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TTULO:

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RESUMEN: Este documento describe las actividades para la validacin de Mtodos de Ensayo Microbiolgicos que soliciten su acreditacin ante el Organismo Argentino de Acreditacin.

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1. OBJETIVO .......................................................................................................... 3 2. ALCANCE ........................................................................................................... 3 3. DOCUMENTACIN DE REFERENCIA .............................................................. 3 4. ABREVIA TURAS Y DEFINICIONES ................................................................. 4 5. RESPONSABILIDADES ..................................................................................... 8 6. DESCRIPCIN ................................................................................................... 8 6.1. Requisitos generales para las actividades de validacin y para la estimacin de la incertidumbre de medicin..................................................................................... 8 6.2. Validacin de los mtodos................................................................................ 10 6.3. Estimacin de la incertidumbre de medicin .................................................... 14 6.4. Expresin de la Incertidumbre de medicin en los informes de ensayo ........... 16 7. DOCUMENTACIN RELACIONADA ............................................................... 16 8. Anexo I - Parmetros de validacin y expresiones para su clculo .................. 17

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1. OBJETIVO
Establecer una gua para la validacin de mtodos de ensayo no normalizados, desarrollados o diseados por el Laboratorio, mtodos normalizados empleados fuera del alcance previsto, ampliaciones y modificaciones de los mtodos normalizados y para las verificaciones necesarias para confirmar que puede aplicar correctamente los mtodos normalizados antes de utilizarlos para los ensayos. Establecer los principios y los requisitos para la evaluacin de la incertidumbre de medida en los ensayos y para la expresin de dicha incertidumbre. Esta gua est dirigida a Laboratorios que realizan ensayos microbiolgicos utilizados en el anlisis de agua y de alimentos destinados al consumo humano y la alimentacin animal, a muestras ambientales en el mbito de la produccin y manipulacin de alimentos y, en productos farmacuticos o cosmticos.

2. ALCANCE
Esta gua la deben aplicar los laboratorios de ensayo acreditados ante el OAA, los laboratorios que solicitan su acreditacin, y los evaluadores y expertos tcnicos que actan en los procesos de acreditacin.

3. DOCUMENTACIN DE REFERENCIA
3.1. Norma IRAM 301 vigente (ISO/IEC 17025: vigente), Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo / calibracin. 3.2. Norma ISO 9000 vigente. Sistemas de Gestin de la Calidad - Fundamentos y vocabulario. 3.3. Norma ISO 16140: 2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs Protocol for the validation of alternative methods. 3.4. Norma ISO/TR 13843 vigente. Water quality - Guidance on validation of microbiological methods. 3.5. Norma ISO/TS 19036:2006. Microbiology of food and animal feeding stuffs Guidelines for the estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations. ISO/TS 19036:2006/Amd 1:2009. Measurement uncertainty for low counts. 3.6. Norma ISO 17994 vigente. Water quality -- Criteria for establishing equivalence between microbiological methods. 3.7. Norma ISO 5725-2 vigente. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results -- Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method. 3.8. Norma ISO 5725-3 vigente. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results -- Part 3: Intermediate measures of the precision of a standard measurement method 3.9. Norma ISO 8199 vigente. Water quality -- General guidance on the enumeration of micro-organisms by culture. 3.10. Norma ISO 11133-2 vigente. Microbiology of food and animal feeding stuffs -Guidelines on preparation and production of culture media -- Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media

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3.11. AOAC INTERNATIONAL Methods Committee Guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis. Journal of AOAC Int. Vol. 85, No 5, 2002 3.12. AOAC INTERNATIONAL Presidential Task Force on Best Microbiological Methodology. BPMM Task Force Final Report 8-7-06. Practices for

3.13. EA Guide EA-04/10: 2002. Accreditation for Laboratories Performing Microbiological Testing. 3.14. Environment Agency. Standing Committee of Analysts. Methods for the Examination of Waters and Associated Materials. The Microbiology of Drinking Water (2002) - Part 3 Practices and procedures for laboratories 3.15. Oficina Internacional de Pesos y Medidas (BIPM). Vocabulario Internacional de Metrologa - Conceptos fundamentales y generales, y trminos asociados (VIM). JCGM 200:2008. JCGM 200:2008 Corrigendum. May 2010. 3.16. NMKL/NordVal. Protocol for the validation of alternative microbiological methods.2009 3.17. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA) vigente. 3.18. The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics. EURACHEM Guide. Editor: H. Holcombe, LGC, Teddington: 1998.

4. ABREVIA TURAS Y DEFINICIONES

4.1. ABREVIATURAS - AOAC: Association of Analytical Communities. - EA: European co-operation for Accreditation. - ISO: International Standardization Organization

- IRAM: Instituto Argentino de Normalizacin.

