya ha tenido lugar, pero no se han establecido todas las interacciones entre aminocidos Posteriormente, el glbulo ha de franquear unas barreras de activacin, transformndose en una serie de intermediarios hasta alcanzar su estado nativo Aproximaciones bioinformticas y simulaciones moleculares - Prediccin de la estructura de una protena - Importancia en el diseo de frmacos

Plegamiento en varios pasos

1. Formacin de estructuras secundarias (-hlice y -lmina) Actan como ncleos de plegamiento, estabilizando otras regiones ordenadas de la protena 2. Formacin de dominios Por agregacin cooperativa de distintos ncleos de plegamiento 3. Formacin del glbulo fundido En protenas con varios dominios, dichos dominios se agregan formando un glbulo fundido 4. Transformacion del glbulo fundido en una estructura terciaria que adopta la estructura nativa de una protena monomrica Se logra mediante pequeos cambios conformacionales 5. Adquisicin de la estructura cuaternaria y obtencin de la forma nativa Estructura cuaternaria exclusivamente en protenas multimricas

Los chaperones moleculares en el plegamiento de protenas (I)

Chaperones moleculares Protenas que se unen a polipptidos en una conformacin inestable, facilitando su correcto plegamiento, estado oligomrico destino final Actan como enzimas al disminuir la barrera energtica que separa el estado nativo de otros mal plegados aceleran el correcto plegamiento

No contienen informacin sobre modelos particulares de plegamiento, sino que ayudan a las protenas mal plegadas a encontrar su conformacin nativa

Los chaperones moleculares en el plegamiento de protenas (II)

Presentes en las tres divisiones, Bacteria, Archaea y Eucarya No todas las distintas familias de chaperones estn presentes en las tres divisiones, sino que algunas son exclusivas Los eucariontes presentan ms familias de chaperones y con ms miembros que las otras dos divisiones. Causas: compartimentacin celular, mayor diversidad de funciones? Las protenas en el ER necesitan de las chaperoninas para plegarse, ya que la alta concentracin de protenas en el lumen del ER dara lugar a interacciones intermoleculares indeseadas Agregosoma Estructura que contiene varios chaperones as como componentes del proteasoma

PROTEINAS DE CHOQUE TERMICO -HSP- (I)

Situacin de estrs (Q, radicales libres) cadenas polipeptdicas desnaturalizadas Aumento en la expresin de HSP HSP se expresan habitualmente en muchos compartimentos celulares Conservadas durante la evolucin Localizacin y expresin ubicua

FamiliaHSP60 chaperoninas 60
GroEL:enelcitosol debacterias Hsp60:enlamatrizmitocondrial ProtenadeuninaRUBISCO:encloroplastos

FamiliaHSP70 estrs70
HSP70:enelcitosol delmamferos BiP (binding protein):78KDa,enellumendelER Grp75:enmitocondrias DnaK:enbacterias

FamiliaHSP90 estrs90
Hsp83:enelcitosol deeucariontes Grp94:enellumendelERenmamferos HtgP:enbacterias

Proteinas de choque trmico -HSP- (II)

Calnexina Chaperonina anclada a la cara luminal del ER Se une a protenas glicosiladas, permitiendo su correcto plegamiento Cuando la protena est plegada correctamente, la glicosilacin se detiene se eliminan los restos de Glc y la protena se separa de la calnexina la protena madura est lista para ser exportada al Golgi

Proteinas de choque termico -HSP- (III)

HSP70 Localizacin ubicua: citosol, mitocondria, cloroplasto, ER, y en bacterias Se une a protenas que estn siendo sintetizadas por los ribosomas Se une a pequeos segmentos hidrofbicos, los estabiliza y evita un plegamiento temprano y la agregacin con otras protenas Cataliza el plegamiento de novo Transfiere los polipptidos a otros chaperones, paso al ER, transporte a la mitocondria etc. HSP70 es una ATPasa: la unin y separacin de pptidos es ATP-dependiente

CHAPERONINAS
Chaperoninas = ATPasas lentas ADP-chaperonina: gran afinidad por protenas desnaturalizadas Unin de un fragmento proteico: ADP ATP

ATP-chaperonina se separa del polipptido Hidrlisis ATP ADP Nuevo ciclo

El intervalo entre liberacin y unin del polipptido determinado por la velocidad de hidrlisis del ATP

El plegamiento de la protena viene determinado por las leyes termodinmicas La chaperonina simplemente suministra ms tiempo para que el proceso tenga lugar

GroEL & GroES (I)

GroEL & GroEs GroEL -14 subunidades de 60 Kda - forman 2 anillos concntricos con 7 subunidades por anillo - cavidad interior para una protena de 90 KDa GroES - 7 subunidades de 10 KDa que forman un anillo GroEL y GroES - trabajan conjuntamente en un proceso ATP-dependiente - encierran a un polipptido desplegado en una cavidad favorable para que adopte su conformacin nativa

GroEL & GroES (II)

GroES

GroEL

vistalateral

vistadesde abajo

Estructura deGroEL &GroES

Fuente de las imgenes: RCSB PDB N. acceso: 1PF9

Mecanismo de GroEL y GroES

1. GroEL-14 ADPs + GroES se unen a un polipptido desplegado Las paredes interiores de GroEL abierto son hidrofbicas Se separan los 14 ADPs y GroES 2. GroEL une 14 ATPs interaccin polipptido # GroEL GroES se une a la otra cara de GroEL Las paredes interiores de GroEL cerrado se vuelven hidroflicas 20s para que se pliegue antes de hidrolizar el ATP 3. Hidrlisis simultnea: ATP ADP + Pi

El polipptido se libera dentro de la cavidad 4. Si el polipptido se ha plegado en su forma nativa, es liberado de la cavidad Si no es as, se repite el ciclo cuando GroEL gira 180

OTRAS PROTEINAS IMPLICADAS EN EL PLEGAMIENTO PDIisomerasa Protenaisomerasa delospuentesdisulfuro

Cataliza la interconversin de los puentes disulfuro entre los residuos de Cys correctos Posee 3 Cys, una de las cuales ha de estar en la forma SH para ser catalticamente activa Mecanismo La enzima cataliza la rotura aleatoria de puentes disulfuro en los polipptidosyformandotransitoriamenteenlacesenzima sustrato Laprotenaretienelasconformacionestermodinmicamentemsestables hastaqueseobtienelaestructuranativa

Prolil isomerasas (PPIase)

Catalizanlaisomerizacincistrans deenlacesXPro Trigger Factor (TF): prolil isomerasa bacteriana que suele estar unida a ribosomas (interacciona con el RNA de la subunidad 50S), interaccionando conpptidos queestnsiendotraducidos