Universidad Autnoma de Mxico

Instituto de Biotecnologa

MTODOS FSICO-QUMICOS EN BIOTECNOLOGA

ESPECTROFLUORIMETRA

Alumnas: MARA TERESA MARTNEZ ESTRADA CLAUDIA L. MOCTEZUMA GONZLEZ

PROFESOR: DR. ROBERTO PABLO STOCK SILBERMAN

30 / MAYO / 2006

_NDICE
Antecedentes histricos Fsica y qumica Absorcin de la luz Naturaleza de los estados excitados Poblacin de los estados excitados Desactivacin del estado excitado Relajacin vibracional Conversin interna: no radiativa Fluorescencia Cruzamiento intersistemas Transferencia de la energa de excitacin sin radiacin Apagamiento colisional Transferencia no colisional Reacciones qumicas Caractersticas y parmetros de la fluorescencia Espectro de fluorescencia Eficiencia cuntica Tiempo de vida de radiacin Anisotropa de fluorescencia Fluorescencia de estado estable y resuelta en tiempo Fluorforos Efectos del solvente Espectrofluormetros La fuente de luz Componentes de excitacin de la muestra Selectores de longitud de onda Calibracin de los monocromadores Filtros pticos Compartimiento de la muestra Efecto de la geometra de la muestra Detectores Contador de fotones contra deteccin anloga de fluorescencia Desviaciones de la ley de Lambert-Beer Dispersin de la luz Fluorescencia Agregados Anlisis de datos Definicin de sensibilidad Conversin entre longitud de onda y nmero de onda Curvas de calibracin
2

4 4 5 6 8 9 9 10 10 11 11 11 12 13 14 14 16 17 18 18 20 28 29 30 32 32 35 35 36 36 38 39 39 39 40 40 40 40 41 42

Datos del espectro Correccin de los espectros de fluorescencia Eficiencia cuntica Problemas qumicos Compuestos fluorescentes de referencia Medio Impurezas e interferencia Apagado Fotlisis Efecto de la temperatura Adsorcin Aplicaciones Fluorescencia de protenas Fusin de membranas Citmetro de flujo Secuenciacin de DNA PCR en tiempo real Bibliografa Apndice

42 42 44 46 46 46 46 46 46 47 47 47 47 49 49 51 53 55 57

ESPECTROFLUORIMETR_A
La espectrometra de fluorescencia o espectrofluorimetra es el mtodo espectroscpico ptico ms extensivamente usado en mediciones analticas y en investigacin cientfica. El gran nmero de aplicaciones va desde la determinacin analtica de trazas de metales en el ambiente a mediciones de pH en clulas completas bajo condiciones fisiolgicas. En la investigacin en laboratorio, la espectrofluorimetra se est aplicando para estudiar procesos fsicos fundamentales de molculas; relaciones estructura-funcin e interacciones de biomolculas como protenas y cidos nucleicos; secuenciacin de DNA y caracterizacin genmica. En aplicaciones analticas, el uso de la fluorescencia es dominante en laboratorios clnicos donde inmunoensayos de fluorescencia han reemplazado ampliamente a los radioinmunoensayos. Hay dos razones principales para el extensivo uso de la espectrofluorimetra. La primera, es el alto nivel de sensibilidad y el amplio rango dinmico que pueden realizarse. Un gran nmero de laboratorios han reportado deteccin de una sola molcula. En segundo lugar, la instrumentacin requerida es conveniente y para la mayora de propsitos puede adquirirse por un costo no muy elevado.

ANTECEDENTES HISTRICOS
Sir John Frederick William Herschel (1792-1871) hizo la primera observacin de fluorescencia de una solucin de quinina vista a la luz del sol, y la describi en On a Case of Superficial Color Presented by a Homogeneous Liquid Internally Colorless en Philosophical Transactions of the Royal Society of London (1845) 135:143-145. En su primera descripcin, Herschel reconoci la presencia de un fenmeno inusual, el cual no pudo explicar con el conocimiento cientfico de aquella poca. En estos das, la fluorescencia de la quinina permanece como uno de los ejemplos de fluorescencia ms usados. Es interesante hacer notar que el conocimiento del primer fluorforo, quinina, fue responsable de estimular el desarrollo del primer espectrofluormetro, el cual apareci en 1950. Durante la Segunda Guerra Mundial, el Departamento de Defensa de Estados Unidos se interes en monitorear los medicamentos contra la malaria, incluyendo la quinina. Esta evaluacin de medicamentos result en un programa subsecuente en el Instituto Nacional de Salud para desarrollar el primer espectrofluormetro prctico. Muchos otros fluorforos se encuentran en nuestra vida diaria. El verde y rojonaranja algunas veces vistos en el anticongelante se deben a cantidades traza de fluorescena y rodamina, respectivamente.

FSICA Y QUMICA
La luz es una forma de radiacin electromagntica, usualmente una mezcla de ondas con diferentes longitudes de ondas. La longitud de onda () es definida como la distancia entre dos crestas de una onda. Las unidades utilizadas son nanmetros. Dependiendo de la longitud de onda nuestros ojos perciben un color diferente, si es que sta se encuentra en el rango visible, o no lo perciben si pertenece un espectro diferente (Figura 1). La luz cerca del rango ultravioleta (UV) y visible tiene una energa de 150400kJmol_1.

Espectro visible UV Infrarojo

Espectro de luz blanca

Figura 1. Representacin del espectro de luz a diferentes longitudes de onda. El ultravioleta (UV) abarca aproximadamente hasta 400 nm, el visible de 400 a 750 nm y el infrarrojo a partir de 450 nm.

ABSORCIN DE LA LUZ
La luz de ciertas longitudes de onda puede ser selectivamente absorbida por una substancia de acuerdo a su estructura molecular. La absorcin de la energa de la luz ocurre cuando un fotn incidente promueve la transicin de un electrn de un estado de menor a mayor energa. Las molculas con electrones en compuestos aromticos usualmente absorben luz cerca del UV (150400nm) o en la zona del visible (400750nm). Los electrones excitados eventualmente pierden esta energa ganada y por un proceso de radiacin regresan a su estado inicial. La radiacin emitida por una molcula, o un tomo, despus de que ha absorbido energa para colocarse en un estado excitado, es convenientemente definida como luminiscencia. sta se divide formalmente en dos categoras, fluorescencia y fosforescencia, dependiendo de la naturaleza del estado excitado. Todos los mtodos espectrofotomtricos se basan en dos leyes que combinadas se conocen como la ley de Lambert y Beer. La ley de Lambert establece que la fraccin de luz absorbida por un medio transparente es independiente de la intensidad de luz incidente, y cada capa sucesiva del medio absorbe una fraccin igual de la luz pasando a travs de l. Lo cual puede ser expresado como: log (Io/I) = kl donde, Io es la intensidad de la luz incidente, I es la intensidad de la luz transmitida, l es la longitud por donde pasa la luz en la celda del espectrofotmetro y k es la constante del medio. La ley de Beer dice, la cantidad de luz absorbida es proporcional al nmero de molculas del cromforo a travs del cual pasa la luz. Lo cual indica que: k = c donde c es la concentracin y es el coeficiente molar de absorcin, una caracterstica propia del cromforo. es igual a la absorcin de una solucin molar en una celda de 1 cm. Retomado la ecuacin de Lambert, obtenemos que: log (Io/I) = cl

Si consideramos que el trmino log(Io/I) es conocido como absorbancia y en algunas ocasiones en algunas ocasiones el paso de la luz a travs de de la celda es descrito en trminos de transmitancia (T = I/Io), tenemos que: A= log(1/T) = cl De acuerdo a la ley de Lambert y Beer, la absorbancia debe de ser linealmente proporcional a la concentracin del cromforo. La absorbancia de un soluto depende linealmente de su concentracin. La longitud de onda y la fuerza de absorbancia de una molcula no solo dependen de su naturaleza qumica sino tambin del ambiente molecular de sus cromforos. Por lo tanto la espectroscopia es una tcnica excelente para seguir las reacciones enzimticas y transiciones conformacionales en protenas y cidos nuclicos. El uso de estas mediciones yace en que no es un mtodo destructivo y no requiere grandes cantidades de muestra.

NATURALEZA DE LOS ESTADOS EXCITADOS

El estado electrnico de una molcula est referido a las propiedades de todos los electrones en todos sus orbitales. La funcin de onda de un estado electrnico es una combinacin de la funciones de onda de cada uno de los electrones en cada uno de los orbitales de la molcula de la cual forman parte. La forma en que una molcula absorbe radiacin electromagntica es por medio de un proceso mecnico cuntico, donde una molcula es transformada de un estado basal a un estado excitado. La energa del fotn de luz absorbido corresponde a la diferencia de energa entre los dos estados. En la luz del ultravioleta y el espectro visible (200-800 nm), corresponden energas de 143 a 35.8 kcal mol-1. En los tomos la absorcin involucra la promocin de un electrn de una capa orbital externa hacia un orbital vaco de mayor energa. En molculas, un electrn es promovido del mayor orbital molecular ocupado (HOMO, highest occupied molecular orbital), al menor orbital molecular desocupado (LUMO, lowest unoccupied molecular orbital). Cuando un electrn en una molcula es movido de un orbital a otro, cambia el estado de la molcula y entonces es importante considerar los estados de la molcula involucrados en lugar de considerar solamente los orbitales involucrados en la promocin del electrn. Una molcula en un estado excitado es mejor referida como una nueva entidad, solo remotamente relacionada a la misma molcula en estado basal. Un estado excitado tendr una distribucin electrnica completamente diferente del estado basal, una nueva geometra, y ms que eso, podr reaccionar qumicamente de forma diferente del estado basal, que es el estado normal o de menor energa. Existe slo un estado basal para una molcula dada. Sin embargo, hay diversos estados excitados posibles an para molculas muy simples, y la naturaleza exacta de los cuales depende de los tipos de orbitales involucrados. Los estados electrnicos de las molculas electrnicas se pueden agrupar en dos grandes categoras: estados singlet y triplet. En los estados excitados singlet, un electrn en un orbital excitado est apareado (spin opuesto) a un segundo electrn en un orbital en el estado basal, dicho de otra forma, todos los electrones en la molcula tienen sus spins apareados. En consecuencia, el regreso al estado basal es permitido por el spin y ocurre rpidamente por emisin de un fotn. Este es el caso de la fluorescencia, y las velocidades de emisin de sta son tpicamente de 108 s-1, por lo que la vida media de la fluorescencia es cercana a 10 ns.
6

Los estados excitados triplet son aquellos en los cuales un par de electrones tienen sus spins desapareados, esto es, el electrn en el orbital excitado tiene la misma orientacin que un electrn en el estado basal. La fosforescencia es la emisin de luz de estados excitados triplet. La transicin al estado basal es impedido y las velocidades de emisin son lentas (103 100 s-1), tal que la vida media de la fosforescencia es tpicamente de milisegundos a segundos. Aunque la naturaleza exacta de los estados excitados muestra una gran variabilidad dependiente de parmetros especficos para una molcula dada, se pueden considerar algunas molculas simples para ejemplificarlos. Debido a que tanto la fluorescencia como la fosforescencia ocurren generalmente en molculas que tienen sistemas de electrones !, se elige al etileno como un ejemplo simple de dicho sistema. Ya que cada uno de los dos tomos de carbono del etileno involucrados contribuye con dos electrones a los sistemas de orbitales _ y !, el estado basal del etileno es aquel en el cual dos electrones estn en el orbital _ y dos en el orbital !, quedando vacantes los orbitales _* y !* (Figura 2).

Figura 2. Estado electrnico basal del etileno. Diagrama que muestra los orbitales moleculares del etileno (H2C=CH2) y sus relaciones con los tomos de carbono.

Con la interaccin de un fotn de la energa apropiada, un electrn del orbital enlazante ! del estado electrnico basal puede ser promovido al orbital antienlazante !* (LUMO). Este proceso de excitacin es llamado una transicin !-!* y el estado excitado es referido como estado !-!*. El otro orbital antienlazante existente es de mayor energa (_*). La excitacin de un electrn del orbital enlazante ! al orbital antienzalante _* ocurrir cuando la energa del fotn corresponda a la diferencia de energa entre el estado basal y el estado excitado !-_*. La multiplicidad, M , de los estados describe el spin de los electrones. A los electrones se les designa un nmero cuntico spin, S, ya sea +_ _ y as la multiplicidad del estado se puede calcular de acuerdo a la ecuacin:

M = 2|_S| + 1
En el estado basal, _S = 0, M = 1 y por esto se designa estado basal singlet, So. En el estado excitado !-!* los spines originales de los electrones se conservan y M =1. Por esto, se designa tambin como estado singlet. En el ejemplo del etileno, al primer estado excitado singlet !-!* se denominara S1, al segundo S2.

Tambin es posible un estado excitado ms, correspondiente a la promocin de un electrn, pero con un subsecuente cambio de spin. Este es el estado triplet, M = 3, caracterstico de la fosforescencia.

POBLACIN DE LOS ESTADOS EXCITADOS

La forma ms directa para la promocin de un electrn es que la molcula absorba un fotn de la energa apropiada. La diferencia de energa entre los dos estados corresponder a la energa del fotn absorbido, _E = hc/_, donde h es la constante de Planck, c es la velocidad de la luz en el vaco y _ es la longitud de onda de la luz. A temperatura ambiente, la energa termal no es adecuada para poblar significativamente los estados excitados. La diferencia de energa entre los estados So y S1 es demasiado grande para poblar termalmente S1, y por esta razn se usa luz y no calor para inducir fluorescencia. Cada uno de los estados electrnicos, excitado o basal, tiene un nmero de niveles vibracionales 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, etc. Los niveles vibracionales surgen porque una molcula en un estado electrnico puede absorber pequeos incrementos de energa, aunque mantiene la misma configuracin electrnica. Los procesos que ocurren entre la absorcin y emisin de luz se ilustran usualmente por el diagrama de Jablo_ski (Figura 3). Existe en una variedad de formas para ilustrar varios procesos moleculares que pueden ocurrir en los estados excitados.

S2 Conversin interna S1 Cruzamiento intersistema

Energa

Fluorescencia h_A SO h_A h_P h_F Fosforescencia

T1

(a)

(b)

Figura 3. Diagrama de Jablo_ski. Ilustra el proceso involucrado en la creacin de un estado excitado singlet por absorcin ptica y subsecuente emisin de fluorescencia. Los estados basales, primer excitado singlet y segundo excitado singlet se representan con So, S1 y S2, respectivamente. Las transiciones entre los estados se dibujan como lneas verticales para ilustrar la naturaleza instantnea de la absorcin de la luz. (a) Las lneas horizontales numeradas denotan los niveles vibracionales. (b). 1: Excitacin; 2: Conversin interna (ver ms adelante); 3: Emisin por fluorescencia.

El espaciamiento de energa entre los diferentes niveles de energa vibracional se ilustra con los espectros de emisin. Un espectro de emisin de fluorescencia es un PLOT de las intensidades de fluorescencia versus longitudes de onda o wavenumber. A 20 C la mayora de las molculas existen en el estado vibracional ms bajo del estado basal. El total de energa, E, de un estado particular de una molcula puede representarse como la suma de la energa electrnica, Eel, la energa vibracional, Evib, y la

energa rotacional, Erot. El cambio general de la energa como resultado de la absorcin de un fotn de luz es:

E = Eel + Evib + Erot

Usualmente, la absorcin de un fotn por una molcula es a un nivel vibracional por arriba del nivel cero del estado singlet excitado. El proceso de absorcin ocurre muy rpido (10-15 s), tan rpido que no hay cambio en la coordinacin nuclear de la molcula durante el proceso (Transicin Frank Condon). Este tiempo es corto, relativo al tiempo requerido para otros procesos electrnicos y para el movimiento nuclear. La poblacin de los estados triplet, involucrados en la fosforescencia, por absorcin directa a partir del estado basal es insignificante, sin embargo, ocurre un proceso para poblarlo a partir del estado singlet en muchas molculas.

