Introduccin a la Biologa Celular y Molecular

TP2: Extraccin y cuantificacin de protenas

Objetivos
Obtener un extracto crudo de protenas a partir de distintos rganos. Realizar un fraccionamiento a partir de una precipitacin con Sulfato de Amonio. Cuantificar las protenas resultantes de cada fraccin.

Introduccin
Las protenas son las molculas orgnicas ms abundantes en la clula, ellas constituyen ms del 50% del peso seco de la clula. Cada tipo celular, tiene un rol especfico determinado por su composicin proteica. Con la posibilidad de que 20 (o 22) aminocidos diferentes puedan estar unidos en cualquier orden para conformar polipptidos de cientos de aminocidos, tienen el extraordinario potencial de producir una gran cantidad de variantes en su conformacin. Esta variedad genera funciones tan refinadas como las de las enzimas que estn involucradas en el metabolismo celular. Una bacteria puede tener cerca de 1000 protenas diferentes, en una clula humana puede haber ms de 10.000 clases de protenas distintas. La composicin protica de las clulas en un determinado momento depende del conjunto de genes que se estn activando y esto est relacionado directamente con las seales que recibe la clula, de su micro ambiente y de las caractersticas celulares que le son propias. Es decir que el patrn proteico de una clula vegetal ser distinto al de una clula animal, una clula heptica de un ratn, ser distinta de una clula heptica de un humano, y a su vez una clula heptica de ratn ser distinta a una neurona del mismo animal La expresin de protenas puede estudiarse por ejemplo, mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida (TP N3). Para esto es necesario extraer primero las protenas a partir de las clulas que constituyen los tejidos u rganos. Al momento de elegir el protocolo a seguir para obtener el extracto crudo, es importante tener en cuenta tanto el material de partida como su posterior utilizacin: Material biologico de partida-tipo de organismo: En el caso de rganos u otros tejidos animales, es necesario disgregarlos antes de proceder a la lisis celular, ya que las clulas se encuentran rodeadas de tejido conectivo. En general estas tcnicas involucran la utilizacin de enzimas (como por ejemplo colagenasa) y/o una ruptura mecnica grosera. Para esto pueden utilizarse morteros, homogeneizadores elctricos, tijeras o tamices metlicos (mesh), entre otros. Cuando el material es un cultivo celular, la extraccin puede realizarse adicionando un detergente, realizando un shock osmtico, o por sonicacin. Finalidad del extracto proteico: esto determinar el buffer de extraccin que se utilizar dependiendo se desea o no que las protenas conserven su actividad biolgica, su conformacin nativa, su interaccin con otras protenas u otras molculas. Algunos protocolos son tan violentos que involucran la ruptura de todas las membranas; otros en cambio permiten fraccionar y obtener, distintos componentes subcelulares (ncleos, mitocondrias, etc). La extraccin de protenas celulares comienza siempre con una ruptura celular o lisis. Los mtodos ms utilizados se basan esencialmente en la homogenizacin de los tejidos y la destruccin de los lmites celulares por medio de diferentes procedimientos fsicos y/o qumicos. Obtenindose lo que se denomina extracto crudo. Los objetivos a lograr en esta etapa son maximizar la liberacin de las protenas de inters, evitando la degradacin trmica o las alteraciones secudarias por oxidacin, protelisis, etc. Se han desarrollado una amplia gama de tcnicas de disrupcin celular, que se usan a escala de laboratorio que se pueden clasificar como: a) mtodos fsicos mecnicos: agitacin con abrasivos, homogeneizacin a alta presin o extrusin por presin; b) mtodos fsicos no mecnicos: shock osmtico, ciclos de congelacin

