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PRACTICA N 4 DIAGNSTICO DE ANEMIA HEMOLTICA POR ANTICUERPOS IRREGULARES

MARCO TERICO Los eritrocitos son clulas encargadas del transporte y oxigenacin de las clulas, poseen un tiempo de vida entre 100 a 120 das, luego de cumplir este ciclo se dirigen al bazo donde se realiza la hemocatresis, la cual esta mediada por el sistema reticuloendotelial. Debido a la destruccin de los hemates se produce bilirrubina indirecta o no conjugada, la cual es transportada por la albumina al hgado para conjugarse o convertirse en bilirrubina directa, parte de esta bilirrubina directa es excretada por el rin y en forma de urobilinogeno, tambin es excretada por el hgado a los conductos biliares y de ah pasa al intestino delgado. En forma de estercobilina. Gracias a la eficiente excrecin de la bilirrubina por parte del hgado, los niveles de este compuesto en sangre son bastante bajos. No obstante, cuando por algn motivo los niveles de esta sustancia aumentan en la sangre se puede producir una acumulacin de bilirrubina en el cuerpo que se manifiesta como ictericia. Cabe mencionar que los recin nacido poseen una ictericia. Hasta cierto punto es normal que los bebs recin nacidos luzcan "amarillos" pues sus hgados no estn lo suficientemente maduros para procesar y excretar la bilirrubina del modo ms eficiente. Por ello, los valores normales de bilirrubina en un recin nacido son mucho mayores a los de un adulto. Sin embargo, si la ictericia es excesiva y/o prolongada debe ser valorada por un mdico. La anemia hemoltica es una afeccin en la cual hay un nmero insuficiente de glbulos rojos en la sangre, debido a su destruccin prematura. Existen muchos tipos especficos de este tipo de anemia hemoltica. Segn su herencia: Congnitas Aquiridas Segn su mecanismos de accin Corpusculares Extracorpusculares Segn el lugar donde se produce la hemolisis Intravascular Extravascular

COMPETENCIAS Explica el fundamento, desarrolla la Prueba de Antiglobulina Indirecta o test de Coombs indirecta para la deteccin de Anticuerpos Irregulares mtodos y procedimientos de laboratorio para Interpreta los resultados obtenidos del test de Coombs Indirecto para la determinacin de anticuerpos irregulares relacionados a Anemia Hemoltica Inmune.

MATERIALES Y EQUIPOS REQUERIDOS 1. Sistema al vaco: Aguja (21x1), Holder, 2. Tubos al vaco con EDTA 3. Tubos al vaco sin anticoagulante 4. Papel filtro 5. Micropipetas de 10 100 l 6. Micropipetas de 100 1000 l 7. Tubos de 10 x 75 + gradillas 8. Parafilm 9. Centrfuga 10. Bao Mara 11. Suero Fisiolgico 12. Goteros 13. REACTIVO ANTIGLOBULINA HUMANA 14. ALBUMINA BOVINA 15. ANTI -D 16.

Procedimiento Para el caso de transfusin sangunea 1. Extraer hemates del paquete globular. 2. Lavar los hemates 3 veces con solucin salina 0.9% obtenidos de paquete del donante.

3. Prepare una suspensin al 5% en solucin salina normal de los hemates del donante. 4. En un tubo agregar dos gotas de sangre suspendia y dos gotas de suero del receptor 5. Centrifugar los por un lapso de 15 segundos. 6. Agregue dos gotas de albmina bovina solucin al 22% al tubo

7. Incube en un bao mara a 37C por 15 minutos. (la incubacin puede Prolongarse hasta 60 minutos si se desea). 8. Centrifugar por un lapso de 15 segundos. 9. Observar si hay presencia de aglutinacin 10. Lvese tres veces. Centrifugando por 15 segundo entre cada lavado.

11. Despus del ltimo lavado, decante lo ms posible. 12. Agregue dos gotas de suero Anti-humano y mezcle bien.

13. Centrifugue por 1 minuto a 1500 r.p.m. durante 15 segundos. 14. Agite el botn hematico del tubo observando si hay presencia de aglutinacin.

Las fases del test de coombs indirecto Frio: formacin del complejo antgeno - anticuerpo pero en inmunoglobulinas de tipo M. Proteica: disminucin del potencial Z con el fin de que exista una mayor sensibilidad de los hemates formando el complejo antgeno anticuerpo.