DESACTIVACIN DEL ESTADO EXCITADO

El proceso de luminiscencia puede interpretarse solamente en trminos del estado excitado, del cual la emisin ocurre, y su relacin con el estado basal de la molcula. Aunque la simple imagen de la absorcin de un fotn y la subsecuente emisin para dar fluorescencia parece ser la regla, existen procesos que preceden y/o compiten con la emisin del fotn. Cualquier proceso que ocurra en lugar de la fluorescencia, compite con ella. El proceso de excitacin molecular y subsecuente prdida de energa de excitacin puede tratarse considerando cuatro estados (Figura 4): el estado basal (S0), el estado al cual la excitacin ocurri inicialmente (S2), el estado excitado singlet ms bajo (S1) y el estado excitado triplet (T1). Para que un proceso compita efectivamente con el proceso radiativo normal, ste debe tener una constante de velocidad mayor que el decaimiento espontneo del estado excitado del cual debe ocurrir. Expresado matemticamente:

kCP > _S
donde kCP es la constante de velocidad del proceso competidor y _S es el tiempo de vida (ver ms adelante) del estado involucrado. Despus de la absorcin del fotn, la molcula puede hacer una de dos cosas: emitir el fotn del mismo nivel vibracional al cual fue inicialmente excitado, o sufrir cambios en el nivel vibracional antes de la emisin. Cul de los dos procesos siga, depende de forma principal del ambiente de la molcula. Para una molcula aislada en fase gaseosa, la nica manera de perder energa vibracional es emitir un fotn infrarojo, lo cual es menos probable que sufrir una transicin electrnica para regresar al estado basal. Por ello, uno tiende a ver la emisin de un fotn de niveles vibracionales ms altos de estados excitados en espectros de fase gaseosa a bajas presiones.

RELAJACIN VIBRACIONAL
En solucin, la relajacin termal de una molcula excitada vibracionalmente es muy rpida a travs de la transferencia del exceso de energa vibracional de la molcula soluto al solvente. Este proceso es tan eficiente que, no solo uno o dos cuantos de energa vibracional se pierden, sino todo el exceso de energa vibracional del estado excitado, en 10-13 a 10-11 s. Esto significa que antes de que una molcula excitada en solucin pueda

emitir un fotn, sufrir una relajacin vibracional y por lo tanto la emisin del fotn ocurrir siempre a partir del nivel vibracional ms bajo de un estado excitado.
kPR kET

10 s

11 -1

Estado excitado inicial

kNR ~ 1011 s-1

Estado excitado menor singlet

kPR kET

108 s-1

kNR ~ 108 s-1 10-15 s kR ~ 1011 s-1

Estado basal
kNR ~ 1011 s-1 kNR ~ 102 s-1 kPR kET 102 s-1 Estado triplet menor

kISC ~ 108 s-1

Figura 4. Relacin entre los procesos del estado excitado. k PR=constante de reaccin qumica; kET=constante de transferencia de energa,; kNR=constante no radiativa (conversin interna); kISC=constante de cruzamiento intersistemas; kR=constante radiativa: fluorescencia; kP=constente de fosforescencia.

CONVERSIN INTERNA: NO RADIATIVA (RADIATIONLESS)

Se pueden encontrar procesos no radiativos por los cuales las molculas en un estado excitado singlet pueden regresar al estado basal sin la emisin de un fotn, convirtiendo toda la energa de excitacin en calor. A stos se llama conversin interna. De forma general, la energa de separacin entre estados excitados singlet en molculas aromticas es ms pequea que la separacin entre el estado S1, y el estado basal, S0. Esto significa que el nivel vibracional 0 de S2, por ejemplo, se sobrelapar con los niveles vibracionales ms altos de S1. Esta situacin da lugar a un alto grado de acoplamiento entre los niveles vibracionales, de tal manera que la molcula sufre una conversin interna del estado S2 al nivel vibracional ms bajo del estado S1. Otro proceso de conversin interna puede ocurrir cuando el nivel vibracional 0 de S1 se sobrelapa con un nivel vibracional de muy alta energa de S0. El electrn se mueve de regreso al orbital enlazante no lleno, y la molcula entonces se relaja vibracionalmente muy rpido al nivel ms bajo de S0. Estas rutas de desactivacin del estado excitado que son no-radiativas se agrupan en una velocidad del proceso descrito por la constante de velocidad no radiativa, kNR.

FLUORESCENCIA
Una vez que una molcula llega al nivel vibracional ms bajo de un estado excitado singlet S1(0) puede sufrir un proceso que es motivo de nuestro inters. ste es, que regrese a uno de varios niveles de energa vibracionales/rotacionales del estado S0
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por la emisin de un fotn de luz que corresponde a la diferencia de energa entre el estado excitado S1, nivel vibracional 0, y un nivel vibracional particular de S 0. En este proceso radiativo llamado fluorescencia, el electrn en el orbital antienlazante (!*) hace un salto cuntico de regreso al orbital enlazante (!) medio lleno, emitiendo el fotn de luz. El mecanismo puede definirse:

F* _ F + hv
siendo F* la molcula fluorescente en estado excitado S1(0), y F su estado despus de la emisin del fotn, hv. El tiempo de vida de un estado singlet excitado es aproximadamente de 10-9 a 10-7 s y por lo tanto el tiempo de cada de la fluorescencia es del mismo orden de magnitud. La constante de velocidad que se asocia con el proceso radiativo de fluorescencia se define como kR.

CRUZAMIENTO INTERSISTEMAS (INTERSYSTEM CROSSING)

Existe un proceso muy eficiente para poblar estados triplet partiendo del estado excitado singlet en muchas molculas. Este proceso es referido como cruzamiento intersistemas, y es un proceso de conversin interna dependiente de spin. Ocurre cuando uno de los electrones sufre una inversin de su spin de +_ a _ o viceversa. Esto resulta en un estado electrnico de menor energa (los electrones solos en diferentes orbitales prefieren tener spines paralelos) con una multiplicidad M = 3, con la que se designa al estado estado triplet, T1. A este proceso de cruzamiento intersistemas se asocia la constante de velocidad kISC.

TRANSFERENCIA DE LA ENERGA DE EXCITACIN SIN RADIACIN

El estado excitado inicial puede ser un estado excitado singlet mayor o un nivel vibracional del estado excitado singlet ms bajo. Ya que la conversin interna ocurre hacia el nivel vibracional ms bajo del estado S1 en aproximadamente 10-13 a 10-11 s, cualquier proceso competidor que vaya a ocurrir a partir de este estado debe tener una constante de velocidad de al menos 1011 l/mol-s. En el nivel vibracional ms bajo del estado excitado singlet una molcula tiene un tiempo de vida aproximado de 10-8 s, por lo que la transferencia de energa puede ocurrir por mecanismos colisionales o no.
APAGAMIENTO COLISIONAL (COLLISIONAL QUENCHING). El apagamiento colisional es un proceso bimolecular dependiente del contacto entre la molcula excitada y el apagador (quencher). Es un proceso de difusin controlada que requiere que el tiempo de vida del estado excitado sea mayor de 10-9 s. El mecanismo puede describirse como sigue:

F + hv _ F* F* _ F + hv F* + Q _ F + Q
La molcula fluorescente F absorbe un fotn para dar F*, el nivel de equilibrio del estado singlet excitado ms bajo. F* puede emitir un fotn, hv, y regresar al estado basal (fluorescencia), o puede interactuar con la molcula apagadora Q, perdiendo la energa

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de excitacin y regresar a S0 sin emisin. Este mecanismo simple es descrito por la ley de Stern- Volmer: F0/F = 1 + K[Q] = 1 + kq_S[Q] En esta ecuacin F0 es la intensidad de la fluorescencia en ausencia del apagador, F es la intensidad de la fluorescencia a una concentracin [Q] del apagador. K es la constante de apagamiento de Stern-Volmer, k q es la constante de apagamiento bimolecular y _S es el tiempo de vida del apagador. Bsicamente hay dos mecanismos por los cuales la prdida colisional de la energa de excitacin puede ocurrir: intensificacin del cruzamiento intersistemas por el apagador, o transferencia de electrones. Una gran variedad de molculas pueden actuar como apagadores colisionales, que incluyen oxgeno, halgenos, aminas y molculas deficientes de electrones como arcrilamida. El mecanismo de apagamiento vara con el par fluorforo-apagador.

TRANSFERENCIA

NO COLISIONAL. Otro proceso importante que ocurre en el estado

excitado es la transferencia de energa por resonancia (RET). La transferencia de energa que ocurre a travs de distancias ms grandes que la distancia de colisin molecular es llamada transferencia de energa no colisional. El proceso ocurre cuando el espectro de emisin de un fluorforo se sobrelapa con el espectro de absorcin de un aceptor (Figura 5). El aceptor no necesariamente es fluorescente. RET no involucra la emisin de luz por el donador, esto es, no es el resultado de la emisin del donador siendo absorbida por el aceptor. No hay un fotn intermediario en RET. El donador y el aceptor estn acoplados por una interaccin dipolo-dipolo. Por esta razn el trmino RET es preferido al trmino de transferencia de energa por resonancia fluorescente (FRET), que tambin es muy comn. El proceso se resume como: D + hv _ D* D* + A _ D + A* A* _ A + hv donde la molcula donadora D, absorbe radiacin y va al estado excitado D*. D* y A, el aceptor, interactan y la energa de excitacin es transferida a A. Esta molcula en su estado excitado, A*, puede emitir su propia fluorescencia caracterstica. El efecto neto es que la energa de excitacin es transferida de D a A (Figura 5). Si D y A tienen un nivel de energa comn, la energa ser transferida de ida y vuelta entre ellos hasta que uno la emita. Pero si el nivel vibracional ms bajo del estado excitado de A se ubica por debajo que el estado de equilibrio del donador, una vez que la energa se le ha transferido, ocurre una conversin interna rpidamente a su nivel vibracional ms bajo. El grado de transferencia de energa est determinado por la distancia entre D y A, y el grado de sobrelapamiento espectral. Por conveniencia, ste (Figura 5b) se describe en trminos de la distancia de Frster (R0). La velocidad de transferencia de energa a kET (r) est dado por: kET (r) = (1/_D) (R0/r)6 donde r es la distancia entre D y A, y _D es el tiempo de vida del donador sin transferencia de energa. La eficiencia de la transferencia de energa para un par donador-aceptor a una distancia fijada es:

E=

R 06 . R0 + r6
6

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Acoplamiento vibracional Estado excitado

Donador de emisin

Absorcin

Figura 5. (a) Sobrelapamiento espectral de FRET; (b) El mecanismo de la transferencia de energa no colisional.

Por tanto el grado de transferencia depende de la distancia, r. Afortunadamente, las distancias Frster son comparables en tamao a las macromolculas biolgicas, 30-60. Por esta razn, la transferencia de energa se ha usado como una regla espectroscpica para la medicin de distancias entre sitios en protenas. Una de las condiciones primarias para que ocurra el FRET es que las orientaciones de la transicin dipolo del donador y del aceptor estn aproximadamente en paralelo. La distancia a la cual el 50% de las molculas donadoras se desactivan por FRET (50% eficiencia), es definida por el radio de Fster (R0). La magnitud de R 0 depende de las propiedades espectrales de donador y receptor (Tabla 1).

donde, K 2 es el factor de orientacin dipolo (rango 0 a 4); K 2=2/3 para donadores y aceptores orientados al azar; QYD es la eficiencia cuntica de fluorescencia del donador en ausencia del aceptor; n es el ndice de refraccin; J(_) es la integral del sobrelapamiento espectral = _A(_) FD(_)_4 d_ cm3 M-1 (_A es el coeficiente de extincin del aceptor; FD es la intensidad de emisin de fluorescencia del donador como una fraccin de la intensidad total integrada).

En el estado excitado singlet (nivel vibracional ms bajo), una molcula tiene un tiempo de vida de aproximadamente 10-8 s, y por tanto las reacciones qumicas, reversibles o no, pueden ocurrir de dicho estado. Frecuentemente las reacciones del estado excitados son diferentes de las reacciones de la misma molcula en estado basal. Ya que S1 es un estado electrnico que tiene una distribucin electrnica diferente de S0, el estado basal, la molcula puede sufrir cambios en el sobrelapamiento de sus orbitales moleculares. Una nueva configuracin de enlaces puede resultar en la formacin de una nueva molcula o

Fluorescencia int. o absorcin

Fluorescencia

Aceptor de absorcin Longitud de onda

Estado basal Molcula D Molcula A

(a)

(b)

R0 = [8.8 x 1023 K2 n4 QYD J(_)]1/6

REACCIONES QUMICAS

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fotoproducto. Este es un proceso fotoqumico que tiene una constante de velocidad asociada, kPR, que compite con otros procesos de desactivacin del estado excitado.
Tabla 1. Valores tpicos de R0 para algunos pares donador-aceptor. Donador Aceptor Ro () Fluorescena Tetramethylrhodamina 55 IAEDANS fluorescena 46 EDANS Dabcyl 33 Fluorescena fluorescena 44 BODIPY FL BODIPY FL 57 Fluorescena QSY 7 y QSY 9 61

Todos estos procesos diferentes de desactivacin del estado excitado compiten unos con otros. Sus diferentes procesos cinticos se resumen en la Tabla 2.
Tabla 2. Sumario de los procesos de desactivacin de estados excitados singlet de una molcula, M. Absorcin de un fotn: despus de la M(S0) + hv _ M(S1) relajacin vibracional a S1(0) Cruzamiento intersistemas M(S1) _ M(T1) kISC Fotoqumica M(S1) _ Producto kPR No radiativa (Conversin interna) M(S1) _ M(S0) kNR Fluorescencia (radiativa ) M(S1) _ M(S0) + hv kR Transferencia de energa por Apagador M(S1) + [Q] _ M(S0) + [Q] kQ [Q] Transferencia de energa por M(S1) + Aceptor _ M(S0) + Aceptor kET Resonancia M(S1) corresponde a la molcula excitada electrnicamente, M.

CARACTERSTICAS Y PARMETROS DE LA FLUORESCENCIA

El fenmeno de la fluorescencia presenta ciertas caractersticas generales, con excepciones poco frecuentes. En general, si un fluorforo dado no presenta cualquiera de las caractersticas, se puede inferir un comportamiento especial para ese compuesto.

ESPECTRO DE FLUORESCENCIA
La luz emitida por una molcula a partir de su estado excitado singlet en su nivel vibracional ms bajo, S1(0), corresponde a la diferencia de energa de ste con un nivel vibracional de S 0. Habr un espectro de energa de los fotones que fluorescen, y este espectro (Figura 6) es el que se mide en el espectrofluormetro. La longitud de onda (wavelength) _0 corresponde a la transicin radiativa de S1(0) a S0(0). Esta es la transicin de energa ms grande y es la diferencia de energa entre estos dos estados. En _MAX, la longitud de onda corresponde a la intensidad de fluorescencia ms alta, la transicin de S1(0) a S0(n) representa la transicin radiativa ms probable entre estos dos estados. Los datos del espectro de fluorescencia se presentan generalmente en un espectro de emisin de fluorescencia, un PLOT de las intensidades de fluorescencia versus longitudes de onda (nanmetros) o nmero de onda (cm-1). Los espectros de emisin varan ampliamente y son dependientes de la estructura qumica del fluorforo y del solvente en cual est disuelto. Los espectros de algunos compuestos, como el perileno, muestran una estructura significativa debida a los niveles de energa vibracional individuales de los

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estados basal y excitado. Otros compuestos, como la quinina, muestran espectros que carecen de la estructura vibracional (Figura 7).
Fluorescencia (unidades arbitrarias)
6 5 4 3 2 1 0 290 310 330 350 370 390

Longitud de onda (nm)

Figura 6. Espectro de fluorescencia tpico que representa la distribucin de energa de los fotones de S1(0) a diferentes niveles vibracionales del estado basal, S0.

Longitud de onda (nm) Intensidad de fluorescencia (normalizada) Coeficiente de extincin M cm Coeficiente de extincin M cm

Longitud de onda (nm) Intensidad de fluorescencia (normalizada)

Sulfato de quinina en 1M H2SO4

Perileno en benceno

Absorcin

Emisin

Absorcin

Emisin

Nmero de onda

Nmero de onda

Figura 7. Espectros de absorcin y emisin de perileno y quinina. El espectro de emisin no se puede presentar correctamente en longitud y nmero de onda a la vez.

Una propiedad de la fluorescencia es que el mismo espectro de emisin se observa generalmente independientemente de la longitud de onda de excitacin. Esto es conocido como la regla Kasha, aunque Vavilov report en 1926 que la eficiencia cuntica (quantum yield) era generalmente independiente de la longitud de onda de excitacin. Debido a la rpida relajacin del exceso de energa de un fluorforo (10-12 s), los espectros de emisin son usualmente independientes de la longitud de onda de excitacin. Hay excepciones, como los fluorforos que existen en dos estados de ionizacin, cada uno de los cuales muestran distintos espectros de emisin y absorcin. Tambin, se sabe que algunas molculas emiten a partir del nivel S2, pero tales emisiones son raras y generalmente no se observan en molculas biolgicas. Es interesante observar que el perileno sigue la regla de la Imagen de Espejo, pero la emisin de la quinina exhibe un pico en lugar de los dos picos vistos en su espectro de excitacin a 310 y 335 nm. En el caso de la quinina, el pico de absorcin de longitud de
15

onda ms corta se debe a la excitacin al segundo estado excitado (S2), que se relaja rpidamente a S 1. El espectro de emisin de la quinina es la imagen especular de la absorcin S0 _ S 1, y no de su espectro de absorcin total. Esto es cierto para la mayora de los fluorforos. La naturaleza generalmente simtrica del especto es el resultado de la misma transicin, involucrada tanto en la absorcin como en la emisin y las similitudes de los niveles de energa vibracional de S0 y S 1. En muchas molculas estos niveles de energa no estn significativamente alterados por las diferentes distribuciones de S0 y S 1. De acuerdo al principio Franck Condon, todas las transiciones electrnicas son verticales, esto es, ocurren sin cambio en la posicin del ncleo. Como resultado, si la particular probabilidad de transicin (factor Franck-Condon) entre los niveles vibracionales cero y dos es la ms grande en la absorcin, la transicin recproca es tambin ms probable en la emisin (Figura 8).