- NMKL: Nordic Committee on Food Analysis 4.2. DEFINICIONES Analito: componente medido por el mtodo de anlisis. En el caso de mtodos microbiolgicos esto es el microorganismo sus componentes o productos asociados (enzimas o toxinas) (3.11) Especificidad: (para un tipo de matriz y un nivel de inoculacin dado): Fraccin del nmero total de cultivos o colonias negativos que son asignados correctamente con el mtodo utilizado (3.4). Nota: Tambin puede definirse como la capacidad de un mtodo de no detectar el microorganismo diana, si este no est presente. Exactitud de medida: proximidad entre un valor medido y un valor verdadero de un mensurando (3.15). Nota: Es la combinacin de la precisin y la veracidad. La exactitud en los ensayos microbiolgicos, pueden determinarse mediante los resultados obtenidos en los interlaboratorios (que dan una idea de precisin) y mediante el anlisis de un material de referencia certificado (que da una indicacin de la veracidad).

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Exactitud relativa: Grado de concordancia entre los resultados del mtodo evaluado y los obtenidos utilizando un mtodo de referencia reconocido (3.3). Nota: En lo posible deben utilizarse muestras idnticas. Sin embargo, cuando se utilizan diferentes pre-enriquecimientos, se hace necesario la duplicacin de las muestras. Factor de cobertura (k): factor numrico utilizado como multiplicador de la incertidumbre de medida para obtener una incertidumbre expandida de medicin. (3.5). Nota: Tpicamente su valor se encuentra entre 2 y 3 Incertidumbre de medida: Parmetro, asociado al resultado de una medicin, que caracteriza la dispersin de los valores que podran ser razonablemente atribuidos al mensurando (3.5). Nota: El parmetro puede ser, por ejemplo, una desviacin estndar (o un mltiplo de ella), o la mitad de un intervalo de un nivel de confianza determinado. Incertidumbre combinada, uc (y): incertidumbre estndar de un resultado, y, de una medicin cuando ese resultado es obtenido a partir de valores de otras cantidades, que es igual a la raz cuadrada positiva de la suma de los trminos, siendo estos trminos, las varianzas o covarianzas de esas cantidades divididas por los resultados de esas mediciones (3.5). Incertidumbre estndar, u (xi): incertidumbre del resultado xi de una medicin expresada como una desviacin estndar (3.5). Incertidumbre expandida (U): cantidad que define a un intervalo en torno al resultado de una medicin que puede esperarse que incluya una fraccin grande de la distribucin de los valores que pueden atribuirse razonablemente al mensurando (3.5). Inclusividad/ Exclusividad: inclusividad es la capacidad de un mtodo alternativo de detectar el microorganismo diana a partir de un amplio rango de cepas. Exclusividad es la falta de interferencia, en un mtodo alternativo, a partir de un rango amplio de cepas nodiana (3.3). Nota: La exclusividad expresa la capacidad del mtodo de no detectar a los microorganismos no - diana, es decir aquellos que pueden presentar reacciones cruzadas con el microorganismo diana. La inclusividad es el rango de cepas que refleja la diversidad gentica y / o serolgica del microorganismo diana que el mtodo puede detectar. La inclusividad y la exclusividad se determinan sobre un amplio rango de cultivos puros de cepas diana y no - diana, mientras que la sensibilidad/especificidad se determinan en matrices contaminadas. La inclusividad/exclusividad da una medida de la selectividad del mtodo. Este requisito no es aplicable al recuento total de microorganismos viables, recuento de hongos y levaduras o mtodos de enumeracin que no estn dirigidos contra microorganismos especficos. Lmite de deteccin: aplicado a ensayos microbiolgicos cualitativos, es el nmero mnimo de microorganismos que pueden ser detectados, pero en cantidades que no pueden estimarse con precisin (3.13). Lmite de cuantificacin: aplicado a ensayos microbiolgicos cuantitativos, es el nmero mnimo de microorganismos dentro de una variabilidad definida que puede determinarse en las condiciones experimentales del mtodo evaluado (3.13).