Trmica: formacin del complejo antgeno - anticuerpo pero en presencia de inmunoglobulinas de tipo G. Coombs: formacin del complejo antgeno anticuerpo - antianticuerpo

Es importante el uso de la prueba de la inmunoglobulina humana, debido que puede prevenir si el receptor pueda tener anticuerpo irregulares los cuales puedan ocasionar una reaccin con los hemates del plaquete globular de un receptor. Y asi poder eviar una anemia hemoltica adquirida.

La distancia que han de salvar los anticuerpos para producir aglutinacin es la que guardan entre s los hemates en suspensin en su propio suero o plasma o en un medio salino isotnico, distancia que viene impuesta por las fuerzas de repulsin existentes entre los hemates. La teora ms ampliamente aceptada para explicar este hecho es la del potencial Zeta.

La superficie de los hemates tiene cargas elctricas negativas debidas a los carboxilos del cido silico (NANA) de la membrana. Si los hemates estn en suspensin en un medio que contiene iones libres, los cationes forman una envoltura de cargas positivas alrededor de aquellos convirtindolos en partculas cargadas de electricidad del mismo signo que experimentan una fuerza de repulsin entre ellas. Esta fuerza de repulsin se denomina potencial Zeta.

La albmina acta disminuyendo el potencial zeta y aumentando la constante dielctrica del medio, con lo cual la fuerza de repulsin entre hemates se reduce facilitando su aglutinacin. Los anticuerpos del sistema Rh reaccionan muy bien en todos aquellos medios que contienen Seroalbmina bovina (SAB).

Sistema de complemento

El complemento es un conjunto de ms de 20 protenas plasmticas solubles (-globulinas) que forman un sistema enzimtico en cascada. Est siempre presentes de forma inactiva. Se activan secuencialmente ante la presencia de complejos Ag-Ac o directamente por Ag. Al activarse un componente se escinde en dos fragmentos: Uno grande (b) y otro pequeo (a). Estas protenas reciben el nombre de complemento porque ayudan y complementan los mecanismos de respuesta inmune. Las principales son los componentes C1 a C9, el factor B y el factor D. Los componentes del complemento con accin enzimtica se representan con una lnea sobre los nmeros y letras que los designan. VA CLSICA: Se inicia: Por el complejo Ac-Ag, pues al formarse se descubre un lugar reactivo en el fragmento Fc del Ac que activa al componente C1qrs del complemento Por la protena C Reactiva (PCr) (formada en el hgado como respuesta a una infeccin o lesin de los tejidos) que se une en presencia de Ca++ la membrana de microorganismos, formando un complejo que activa el sistema del complemento.

VA ALTERNATIVA: Activada por polisacridos de la membrana celular de microorganismos. Es un circuito cclico de amplificacin de la seal. SECUENCIA FINAL: Es una va comn a partir de la activacin del C3 a C3b por las C3-convertasas obtenidas en las dos vas anteriores. Se forma C5b a partir del C5. Al C5b se le unen los componentes C6 a C9, formando el complejo C5b-9 o Complejo de Ataque a la Membrana (MAC o CAM).

El CAM es una estructura tubular que se une a la membrana de los microorganismos, atravesndola y permitiendo el paso de Na+ y agua que implica la lisis del microorganismo. PROTEINAS PLASMTICAS. Albmina (60%) Contribuyente mayoritario a la presin coloidal. Transporte de lpidos y hormonas esteroideas. Globulinas (35%) Transporte iones, hormonas, lpidos; funcin inmune Fibringeno (4%) Componente esencial del mecanismo de coagulacin (conversin a fibrina insoluble) Protenas reguladoras (< 1%)

Caractersticas de las protenas plasmticas. La mayora son sintetizadas en el hgado Casi todas son glicoprotena Muchas muestran polimorfismo Cada protena posees una vida media Algunas se incrementan en estados inflamatorios

Regin alfa-1 Alfa-1- Antitripsina Alfa-1- Antitripsina (45 kDa) Funcin: neutralizacin de proteasas de la familia de la tripsina y plasmina. Producida por leucocitos de pulmn, pncreas y otros rganos Aumentada: en reacciones inflamatorias. Protena de fase aguda Disminuida: enfermedad pulmonar, enfisema. Pacientes con deficiencia en alfa-1-antitripsina desarrollan enfisema