Enega

Figura 8. Regla de imagen de espejo y factores Frank-Condon.

Aunque frecuentemente se sigue la regla de la imagen de espejo, ocurren muchas excepciones a esta regla, como cuando el espectro de emisin muestra estructuras vibracionales. Algunos fluorforos tambin pueden formar complejos con ellos mismos. El caso mejor conocido es el pireno. A bajas concentraciones, ste muestra una emisin altamente estructurada. A altas concentraciones la emisin UV previamente invisible se vuelve visible a 470 nm. Esta emisin de amplia longitud de onda se debe a la formacin de un eximero, un dmero de estado excitado (excited-state dimer). Otros procesos del estado excitado pueden cambiar el espectro de emisin y pueden o no, cambiar el perfil de espectral. La acridina despliega dos espectros de emisin que dependen del pH. El pka de disociacin del protn es 5.45 en estado basal. Sin embargo, la emisin del grupo acridina se puede observar a valores de pH mayores. Esto, porque el pka del estado excitado es 10.7, y por tanto la acridina puede unir un protn del solvente durante su tiempo de vida excitado. Tambin pueden ocurrir cambios en el pk a en el estado excitado de fluorforos bioqumicos. Por ejemplo, el fenol y la tirosina, cada uno de ellos muestran dos emisiones, la emisin de longitud de onda larga siendo favorecida por una alta concentracin de aceptores de protones.

EFICIENCIA CUNTICA (QUANTUM YIELD)

El tiempo de vida de la fluorescencia y la eficiencia cuntica son probablemente las caractersticas ms importantes de los fluorforos. La eficiencia cuntica _F se define como la fraccin de las molculas excitadas que fluorescen, de acuerdo a esto: _F = nmero de fotones emitidos . nmero total de fotones absorbidos

Enega Distancia 16

Abs.

Emisin

Longitud de onda

Obviamente, el valor mximo de _F es 1, esto es que todas las molculas que han sido excitadas a S1 regresen a S0 por la emisin de un fotn de luz. Se puede mostrar que _F est relacionado con las constantes de velocidad mencionadas antes: _F = kR . kR + kNR + kISC + kPR

Otros procesos pueden ser incluidos en esta relacin. El denominador de esta expresin se relaciona con A, la absorbancia de la molcula. Si I0 es la intensidad de la luz excitante en fotones s-1 entonces la intensidad integrada de la fluorescencia, IF (fotones s-1) es: IF _ (nmero total de fotones absorbidos / s, IA) (_F) Y de la ley de Beer-Lambert: A = _cl y _cl = log (I0/I) donde I es la intensidad de la luz transmitida en fotones s-1. y IA = I0 I = I0 (1 10-_cl) IF = I0 (1 10-_cl) (_F)

As que la seal fluorescente integrada depende de la intensidad de la luz incidente, la absorbancia de la muestra a la longitud de onda de excitacin, _EX, y de _F. Para molculas altamente fluorescentes, como rodamina B y fluorescena, la eficiencia cuntica alcanza la unidad, mientras que para otras, la fluorescencia es tan dbil que no es posible observarla y su eficiencia cuntica se aproxima a cero. Sin embargo, aun cuando se emita un cuanto de radiacin en fluorescencia, este cuanto ser de menor energa en promedio que el cuanto absorbido, debido a la relajacin vibracional. El cambio en la energa del fotn causa un cambio en el espectro de fluorescencia hacia longitudes de onda ms amplias, respecto al espectro de absorcin. Este fenmeno observado por Sir G. G. Stokes en 1852 se denomina cambio de Stokes (Stokes shift).

TIEMPO DE VIDA DE RADIACIN (LIFETIME)

Si se excita una muestra con un pulso infinitamente angosto de luz, creando una poblacin de molculas en estado S 1, se puede escribir una ecuacin diferencial que relaciona la concentracin de M(S1) en cualquier tiempo, t, con los diferentes procesos de desactivacin: -d M(S1) / dt = (kR + kNR + kISC + kPR ) M(S1) y la integracin lleva a: M(S1)(t) = M(S1)(0) e-_kt

donde M(S1)(t) es la concentracin M(S1) en cualquier tiempo t; M(S1)(0) es la concentracin de M(S1) al tiempo t = 0; y _k = k R + k NR + k ISC + k PR. Ya que IF _ M(S1), se puede escribir la expresin: IF(t) = IF(0)e-_kt Por definicin, el tiempo de vida de un estado excitado singlet, M(S1), es:

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_S = 1 . kR + kNR + kISC + kPR mostrando que el estado excitado singlet tiene un tiempo de vida finito que depende de la eficiencia de los diferentes procesos de desactivacin que compiten. El tiempo de vida de radiacin de S1 est definido de acuerdo a: _R = 1 / kR As, si el nico proceso de desactivacin de S1 es fluorescencia, siendo _S = _R, y _F = 1. Una relacin importante es: _ F _R = _ S Cuando se miden _ S y _ F, se puede calcular la constante de velocidad molecular intrnseca, kR = _R.

ANISOTROPA DE FLUORESCENCIA
Sobre la excitacin con luz polarizada, la emisin de muchas muestras tambin est polarizada. El grado de polarizacin de la emisin se describe en trminos de la anisotropa (r). Las muestras que exhiben anisotropas distantes de cero se dicen que despliegan una emisin polarizada. El origen de este fenmeno se basa en la existencia de momentos de transicin para la absorcin y emisin las cuales caen a lo largo de direcciones especficas en la estructura del fluorforo. En soluciones homogneas los fluorforos en estado S0 se encuentran orientados al azar. Cuando se exponen a la luz polarizada, estos fluorforos que tienen sus momentos de transicin de absorcin orientados a lo largo del vector elctrico de la luz incidente son excitados de manera preferencial. Por tanto, la poblacin en estado excitado no se encuentra orientada al azar. La despolarizacin de la emisin puede ser causada por un nmero de fenmenos. La difusin rotacional de los fluorforos es una causa comn. Las mediciones de anisotropa revelan el promedio del desplazamiento angular del fluorforo que ocurre entre la absorcin y emisin del fotn. Este desplazamiento angular depende de la velocidad y grado de difusin rotacional durante el tiempo de vida del estado excitado. Estos movimientos difusivos dependen a su vez de la viscosidad de los solventes y del tamao y forma de la molcula que rota. Para fluorforos en solucin, depende del arrastre viscoso impuesto por el solvente, por lo que, el cambio en la viscosidad del solvente resultar en un cambio en la anisotropa. Para fluorforos pequeos en solucin de baja viscosidad, la velocidad de difusin rotacional es tpicamente ms rpida que la velocidad de emisin. Bajo estas condiciones, la emisin es despolarizada y la anisotropa se acerca a cero.

FLUORESCENCIA DE ESTADO ESTABLE (STEADY-STATE) Y RESUELTA EN TIEMPO (TIME-RESOLVED)

Las mediciones de la fluorescencia se pueden clasificar en dos tipos. Las mediciones de estado estable son aquellas que se realizan con constante iluminacin y observacin. La muestra es iluminada con un haz continuo de luz, y se registra la intensidad o espectro de emisin (Figura 9). Debido a la escala en nanosegundos de la fluorescencia, la mayora de

18

las mediciones son de este tipo. Cuando la muestra se expone a la luz, casi inmediatamente se alcanza el estado estable. El segundo tipo de medicin, las mediciones resueltas en tiempo, se usa para medir decaimientos de intensidad o decaimiento de anisotropa (r). Para estas mediciones, la muestra es expuesta a un pulso de luz con una anchura que es tpicamente ms corta que el tiempo de decaimiento de la muestra (Figura 9). Este decaimiento de intensidad es registrado con un sistema de deteccin de alta velocidad que permite que la intensidad o anisotropa sean medidas en una escala de tiempo de nanosegundos. La observacin de estado estable es simplemente un promedio del fenmeno resuelto en tiempo sobre el decaimiento de intensidad de la muestra. Por ejemplo, considerando un fluorforo que despliega un solo tiempo de decaimiento (_) y un solo tiempo de correlacin rotacional (_), la intensidad y decaimiento de anisotropa estn dados por: I(t) = I0e t/_ r(t) = r0e-t/_ donde I0 y r0 son, respectivamente, las intensidades y anisotropas al t = 0, inmediatamente despus del pulso de excitacin.

Log I(t)

Estado estable: Iluminacin y observacin constante

Figura 9. Comparacin de la espectrofluorescencia resuelta en tiempo y de estado estable.

Las mediciones resueltas en tiempo tpicamente requieren instrumentos ms complejos y caros, sin embargo, hay muchas razones para su uso. Mucha informacin molecular disponible de la fluorescencia se pierde durante los procesos que promedian el tiempo. Por ejemplo, los decaimientos de anisotropa de macromolculas fluorescentes son frecuentemente ms complejos que un solo exponencial. El decaimiento de intensidad tambin contiene informacin que se pierde durante un proceso promediado. Frecuentemente, las macromolculas existen en ms de una conformacin, y el tiempo de de decaimiento de una sonda unida puede depender de conformacin. El decaimiento de intensidad puede revelar dos tiempos de decaimiento, y por tanto la presencia de ms de

1(_) Longitud de onda (nm) Tiempo (ns)

Tiempo (ns)

19

Log r(t) Tiempo (ns) Tiempo-resuelta: excitacin pulsada y alta velocidad de deteccin.

un estado conformacional. La intensidad de estado estable revelara una intensidad promedio dependiente del promedio de los dos tiempos de decaimiento. Hay ms numerosas razones adicionales para las mediciones de fluorescencia resueltas en tiempo. Estas mediciones tambin revelan si el apagamiento es debido a difusin o a la formacin de complejos con fluorforos en estado basal. En fluorescencia, mucha de la informacin molecular est disponible de mediciones resueltas en tiempo.

FLUORFOROS
Recapitulando, los fluorforos son molculas fluorescentes que tienen un espectro de absorcin y emisin bien definidos; existe una diferencia entre los picos de absorcin y emisin de un fluorforo (Stokes shift); la intensidad de su fluorescencia emitida vara con la longitud de excitacin, pero no vara la distribucin de su espectro (Figura 10). Entre los ms utilizados se pueden encontrar molculas orgnicas simples y protenas fluorescentes.

Figura 10. La excitacin de un fluorforo a tres diferentes longitudes de onda (EX 1, EX 2, EX 3) no cambia el perfil de emisin, pero produce variaciones en la intensidad de emisin de fluorescencia (EM 1, EM 2, EM 3) que corresponden a la amplitud del espectro de excitacin.

Los fluorforos se pueden dividir en dos grandes clases: intrnsecos y extrnsecos. Los fluorforos intrnsecos se hallan de manera natural, e incluyen los aminocidos aromticos, NADH, flavinas y derivados del piridoxal y clorofila (Tabla 3). Si bien la eficiencia cuntica de la tirosina es similar al triptofano, su espectro de emisin est menos distribuido en la escala de longitud de onda. Esto da la impresin de una mayor eficiencia cuntica para la tirosina.
Tabla 3. Parmetros de fluorescencia de aminocidos aromticos en agua a pH neutro. Amplitud Eficiencia Tiempo Especie _EX (nm) _EM (nm) de onda (nm) cuntica de vida (ns) Fenilalanina 260 282 0.02 6.8 Tirosina 275 304 34 0.14 3.6 Triptofano 295 353 60 0.13 3.1

Los cofactores de las enzimas frecuentemente fluorescen. El NADH es altamente fluorescente, con un mximo de emisin y absorcin a 340 y 460, respectivamente. El cofactor piridoxal fosfato tambin es fluorescente. Sus espectros de emisin y absorcin son dependientes de su estructura qumica en la protena. La riboflavina, FMN y FAD absorben
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Fluorescencia de excitacin

Espectro de Espectro de excitacin excitacin

Espectro de emisin

Fluorescencia de emisin

Longitud de onda

luz en el rango visible (~450 nm) y emiten alrededor de 535 nm. En contraste con el NADH, las formas oxidadas de las flavinas son fluorescentes, y no las formas reducidas. Los cidos nucleicos y nucletidos en general no fluorescen, sin embargo existen excepciones. El tRNAPE de levadura contiene una base altamente fluorescente, la base Yt. Por otro lado, los fluorforos extrnsecos se agregan a la muestra para proveer fluorescencia cuando no existe o para cambiar las propiedades del espectro de la muestra. stos incluyen a la fluorescena y la rodamina, entre otras numerosas sustancias. En el caso de las protenas, es frecuente su marcaje con cromforos que tienen longitudes de excitacin y emisin ms grandes que los aminocidos aromticos, una gran variedad de fluorforos se pueden encontrar en catlogos de sondas moleculares. Un nmero grande de fluorforos estn disponibles para el marcar covalentemente, o no, protenas. Las sondas covalentes pueden tener una variedad de grupos reactivos, para acoplarse con aminas, sulfhidrilos, o cadenas laterales de las histidinas. El cloruro de Dansilo (DNS-Cl, Figura 11) fue descrito por Weber en 1951. El DNS-Cl es usado ampliamente para marcar protenas, especialmente donde se anticipan mediciones de polarizacin. Su vasto uso es el resultado de su temprana introduccin en la literatura y su tiempo de vida favorable (~10 ns). Los grupos Dansilo se pueden excitar a 350 nm, donde las protenas no absorben, sin embargo, debido a que absorben cerca de los 350 nm, pueden servir como aceptores de la fluorescencia de protenas. El espectro de emisin del motivo dansilo es altamente sensible a la polaridad del solvente, y las emisiones mximas son tpicamente prximas a 520 nm.

DNS-Cl

5-IAF

FITC

TRICT Acrilodan NBD-Cl

Figura 11. Sondas reactivas para conjugacin con macromolculas.

Las fluorescenas y rodaminas tambin son muy usadas como marcadores extrnsecos. En contraste con los grupos Dansilo, no son susceptibles a la polaridad del solvente. Una razn adicional para su amplio uso es su alto coeficiente de extincin molar, cercano a 80,000 M-1 cm-1 (Tabla 4). Una amplia variedad de reactivos derivados estn disponibles, incluyendo iodoacetamidas, isotiocianatos, y maleimidas. Iodoacetamidas y maleimidas se usan

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tpicamente para marcar grupos sulfhidrilos mientras que los isotiotiocianatos, N hidroxiciccinimida y cloruros sulfonilos (sulfonyl chlorides) se usan para marcar aminas.
Tabla 4. Propiedades espectrales de fluorescencia de sondas extrnsecas muy usadas.

Emisin (nm) _ (ns) _ _ (M-1 cm-1) DNS-Cl 340-350 4,300 510-560 0.1-0.3 10-15 FITC 492 72,000 516-525 0.3-0.85 4.5 TRITC 535-545 107,000 570-580 2.0 NBD 470 12,900 550 DNS-Cl, Dansyl chloride; FITC, fluorescein 5-isothiocyanate; NDB, 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4yl; TRITC, tetramethylrhodamine 5-(6-)isothiocyanate.

Fluorforo

Absorcin (nm)

Un problema de la fluorescena es su tendencia a apagarse a s misma. Esto se debe a su pequeo cambio de Stokes (Figura 12a). Cuando ms de un grupo de fluorescena est unido a una protena, puede ocurrir transferencia de energa entre ellos. Esto se entiende dndose cuenta que dos grupos de fluorescena unidos a la misma protena parecen estar a 40 uno del otro, lo cual est en la distancia Fster para la transferencia de energa.

Absorbancia o Fluorescencia

Figura 12. Espectro de excitacin y emisin de (a) superior: FITC; inferior: DNS-Cl marcados con anticuerpos; (b) Espectro de excitacin y emisin del Casade Yellow en metanol.