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Nota: Tambin se lo denomina lmite de determinacin. Representa el nivel ms bajo validado con una precisin satisfactoria. Mensurando: magnitud que se desea medir (3.15). Nota: En microbiologa el mensurando es definido en trminos del mtodo empleado. Puede expresarse, por ejemplo, como ufc por la unidad de cantidad de muestra (ufc/ml ufc/g). Ejemplo: en la determinacin cuantitativa de Listeria en leche, el mensurando puede ser el resultado obtenido a partir del recuento de colonias, luego que se han seguido todos los pasos especificados en el mtodo de ensayo. Mtodo cualitativo: mtodo de anlisis cuya respuesta es la presencia o ausencia del analito, detectado de forma directa o indirecta en una cierta cantidad de muestra. (3.3). Mtodo cuantitativo: mtodo de anlisis cuya respuesta es la cantidad del analito medido de forma directa (enumeracin en masa o volumen), o indirecta (color, absorbancia, impedancia, etc.) en una cierta cantidad de muestra (3.3). Mtodo de referencia: mtodo internacionalmente reconocido y ampliamente aceptado (3.3). Nota: (por ejemplo, NMKL, ISO, CEN, mtodos de AOAC Internacional, mtodos que se indican en la Unin Europea, en las legislaciones nacionales y ciertas normas nacionales de calidad equivalente). Mtodo alternativo: mtodo de anlisis que demuestra o estima, para una dada categora de productos, el mismo analito que se mide utilizando el correspondiente mtodo de referencia (3.3). Precisin de medida: proximidad entre las indicaciones o los valores medidos obtenidos en mediciones repetidas de un mismo objeto, o de objetos similares, bajo condiciones especificadas. (3.15). Nota: Es habitual que la precisin de una medida se exprese numricamente mediante medidas de dispersin tales como la desviacin tpica, la varianza o el coeficiente de variacin bajo las condiciones especificadas. Las condiciones especificadas pueden ser condiciones de repetibilidad, condiciones de precisin intermedia, o condiciones de reproducibilidad Precisin intermedia: precisin de medida bajo un conjunto de condiciones de precisin intermedia. (3.15). Nota: Este conjunto de condiciones incluye el mismo procedimiento de medicin, el mismo lugar y mediciones repetidas del mismo objeto u objetos similares durante un periodo amplio de tiempo, pero que puede incluir otras condiciones que involucren variaciones. Las variaciones pueden comprender nuevas calibraciones, patrones, operadores y sistemas de medida. En la prctica, conviene que toda especificacin relativa a las condiciones incluya las condiciones que involucren variaciones y las que no. Rango de validacin: rango de nmero medio de partculas por porcin analtica para el cual las expectativas de las especificaciones de validacin (en particular linealidad)han sido aceptablemente demostradas. Nota: por lo general se expresa como el rango de recuento de colonias confiable (3.4). Repetibilidad: precisin de medida bajo un conjunto de condiciones de repetibilidad. (3.15).

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Nota: Este conjunto de condiciones incluye el mismo procedimiento de medida, los mismos operadores, el mismo sistema de medida, las mismas condiciones de operacin y el mismo lugar, as como mediciones repetidas del mismo objeto o de un objeto similar en un periodo corto de tiempo. Reproducibilidad: precisin reproducibilidad (3.15). de medida bajo un conjunto de condiciones de

Nota: Este conjunto de condiciones incluye diferentes lugares, operadores, sistemas de medida y mediciones repetidas de los mismos objetos u objetos similares. Los diferentes sistemas de medicin pueden utilizar diferentes procedimientos de medida. En la prctica, conviene que toda especificacin relativa a las condiciones incluya las condiciones que varan y las que no. Robustez: capacidad de un mtodo para mantenerse sin cambios ante pequeas pero deliberadas variaciones en los parmetros del mtodo, que provee una indicacin de su confiabilidad durante el uso normal (3.18). Nota; las variaciones a las que hace referencia la definicin son por ejemplo, cambios en las condiciones ambientales, en las condiciones de incubacin (tiempo/temperatura), calidad y vida til de medios de cultivo y reactivos, pH, etc. La informacin de la prueba de robustez puede utilizarse para especificar las condiciones en que debe ser aplicado el mtodo Sensibilidad (para un tipo de matriz y un nivel de inoculacin dado): Fraccin del nmero total de cultivos o colonias positivos que son correctamente asignados con el mtodo utilizado (3.4). Tambin puede definirse como la capacidad de un mtodo de detectar el microorganismo diana, cuando este est presente. Tasa de Falsos Positivos (para un tipo de matriz y un nivel de inoculacin dado): es la probabilidad o frecuencia con que la muestra sea asignada como positiva cuando en realidad es negativa. Falsos Positivos son aquellos que han sido asignados como tales conociendo que en realidad son negativos. La incidencia de falsos positivos es igual a: 1 menos la especificidad (3.11). Tasa de Falsos Negativos (para un tipo de matriz y un nivel de inoculacin dado): es la probabilidad o frecuencia con que una muestra conocida como positiva, sea asignada como negativa por el mtodo. La incidencia de falsos negativos es igual a 1 menos la sensibilidad (3.11). Validacin: Confirmacin mediante el suministro de evidencia objetiva de que se han cumplido los requisitos para una utilizacin o aplicacin especfica prevista (3.2). Verificacin: Confirmacin mediante la aportacin de evidencia objetiva de que se han cumplido los requisitos especificados. (3.2). Veracidad: proximidad entre la media de un nmero infinito de valores medidos repetidos y un valor de referencia (3.15). Nota: El verdadero valor de una cantidad es un concepto terico y, en general, no puede ser conocido exactamente. En la prctica el valor de referencia aceptado puede sustituir al valor verdadero. La veracidad se expresa habitualmente en trminos de sesgo o bias. Es aceptado, en los ensayos microbiolgicos cuantitativos, que no se tenga en cuenta al sesgo, en la estimacin de la incertidumbre de medicin debido a la naturaleza emprica de

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los mtodos microbiolgicos. Es el procedimiento analtico el que determina directamente el resultado de la medicin, por ejemplo, el nmero de unidades formadoras de colonias por unidad de muestra. Por lo tanto, no es posible en la prctica determinar el valor verdadero que se requiere para determinar el sesgo. Incluso cuando se utilicen materiales de referencia certificados, o los valores derivados de los Ensayos de Aptitud, slo puede evaluarse una parte del sesgo. En cualquier caso, an cuando no se evale el componente de la incertidumbre debida al sesgo, el laboratorio puede demostrar que se encuentra bajo control, por ejemplo, mediante su participacin en ensayos de aptitud o mediante el ensayo de materiales de referencia certificados.