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descongelacin, sonicacin o secado; c) mtodos qumicos: tratamiento con lcali, solventes, detergentes, cidos o sustancias caotrpicas Luego de la lisis, suelen aplicarse sucesivos pasos de separacin y purificacin de los componentes celulares. Como primera medida, puede realizarse una centrifugacin diferencial para obtener fracciones subcelulares o para aislar organelas especficas. En este caso, las protenas asociadas a membrana quedarn en el pellet (precipitado que queda en el fondo del tubo luego de una centrifugacin) y las solubles en el sobrenadante. En general, el extracto obtenido es sometido a tratamientos que separan las protenas en diferentes fracciones basados en algunas propiedades tales como tamao o carga, proceso denominado fraccionamiento. Las primeras fases en este proceso suelen utilizar diferencias en la solubilidad de las protenas. Existen diversos factores que afectan esta solubilidad; en particular, la composicin en aminocidos (una protena rica en aminocidos polares es en general ms soluble que una rica en aminocidos hidrofbicos); la estructura tridimensional (las protenas fibrosas son en general menos solubles que las globulares) y el entorno de la propia protena. Respecto a las condiciones del entorno de las protenas, los principales factores que pueden afectar su solubilidad son la temperatura; la constante dielctrica del medio; el pH del mismo; y la fuerza inica. La precipitacin salina de las protenas es una tcnica en donde se logra la precipitacin de una fraccin de protenas mediante el aumento de la fuerza inica del medio. Grandes cantidades de una sal agregada a una solucin de protenas, disminuye la interaccin protenaH2O porque quita la capa de solvatacin, predominando la interaccin protena-protena y generando la precipitacin de las mismas. La concentracin salina a la que se produce la precipitacin no es igual para todas las protenas, lo que permite usar sta propiedad para la separacin y purificacin de protenas particulares a partir de mezclas complejas. Comnmente se usa sulfato de amonio (NH4)2SO4 para tal fin, a causa de su gran solubilidad (760 g de sulfato de amonio/1000 ml. de agua a una temperatura de 20C) y porque el in sulfato divalente permite alcanzar altas fuerzas inicas. La adicin gradual de sta sal permite el fraccionamiento de una mezcla de protenas, las cuales son precipitadas pero no desnaturalizadas. La cantidad de protenas en la muestra analizada puede estimarse por diversos mtodos. La mayora de las protenas absorben a 280 nm, y a bajas concentraciones, lo hacen de manera proporcional con su concentracin. Este es un mtodo rpido y sencillo pero tiene la desventaja es que la muestra debe estar pura, ya que otras molculas no-proteicas como el DNA, tambin absorben a esa longitud de onda. Por otro lado, los ensayos colorimtricos involucran la adicin de una sustancia qumica que es capaz de reaccionar con determinados residuos aminoacdicos. El resultado de estas reacciones es el cambio de color en la solucin, que es cuantificado mediante una medida de absorbancia. En general, estos mtodos son ms sensibles que la cuantificacin por absorbancia directa a 280 nm. Posteriormente, para determinar la concentracin de protenas totales de la muestra a analizar los resultados de absorbancia se interpola a un curva de calibracin construida utilizando una protena estndar, por lo general albmina srica bovina (BSA bovine seric albumin), cuya concentracin es conocida. Los ensayos colorimtricos ms utilizados son: Ensayo de Bradford (595nm): es uno de los ms sensibles. Es rpido y muy sencillo y adems no presenta interferencia con sustancias reductoras como el DTT y el -mercaptoetanol, que s interfieren con Los ensayos de Lowry y BCA. La desventaja es que es altamente sensible a detergentes y lpidos. Ensayo de Lowry (750 nm): se trata de una reaccin de redox con los enlaces peptdicos y con los laminocidos Tyr, Trp y Cys. Es rpido, sencillo y relativamente sensible. Como desventaja, es afectado por un amplio rango de compuestos no proteicos como EDTA, sulfato de amonio, Tritn X-100. Sin embargo existen variables que pueden realizarse para evitar estas interferencias, que estn disponibles comercialmente. Ensayo BCA (Bicinchoninine acid assay) (562nm): es ms sensible que Lowry y puede realizarse en un amplio rango de temperaturas. Tambin es sencillo, pero requiere de tiempos de

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incubacin un poco ms largos. Los complejos coloreados son muy estables. Aunque es altamente susceptible a interferencias, no interfiere con detergentes y lpidos. En este trabajo prctico se obtendrn los extractos proteicos crudos de distintos rganos de ratn. Se realizar una centrifugacin diferencial y la precipitacin salina con distintas concentraciones de sulfato de amonio de la fraccin soluble. Finalmente se cuantificarn las fracciones del extracto proteico, que sern el material de partida en el TP N3 (electroforesis en gel de poliacrilamida).