Por dicha razn, se buscan fluorforos con cambios de Stokes ms grandes, como el DNS-Cl. Sin embargo, su hidrofobicidad se vuelve un problema en altos grados de marcaje, resultando en la agregacin de la protena. Esta es una de las causas de que se estn desarrollando nuevos fluorforos que tengan grandes cambios de Stokes y buena solubilidad en agua. Uno de esos fluorforos es el Cascade Yellow (Figura 12b). Su mayor cambio de Stokes minimiza su tendencia para homotransferirse y el cambio en los anillos aromticos ayuda en su solubilidad. Un acoplamiento exacto entre una lnea particular de emisin de un lser y el mximo de absorcin de una sonda especfica no siempre es posible, pero la eficiencia

Fluorescencia relativa Longitud de onda (nm)

(a)

Longitud de onda (nm)

(b)

22

de excitacin de lneas cercanas al mximo es usualmente suficiente para producir un nivel de fluorescencia detectable rpidamente. En la figura 13 se muestran los espectros de absorcin de dos sondas comunes. La excitacin de FITC a 488 nm usando un lser de argn produce una eficiencia de absorcin de alrededor del 87%. En contraste, cuando las lneas de 477 o 514 nm del lser de argn se usan para excitar FITC, la eficiencia de emisin alcanza solo 58 28%, respectivamente. Claramente, la lnea lser de 488 nm del lser argn (o criptn-argn) es la fuente ms eficiente para excitar este fluorforo.

Excitacin

Figura 13. Espectros de absorcin de dos sondas comunes con las lneas de excitacin de un lser eficiente. En verde, el perfil de absorcin de FITC cuyo mximo de absorcin es 495 nm. En rojo, el perfil de absorcin de Alexa Fluor 546.

Alexa Fluor 546 tiene un coeficiente de extincin mximo de 556 nm, y est diseado para dar mayor una eficiencia cuntica a niveles significativamente reducidos de fotoblanqueo en experimentos de fluorescencia. La lnea espectral ms eficiente para excitar Alexa Fluor 546, es la lnea amarilla de 568 nm de un lser criptn-argn, con una eficiencia cuntica de ~84%. Las lneas espectrales siguientes ms cercanas, de 543 nm del lser verde helio-nen y de 594 nm del lser amarillo helio-nen, excitan este fluorforo con eficiencias de 43 y 4%, respectivamente. La lnea de 488 nm del lser argn (Figura 13) excita Alexa Fluor 546 con una eficiencia de ~7%, un factor que puede ayudar cuando se hacen experimentos duales de marcaje con FITC y Alexa Fluor 546. Alexa Fluor, una marca registrada de Molecular Probes, son derivados de rodamina sulfonada que exhiben mayor eficiencia cuntica para emisiones de fluorescencia ms intensas que las sondas similares espectralmente, y tienen caractersticas mejoradas, que incluyen mayor fotoestabilidad, espectros de absorcin acoplados a lneas de lser comunes, insensibilidad al pH, y mayor grado de solubilidad en agua. La notacin alfanumrica de los colorantes est asociada con el lser de excitacin especfico o las lneas espectrales para las cuales las sondas fueron diseadas (Figura 14). Tambin existe un grupo de fluorforos que no se unen a las protenas covalentemente. Los de esta clase, frecuentemente fluorescen dbilmente o no fluorescen en agua pero fluorescen fuertemente cuando estn unidos a protenas (apomyoglobinas) o membranas. El marcaje de membranas se realiza comnmente por simple particin de las sondas insolubles en agua en las regiones no polares de la
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Intensidad relativa (%)

Excitacin

Excitacin

Alexa

Longitud de onda (nm)

membrana. DPH es una de las sondas ms comunes. La adicin de DPH a una suspensin de membrana resulta en la completa unin, sin que haya una emisin significativa del DPH en la fase acuosa. Las membranas tambin se pueden marcar con sondas ms solubles en agua como la fluorescena y la rodamina. En tales casos las sondas pueden ser forzadas a localizarse en la membrana por unin a largas cadenas acilo o a fosfolpidos.

Figura 14. Algunos fluorforos sintticos Alexa Fluor, de Molecular Probes.

La sensibilidad de la deteccin de fluorescencia frecuentemente se ve limitada por la autofluorescencia de las muestras biolgicas. Conforme la longitud de onda de excitacin se vuelve mayor, disminuye la autofluorescencia y por tanto la deteccin sobre el fondo aumenta. Los colorantes de longitud de onda grande se pueden excitar con fuentes simples de lser. Estos colorantes estn disponibles en la clase de colorantes de cianina, como Cy3, Cy5 y Cy7, que tienen longitudes de onda de absorcin y emisin por arriba de 650 nm y muestran pequeos cambios de Stokes. Otros colorantes de longitud de onda grande son la rodamina 800, oxazina, IR-125 y Thiazole Orange. La familia de los colorantes de cianina, Cy2, Cy3, Cy5, Cy7 y sus derivados est basada en un ncleo heterocclico parcialmente saturado con dos unidades aromticas conectadas por un polialqueno de nmero variable de carbonos (Figura 15). Estas sondas muestran perfiles de excitacin y emisin similares a la fluorescena, pero tiene mayor solubilidad en agua, fotoestabilidad y mayor eficiencia cuntica. La intensidad de su emisin fluorescente es menos sensible a pH que los fluorforos tradicionales y, de manera similar a los Alexa Fluor, sus longitudes de excitacin estn diseadas para usarse con fuentes de lser comunes. Entre los colorantes de cianina, se incluyen los derivados Cy5 de amplia longitud de onda (Figura 15), que se pueden excitar en la regin roja del espectro (650 nm) y emiten en el rojo lejano (680 nm). Este fluorforo es eficientemente excitado por la lnea espectral de 647 nm del lser criptn-argn, y la lnea 644 del lser helio-nen. Entre las sondas que unen DNA, se encuentran el bromuro de etidio (EB), homodmero de etidio, Naranja de acridina, TOTO, DAPI, y Hoechst 33342. Uno de los ms usados es el EB, que aunque fluoresce muy dbilmente en agua, su intensidad se incrementa cerca de 30 veces unido al DNA. El tiempo de vida del EB es cerca de 1.7 ns en agua y 20 ns unido a DNA de doble cadena por intercalacin de sus anillos aromticos planos entre las pares de bases del dsDNA. A veces se desea detectar substancias silenciosas espectroscpicamente, como Cl-, Na+, o Ca2+. Esto es posible usando fluorforos sensores como Fura-2, MQAE, Verde Calcio y Carboxy Snarf-6 (Tabla 5). La sonda MQAE (N(ethoxycarbonylmetyl)-6-methoxy quinolinium) es colisionalmente apagada por cloruro de acuerdo a la ecuacin Stern-

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Volmer, permitiendo que se pueda calcular la concentracin de cloruro por el grado de apagamiento.
Absorbancias relativas e intensidades
Longitud de onda (nm)

Espectro de absorcin

Espectro de emisin

Figura 15. Estructura y perfiles espectrales de algunos fluorforos de cianina. Tabla 5. Algunos fluorforos sensores de iones y pH, sus tiempos de vida media, mximos de absorcin y de emisin en sus formas libre y unidos. Sensores Fluorescentes Tiempo de vida media [ns] Absorcin Mx [nm] Emisin Mx [nm] libre Enlazado libre enlazado libre enlazado a) Sensores de Calcio Fura-2 1.09 1.68 362 335 500 503 Indo-1 1.4 1.66 349 331 482 398 Ca-Verde 0.92 3.66 506 506 534 534 Ca-Naranja 1.20 2.31 555 555 576 576 Ca-Crimson 2.55 4.11 588 588 610 612 Quin-2 1.35 11.6 356 336 500 503 b) Sensoress de Magnesio Mg-Quin-2 0.84 8.16 353 337 487 493 Mg-Verde 1.21 3.63 506 506 532 532 c) Sensores de potasio PBFI 0.52 0.59 350 344 546 504 d) Sensores de Sodio Sodio verde 1.13 2.39 507 507 532 532 e) Sensores de pH SNAFL-1 1.19 3.74 539 510 616 542 Carboxy-SNAFL-1 1.11 3.67 540 508 623 543 Carboxy-SNAFL-2 0.94 4.60 547 514 623 545 Carboxy-SNARF-1 1.51 0.52 576 549 638 585 Carboxy-SNARF-2 1.55 0.33 579 552 633 583 Carboxy-SNARF-6 1.03 4.51 557 524 635 559 Carboxy-SNARF-X 2.59 1.79 575 570 630 600 Resorufina 2.92 0.45 571 484 587 578 BCECF 4.49 3.17 503 484 528 514

25

Otro tipo de sondas son las fluorognicas. Estas son dbilmente fluorescentes o no fluorescen hasta que ocurre un evento, como la ruptura enzimtica. Una sonda tpicamente fluorognica es 7-UmP (7-Uberlliferyl phosphate), que no es fluorescente como ster fosfato, pero se vuelve altamente fluorescente por hidrlisis. 7-UmP se usa para medir la actividad de la fosfatasa alcalina. Las sondas fluorognicas tambin se pueden basar en la transferencia de energa. Por otro lado, aunque las protenas despliegan fluorescencia debido a sus aminocidos aromticos o grupos prostticos, varias clases de protenas muestran fluoescencia intrnseca a longitudes de onda mayores. Las filicobiliprotenas son protenas fluorescentes de algas verde-azules y rojas. Contienen ficobilisomas, que colectan la luz que no es absorbida por la clorofila, sin embargo, a pesar de la remocin de stos, la ficobiliprotenas son altamente fluorescentes. Un elemento de este grupo es la protena fluorescente verde (GFP) del pez (jellyfish) bioluminiscente Aequorea victoria. GFP tiene un grupo fluorescente en una regin altamente restringida y protegida (figura 16). Es remarcable que el cromforo se forma espontneamente a pesar del desdoblamiento de la protena. Es posible crear mutantes con propiedades espectrales diferentes. Se conocen mutantes de esta protena que despliegan espectros de absorcin y emisin de longitud de onda grande, y las cuales muestran menos dependencia de la excitacin.

(a)

(b)

Figura 16. Protena fluorescente verde, GFP. (a) el cromforo consiste de un tripptido cclico formado por Ser65, Tyr66 y Gly 67. (b) la localizacin del cromforo en la hlice _ dentro del barril _ de 11 lminas de GFP.

La salida de fluorescencia de un fluorforo dado depende de la eficiencia con la cual absorba y emita fotones, y de su habilidad para sufrir repetidos ciclos de excitacinemisin. Las eficiencias de absorcin y emisin son mayormente cuantificadas en trminos del coeficiente de extincin molar para la absorcin y la eficiencia cuntica para la fluorescencia. Ambos son constantes en condiciones ambientales especficas. El valor del coeficiente de extincin molar es especfico a una sola longitud de onda (usualmente el mximo de absorcin), mientras que la eficiencia cuntica es una medida de la emisin total de fotones en el perfil espectral fluorescente completo. La intensidad de fluorescencia por molcula de fluorforo es proporcional al producto de la eficiencia cuntica y el coeficiente de extincin molar. El rango de estos parmetros entre fluorforos de importancia prctica es aproximadamente de 5000 a 200,000 cm-1M-1 para _ y 0.05 a 1.0 para la eficiencia cuntica.

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Hay una gran diversidad de molculas fluorescentes (Tabla 6), y numerosas interacciones y procesos pueden alterar las caractersticas espectrales. Los fluorforos se pueden unir covalentemente o no a las macromolculas, o pueden ser diseados para interactuar con iones especficos. La emisin puede ocurrir del UV o el NIR (infrarojo cercano), y las sondas pueden tener tiempos de vida cortos (nanosegundos) o largos (microsegundos a milisegundos).
Tabla 6. Longitudes de onda de excitacin y emisin de algunas sondas utilizadas en la investigacin e fluorescencia y aplicaciones. La posicin de la mxima depende del solvente utilizado en la medicin. Esta tabla solo intenta dar una indicacin del rango de longitud de onda cubierto por cada fluorforo. Fluorforo Excitacin [nm] Emisin [nm] 5-Hydroxytryptamina (HAT) 370-415 520-540 Acridina amarilla 470 550 Acridina naranja 500 530 Alexa Fluor 488 494 519 Alexa Fluor 532 530 555 Alexa Fluor 546 554 570 BODIPY 500/510 508 515 BODIPY 530/550 534 554 Cascada azul 375 410 Coumarina 384 470 CY2 489 506 CY3 548 562 CY5 650 670-700 Dansylo 340 520 DAPI 345 458 DPH 354 430 Bromuro de Etidio 510 595 FITC 494 518 Fluorescena 495 517 FURA-2 340/380 500/530 GFP 395/489 509 Hoechst 33258 365 480 Hoechst 33342 355 465 Lucifer amarilla CH 428 535 Rojo Nilo 485 525 Verde Oregn 488 493 520 Verde Oregn 500 503 522 Verde Oregn 514 511 530 Prodan 361 498 Pireno 341 376 Rhodamina 110 496 520 Rhodamina 123 505 534 Rhodamina 6G 525 555 Rhodamina B 540 625 SITS 336 438 SNARF 480 600/650 Stilbene SITS, SITA 365 460 Rojo de Texas 589 615 TOTO-1 514 533 YOYO-1 491 509 27

YOYO-3

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EFECTOS DEL SOLVENTE

La polaridad del solvente y el ambiente local tienen profundos efectos en el espectro de emisin de los fluorforos polares. Estos efectos son el origen del cambio de Shift. Los espectros de emisin son medidos fcilmente y, como resultado, hay numerosas publicaciones de espectros de emisin de fluorforos en diferentes solventes, y cuando estn unidos a protenas, membranas y cidos nucleicos. Un uso comn de los efectos del solvente es determinar la polaridad del sitio de unin de la sonda en la macromolcula. Esto se realiza comparando los espectros de emisin y/o la eficiencia cuntica del fluorforo cuando est unido a la macromolcula y cuando est disuelto en solventes de diferente polaridad. La emisin de los fluorforos generalmente ocurre a longitudes de onda mayores que la absorcin. Esta prdida de energa se debe a una variedad de procesos dinmicos que signe a la absorcin de la luz. Cuando un fluorforo es excitado, el exceso de energa vibracional es rpidamente cedido al solvente (Figura 17). Si el fluorforo es excitado a un estado singlet S2, rpidamente decae al estado S1 en 10-12 s debido a la conversin interna. Los efectos del solvente cambian esta emisin a niveles de energa an ms bajos debido a la estabilizacin del estado excitado por las molculas polares del solvente. Tpicamente el fluorforo tiene un momento dipolo ms grande en el estado excitado (_ E) que en el estado basal (_ G). Despus de la excitacin, los dipolos del solvente pueden reorientar o relajar alrededor de _E, lo cual baja la energa del estado excitado. Como la polaridad del solvente se incrementa, este efecto se hace mayor tambin, resultando en la emisin a energas ms bajas o mayores longitudes de onda.

S2 S1 __

Conversin interna y relajacin vibracional (10-12 s)

Solvente menos polar Solvente ms polar

Relajacin del solvente (10-10 s)

h_A

(10-15 s) h_F _G

h_F

Figura 17. Diagrama de Jablonski para fluorescencia con relajacin de solvente.

En general, solo los fluorforos que son polares por s mismos muestran una gran sensibilidad a la polaridad del solvente. Las molculas no polares, como los hidrocarburos aromticos no sustituidos, son mucho menos sensibles a la polaridad del solvente. Los tiempos de vida de la fluorescencia (1-10 ns) son usualmente ms largos que el tiempo requerido para la relajacin del solvente. Para solventes lquidos a temperatura ambiente, la relajacin del solvente ocurre en 10-100 ps.

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Adems de las interacciones solvente-fluorforo, muchos fluorforos pueden formar un estado de transferencia de carga interno (ICT), o un estado de transferencia de carga interna distorsionada (TICT). En la descripcin de los efectos generales del solvente, el fluorforo es considerado como un dipolo en un medio continuo de constantes dielctricas uniformes. En este marco, interacciones especficas solvente-fluorforo, o formacin de los estados ICT, se pueden detectar como desviaciones de esta teora. Ya que este modelo es debido a interacciones qumicas, no podemos esperar que la teora explique los efectos de interacciones especficas solvente-fluorforo. Las interacciones entre el solvente y el fluorforo afectan la diferencia de energa entre el estado basal y el excitado. En una primera aproximacin, esta diferencia de energa (en cm-1) es una propiedad del ndice refractivo (n) y la constante dielctrica (_) del solvente y es descrito por la ecuacin Lippert:

_A - _F

2 hc

_1 2_ + 1

n2 1 n2 + 1

( _E _G )2 + constante a3

En esta ecuacin _A y _F son los nmeros de onda (cm-1) para la absorcin y la emisin, respectivamente. h=6.6256 x 10-27 erg, h es la constante de Planck, c=2.9979 x 1010 cm/s es la velocidad de la luz, y a es el radio de la cavidad en la cual el fluorforo reside. La ecuacin de Lippert es una aproximacin en la cual los trminos de orden mayor son descuidados. Estos trminos contaran para efectos de segundo orden, como momentos dipolo inducidos en las molculas de solvente por el fluorforo excitado, y viceversa. Una descripcin cuantitativa de los efectos del ambiente en el espectro de emisin de fluorescencia es probablemente el tpico ms difcil en la espectroscopa de fluorescencia. No hay una teora o tipo de interaccin que pueda usarse en todas las circunstancias. Hay al menos tres efectos comnmente observados: 1. Efectos generales del solvente debidos a interacciones del dipolo del fluorforo con su ambiente. 2. Efectos especficos del solvente debidos a interacciones fluorforo-solvente. 3. Formacin de estados ICT o TICT dependientes de la estructura de la sonda y el solvente circundante. An cuando solo un tipo de interaccin estuviera presente, los efectos seran complejos y ms all de los lmites de la mayora de los modelos. Por ejemplo, la ecuacin Lippert es slo una aproximacin e ignora los trminos de orden superior, adems, solo aplica a dipolos esfricos en una cavidad esfrica. Se necesitan expresiones ms complejas para molculas no esfricas, pero generalmente no se puede describir la forma del fluorforo en detalle. Respecto a los efectos especficos, no hay una teora general que prediga el cambio en el espectro de emisin debido a la formacin de puentes de hidrgeno. Finalmente, para fluorforos unidos a macromolculas o en solventes viscosos, la relajacin espectral puede ocurrir durante la emisin, de tal forma que el espectro de emisin representa el promedio de la emisin relajada y no relajada.