5. RESPONSABILIDADES Se encuentran descriptas en el documento DC-SG-07, Responsabilidades y en el punto 6 de este documento. 6. DESCRIPCIN
Un Laboratorio que realiza ensayos microbiolgicos puede utilizar mtodos cualitativos y/o cuantitativos, los cuales se basan en la capacidad natural de los microorganismos de desarrollarse en un determinado medio de cultivo, a fin de detectarlos y/o poder cuantificarlos. El laboratorio debe utilizar mtodos de ensayo, que satisfagan las necesidades del cliente y que sean apropiados para los ensayos que realiza, es decir ajustados a su propsito. Para ello puede utilizar:

mtodos normalizados: son aquellos mtodos publicados como normas internacionales o nacionales, o por organizaciones tcnicas reconocidas (Ej.: ISO, NMKL, UNE, EN, AOAC, APHA, FDA, EPA, Standard Methods for Water and Wastewater, USP, EP, etc.)

mtodos alternativos: se trata de mtodos que han sido validados por comparacin con el mtodo de referencia que corresponda, de acuerdo a un estndar aceptado (ej. ISO 16140, ISO/TR 13843, ISO 17994) y son reconocidos formalmente como equivalentes al mtodo de referencia por un organismo competente de acuerdo a unos datos experimentales obtenidos por ej. mediante ensayos colaborativos.

mtodos no normalizados: pueden considerarse aquellos mtodos normalizados modificados o utilizados fuera de su alcance. Por ejemplo: otra matriz, otros medios de cultivo, diferentes tiempos/temperaturas de incubacin, equipos con distintas tolerancias a las especificadas, combinacin de partes del mtodo normalizado con partes de una referencia bibliogrfica, etc.

mtodos internos: son aquellos elaborados por el propio laboratorio y que no se encuentran en normas o u otras colecciones de mtodos.

6.1. Requisitos generales para las actividades de validacin y para la estimacin de la incertidumbre de medicin
a) La validacin de los mtodos de ensayo y la estimacin de la incertidumbre de medicin, debe ser realizada por miembros del personal experimentados, competentes y, por lo tanto, autorizados. El laboratorio debe operar bajo un sistema de aseguramiento de la calidad de sus ensayos. Los equipos e instrumentos deben ser calibrados y/ o validados

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antes de su uso, los medios de cultivo evaluados y controlados, etc. Ver lo dispuesto en el documento CE-LE-06 Criterios especficos para la evaluacin y acreditacin de laboratorio que llevan a cabo ensayos microbiolgicos. b) Para la validacin/verificacin de los mtodos, el nmero y categora de matrices a analizar debe justificarse de acuerdo al alcance de la acreditacin y debe basarse en referencias bibliogrficas o estndares reconocidos, por ejemplo el anexo B de la norma ISO 16140 o el anexo B del documento Final Report and Executive Summaries from the AOAC International Presidential Task Force on Best Practices in Microbiological Methodology. c) Para la estimacin de la incertidumbre, debe tenerse en cuenta: el tipo de matriz (o grupo consistente de matrices), el microorganismo (o grupo consistente de microorganismos, por ejemplo, coliformes) y el mtodo empleado. El nmero y categora de matrices a analizar debe justificarse de acuerdo al alcance de la acreditacin y debe basarse en referencias bibliogrficas o estndares reconocidos, por ejemplo la norma ISO/TS 19036. d) Las actividades de validacin y las de estimacin de incertidumbre de medicin deben reflejar las condiciones reales de la aplicacin de los mtodos de ensayo, es decir, deben tener en cuenta las condiciones encontradas en la prctica diaria. Por ello pueden utilizarse: de preferencia muestras naturalmente contaminadas, contaminadas por mezcla, o en su defecto muestras inoculadas o materiales de referencia. El Anexo C de la norma ISO 16140 sirve como referencia para alimentos. Una gua para la preparacin de muestras de agua, se encuentra en la referencia 3.14 de este documento. Cuando se utilice la inoculacin, debe tenerse en cuenta que segn la naturaleza del mtodo y de la matriz, se hace necesario considerar la presencia de la flora acompaante a fin de evaluar posibles interferencias. Para ello se pueden utilizar matrices estriles inoculadas, con el microorganismo diana y con cepas distintas a la diana en concentraciones superiores. Tambin pueden utilizarse muestras no esterilizadas inoculadas, que hayan demostrado previamente la ausencia del microorganismo diana. Para la seleccin de los microorganismos a utilizar puede servir como referencia lo indicado en el Anexo G de la norma ISO 16140 o en la norma ISO 11133-2. El nivel del inculo debe ser acorde a lo analizado por el laboratorio en la prctica diaria y lo especificado por el mtodo de ensayo, por ejemplo el anlisis de muestras de alimentos con alta carga y baja carga en la determinacin de Salmonella. Tambin debe tenerse en cuenta el estado fisiolgico del/los microorganismo (s) de acuerdo a las matrices analizadas. e) Tanto en la validacin como en el clculo de la incertidumbre de medicin se debe tener en cuenta el rango de trabajo que emplee el Laboratorio en sus anlisis de rutina. f) Para los modelos descriptos en 6.3.2.1 y 6.3.2.2, la incertidumbre debe recalcularse cuando se produzcan cambios significativos en las condiciones: por ejemplo, cambio en los equipos, en los analistas, en los medios de cultivo, etc. Si se necesita estimar la incertidumbre para un cliente o para la interpretacin de un resultado en contra de una especificacin, y el clculo no se ha actualizado en los ltimos 6 meses, es recomendable que se lo revise. g) Se debe designar a un Responsable que tenga las calificaciones y la competencia necesarias, para evaluar el diseo experimental y los resultados obtenidos, tanto en la validacin de los mtodos como en la estimacin de la incertidumbre de medicin. ste