Alfa-1-Lipoprotena Alfa-1-Lipoprotena (HDL, 200 kDa) Funcin: Transporte de colesterol y de vitaminas liposolubles. Producida por hgado e intestino Aumentada: Hiperlipidemia Disminuida: Enfermedad heptica, particularmente en la Enfermedad de Tangier Alfa-1-Glicoprotena Alfa-1-Glicoprotena ( 44 kDa) Funcin: Esta presente en secreciones mucosas y en diferentes tejidos. Producida por muchos tejidos Aumentada: Inflamacin. Protena de Fase aguda y algunos errores del metabolismo

Protrombina Protrombina ( 72 kDa) Funcin: Factor II de la coagulacin. Se transforma en trombina por accin del factor V Producida por hgado Disminuida: Enfermedad heptica

TBG TBG (Thyroid-binding globulin) Protena de unin a hormonas tiroideas ( 36,5 kDa) Funcin: Unin y transporte de hormonas tiroideas en sangre Producida por hgado Aumentada: embarazo Disminuida: Sndrome nefrtico. Regin alfa-1

Alfa-2 macroglobulina Alfa-2 macroglobulina ( 820 kDa) Funcin: inhibicin de proteasas: tripsina, plasmina, kalikreina Producida por hgado Aumentada: Sindrome nefrtico, enfisema, diabetes mellitus, embarazo, sndrome de Down Disminuida: Artritis y mieloma

Haptoglobina Haptoglobina ( 85-1000 kDa) Funcin: unin a hemoglobina. Los complejos Hb-haptoglobina preservan las reservas de hierro

Producida por hgado Aumentada: Inflamacin aguda y crnica, neoplasias, infarto de miocardio, Enf. Hodgkin Disminuida: Enfermedad heptica, anemia hemolitica y megalobstica.

Ceruloplasmina Ceruloplasmina ( 132 kDa) Protena mayoritaria para el transporte de cobre, exportada desde el hgado al resto de tejidos Regula los procesos de oxidoreduccin, transporte y utilizacin del hierro Aumentada en enfermedad heptica activa o en daos tisulares, embarazo Disminuida en enfermedad de Wilson

Alfa-2-Lipoprotena Funcin: Transporte de lpidos Producida por hgado Aumentada: Hiperlipidemias Disminuida: Enfermedad heptica grave 44 Eritropoyetina Eritropoyetina EPO (30 kDa) Funcin: Hormona de la eritropoyesis Producida por rin Aumentada: Anemia, (deportistas) Disminuida: Enfermedades renales, Enfermedades autoinmunes

Regin Beta Transferrina Transferrina (80-90 kDa) Transporta hierro en plasma como frrico (Fe3+) cada molecula de tranferrina une dos Fe3+. Normalmente, transferrina est un 30% saturada con Fe3+. Aumento de % de saturacin sobrecarga de hierro Diminiucin de % de saturacin deficiencia de hierro Transferrina- Fe3+ se une a receptores de transferrina en las clulas y se internaliza. En las clulas, Fe3+ se convierte en Fe2+ (ferroso) y se usa para la sntesis de citocromos, etc. La unin de Fe3+ a transferrina protege de los efectos txicos del hierro a las clulas (stress oxidativo) En estados inflamatorios la transferrina- Fe3+ se degrada por el sistema retculoendotelial, al no aumentar la sntesis se produce una disminucin de su concentracin en plasma

Beta-lipoprotena (LDL) Beta-lipoprotenas (1000 kDa) Funcin: Transporte de colesterol y fosfolpidos Producida por hgado Aumentada: Hiperlipidemias, Nefrosis Disminuida: Ayuno C3 y C4 C3 y C4 (185 a 417 kDa) Funcin: Protenas del complemento Producida por hgado Disminuida: enfermedades autoinmunes: lupus, anemia hemoltica

C1 inactivador de esterasas C1 (104 kDa) Funcin: Inhibe la accin del factor de complemento C1 Producida por hgado Disminuida: Muy disminuida o ausente en el edema angioneurtico hereditario

Hemopexina Hemopexina (80 kDa) Funcin: transporte de grupo hemo Producida por hgado Aumentada: en las misma situaciones que haptoglobina Disminuida: en las misma situaciones que haptoglobina Regin Gamma: IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE Esta regin contiene la mayor parte de las Inmunoglobulinas: IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE Producidas: por linfocitos B-- plasmticas. Aumentada: Hipergammaglobulinemia, enfermedad heptica, infeccin crnica, lupus, mieloma, linfomas Disminuida: Envejecimiento, drogas, leucemia linfocitica crnica, agammaglobulinemias, etc

INMUNOGLOBULINAS Protenas con funcin inmunolgica y la mayora son -globulinas, pero otras pertenecen a la fraccin o a la

Se obtienen tres fragmentos: uno denominado Fc, que determina la actividad biolgica, contiene el alotipo y determina la clase y subclase de cadena pesada y dos denominados cada uno de ellos Fab, que contienen el idiotipo y es por donde la molcula se une al antgeno.