ESPECTROFLUORMETROS.
Los componentes principales de cualquier espectrofluormetro son: la fuente de luz, el selector de onda, la celda para la muestra, un segundo selector de onda para aislar la
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fluorescencia emitida y el detector. En la figura 18 se muestra un esquema general de un espectrofluormetro.

Monocromador dual de rejilla de excitacin TFM

Fuente de luz Lmpara de arco de xenn

TFM

Obturador Contenedor del filtro Mdulo ptico Polarizador

Monocromador de emisin

Cmara de la muestra

Salida de datos

Adquisicin y anlisis de datos

Figura 18. Diagrama esquemtico de un espectrofluormetro. TFM, Tubo fotomultiplicador.

Un espectrofluormetro ideal debera de cumplir con las siguientes caractersticas: 1. La fuente de la luz debe de producir una salida de fotones constantes a todas las longitudes de onda. 2. El monocromador debe de pasar fotones de todas las longitudes de onda con la misma eficiencia. 3. La eficiencia del monocromador debe de ser independiente de la polarizacin. 4. El detector (tubo fotomultiplicador) debe de detectar los fotones de todas las longitudes de onda con la misma eficiencia. Desafortunadamente estos elementos ideales no existen, por lo cual se debe de realizar una seleccin adecuada y hacer las correcciones pertinentes de la respuesta no ideal.

LA FUENTE DE LUZ
Los fotones correspondientes a la fluorescencia que pasan a travs del monocromador de emisin son slo una pequea fraccin del total de la intensidad. Por
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lo tanto es necesario el uso de una fuente que tenga una salida relativamente alta. La mayora de los espectrofluormetros tienen una lmpara de arco de xenn (Figura 19) de alta presin como fuente de excitacin ya que produce un espectro continuo de alta intensidad que va de 200-1000 nm. Estas lmparas emiten luz como resultado de la recombinacin de electrones con tomos ionizados de xenn. Estos iones son generados por la colisin de los tomos de xenn con los electrones que fluyen a travs del arco.

Terminal + Cable iniciador nodo Ctodo Franja de conductores de molibdenum Terminal -

Bulbo de cuarzo Xenn

Figura 19. Lmparas de arco de xenn (Hamamatsu).

La salida, que dependiente de la longitud de onda de las lmparas de xenn, es la mayor razn para la distorsin del espectro de excitacin de los componentes los cuales absorben en el ultravioleta. El gas en las lmparas de xenn se encuentra bajo alta presin (aproximadamente 10 atm) por lo que siempre, al manejar este tipo de lmparas, se deben de usarse lentes de seguridad. La envoltura de cuarzo no debe de ser tocada, si lo es, debe de limpiarse con algn solvente como etanol ya que los residuos de las huellas digitales se quemarn, quedando una mancha en la cobertura de cuarzo provocando un posible fallo de la lmpara. Por supuesto la lmpara nunca debe de ser observada directamente cuando est encendida, ya que puede daar la retina o la cornea. Las lmparas de xenn tienen una vida til aproximada de 2000 hrs. Otras lmparas que tambin se pueden utilizar son las de mercurio de alta presin, las de arco de xenn-mercurio, las de mercurio de baja presin y otra fuente de luz como el LASER. Las lmparas de mercurio de alta presin tienen intensidades mayores que las de xenn pero la intensidad est concentrada en lneas. Estas lmparas son tiles si las lneas de mercurio son aptas para las longitudes de onda de excitacin del fluorforo. Las lmparas de arco de xenn-mercurio tienen mayores intensidades que las de xenn en el ultravioleta y la presencia de xenn ayuda a ensanchar el espectro de salida. Las lmparas de mercurio de baja presin producen una lnea de mercurio muy afilada la cual es til para calibrar. Las fuentes de luz antes mencionadas se usan para estados estables o iluminacin continua, lo cual implica que no pueden ser usadas en pulsos o amplitud modulada para mediciones resueltas en tiempo. Las lmparas de arco usadas para mediciones de tiempos de vida de fase modulada usan moduladores de luz externos.

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Finalmente, los LASER (Ligth Amplification by Stimulated Emission of Radiation) se utilizan desde los aos 70 como fuentes de excitacin para medidas de fotoluminiscencia. Los LASER sintonizables de colorante, tienen un inters particular, ya que utilizan como sistema de bombeo, un LASER de nitrgeno pulsante o un LASER de Nd: YAG. La mayora de los espectrofluormetros comerciales utilizan lmparas (ya descritas) como fuentes, por ser menos caras y menos complicadas en su uso. Sin embargo, las fuentes de LASER ofrecen importantes ventajas en determinados casos, por ejemplo, cuando las muestras son muy pequeas como en cromatografa con microcolumnas y en electroforesis capilar donde la cantidad de muestra es de uno o menor; en los sensores de control remoto, como en la deteccin fluorimtrica de radicales hidroxilo en la atmsfera o de clorofila en seres vivos acuticos, donde la naturaleza colimada de los haces de LASER es vital; o cuando se requiere una radiacin de excitacin altamente monocromtica para minimizar los efectos de las interferencias fluorescentes. La tabla 7 presenta diferentes fuentes de luz utilizadas principalmente para microscopa confocal, pero que tambin pueden usarse para espectrofluorimetra.
Tabla7. Lneas de espectros de LASER y lneas espectrales de descarga Fuente Argn Diodo DPSS He-Cd Kr-Ar Kriptn He-Ne Arco de Hg Arco de Xe U.V. 351, 364 355 322, 354 365 Violeta 405, 440 430, 442 442 405, 436 Azul 457, 477, 488 457, 473 488 467 Verde 514 532 543 546 Amarillo 561 568 594 579 Naranja 593 612 Rojo 635, 640 638 647 647 633 Cerca del IR 650, 685 660, 671 676 676, 752 -

COMPONENTES DE EXCITACIN DE LA MUESTRA

La luz emitida por la fuente de excitacin es colectada con espejos y enfocada a travs de lentes en un haz de luz. La longitud de onda de excitacin apropiada se determina de un espectro de absorcin y se selecciona usando filtros o monocromadores. La excitacin por un doble monocromador es ventajosa cuando se est trabajando con muestras que tienen un alto grado de dispersin, como suspensiones celulares, miscelas, o preparaciones de membranas. Esto reduce dramticamente el desvo de luz que pasa a travs del monocromador y cae en la muestra. El uso de un doble monocromador resulta en un descenso en la luz de salida y por lo tanto se puede necesitar una fuente ms potente.

SELECTORES DE LONGITUD DE ONDA

Hay un gran nmero de monocromadores disponibles comercialmente que pueden ser usados para aislar una lnea particular de una fuente de luz. Adems de seleccionar la longitud de onda para la mxima transmisin, tambin se debe de
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considerar la mitad del ancho de banda que define el rango de longitudes de onda que se transmitir. La intensidad de la luz transmitida ser reducida tanto, como el ancho de la banda. La longitud de onda de excitacin, o longitud de onda de fluorescencia, de la luz es usualmente seleccionada a travs de un monocromador. Se prefiere un muy buen monocromador ya que el recproco de la dispersin, D-1, es constante sobre todas las longitudes de onda. D-1, es el parmetro que relaciona el ancho de banda efectivo de una longitud de onda pasando a travs de un monocromador al ancho de la hendidura (mm) del monocromador y tiene unidades de nm mm-1. La intensidad de luz que pasa a travs de monocrmador es aproximadamente proporcional al cuadrado del ancho de la hendidura. El valor de D-1 depende de la calidad del monocromador, pero tpicamente vara de 2-8 nm mm-1. Las especificaciones de un monocromador incluyen, la dispersin y los niveles de desviacin de la luz. Cuando se selecciona un monocromador para espectrofluorimetra, se busca niveles bajos de desviacin de luz para evitar problemas debidos a la dispersin. Se elige un monocromador de alta eficiencia para maximizar la habilidad de detectar bajos niveles de luz. La resolucin normalmente tiene una importancia secundaria ya que el espectro de emisin raramente tiene picos con anchos menores de 5 nm. La eficiencia de la transmisin de un monocromador de rejilla est en funcin de la longitud de onda. La eficiencia puede ser maximizada eligiendo el ngulo de brillo (blaze angle), el cual es determinado por la forma y ngulo de la herramienta usada para generar la rejilla. La eficiencia de la transmisin de los monocromadores de rejilla est en funcin de la longitud de onda. Generalmente, se elige un monocromador de excitacin con una alta eficiencia en el ultravioleta y uno de emisin con alta eficiencia en el espectro visible. Una caracterstica importante de los monocromadores de rejilla es que la eficiencia de la transmisin depende de la polarizacin de la luz. El espectro de emisin de una muestra puede modificar la eficiencia segn la longitud de onda y alterado en forma, dependiendo de las condiciones de polarizacin elegidas para correr el espectro de emisin. Consideremos un espectro de emisin corrido con cualquier tipo de rejilla, pero a travs de una polarizacin orientada horizontal o verticalmente figura 20. El espectro corrido con una polarizacin vertical aparenta cambiar a longitudes de onda relativas ms cortas a aquellas con polarizacin horizontal. Esto es debido a que la eficiencia de transmisin para luz polarizada verticalmente es mayor a longitudes de onda menores. Este cambio de espectro podra ser observado independientemente de la muestra, y de si la emisin fue polarizada o no. Es muy importante comparar solamente aquellos resultados que hayan sido corridos en condiciones idnticas, incluyendo la orientacin del polarizador.

Eficiencia % Longitud de onda, nm

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Figura 20. Eficiencias para transmisin vertical (l) y horizontal (_) de luz polarizada. Tambin se muestra la eficiencia de transmisin para luz no polarizada (O).

Una forma de evitar estas dificultades es usar una orientacin definida de los polarizadores cuando se corre un espectro de emisin. Un mtodo muy empleado es usar las condiciones del ngulo mgico. Esto es que el polarizador de excitacin se encuentre orientado verticalmente y el polarizador de emisin orientado a 54.7 de la vertical. El uso de estas condiciones resulta en una seal proporcional al total de la intensidad de la fluorescencia (IT) la cual est dada por: IT = I V + 2 I H Donde IV e IH son las intensidades de emisin polarizadas vertical y horizontalmente. Las caractersticas de polarizacin de los monocromadores tienen importantes consecuencias en las medidas de polarizacin de fluorescencia. Las mediciones deben de ser corregidas por la variacin de eficiencias de cada componente, lo cual es expresado como el factor-G. La medida del factor-G es generalmente llevada a cabo usando luz polarizada horizontalmente, y la intensidad de este componente debe de ser baja. Para medidas de fluorescencia, la desviacin de los niveles de luz del monocromador es, posiblemente, el parmetro ms crtico. La desviacin de la luz se encuentra definida como cualquier luz que pasa a travs del monocromador adems de aquella longitud de onda deseada. Toda la potencia de la fuente de luz entra al monocromador de excitacin. Las longitudes de onda del ultravioleta son usadas para la excitacin, y la intensidad debe de ser 100 veces menor que la salida visible de la lmpara. Las intensidades de fluorescencia son frecuentemente bajas. La desviacin de la luz a longitudes de onda de emisin mayores puede ser pasada por el monocromador de excitacin y ser fcilmente tan intensas como la fluorescencia misma. Muchas muestras biolgicas son turbias, por lo tanto la desviacin de la luz de entrada a la longitud de onda de emisin puede ser dispersada e interferir con la medicin de intensidad de fluorescencia. Por esta razn, normalmente se usan dos monocromadores de rejilla para la excitacin. Los dobles monocromadores son menos eficientes y por lo tanto se sacrifica la sensibilidad. Generalmente, slo un bajo porcentaje de la luz de excitacin es absorbida por los fluorforos y los rendimientos de fluorescencia pueden ser menores. La seal de fluorescencia usualmente no es 1000 veces menos intensa que la luz de excitacin. Si consideramos una suspensin turbia de membranas, de la cual deseamos observar la fluorescencia de protenas unidas a membrana, la longitud de onda de excitacin y emisin deben de ser cercanas a 280 y 340 nm respectivamente. Ya que la emisin del monocromador es imperfecta, parte de la luz dispersada a 280 nm puede pasar a travs del monocromador de emisin a 340 nm. Asumiendo que el monocromador de emisin discrimina contra 280 nm por un factor de 10-4, la intensidad de la luz dispersa a 280 nm puede ser fcilmente 1000 veces ms intensa que la fluorescencia a 340 nm. Por lo tanto el 10% de la fluorescencia puede de hecho ser debida a la dispersin de la luz de excitacin. Tambin es importante reconocer que la dispersin de la luz es altamente polarizable, tpicamente 100%. Por lo tanto el desvo de la dispersin de la luz puede invalidarse fcilmente.

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Un parmetro esencial que no debe de pasar desapercibido es correr una muestra blanco en cada experimento. El blanco est conformado exactamente como las muestras pero sin fluorforo. Este tipo de control, permite calcular y controlar la dispersin, adems de que revela si en la muestra se encuentran impurezas fluorescentes, como es el caso de muchas plantas, ya que la clorofila fluoresce en rojo y los compuestos fenlicos (que se liberan en plantas bajo estrs) en verde. Si el blanco fuera analizado con el polarizador de emisin en una orientacin horizontal, uno puede concluir errneamente que la cantidad de luz dispersada no es significante. Cuando se analizan los espectros por la presencia de luz dispersada, es preferible mantener ambos polarizadores en posicin vertical y maximizar la probabilidad de observar la seal de interferencia.

CALIBRACIN DE LOS MONOCROMADORES

Dado lo anterior, podemos inferir la gran importancia de mantener calibrados correctamente los monocromadores. Para la calibracin se utiliza una lmpara de baja presin de mercurio que tiene la forma de un pequeo cilindro de 5 mm de dimetro y se ajusta en el contenedor de la celda mediante un bloque que tiene la forma de la celda. Este contenedor tiene un pequeo agujero que permite que una pequea cantidad de luz entre al monocromador de emisin. Es importante atenuar la luz para evitar que el tubo fotomultiplicador o los amplificadores se daen. Las medidas de las longitudes de onda son comparadas con valores conocidos (Tabla 7) y si es que existen desviaciones constantes, se recalibra hasta que coincidan. En caso de que la escala de longitudes de onda no sea linear, el monocromador debe de ser enviado al fabricante para que sea realineado.
Tabla 7. Longitudes de onda e intensidades relativas de lneas de mercurio* Longitud de onda Intensidad relativa Longitud de onda Intensidad relativa nm Nm 253.7 100 366.3 0.1 296.5 0.6 404.7 0.9 302.2 1.1 435.8 1.7 312.6 0.7 546.1 1.2 313.2 1.1 577 0.2 365 0.9 579 0.2 365.5 0.2 * Los valores de las intensidades relativas son slo aproximaciones.

FILTROS PTICOS
La mayor fuente de error en las mediciones de fluorescencia es la interferencia debida a la dispersin y desviacin de la luz. Para minimizar este problema se usan filtros pticos adems de los monocromadores. Para ilustrar la utilidad de los filtros considera un filtro en la ruta de la luz de excitacin (Figura 21). Un filtro como A puede remover la desviacin de la luz a la longitud de onda de observacin previa a su llegada y dispersin de la muestra. De esta forma uno puede bloquear la desviacin de la luz que pas por el monocromador de excitacin. De manera alternativa, uno puede emplear filtros para eliminar la dispersin de la luz previa a su llegada al monocromador de emisin. Cualquiera de los filtros B o C puede llevar a cabo esta tarea. El filtro B no distorsionar el

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espectro de emisin, mientras que el filtro C atenuar selectivamente el lado corto de la longitud de onda de la emisin.