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decidir adems las acciones a seguir en caso que no se obtengan los resultados esperados. h) La participacin en Ensayos de Aptitud (EA), no puede ser utilizada como nico mtodo para la validacin ni para la estimacin de la incertidumbre de medicin, debido a las siguientes limitaciones:
en las rondas de EA, las matrices, en muchos casos, son diferentes a las que analiza el

Laboratorio en su rutina diaria y no tienen en cuenta la presencia de flora acompaante;

las muestras distribuidas durante la ronda, han sido especialmente homogeneizadas y

estabilizadas;
los niveles de microorganismos en las muestras del EA, pueden no ser aquellos que el

laboratorio analiza rutinariamente y pueden no cubrir el rango encontrado en el trabajo diario;

los laboratorios participantes, utilizan una variedad de mtodos empricos para obtener

su resultado, por lo cual para evaluar el resultado de la ronda se utilizan valores de consenso. Sin embargo la participacin en EA, puede utilizarse como actividades complementarias a la validacin y pueden dar una indicacin de la precisin obtenida para un mtodo en particular. La participacin en EA puede utilizarse en la estimacin de la incertidumbre de medicin bajo las condiciones estipuladas en la norma ISO/TS 19036 vigente.

6.2. Validacin de los mtodos

El trmino validacin se utiliza para indicar el proceso que provee evidencia objetiva que el mtodo es capaz de servir a su uso esperado, es decir para detectar o cuantificar un microorganismo o grupo de microorganismos especficos, para lo cual deben determinarse sus caractersticas de desempeo a fin de comprobar que cumple con los requisitos especificados para ese uso particular. El trmino verificacin se utiliza, en el contexto de este documento, para indicar el proceso que lleva a cabo el laboratorio con el fin de demostrar su capacidad para ejecutar correctamente un mtodo normalizado cuando lo realiza exactamente como est descripto en la norma. En adelante se mencionar el trmino validacin pero lo expuesto aplica igualmente a la verificacin de los mtodos de ensayo. 6.2.1. Etapas en el proceso de validacin El proceso de validacin de un mtodo debe estar cuidadosamente planificado, por ello deben contemplarse los siguientes pasos: a) Conocer el problema analtico a resolver. Los procedimientos y el alcance de la validacin no son siempre los mismos. Deben ser establecidos de acuerdo a las caractersticas del mtodo de ensayo utilizado por el Laboratorio y tener en cuenta las necesidades del cliente. b) Planificar las acciones a seguir. Esto implica especificar los requisitos y condiciones a cumplir, determinar los parmetros de desempeo del mtodo, establecer el diseo

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experimental y el mtodo de anlisis de resultados. El diseo experimental y el anlisis de resultado tienen que ser estadsticamente vlidos. En esta etapa es fundamental definir el alcance de la validacin de acuerdo al mtodo a emplear, especificar la matriz o matrices a estudiar; establecer condiciones tales como temperatura y tiempo de incubacin, lmites de operacin; realizar una clara descripcin del/los microorganismos de inters; y establecer otras limitaciones y especificaciones. Si los parmetros de desempeo no estn ya especificados, el laboratorio debe decidir cules deben ser caracterizados con el fin de validar el mtodo, lo cual deber estar fundamentado de manera confiable y cientfica. En todos los casos se requiere un Protocolo de validacin (ver 6.2.3.1). c) Llevar a cabo la validacin y evaluar los resultados obtenidos, por comparacin con los parmetros de desempeo establecidos. Confirmar la validez del procedimiento utilizado de acuerdo al propsito establecido y, si se han satisfecho los requisitos. d) Realizar el Informe de validacin (ver 6.2.3.2). 6.2.2. Alcance de la Validacin/verificacin de los mtodos El alcance depender del tipo de mtodo utilizado. Se pueden presentar los siguientes casos. 6.2.2.1 Mtodos normalizados: el Laboratorio utiliza un mtodo normalizado que se aplica exactamente como est descripto en la norma. En este caso el laboratorio debe confirmar que puede aplicarlo correctamente previo a su uso en ensayos, mediante la comprobacin del cumplimiento de los parmetros estadsticos que figuran en el mtodo normalizado (siempre y cuando se indiquen en la norma). Los parmetros a determinar son: Ensayos cualitativos Ensayos cuantitativos Lmite de deteccin Precisin (Repetibilidad + Precisin Verificacin de la sensibilidad y la intermedia) especificidad Lmite de cuantificacin (a) Verificacin de la veracidad
(a)