4 cadenas polipeptdicas unidas entre s por enlaces covalentes y puentes disulfuro en forma de Y Regin bisagra : zona de unin de los tres brazos de la Y

Cadena ligera: Tipo kappa (k) Tipo lambda () Cromosoma 2 Cromosoma 22

En cada molcula de inmunoglobulina las dos cadenas ligeras son del mismo tipo, k o bien , pero nunca existe una de cada tipo en la misma inmunoglobulina. Cadena pesada:

Estas dos cadenas estn unidas entre si por puentes disulfuro intercatenarios. Hay una zona de unos 15 aminocidos, de gran flexibilidad y constituye lo que se denomina zona bisagra Es por donde se deforma la molcula de inmunoglobulina cuando se produce la unin con el antgeno, facilitndose as su acoplamiento con ste CLASES: INMUNOGLOBULINA G

Monmero Dos zonas de unin al antgeno (dos fragmentos Fab) Cuatro subclases (Ig1, Ig2, Ig3, Ig4) La Ig ms abundante en el plasma (80%) Bajo PM Difunde bien a otros lquidos corporales y atraviesa la barrera placentaria Neutraliza toxinas bacterianas Activa el complemento Sensibiliza y agrega microorganismos para estimular su fagocitosis (opsonizacin) Es la Ig ms importante en la respuesta inmunitaria secundaria

INMUNOGLOBULINA M Elevado PM Representa del 5 al 10 % de las Igs sricas totales y junto a la IgD es la ms frecuentemente encontrada en la superficie de los linfocitos B como inmunoglobulina de membrana ( BCR ) Pentmero de Ig. Los 5 monmeros estn unidos por puentes disulfuro y la protena J 10 fragmentos Fab para unin al Ag No atraviesa activamente las membranas biolgicas Eficaz en la aglutinacin y citolisis de microorganismos Respuesta inmunitaria primaria: Papel predominante (aparicin temprana) posee capacidad neutralizante, precipitante, aglutinante y activa complemento

INMUNOGLOBULINA A Dos subclases: IgA1: Monomrica. En plasma (poco abundante) IgA2: Dimrica. Predominante en secreciones (saliva, lagrimas, nasal, leche materna, etc.) Los monmeros estn unidos por puentes disulfuro y protena J Tiene otra cadena polipeptdica denominada COMPONENTE SECRETOR (sIgA), producida por las clulas de las mucosas que la protege de la proteolisis enzimtica y facilita su transporte Inhibe la adherencia de los microorganismos a la superficie de las clulas de las mucosas, por lo que es una primera lnea de defensa frente a las infecciones Tambin es importante en el procesamiento de los antgenos alimentarios en el intestino

INMUNOGLOBULINA D Monmero Poco abundante en plasma Hasta fechas muy recientes no se haba demostrado que esta inmunoglobulina posea capacidad de unirse a antgenos, por lo que se dudaba de que actuase con funcin de anticuerpo Se encuentra en la superficie de algunos linfocitos B ( BCR ) Se piensa que colabora de forma importante en la activacin de linfocitos B al actuar como receptor en la superficie de los mismos

INMUNOGLOBULINA E Monmero Baja concentracin en plasma. Se encuentra en la superficie de los mastocitos y los basfilos Es la mediadora de las reacciones de hipersensibilidad inmediata (alergias). Confiere proteccin local frente a ciertos patgenos grandes, como helmintos: sirve para reclutar clulas plasmticas a travs de una reaccin de inflamacin aguda Est aumentada en infecciones parasitarias

Reactivo de coombs

Los eritrocitos humanos en presencia de un anticuerpos dirigido contra un antgeno que posean, pueden ser sensibilizadas para no lograr la aglutinacin por la naturaleza misma del anticuerpo o el antgeno en cuestin. El suero antihumano, reaccionar contra la gamma globulina que han sensibilizado a componentes del complemente humano y propiciar la aglutinacin de los eritrocitos.