Figura 21. Uso de filtros pticos. A. Filtro de excitacin. B, C. filtros de emisin.

Frecuentemente se desea observar la fluorescencia de emisin sin considerar la distribucin de la longitud de onda, bajo estas circunstancias se remueve el monocromador de emisin del sistema, y se observa la emisin a travs del filtro el cual remueve la dispersin de la luz. Este procedimiento resulta en un incremento en la sensibilidad debido a que el filtro de pase de banda (bandpass) de observacin se ve incrementado y se remueve la atenuacin causada por el monocromador.

COMPARTIMIENTO DE LA MUESTRA
Las celdas utilizadas en espectrofluorimetra tienen las cuatro caras lisas, ya que en la mayora de los instrumentos los fotones son detectados en un ngulo de 90 con respecto al haz de incidencia. La geometra de 90 es usada para minimizar cualquier interferencia en la deteccin de la luz fluorescente. En la mayora de los casos las celdas estn elaboradas de silica fusionada (cuarzo) pero si la longitud de onda de excitacin y fluorescencia se encuentran sobre 300 nm se pueden utilizar celdas de plstico. Los procesos de desactivacin de S1(0) son usualmente dependientes de altas temperaturas por lo tanto el contenedor de la celda debe de ser termoestable. Los fotones de la fluorescencia son colectados con lentes y enfocados a un selector de longitud de onda. Un contenedor de muestras que pueda llevar cuatro celdas en una torre rotatoria es ventajoso. De esta manera otras muestras y soluciones blanco pueden ser mantenidas a la misma temperatura.

EFECTO DE LA GEOMETRA DE LA MUESTRA

La aparente intensidad fluorescente y la distribucin del espectro pueden ser dependientes de la densidad ptica de la muestra y de la geometra de la iluminacin de la muestra. Algunos tipos de celdas se muestran en la figura 22.

Intensidad de fluorescencia Longitud de onda, nm

Eficiencia de filtro de transmisin (------)

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Figura 22. Varios arreglos en la geometra para observar la muestra.

La intensidad de la fluorescencia es proporcional a la concentracin nicamente dentro de cierto rango de densidades pticas. Supongamos una celda de 1 x1 cm la cual es iluminada centralmente y observada en el ngulo correcto. Asumamos que la densidad ptica es de 0.1 a la longitud de onda de excitacin. Usando la definicin de densidad ptica (D.O = log Io/I) la intensidad de la luz (I) en el centro de la celda es de 0.88 Io. Ya que la intensidad de la fluorescencia observada es proporcional a la intensidad de la luz de excitacin, el rendimiento aparente ser el 10 % menor que el observado para una solucin infinitamente diluida. Este efecto es conocido como de filtro interior y puede disminuir la intensidad de la excitacin al punto de observacin, o disminuir la fluorescencia observada por la absorcin de esta fluorescencia. El efecto de filtro interior es causado por uno o dos factores: absorcin de la fluorescencia de emisin por una especie en solucin, o la absorcin de una fraccin significante de la radiacin de excitacin por algunas especies en solucin. El efecto de filtro interno especficamente no incluye aquellos procesos en los cuales disminuye la tendencia de la molcula a emitir fluorescencia despus de que ha sido excitada; este proceso afecta la eficiencia cuntica de la molcula y es referida como apagado. Este efecto est manifestado de diferentes formas, pueden verse alterados la excitacin y emisin de espectros, la curva de calibracin de concentracin contra fluorescencia puede no ser linear a altas concentraciones. En aquellos casos donde el fluorforo es responsable del efecto de filtro interno es conveniente diluir la muestra para corregir la medicin. Una forma prctica de evitar la posible existencia de este efecto es que la absorcin de la solucin no exceda el 5% cuando se trabaja con el arreglo de ngulo correcto. Para demostrar los efectos de la densidad ptica en la intensidad de la fluorescencia, podemos considerar los datos mostrados en la figura 23. La intensidad es proporcional a la densidad ptica slo cuando sta es de 0.05 o inferior. El efecto de filtro interno puede ser corregido aproximando de la manera siguiente: supongamos que la muestra tiene una densidad ptica significante de excitacin y de emisin (DOex, DOem); estas densidades atenan la excitacin y la emisin por 10-1/2DOex y 10-1/2DOem, respectivamente. La intensidad de la fluorescencia corregida estar dada aproximadamente por:

DOex Fcorr = Fobs anti log

+ DOem 2

Las intensidades corregidas se muestran en la grfica. Se puede observar como en los valores inferiores de la densidad ptica ambos datos (medidos y corregidos) se sobrelapan perfectamente. Para que las correcciones sean ms precisas, es preferible
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preparar curvas de calibracin usando los compuestos y condiciones a los cuales se va a realizar el experimento.

Figura 23. Efecto de densidad ptica en la intensidad de fluorescencia de sulfato de quinina.

Intensidad de fluorescencia

FCORR FOBS

Densidad ptica

DETECTORES
Para el anlisis de fluorescencia, han sido utilizados diferentes tipos de detectores. Casi todos los espectrofluormetros usan tubos fotomultiplicadores (TFM). Los TFM son considerados los mejores como fuente de corriente, la cual es proporcional a la intensidad de la luz. Un TFM consiste de un fotoctodo y una serie de electrodos (dynodes) los cuales son etapas de amplificacin (Figura 24). El fotctodo es una delgada capa de metal que se encuentra por el lado interno de la ventana. Los fotones incidentes causan que los electrones sean lanzados de la superficie.

Entrada de fotn Ventana Fotoctodo

Electrodos

nodo

Electrodo de enfoque Fuente Medidor de salida

Figura 24. Tubo fotomultiplicador TFM.

El fotoctodo y los electrodos permanecen a un potencial negativo, pero mientras para el fotoctodo es alto, tpicamente de 1000 a 2000 V, para los electrodos disminuyen hacia cero a lo largo de la cadena, por lo tanto cada electrodo tiene una carga positiva mayor que su predecesor. El potencial del fotoctodo al primer electrodo generalmente est a
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un voltaje constante (50-200 V). Son estas diferencias de potencial las que causan la salida del fotoelectrn y que sea acelerado hacia el primer electrodo, una vez que ste colisiona provoca la salida de 5-20 electrones ms, dependiendo de la diferencia de voltaje al electrodo. Este proceso contina a travs de la cadena de electrodos hasta que una corriente llega al nodo. El tamao del pulso depende de del voltaje aplicado al TFM.

CONTADOR DE FOTONES CONTRA DETECCIN ANLOGA DE FLUORESCENCIA

Los tubos fotomultiplicadores pueden ser operados en modo anlogo o en contador de fotones, En el modo de contador de fotones los pulsos del nodo individual debidos a cada fotn son detectados y contados, como resultado, el sistema de deteccin es operado en los lmites tericos de sensibilidad. Adems de incrementar la sensibilidad, la estabilidad de los sistemas de deteccin pueden incrementarse, esta es la razn por la que los TFM son operados a alto voltaje. Pequeos cambios en este voltaje no produce cambios significativos en la eficiencia con la que cada fotn es contado, por esta razn, la deteccin por contadores de fotones es frecuentemente usada cuando los niveles de la seal son bajos y cuando es necesario promediar longitudes de onda repetitivas para incrementar la razn entre seal y ruido. Una desventaja de la deteccin por contadores de fotones es que la ganancia de TFM no puede ser variada por cambios en el voltaje aplicado. Otra desventaja es que el contador de fotones es el limitado rango de intensidad sobre el cual la razn de conteo es lineal. Si dos pulsos llegan muy cercanos en tiempo al nodo, sern contados como un solo pulso. Para eventos aleatorios, el conteo necesita ser aproximadamente 100 veces menor para evitar la llegada simultnea de dos fotones. Adems, la razn entre la seal y el ruido se vuelve poco satisfactoria a conteos inferiores a 10,000 fotones por segundo. Este rango de intensidad limitada es una desventaja de la deteccin por contador de fotones para mediciones en estado estable de fluorescencia. En el modo anlogo los pulsos individuales son promediados La corriente de cada pulso contribuye al promedio de la corriente en el nodo, y la llegada simultnea de los pulsos no es un problema. Cuando se usa deteccin anloga la ganancia del sistema de deteccin puede ser variada cambiando ya sea la ganancia del amplificador o el voltaje en el TFM, como resultado un rango ms amplio de los niveles de la seal pueden ser detectados sin preocupacin sobre una respuesta no linear. La alta precisin de las mediciones anlogas requiere amplificadores estables y fuentes de alto voltaje, lo cual actualmente no es un gran problema. Las mediciones en contadores de fotones son menos sensibles a estos factores.

DESVIACIONES DE LA LEY DE LAMBERT-BEER

La ley de Beer dice que la densidad ptica es directamente proporcional a la concentracin de las especies que absorben. Sin embargo se dan desviaciones de esta ley tanto por causas instrumentales como intrnsecas.

DISPERSIN DE LA LUZ
Existen dos fenmenos de dispersin, uno depende del tamao de la partcula de soluto o cualquier material suspendido. Las muestras biolgicas son usualmente turbias ya que las macromolculas u otros grandes agregados dispersan la luz. Las densidades
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pticas resultantes de la dispersin de la luz son proporcionales a 1/ 4 (dispersin de Rayleigh), y puede por lo tanto ser reconocida fcilmente como un fondo de absorcin el cual se incrementa rpidamente con la disminucin de la longitud de onda. El segundo tipo de dispersin se conoce como la dispersin de Raman. En este fenmeno, parte de la energa de excitacin de la luz es abstraida por modos vibracionales de las molculas del solvente. En el caso del agua o solventes hidroxlicos, las vibraciones ms dominantes que absorben esta energa son los grupos OH, cuya energa de vibracin es observada a una longitud de onda de 3300 cm-1. La seal de Raman de los solventes ser observada a una longitud de onda que es 3300 cm-1 menor en energa que la longitud de onda de excitacin. La longitud de onda de la dispersin de Raman ( RA) puede ser calculada como: RA-1 = ex-1 - 0.00033.

FLUORESCENCIA
Si la densidad ptica de la muestra es alta, y si las especies que absorben son fluorescentes la luz emitida puede alcanzar el detector. Este proceso resultar en derivaciones de la ley de Beer. El efecto puede ser minimizado manteniendo la distancia del detector de la muestra, y de ese modo disminuye la eficiencia con lo cual la fluorescencia de emisin es colectada.

AGREGADOS
Si las especies que absorben son slo parcialmente solubles entonces pueden formar agregados cuando aumente su concentracin y el espectro de absorcin de los agregados puede ser diferente del de los monmeros. Un ejemplo es el azul de bromofenol, que a concentraciones alrededor de 10 mg/ml se observa una solucin roja, mientras que la concentracin disminuye parece azul. Dependiendo de la longitud de onda elegida para realizar la medicin, la desviacin puede ser positiva o negativa.

ANLISIS DE DATOS DEFINICIN DE SENSIBILIDAD

La definicin de sensibilidad de fluorescencia y el uso del mismo se encuentra relacionada con la eficiencia cuntica de la substancia. La sensibilidad de la fluorescencia se encuentra definida por: F donde, F, es la eficiencia cuntica de la fluorescencia y , es el coeficiente de extincin molar a determinada longitud de onda. Esta entidad es independiente del instrumento en el cual se haya medido la eficiencia cuntica. Parker y Rees extendieron este concepto usando el coeficiente de extincin molar, la absorbancia (densidad ptica) por centmetro para un compuesto con una concentracin de 1 g/ml. Este valor es denominado Dmax si se usa la absorbancia a la longitud de onda de la mxima absorcin. El producto de la eficiencia cuntica por Dmax constituye la sensibilidad de la fluorescencia. Esta sensibilidad es calculada asumiendo que toda la banda de fluorescencia es observada. Si, de cualquier manera, uno est
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trabajando con un espectrofluormetro, entonces slo una pequea banda de frecuencias cercanas al pico de fluorescencia son usualmente observadas, y la sensibilidad de la fluorescencia quedar definida por:

F Dmax H
donde H es la mitad del ancho del espectro de fluorescencia. La fuente, particularmente si es de mercurio, y la respuesta caracterstica del sistema detector, afecta seriamente la sensibilidad de un instrumento. Por esta razn, la curva de sensibilidad y las caractersticas de emisin de la fuente y del espectrofluormetro deben de ser conocidas para hacer efectivo el uso de la sensibilidad de la fluorescencia.

CONVERSIN ENTRE LONGITUD DE ONDA Y NMERO DE ONDA

Los valores expresados en longitud de onda se convierten fcilmente a nmero de onda simplemente tomando el recproco. De cualquier manera, el paso de banda, en cm-1, no es constante cuando los datos se obtienen en longitud de onda. Por ejemplo, si tenemos un pase de banda constante = 2 1, donde 1 y 2 son las longitudes de onda en cada lado de la mxima transmisin (Figura 25). A 300 nm un filtro de pase de banda () de 2 nm es equivalente a una resolucin de 222 cm-1. A 600 nm, el mismo filtro de pase de banda es equivalente a una resolucin (v) de 55 cm-1. Por lo tanto, como la longitud de onda se incrementa, en cm-1, disminuye con el cuadrado de la longitud de onda de excitacin. Si el espectro es obtenido en una forma usual de la intensidad por intervalo de longitud de onda (I()/), despus la conversin de la escala en nmero de onda requiere que cada intensidad sea multiplicada por 2, I(v) = 2 I()

Nmero de onda (cm-1)

Longitud de onda (nm) Figura 25. Espectro de emisin en escala de longitud de onda y de nmero de onda.

Intensidad de fluorescencia 41

El efecto de esta conversin de longitud de onda a nmero de onda se ilustra en la figura 25. La multiplicacin de los resultados por 2 en un alargamiento de la longitud de onda de emisin mxima.

CURVAS DE CALIBRACIN
La aplicacin del anlisis de fluorescencia a problemas de naturaleza cuantitativa es alcanzada usualmente a travs del uso de curvas de calibracin las cuales se realizan graficando intensidad contra concentracin. Estas curvas de calibracin son usualmente lineares en la regin de 10-4 a 10-6 molar, a mayores concentraciones la fluorescencia usualmente alcanza su mximo y despus disminuye rpidamente. Este fenmeno se conoce como apagamiento de la concentracin, pero la causa es usualmente la presencia de un efecto de filtro interno.

DATOS DEL ESPECTRO

Los mtodos ms comunes para representar los espectros de emisin y excitacin han sido graficar la salida del fotomultiplicador contra la longitud de onda. Con este sistema es imposible comparar los datos obtenidos en diferentes instrumentos. Incluso con instrumentos producidos por el mismo proveedor, los factores de correccin o las curvas de calibracin, son muy diferentes. Por lo tanto, se propone que slo el espectro corregido sea presentado. Ya que existen muchos compuestos sensibles a diferentes longitudes de onda, los espectros corregidos (en algunas ocasiones denominados espectros verdaderos) son los nicos vlidos para comparar. Especficamente ha sido propuesto que lo espectros sean graficados colocando en el eje vertical los cuantos relativos (relative quanta) por intervalo de frecuencia y en el eje horizontal el nmero de onda (en -1 o cm-1). Esto se debe a que si se grafica en la escala de longitud de onda, las bandas tienden a ser agrupadas en las regiones del espectro donde las longitudes de onda son pequeas. Por otra parte, si se grafica con e patrn recomendado de escala en nmero de onda, ser ms sencillo comparar con los espectros de absorcin. Se recomienda usar cuantos relativos (relative quanta) p o r unidad de frecuencia en el eje vertical ya que el rea integrada bajo la curva ser proporcional a la eficiencia cuntica.

CORRECCIN DE LOS ESPECTROS DE FLUORESCENCIA

Cuando los espectros de fluorescencia, teniendo diferentes formas y distribuciones de longitud de onda, son comparados cuantitativamente es necesario corregir para la sensibilidad combinada del monocromador de emisin/TFM dependiente de la longitud de onda. Si el espectro de un soluto bajo diferentes condiciones de muestra tiene formas idnticas y solamente vara en intensidad, entonces no es necesario hacer una correccin instrumental. Los TFM no tienen una sensibilidad fotnica constante a travs del rango de espectro UV-visible. En la figura 26 se muestra una curva tpica de sensibilidad de fotones para un TFM comnmente usado. Esta sensibilidad contra la variacin en la longitud de onda distorsionar el verdadero espectro de fluorescencia del soluto y conducir a errores en la cuantificacin, especialmente donde la integracin del espectro es llevado a cabo.

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Figura 26. Curva del espectro de sensibilidad de Hamamatsu R955 TFM.