El lmite de cuantificacin debe ser determinado en los casos que afecte o est cercano al lmite especificado en la norma correspondiente. Debe tenerse en cuenta que cualquier variacin en el mtodo normalizado implica la repeticin de dicha confirmacin. 6.2.2.2 Mtodos modificados: el Laboratorio realiza modificaciones al mtodo de ensayo normalizado que pueden tener una repercusin sobre la calidad de los resultados. En el caso de los mtodos microbiolgicos se consideran modificaciones relevantes, entre otras: incluir en el alcance del mtodo otra matriz que la especificada en el mtodo normalizado; la utilizacin de medios de cultivos diferentes a los descritos en el mtodo de referencia; cambios en las condiciones de incubacin (tiempo-temperatura);

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el uso de equipos crticos con distinta tolerancia a la especificada en el mtodo normalizado, por ejemplo estufas de incubacin, baos termostticos utilizados para la incubacin de caldos de pre - enriquecimiento o de enriquecimiento, etc.; utilizacin de un rango de recuento diferente al especificado en el mtodo normalizado; utilizacin de un mtodo de recuento de colonias o un mtodo de clculo y expresin de los resultados diferente al especificado en el mtodo normalizado; utilizacin de una porcin de ensayo o suspensin inicial diferente; utilizacin de una sola placa de Petri para el recuento cuando el mtodo normalizado indica dos; combinacin de partes del mtodo normalizado con partes de una referencia bibliogrfica; En estos casos se debe tener en cuenta que los parmetros a determinar dependern de las modificaciones introducidas y la naturaleza del mtodo, prestando particular atencin a aquellas caractersticas de desempeo que puedan haber sido afectadas por el cambio introducido. 6.2.2.3 Mtodos alternativos: el Laboratorio utiliza mtodos alternativos o mtodos rpidos de confirmacin. En estos casos, cuando se dispone de los datos de validacin, el Laboratorio debe realizar una verificacin de su aplicabilidad, siguiendo los lineamientos establecidos en 6.2.2.1. Los datos de validacin pueden obtenerse de ensayos colaborativos o de datos provistos por el fabricante y sometidos a la evaluacin de una tercera parte (por ejemplo, AOAC, AFNOR, NMKL). Cuando no se disponga de esta informacin (datos de validacin), o estos no son plenamente aplicables, el Laboratorio debe realizar la validacin, antes de utilizar el mtodo en el laboratorio, siguiendo los lineamientos establecidos en la Norma ISO 16140 o los protocolos de AOAC, NordVal. 6.2.2.4 Mtodos internos: para estos mtodos, la validacin es mucho ms exigente y deben ser adecuada y totalmente validados antes de su uso, ya que al no disponerse de informacin previa sobre el desempeo del mtodo, se debern evaluar, segn sus caractersticas, todos los parmetros de desempeo posibles, para satisfacer las necesidades del tipo de aplicacin. Se pueden utilizar como guas, segn las matrices, por ejemplo: la Norma ISO 16140, la Norma ISO/TR 13843, o los protocolos de AOAC, NordVal. El diseo experimental y el anlisis de los resultados tienen que ser estadsticamente vlidos. Los parmetros a determinar son: Ensayos cualitativos Ensayos cuantitativos Recuento de microorganismos Recuento de microorganismos Lmite de totales (a) en medio selectivo/diferencial deteccin Adems de los especificados Precisin (Repetibilidad + Sensibilidad en (a): Precisin intermedia) Especificidad (b) Sensibilidad Lmite de cuantificacin Inclusividad/ Especificidad Rango validado Exclusividad Incertidumbre de medicin Inclusividad Robustez Exclusividad Robustez
(b)

El lmite de cuantificacin debe ser determinado en los casos que afecte o est cercano al lmite especificado en la norma correspondiente.