Precauciones para el uso de las micropipetas

1) Los volmenes mnimos y mximos de las pipeta tipo Gilson son los siguientes: Pipeta P2 P20 P100 P200 P1000 Vol. mnimo 0,1 2 20 30 200 Vol. mximo 2 20 100 200 1000

2) La rueda debe ser girada suavemente, NUNCA FORZARLA. NUNCA EXCEDER LOS VALORES ESTABLECIDOS EN EL PUNTO 1, YA QUE SE DESCALIBRA O SE ROMPE. El valor de estas pipetas es aproximadamente u$s 300 3) Dependiendo la marca y el modelo, los volmenes se indican de distinta manera, para las pipetas tipo Gilson: a. Para P20 los dos superiores indican la decena y la unidad en microlitros l, el tercer nmero (que est en otro color) indica la primer cifra despus de la coma. En el ejemplo de la foto indicara 10 l b. Para la P200 los tres nmeros indican centena, decena y unidad en l respectivamente. En el ejemplo de la foto indicara 100 l c. Para la P1000 que solo tienen tres cifras en el visor, el primer nmero (en otro color) corresponde a la unidad de mil l, los otros dos la centena y la decena. En el ejemplo de la foto indicara 1000 l Otros modelos tienen los cuatro dgitos correspondientes al millar, centena, decena y unidad.

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Procedimiento TRABAJAR SIEMPRE CON LAS MUESTRAS EN HIELO PARA EVITAR LA DEGRADACIN POR ACCIN DE LAS PROTEASAS
Extraccin de protenas: 1) 2) 3) 4) Colocar un trozo de tejido en el mortero sobre el hielo. Agregar 1500 l PBS. Homogeneizar con el vstago hasta disgregar el tejido. De ser necesario agregar ms PBS para seguir disgregando (anotar el volumen extra agregado!) 5) Tomar el extracto lquido con micropipeta (utilizando p1000) evitando aspirar los trozos menos disgregados de tejido. 6) Centrifugar 15 minutos a 14.000 rpm a 4C 7) Colocar el sobrenadante en un tubo de 1,5 ml y conservar en hielo. PBS (buffer fosfato salino): NaCl 137 mM, Fosfato 10 mM, KCl 2,7 mM, pH of 7,4 Precipitacin con Sulfato de amonio: 1) Realizar las diluciones de la solucin saturada de SO4(NH4)2 indicadas a continuacin: % Solucin saturada de sulfato de amonio Volumen de Agua (l) Volumen de SO4(NH4)2 saturado (l) 0 500 30 150 350 70 350 150 100 500

2) Rotular en la tapa 4 tubos con el % de sulfato de amonio agregado y el Nmero de grupo de trabajo (ejemplo para el grupo 4: 30% G4) Agregar en cada uno 100 l del extracto crudo de protenas 3) Agregar 100 l de las diluciones de SO4(NH4)2 en le tubo correspondiente. 4) Agitar vigorosamente durante unos segundos 5) Centrifugar 10 minutos a 14.000 rpm. 6) Tomar los sobrenadantes obtenidos y pasar a un nuevo tubo con el mismo rtulo, y descartar el tubo con el pellet 7) Conservar en hielo. Cuantificacin de protenas: Se utilizar el reactivo de Bradford de Bio-rad http://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/bioradbradford.pdf 1) Para realizar la curva del estndar preparar por duplicado 5 diluciones en PBS de la protena estandar (BSA) entre 0,05 mg/ml a 1 mg/ml. Tambin incorporar a la curva el valor "blanco" (PBS solo). 2) Realizar 2 diluciones seriadas 1/10 de las muestras 3) Colocar 200 l del reactivo de Bradford a cada pocillo que se va a utilizar, de una placa de 96 pocillos (microplaca).

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4) Agregar 10 l de cada dilucin del estndar (y del blanco) en los pocillos, cuidando de cambiar el tip entre muestras, (o utilizando el mismo tip, pero tomando siempre desde la muestra ms diluida a la ms concentrada) Tambin colocar en otros posillos 10 l de las muestras (las dos diluciones). CAMBIAR EL TIP AL AGREGAR CADA MUESTRA. 5) Incubar a temperatura ambiente por un mnimo de 5 minutos (y un mximo de 1 hora). 6) Medir la absorbancia a 595 nm en un lector de microplacas. Con los valores obtenidos, construir la curva de calibracin y calcular la concentracin de los extractos. Los clculos debern estar listos al inicio del TP N3.

AL FINALIZAR EL TP ENTREGAR LAS MUESTRAS A LAS INSTRUCTORAS YA QUE SERN UTILIZADAS COMO MATERIAL DE PARTIDA EN EL TP N3