Existen tres mtodos para generar curvas corregidas de los espectros para estas variaciones. Una es medir el espectro de fluorescencia de compuestos estndar cuyo espectro de fluorescencia real haya sido determinado y reportado. Despus los factores de sensibilidad pueden ser calculados comparando las mediciones del espectro experimental con el espectro de referencia. Un segundo mtodo es iluminar un slido dispersador, como MgO, el cual se coloca en un contenedor de muestra, usando una lmpara de tungsteno calibrada que puede proporcionar el Instituto Nacional de Tecnologa de Estndares de Estados Unidos. Estas lmparas actan como radiadores de cuerpo negro, la luz del dispersador pasa a travs del monocromador de emisin y es detectada por el TFM. La curva del espectro medido es comparada con los valores de calibracin obtenidos con la lmpara, de esta manera se realizan las correcciones correspondientes. Una limitacin de este procedimiento es que las lmparas de tungsteno tienen una salida insignificante a longitudes de onda inferiores a 360 nm, por lo cual una curva de correccin puede llevarse a cabo de 360 a 800 nm. Un tercer mtodo satisfactorio y sencillo consiste en colocar un plato difusor o un plato dispersor de MgO en el contenedor de la muestra y entonces tanto el monocromador de emisin como el de excitacin sufren un barrido de 250-600 nm. El reflector es reemplazado por una muestra concentrada de rodamina B en una celda triangular, se coloca un filtro rojo enfrente de la endidura de entrada y se usa una longitud de onda de emisin de 620 nm. Despus el ExM sufre un barrido de 250-600 nm. Este espectro es una representacin cercana de un perfil con una verdadera lmpara de xenn. Las dos curvas que se generan pueden ser comparadas y el factor de correccin de la curva, C(), es calculado:

Sensibilidad (mA/W)
100 200 300 400 500 600 700 800 900

Longitud de onda (nm)

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( ( )) C ( )+ FRB EX ,620nm

(FMM ( EX , EM ))

donde FRB(EX, 620 nm) es el espectro de la rodamina B con el monocromador de emisin constante a 620 nm y EX es variada, y FMM(EX, EM) es el espectro usando un plato de difusin de MgO tanto el monocromador de excitacin como el monocromador de emisin son variados sincrnicamente. Si FM() representa las mediciones no corregidas del espectro fluorescente de la muestra entonces un espectro de fluorescencia corregido de la muestra se puede obtener multiplicando C() y FM(): FM()CORR= C()FM() Por lo tanto la seal de fluorescencia en cada longitud de onda medida de la muestra es multiplicada por el factor de correccin a esa longitud de onda. En el apndice se encuentra el protocolo correspondiente a este ltimo mtodo para generar curvas corregidas de los espectros.

EFICIENCIA CUNTICA
Una entidad fsica fundamental, la cual es usualmente medida en un espectrofluormetro, es la eficiencia cuntica (el nmero de cuantos emitidos, dividido por el nmero de cuantos absorbidos). Se han descrito diversas tcnicas para medir la eficiencia cuntica. En uno de los mtodos, la fluorescencia es comparada con la luz dispersada por una solucin de glucgeno. Bajo condiciones especiales se asume que la solucin de glucgeno tiene una eficiencia cuntica de 1 y que puede ser usada como referencia. Otro mtodo parte de que si el total de la intensidad de fluorescencia de dos componentes puede ser medida en el mismo instrumento con la misma intensidad de luz de excitacin, y si las densidades pticas de dos componentes pueden ser medidas individualmente, entonces la razn de las eficiencias cunticas puede ser calculada. Si la eficiencia cuntica de un componente es conocida por estudios previos entonces puede ser una muestra de referencia para calcular la eficiencia cuntica del compuesto en cuestin. Este mtodo de comparacin depende de que se conozca la eficiencia cuntica de un compuesto de referencia y las condiciones bajo las cuales fue medida (estos datos se pueden obtener de la literatura o realizar las mediciones de manera independiente). Estas mismas condiciones, particularmente la temperatura (del compuesto de referencia), deben de ser reproducidas cuando se realice la medicin de la eficiencia cuntica de la fluorescencia del compuesto en cuestin. Parker y Rees determinaron las eficiencias cunticas de la fluorescena, eosina, rodamina B, tionina y antraceno usando bisulfato de quinina como compuesto de referencia y el valor de 0.55 para su eficiencia cuntica absoluta (obtenido del trabajo de Melhuish). Estos datos se enlistan en la tabla 8. Se incluyen compuestos representativos para los cuales las eficiencias cunticas han sido medidas. Melhuish tambin ha usado como eficiencia cuntica estndar bisulfato de quinina 5 mM en 1N de H2SO4 con longitudes de onda de excitacin de 313 y 366 m. Bajo estas condiciones y usando factores de correccin, la eficiencia cuntica es de 0.51

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Compuesto
Bisulfato de quinina Bisulfato de quinina Fluorescena Fluorescena Fluorescena Fluorescena Acriflavina Antraceno Antraceno Antraceno Antraceno 9-bromoantraceno 9,10-dibromoantraceno 9-cianoantraceno 9,10-difenilantraceno 9,10-difenilantraceno cido antranlico cido metil antranlico Benceno Fluorobenceno Clorofila a Clorofila a Clorofila b

Tabla 8. Eficiencias cunticas (E.C.) de fluorescencia en solucin Conca. Solvente E. C. Compuesto Conca. Eosina 0 1 N c. 0.55 1 x 10-5 Sulfrico Fluoreno 5 x 10-3 1 N c. 0.51 0 Sulfrico Indol 0 Agua 0.65 0 Mesoporfirina 0 0.1M NaOH 0.92 1 x 10-5 Naftaleno 0 0.1N NaOH 0.85 0.001 Naftaleno 1 x 10-5 NaOH ac. 0.79 0 2-Naftilamina 0 Agua 0.54 2.7 x 10-2 0 Etanol 0.28 1-Dimetilamino-naftaleno-4-sulfonato 0 2-Naftol 0 Benceno 0.29 10-3 Perileno 10-3 Poli(metil 0.24 2 x 10-3 metacrilato) Perileno 2 x 10-3 Benceno 0.241 5 x 10-4 1.5 x 10-3 1.5 x 10-3 1.5 x 10-3 1.5 x 10-3 10-3 8 x 10-3 2.7 x 10-2 0.003 0.0032 0 0 0 Benceno Benceno Benceno Benceno Poli(metil metacrilato) Benceno Benceno EPA (77K) EPA (77K) Benceno Benceno Metanol 0.05 0.213 0.796 0.84 0.83 0.536 0.549 0.16 0.17 0.26 0.325 0.06
Fenantreno Fenol Feofitina a Feofitina a Proflavina Pireno Rodamina b Rodamina b Riboflavina Rubreno Salicilato de sodio Tionina

Solvente Agua Etanol Agua Benceno EPA (77K) Alcohol Benceno Agua Agua pH 10 Benceno Poli(metil metacrilato) Alcohol Agua Benceno Metanol Agua pH 4 Poli(metil metacrilato) Etanol

E. C. 0.12 0.54 0.45 0.1 0.34 0.12 0.486 0.48 0.21 0.8 0.87 0.1 0.22 0.175 0.13 0.27 0.61 0.97 0.69 0.26 1.02 0.28 0.024 0.03 0.23

0 0 0 2.5 x 10-6 10-4 10-3 0 0 0 1 x 10-5 0 0

Etanol Agua n-Heptano Agua 0.1 N cido sulfrico Clorofila b Trifenileno 0 Etanol 0.095 9 x 10-4 EPA (77K) Difenilhexatrieno Eosina 10-3 Benceno 0.75 0 0.1N NaOH a 0 Indica una absorbancia (densidad ptica) a la longitud de onda de excitacin igual o menor a 0.05

PROBLEMAS QUMICOS COMPUESTOS FLUORESCENTES DE REFERENCIA

Los requerimientos para considerar a un compuesto como buena referencia son muy estrictos, debe de tener un amplio espectro de fluorescencia, ser un slido fcilmente purificable, ser soluble en agua, en algunos solventes orgnicos y estable al aire y luz. El compuesto de referencia usado debe de absorber en la misma regin del componente que est siendo estudiado y de manera anloga debe de fluorescer como el compuesto estudiado. La quinina y sus derivados se usan con mucha frecuencia, sin embargo hay regiones del espectro donde no son tiles, ya que o no absorben o no fluorescen. El antraceno y la fluorescena tambin se usados.

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MEDIO
Tanto los gases como los lquidos como los slidos han sido usados para realizar mediciones de fluorescencia. La presin de vapor limita el nmero de sistemas por el cual la fluorescencia puede ser medida en la fase gaseosa. Cuando se trabaja con la fase lquida, el medio ms comn, es importante mantener en mente que los efectos causados por los solventes son muy variados y complejos. Algunos solventes no son muy tiles para estudios de fluorescencia debido a que a sus propiedades de apagado. Las mediciones de fluorescencia en la fase slida han sido hechas con cristales, en pequeas esferas y en vidrios.

IMPUREZAS E INTERFERENCIA
Las impurezas en los solventes disminuyen la sensibilidad de los productos y a que los mtodos fluorimtricos son muy sensibles se han descrito diferentes formas de purificar los solventes utilizados. Tambin son fciles de conseguir comercialmente solventes fluoromtricos altamente puros. Adems de los solventes, los reactivos grado qumico, adsorbentes, papel cromatogrfico, por mencionar algunos, contienen impurezas que fluorescen. Cuantitativa y cualitativamente, la fluorescencia ha sido aplicada a la separacin de mtodos utilizando papel cromatogrfico, cromatografa de capa fina y sistemas con resinas de intercambio inico. Los adsorbentes y resinas de intercambio inico no son fluorescentes y no apagan la fluorescencia de los compuestos.

APAGADO
La presencia de oxgeno puede causar un error serio por la oxidacin de la muestra, y es crtica ya que tiene una tendencia a apagar la fluorescencia. La fluorescencia del antraceno se reduce un 50% con oxgeno puro. El apaga puede ser causado por otros solutos o por el solvente mismo.

FOTLISIS
Debido a las longitudes de onda utilizadas para la excitacin de los fluorforos, se relacionan complicaciones relacionadas a la fotodescomposicin. Ciertos pasos en el diseo de los instrumentos puede limitar la fuente de error: un obturador, para que la muestra solamente sea irradiada cuando las mediciones son hechas, una fuente de baja intensidad acoplada con un mejor sistema de deteccin. Existen algunos casos en los que la fotodescomposicin puede ser utilizada como una ventaja.

EFECTO DE LA TEMPERATURA
La intensidad de la fluorescencia usualmente caer con el aumento de la temperatura ya que existen altas probabilidades de que la molcula excitada sea desactivada. Los coeficientes de temperatura se encuentran usualmente en el rango de 1 a 1.2 unidades relativas de fluorescencia por grado centgrado. Aunque la instrumentacin de fluorescencia hace uso de fuentes de alta intensidad, el calentamiento de la cmara de la muestra o de la muestra misma puede ocurrir. La
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mayora de los instrumentos minimizan los efectos de la temperatura aislando el contenedor de la muestra y utilizando un mecanismo obturador.

ADSORCIN
El efecto de adsorcin presenta serios problemas solamente cuando se trabaja con soluciones muy diluidas. Diferentes superficies de vidrio adsorben quinina con diferentes grados. La adsocin no est limitada a los alcaloides como la quinina, de hecho es comn en muchos compuestos orgnicos. Afortunadamente es posible minimizar o eliminar la adsorcin, teniendo superficies mnimas de contacto, dando un pretratamiento a la cristalera; Los solventes usados afectan considerablemente en gran medida el fenmeno de adsorcin, los solventes polares lo disminuyen.

APLICACIONES
Las aplicaciones de la fluorescencia son muy amplias y variadas. La mayora de ellas se relacionan con el uso de pruebas de fluorescencia extrnseca, es decir, un cromforo que se encuentra unido o adsorbido a otra molcula y su fluorescencia es medida. Si se desea ahondar en las posibilidades y tcnicas que ofrece la fluorescencia, es conveniente consultar el catlogo y manual publicado por Molecular Probes (Haugland, R. P.). A continuacin se presenta una breve descripcin de las aplicaciones ms sobresalientes o utilizadas para la fluorescencia.

FLUORESCENCIA DE PROTENAS
Una de las reas de investigacin que se han visto muy beneficiadas con el uso de fluorescencia es el estudio de funcin y estructura de protenas. Existen tres aminocidos aromticos que absorben luz en el rango de espectro UV, fenilalanina, tirosina y triptfano. Debido a su absortividad molar la tirosina (276=1405 M-1 cm-1) y triptfano ((280=5579 M-1 cm-1) han sido muy usados para el estudio de protenas. Usualmente el nmero de residuos de triptfano es limitado y existen diversas protenas que slo tienen un triptfano. El presentar un valor de _ mayor que la fenilalanina y la tirosina, le permite una excitacin preferencial en una protena. Debido a las propiedades electrnicas del triptfano, las interacciones intramoleculares selectivas pueden llevar a un aumento o apagamiento de la fluorescencia. Estas caractersticas proveen informacin sobre la estructura molecular alrededor del triptfano. Obviamente, si hay varios residuos de triptfano en la protena se dificulta la interpretacin del comportamiento individual. Debido a los problemas que ocasiona el encontrar ms de un triptfano, se usan anlogos como 5-hidroxitriptfano y 7-azatriptfano, los cuales son substituidos en protenas en lugar de los residuos de triptfano normales. Estos anlogos presentan espectros caractersticos que permiten la excitacin selectiva y pueden dar informacin til en detalles moleculares de interaccin de complejos protena-protena y protenacidos nuclicos. Una aplicacin prctica de los anlogos de triptfano fue el incorporar 5-hidroxitriptfano a la insulina. La molcula fue funcional, fluorescente y es til para realizar estudios de interaccin entre la insulina y su receptor. La espectrofluorimetra es una herramienta importante en estudios de plegamiento de protena. Jones et al. demostraron que durante el replegamiento de la hidrofolato
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reductasa de E. coli, la fluorescencia decaa. La medicin del tiempo de decaimiento de la anistropa as como los tiempos de vida de la emisin, proporcionaron ms informacin sobre los intermediarios en el plegamiento, de la que se haba obtenido. De manera similar al uso de anlogos de triptfano tambin se puede usar para obtener informacin sobre la dinmica de protenas. Por ejemplo, Silva y Prendergast estudiaron la dinmica interna de un residuo de triptfano de FKBP12, una protena que es importante en importante en la accin inmunosupresora de FK506 y rapamicina. Encontraron que cuando FKBP12 no est unida a FK506 o a rampicina, el movimiento del triptfano es muy rpido, de manera opuesta a cuando se forma el complejo. Las aplicaciones tambin abarcan a los cidos nuclicos. Se han reportado mediciones del decaimiento de la anistropa de oligonucletidos (oligos) y polinucletidos de doble cadena usando la fluorescencia intrnseca de la timina excitada a 293 nm. Lo cual provee evidencia de grandes movimientos en el DNA con tiempos de correlacin de subnanosegundos. Tambin se han estudiado las interacciones entre protenas y DNA. La formacin de complejos entre DNA y protenas de unin, pueden ser detectadas por cambios en la emisin intrnseca de los residuos de triptfano, o cambios en los tiempos de vida de fluorescencia y propiedades rotacionales de pruebas unidas al DNA. Tambin se han desarrollado pruebas que incorporan donadores fluorescentes, aceptores no fluorescentes y combinaciones para detectar protelisis. En la figura 27 se esquematiza una protena que tiene unida una molcula fluorescente en el residuo de cido glutmico y en el de lisina un apagador, que debido a la corta distancia entre ambos absorbe la energa del fluorforo. Cuando la enzima en cuestin corta entre ambos residuos, la distancia entre el fluorforo y el apagador aumenta, permitiendo la fluorescencia.

Figura 27. Principio de respuesta fluorignica a corte por proteasa. Fluorforo (F) y apagador (Q). FUSIN DE MEMBRANAS

Los mtodos fluorimtricos para ensayos de fusin de membranas se basan en procesos como el apagamiento de la fluorescencia. La finalidad de estos mtodos es detectar la fusin de los lpidos de membrana o de otros componentes de las entidades fusionadas. Una de las tcnicas usadas es la transferencia de energa entre NBD y rodamina, cuyo proceso se esquematiza en la figura 28.

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Fusin

Figura 28. Representacin esquemtica de la fusin de membranas marcadas fluorescentemente. D, es la molcula donadora y A la aceptora. La disminucin de la eficiencia de FRET se registra por un incremento en la intensidad de la fluorescencia del donador y por lo tanto la disminucin en la del aceptor.