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6.2.3. Protocolo e Informe de validacin 6.2.3.1 Protocolo de validacin. Con el fin de organizar y planificar las actividades de la validacin se debe elaborar un protocolo de validacin que incluya: Objetivo Alcance: mbito de aplicacin del ensayo a validar. Aqu tiene suma importancia la especificacin de la matriz, especialmente cuando pueden causar diferencias significativas en la recuperacin de los microorganismos y el rango de aplicacin en el caso de los ensayos cuantitativos. Personal que llevar a cabo la validacin Metodologa y diseo experimental. Este debe incluir: la definicin del analito, la naturaleza de las muestras (naturales o inoculadas) utilizadas para la validacin, el acondicionamiento y preparacin de las mismas, los microorganismos utilizados, la estandarizacin del inculo, las condiciones del ensayo, etc. Listado de equipos, instrumentos, materiales, medios de cultivo, reactivos y cepas de referencia. Condiciones ambientales, cuando corresponda. Parmetros de desempeo a determinar. Criterios de aceptacin para cada uno de los parmetros. Anlisis estadstico Metodologa para el clculo de la incertidumbre, cuando corresponda. Registros asociados

El Protocolo de validacin debe ser revisado y aprobado por el Responsable. 6.2.3.2 Informe de validacin. Debe reflejar el protocolo de validacin e incluir, adems de lo especificado en 6.2.3.1 Resultados obtenidos, incluyendo la incertidumbre de medicin, cuando corresponda a un mtodo de ensayo cuantitativo. Conclusiones y declaracin de conformidad sobre la aptitud del mtodo de ensayo, fundamentada en la evaluacin de los parmetros de desempeo respecto a los criterios establecidos. Criterios de revalidacin

El Responsable debe justificar y fundamentar apropiadamente si considera al mtodo adecuado, an cuando se hayan producido desviaciones del protocolo o, cuando uno de los puntos del informe no concuerde con el requisito establecido previamente, por ejemplo los criterios de aceptacin. Se deben adjuntar al informe de validacin los datos originales o hacer referencia en donde estos se encuentren. El Informe de validacin debe ser revisado y aprobado por el Responsable.

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6.3. Estimacin de la incertidumbre de medicin

Para todos los mtodos, ya sean cualitativos o cuantitativos, el Laboratorio debe: a) identificar las distintas fuentes de incertidumbre, como por ejemplo, la homogeneidad de los reactivos, la interpretacin de los analistas, etc. y demostrar que se encuentran bajo control. Esto puede realizarse de muchas maneras, tales como diagramas de flujo, tablas, listas o diagramas de causa-efecto (espina de pescado). 6.3.1. Mtodos de ensayo microbiolgicos cualitativos: El concepto de clculo de incertidumbre de medicin no puede aplicarse directamente a los resultados de los ensayos cualitativos como los obtenidos en los anlisis de deteccin o en los de determinacin de atributos para fines de identificacin. No obstante, el Laboratorio debe, adems de lo especificado en 6.3 a): a) determinar el lmite de deteccin, basado en requisitos de especificidad y sensibilidad y realizado en matrices representativas, teniendo en cuenta, cuando corresponda la presencia de la flora acompaante, ya que es un importante indicador de la validez del mtodo en el laboratorio. b) determinar la incidencia de resultados falsos positivos y falsos negativos asociada a los ensayos cualitativos que se realizan (Tasa de Falsos Positivos y Tasa de Falsos Negativos). Esta no debe exceder las recomendaciones publicadas, ya sea en la literatura (normas o publicaciones relevantes al sector) o por los fabricantes, en este ltimo caso para los mtodos alternativos o de confirmacin rpida. 6.3.2. Mtodos de ensayo microbiolgicos cuantitativos: el Laboratorio debe, adems de lo especificado en 6.3 a): a) realizar un clculo para estimar la incertidumbre asociada a sus ensayos cuantitativos. Existen diferentes modelos para estimar la incertidumbre para ensayos cuantitativos, el laboratorio puede utilizar aquel que, basado en un pensamiento crtico y en el mejor juicio profesional, estime conveniente. La estimacin de la incertidumbre de medicin debe realizarse para resultados vlidos, es decir aquellos que se encuentran dentro de los lmites de recuento especificados en el mtodo. Dado el carcter de los ensayos microbiolgicos, mtodos empricos1, donde es difcil construir un modelo apropiado que permita cuantificar las contribuciones de cada paso a la incertidumbre del proceso de medida y, la poca disponibilidad de materiales de referencia certificados que representen al microorganismo en su hbitat natural, el consenso actual sobre la estimacin de la incertidumbre en los ensayos microbiolgicos cuantitativos es
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Mtodo emprico: es un mtodo que determina un valor al que slo se puede llegar en trminos del mtodo en cuestin y que, por definicin, sirve como el nico mtodo para establecer el valor aceptado del parmetro medido (AOAC). Un mtodo de ensayo diferente (a menudo para el mismo analito) puede dar un resultado diferente, dado que el mensurando se define en los trminos del mtodo. Por esta razn, en los mtodos microbiolgicos cuantitativos, el sesgo o bias no contribuye a la incertidumbre del mtodo, dado que los resultados dependen de las condiciones definidas en el mtodo, tales como, la temperatura y tiempo de incubacin, los medios de cultivo, etc. Es por ello que la utilizacin de materiales de referencia certificados, cuyo valor se obtiene tambin de mtodos empricos, constituye una herramienta til para demostrar la competencia del laboratorio, pero no deben ser utilizados para cuantificar el sesgo.

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que la precisin es el componente ms importante y el nico que puede determinarse de una manera prctica, mediante la utilizacin de datos experimentales. Por ello el Laboratorio puede utilizar los siguientes modelos: 6.3.2.1 Precisin intermedia, tal como se describe en la norma ISO 5725-3 incorpora la mayora, sino todas, las fuentes de incertidumbre significativas. Este enfoque es aplicable para estimar la incertidumbre en ensayos microbiolgicos cuantitativos, cuando el recuento de los duplicados seleccionados para realizar la estimacin se encuentra dentro del rango de recuento especificado en el mtodo que se trate. Sin embargo, cuando se obtienen recuentos bajos o ningn recuento, ya sea en placa o por filtracin por membrana, lo cual para una matriz particular y para un ensayo dado puede ser la regla, no es apropiado el clculo de la precisin intermedia, dado que el coeficiente de variacin (CV) aumenta rpida y significativamente cuando disminuye el recuento. En estos casos no se considera apropiado inocular las muestras con un adecuado nmero de microorganismos para poder llevar a cabo el clculo de la precisin intermedia, dado que se asume que la incertidumbre asociada con los recuentos bajos en placa o en membrana, es similar a la que se obtiene para recuentos mayores y, adems, no refleja ni representa la verdadera condicin de estas muestras. Para recuentos bajos ver 6.3.2.2. 6.3.2.2 Norma ISO/TS 19036:2006 y su Amd1: 2009. Esta norma propone un modelo, que adopta un enfoque top-down o "global", y se basa en la desviacin estndar de la reproducibilidad (sR) del resultado final del proceso de medicin, que incluye todas las fuentes de variabilidad que pueden encontrarse en la prctica. La incertidumbre de medida se estima mediante un enfoque simplificado tomando en cuenta la distribucin de Poisson. Aplica a ensayos cuantitativos de productos destinados al consumo humano y la alimentacin animal y, a muestras ambientales en el mbito de la produccin y manipulacin de alimentos, donde la enumeracin de microorganismos se lleva a cabo mediante tcnicas de recuento de colonias. Tambin es aplicable a ensayos cuantitativos llevados a cabo mediante mtodos instrumentales. Aplica a cualquier resultado incluyendo recuentos bajos y/o bajo nmero de microorganismos. No es aplicable a la enumeracin de microorganismos utilizando la tcnica del Nmero Ms Probable. Utiliza tres posibilidades para el clculo de la desviacin estndar de la reproducibilidad (sR): sR intralaboratorio, que es un caso particular de "precisin intermedia" segn lo definido en la ISO 5725-3. sR interlaboratorio derivado de la validacin del mtodo; sR interlaboratorio derivado de pruebas de aptitud. Para este ltimo caso el Laboratorio debe tener en cuenta las condiciones estipuladas en la norma ISO/TS 19036 vigente. El laboratorio debe tener en cuenta lo especificado en la Norma ISO/TS 19036, al planificar el diseo experimental para la recoleccin de datos y operar bajo condiciones de aseguramiento de calidad, tanto interno como externo, de modo de demostrar que el mtodo se encuentra bajo control y minimizar variabilidades. De este modo se asegura la

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validez de la estimacin de la incertidumbre de medicin para las actividades rutinarias del laboratorio y no solamente en un momento dado. 6.3.3. Ensayos que utilizan el Nmero Ms Probable (NMP) para determinar el nmero de microorganismos en una muestra de ensayo: para estos ensayos y de acuerdo al consenso actual, el Laboratorio puede utilizar los lmites de confianza de las tablas, siempre que: a) identifique las combinaciones inusuales e investigue sus causas; b) demuestre que la precisin (determinada por ejemplo, mediante el anlisis de duplicados) se encuentra dentro de dichos lmites. c) cumpla con lo especificado en 6.3 a).

6.4. Expresin de la Incertidumbre de medicin en los informes de ensayo

En el Amd.1 de la Norma ISO/TS 19036, se dan las indicaciones para la expresin del resultado del ensayo y su incertidumbre asociada. El Laboratorio puede adoptar la expresin que le resulte ms conveniente y que considere clara a fin de informar al cliente, cuando ste as lo requiera. Debe indicarse adems el nivel de confianza considerado y el factor de cobertura. Por ejemplo, lo expresado en el tem 8.2.1 del Amd.1 de la Norma ISO/TS 19036. Tambin deber indicarse o hacer referencia al procedimiento empleado para el clculo de la incertidumbre, ya que, de los diversos mtodos utilizados, algunos, conducen a una subestimacin significativa de la incertidumbre. Este procedimiento debe estar disponible para el cliente. Para los mtodos de recuento que utilizan el Nmero Ms Probable (NMP), la incertidumbre del resultado se expresar como el lmite inferior y superior del intervalo de confianza de las tablas (de acuerdo al mtodo utilizado), indicando el nivel de confianza considerado.

7. DOCUMENTACIN RELACIONADA

CE-LE-06, Criterios especficos para la evaluacin y acreditacin de laboratorios que llevan a cabo ensayos microbiolgicos.

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8. Anexo I - Parmetros de validacin y expresiones para su clculo