En este mtodo, se mezclan clulas marcadas con una combinacin de sondas con donadores y aceptores que se unen a lpidos y clulas no marcadas. Normalmente se usan N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-1,2-dihexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (NBDPE) como donador y Rodamina B 1,2-dihexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, trietilamonio (N-Rh-PE) como aceptor. Se excita a NBD-PE a 470 nm aproximadamente y ste a su vez logra la emission del la rodamina a 585 nm. Cuando las membranas se fusionan la distancia entre ambos aumenta y por lo tanto la emisin de la rodamina disminuye. Esta tcnica, puede usarse para hacer estudios de cintica, sobre la entrada de virus a las clulas por fusin de membrana, o la entrada y salida de componentes a diferentes vesculas o membranas.

CITMETRO DE FLUJO
La citometra de flujo es una tcnica de anlisis que se fundamenta en la dispersin de la luz al chocar con una clula. En la figura 29, se presenta un esquema del aparato. El equipo requiere que las clulas se encuentren en suspensin y las hace pasar una a una a travs de un capilar. Proyecta un haz de luz con una longitud de onda establecida, que se encuentra con cada clula. De la interaccin entre las clulas y el haz de luz se provoca una dispersin, basndose en la difraccin de la luz en sentido frontal, se puede evaluar el tamao de las clulas que pasan y al medir la reflexin de la luz de manera lateral se evala la granularidad o complejidad de estas. Es un mtodo de lectura rpido, que permite analizar un elevado nmero de clulas (de 10.000 a 50.000). Si las clulas son tratadas previamente con anticuerpos monoclonales marcados con algn fluorforo, tambin se pueden evaluar otras caractersticas. El uso de molculas fluorescentes distintas permite analizar la presencia de varios marcadores de manera simultnea. El isotiocianato de fluorescena, la ficoeritrina y el PerCP son los fluorocromos ms empleados en el marcaje de anticuerpos monoclonales. Todos ellos se excitan a 488 nm (luz azul) y emiten en la zona del verde, naranja y rojo, respectivamente. Los aparatos de citometra de flujo pueden hacer anlisis multiparamtrico, es decir, pueden combinar las
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medidas de distintos parmetros medidos sobre la misma clula y relacionarlos. Los citmetros que incluyen la deteccin de fluorescencia se conocen como FACS por sus siglas en ingls "Fluorescence Analizer Cell Sorter.

Figura 29. Esquema general de un citmetro de flujo.

La produccin de nuevos anticuerpos monoclonales con diferentes fluorocromos y los nuevos procedimientos de tincin en histoqumica, han permitido ampliar las reas de estudio en diagnstico clnico e investigacin biomdica, como la inmunotipificacin de leucemias agudas y sndromes linfoproliferativos crnicos. Actualmente, esta tecnologa ha pasado de ser una herramienta til en investigacin bsica al ser empleada en la prctica habitual de muchos laboratorios. Otra de las aplicaciones de la citometra de flujo relacionada con la fluorescencia es la cuantificacin de cidos nuclicos. Para la de DNA utilizando yoduro de propidio y bromuro de etidio, quienes se excitan a una longitusd de onda de 488 nm. La cuantificacin de DNA nos proporciona informacin sobre la existencia o no de anomalas tales como aneuploidias y, por otra parte nos permite conocer la distribucin de una poblacin celular determinada a lo largo de las distintas fases del ciclo celular. En el rea de la patologa tumoral contribuye al diagnstico y a la valoracin de los pacientes. Los principales usos clnicos en tumores slidos son: 1. Ayudar en el diagnstico de malignidad cuando los cambios morfolgicos son equvocos. 2. Subclasficar las lesiones de baja malignidad ("borderline"). 3. Aportar informacin pronstica de valor independiente al estadio y grado. 4. Monitorizar la respuesta al tratamiento. 5. Valorar la posibilidad de recidiva. 6. Establecer el origen sncrono o metcrono de los tumores. La cuantificacin de RNA con fluorocromos como el naranja de tiazol, la tioflavina T o la pironina Y se utiliza como tcnica de rutina en el recuento de reticulocitos y en general en la produccin celular de la mdula sea. El cariotipo de flujo representa un complemento y una alternativa a los mtodos clsicos de estudio de los cromosomas en metafase. Los cromosomas se aslan a partir de preparaciones en metafase y se tien con fluorocromos. Los cromosomas se analizan
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pasando por el citmetro. La separacin de cromosomas permite purificar cromosomas en relacin con su intensidad de fluorescencia o contenido en DNA. Es de utilidad en la realizacin de mapeo gentico y en la produccin de libreras de DNA recombinante. El uso conjunto de hibridacin in situ por mtodos fluorescentes y de la citometra de flujo permite una cuantificacin rpida y precisa de distintas protenas a estudiar como es el caso de la P-glicoproteina y del gen MDR1 en los fenmenos de resistencia a multidrogas de clulas tumorales. La citometra de flujo, utilizando yoduro de propridio, tambin permite realizar cuantificacin de clulas en situacin de apoptosis (muerte celular inducida).

SECUENCIACIN DE DNA
Durante mucho tiempo la secuenciacin de AND estuvo asociada a nucletidos marcados radioactivamente. Se utilizaban istopos como fsforo-32, fsforo-33 o azufre-35 incorporados a nucletidos especficos. Actualmente se utilizan nucletidos marcados fluorescentemente. El procedimiento se basa en copiar la cadena templado introduciendo en el medio nucletidos marcados fluorescentemente y que adems estn modificados (2,3-dideoxinucletidos) de tal manera que bloqueen la extensin de la cadena (Fig 31).

3OH libre

No hay 3OH libre Fig 31. La cadena elongacin de la cadena es bloqueada por la incorporacin de dideoxicitidina trifosfato en lugar de deoxicitidina.

De esta manera la polimerasa tomar aleatoriamente un nucletido marcado que incorporar a la cadena creciente terminando su elongacin, as se obtendrn productos de diferentes tamaos con un nucletido fluorescente en el extremo 3. Cada base se marca con un fuorforo diferente (Figura 30).

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Desnaturalizacin Alineamiento Extensin

Productos

Figura 30. Esquema del sistema de secuenciacin utilizando fluorforos acoplados a nucletidos modificados

Los secuenciadores, detectan la fluorescencia de los cuatro marcadores distintos que identifica a cada base. Cada fluorforo emite a diferente longitud de onda cuando es excitado con un LASER. La secuencia se obtiene en funcin de la longitud de los diferentes segmentos, cuyo tamao difiere en una sola base, y en la fluorescencia asociada a cada base. Los cuatro colores y por lo tanto las cuatro bases pueden ser detectadas y distinguidas utilizando electroforesis capilar. Finalmente se obtiene un espectro similar al de la figura 31.

Figura 31. En la parte superior se muestra un espectro de una secuencia de DNA obtenida por fluorforos asociados. En la parte inferior una placa revelada debido a la marca radiactiva asociada al material gentico.

Sin embargo, existen otras tcnicas como la transferencia de energa fluorescente (Fluorescence energy transfer) en oligos marcados para la secuenciacin y anlisis de DNA. Los oligos tienen en el extreme 5un derivado de fluorescena como un donador comn y otra fluorescena o rodamina derivatizada en un residuo de timidina modificado dentro de la secuencia del oligo como aceptor. Ajustando la distancia entre el donador y aceptor modificando la posicin de la timidina se generan cuatro oligos que absorben a 488 nm y fluorescen a 525, 555, 580, y 605 nm. Utilizando como fuente de excitacin un LASER, la fluorescencia de los oligos es de 2 a 6 veces mayor que la correspondiente a los oligos marcador con un solo fluorforo. El aumento en la intensidad de la fluorescencia permite la secuenciacin de DNA con una cuarta parte del templado usado normalmente. En el artculo de Ju J, et. al., reportan una exactitude del 99.8% al

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secuenciar con cadena sencilla de DNA de M13mp18 como templado en las primeras 500 bases.

PCR EN TIEMPO REAL

Esta variante de la PCR, se ve modificada ya que mide la acumulacin de producto de PCR usando fluorforos acoplados a los oligos. En uno de los extremos del oligo, se une una molcula fluorescente y en el extremo opuesto una molcula apagadora. Debida a la cercana entre ambas, la segunda apaga la fluorescencia del primero. Una vez que dicho oligo se ha alineado con su secuencia queda susceptible a una degradacin por exonucleasas que al cortar y liberar al fluorforo aumentan la distancia entre ste y el apagador, cancelando su efecto y por lo tanto permitiendo la fluorescencia que es medida por un espectrofluormetro acoplado al equipo. En las figura 32 se esquematiza el funcionamiento de esta tcnica. Este mtodo provee una cuantificacin exacta y reproducible.

Desnaturalizacin

Alineamiento

Extensin Figura 32. Representacin esquemtica de PCR en tiempo real con TaqMan oligos. El crculo verde representa al fluorforo, mientras que el rojo al apagador.

Las aplicaciones de esta metodologa son muy variadas. Por ejemplo, en el area de microbiologa clnica y alimentaria, en donde numerosos ensayos para la deteccin y cuantificacin de varios agentes infeccionsos han sido publicados. Tmbin es utilizada para pruebas genticas predictivas y la identificacin de polimorfismos de nucletidos individuales (S ingle Nucleotide Polimorphisms). Grandes compaas biotecnolgicas, estn trabajando en proyectos en los cuales ensayos de alelos especficos son desarrollados automticamente para identificar los SNP durante los programas de secuenciacin. Estos ensayos pueden ser muy importantes, en un futuro, en el rea de diagnstico molecular. Otra aplicacin importante es el uso de PCR en tiempo real para ensayos de RT-PCR para la cuantificacin de expresin gentica. En la tabla 9 se presentan algunos ejemplos de reas en los cuales se puede aplicar PCR en tiempo real.

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Tabla 9. Aplicaciones de PCR en tiempo real para el diagnstico molecular. Microbiologa de Microbiologa Expresin Microbiologa clnica Terapia gnica alimentos veterinaria gentica Carga bacteriana Estimacin de Carga viral (FIV, Citokinas, (Listeria, transferencia Carga viral CSFV, FCV) receptores, etc. Salmonella, gnetica. Campylobacter) Carga bacteriolgica(EHEC, Agentes Biodistribucin Salmonella, zoonoticos de vectores. Mycobacterium) Carga fngica (Candida, Cryptococcus, Aspegillus) Klein D. *Esta lista no es exhautiva

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BIBLIOGRAFIA

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APENDICE

ESPECIFICACIONES TCNICAS DE ALGUNOS ESPECTROFLUORMETROS COMERCIALES.

A continuacin se presentan algunos de los espectrofluormetros que se encuentran actualmente en el mercado con sus caractersticas ms importantes. Quanta master Espectrofluormetros. La eleccin del espectrofluormetro depende de las necesidades de cada grupo de trabajo, por ejemplo, para aplicaciones mdicas, biolgicas o farmaceticas, la cantidades a medir pueden ser extremadamente pequeas, por lo cual es necesario tener tanta sensibilidad como sea posible. Para poder medir pequeos cambios en las mediciones es necesario tener la mejor sensibilidad, por otro lado, si la muestra no cambia con el tiempo ni se degrada (lo cual no aplica a muestras biolgicas) el instrumento que se necesita ser diferente. En la siguiente tabla se muestran las caractersticas de los diferentes equipos.
Nmero de modelo QM- -2006 + ++ +++ Emisin dual Control de temperatura rpido Capacidad de tiempo de vida de fosforescencia Cambio rpido de la longitud de onda de excitacin Bench-top Grado investigacin Especialidad

3 X

4 X

4SE

6 X

6SE

7 X

7SE

8 X

Sensibilidada

X X

X X X

X X

Caractersticas especiales

X X X X X X X X X X X X X X X

Uso general

La versin SE la seal de ruido es de 10,000:1, lo cual se traduce en el doble de sensibilidad. Los sistemas SE usan un detector diferente as como una mejor fuente de excitacin.

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QM-4/2005

32 x 26 pulgadas
Espectrofluormetro QM-4/2005 de Photon technology international, Inc. 1. Lmpara de arco 2. Hendiduras ajustables 3. Monocromador de excitacin 4. Compartimiento de la muestra 5. Baffle 6. Contenedor de filtros 7. ptica de excitacin/emisin 8. Contenedor de la celda 9. Obturador 10. Unidad de correccin de excitacin 11. Monocromador de emisin 12. Detector TFM.

Especificaciones bsicas: Sensibilidad (Banda de Raman de agua medida con 350nm de excitacin y nominal 397nm de emisin con un pase de banda de 5nm) QuantaMaster QM-4/2005... SNR = 6,000:1 typ. QuantaMaster QM-4/2005SE.. SNR = 10,000:1 typ. Rango de adquisicin de datos: 1000 puntos/seg. a 1 punto/100 seg. Rango de longitude de onda: 180 nm to 24 microns. Ancho de banda: 0 a 25 nm, continuamente variable. Rango de deteccin: 185 a 650 nm con un TFM estndar 1527 (Rango extendido a cerca del IR) Rango de alto voltaje: -200 a -1,100 VDC Resolucin: 0.2 nm Exactitud: +/-0.5 nm
_

QM-8/2005
Iluminador: 31 X10 in Muestra/deteccin: 26 X 18 in

Espectrofluormetro QM-8/2005 de Photon technology international, Inc. 1. Lmpara de arco 2. Hendiduras ajustables 3. Monocromador de acceso aleatorio 4. Gua de luz lquida grado UV 5. Adaptador de gua de luz lquida 6. Compartimiento de la muestra 7. Buffer 8. Contenedor de filtros 9. ptica de excitacin/emisin 10. Contenedor de la celda 11. Monocromador de emisin 12. Detector TFM.

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Especificaciones bsicas:

Caractersticas de adquisicin de datos: Rango (excitacin sencilla, emisin sencilla): 1000 puntos/seg. a 1 punto/100 seg. Rango (excitacin dual, emission sencilla): arriba de 250 razones/seg. Capacidad de excitacin multilongitud de ondas: arriba de 10 pares de longitudes de onda aleatorias (software limitado) Rango dinmico: FURA-2 Rmax/Rmin = 40 typ. Excitacin: Rango de longitude de onda: 250 A 650 nm Rango de barrido ptimo: 300 a 600 nm Velocidad de transicin: <3 milliseg punto a punto. Resolucin: <1 nm Exactitud: +3/-1 nm Ancho de banda: 1-40 nm, continuamente variable Emisin: Rango de longitude de onda: 180 nm a 24 microns.(Deteccin til de rango de longitude de onda dependiente del TFM) Ancho de banda: 0 a 25 nm, continuamenete variable. Rango de deteccin: 185 a 650 nm con TFM estndar 1527 (rango extendido cercano al IR) Rango de alto voltaje: -200 a -1,100 VDC Resolucin: 0.2 nm Accesorios opcionales: Deteccin cerca del IR. Iluminador DeltaScan Contendor de muestra slida. Imagen de fluorescencia mejorada. Microcelda Emisin dual (formato-T) Guas de longitud de luz extendida Deteccin remota de fibra. Contenedor Powder de muestra Deteccin de microscopio mejorado (Upgrade) Fosforescecia mejorada. Glan Thompson o lamina polarizada Vista de video simultnea Accesorio de Langendorff Whole Organ.

Espectrofluormetro Shimadzu RF-3501 PC. Este aparato sirve para la medicin de compuestos que emiten un determinado tipo de radiacin al ser excitados o irradiados por una luz con una longitud de onda concreta. Este equipo es capaz de seleccionar las radiaciones de emisin y excitacin (lo cual amplia el tipo de muestras analizables con este instrumento) as como de realizar "barridos", es decir, lecturas de espectros de luz.

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INSTRUMENTO MARCA MODELO N de SERIE Especificaciones tcnicas: Rango de lectura Amplitud de banda Precisin Velocidades de barrido Sensibilidad Respuesta Fuente de radiacin Software y PC 220 - 900 nm 1.5, 3, 5, 10, 15 y 20 nm 1.5 nm 7 seleccionables Alta y baja (alta = 50 x baja)

ESPECTROFLUORIMETRO SHIMADZU RF-5301-PC A40193600553

8 seleccionables (0.02, 0.03, 0.1, 0.25, 0.5, 2, 4 y 8 segundos) Lmpara de xenon de 150W Disponibles con conexin a red

Espectrofluormetro SLM-AMINCO, modelo Aminco-Bowman Series 2

ptica prepara para medidas en T. Lmpara continua de Xenn de 150W y/o pulsante segn configuracin. Medida de fluorescencia, quimioluminiscencia y, con lmpara pulsante, de fosforescencia. Rango ptico de 220 a 850 nm. Sensibilidad mejor de 3000:1 RMS medido en la lnea de Raman del agua con excitacin a 350 nm, emisin a 397 nm, rejillas de excitacin y emisin a 4 nm y tiempo de integracin de 1 segundo.

60

 Velocidad de barrido de 3 a 6000 nm/min. Posibilidad de medir barridos repetitivos y/o sincrnicos. Incremento mnimo de longitud de onda de los monocromadores de 0,2 nm. Precisin de la longitud de onda 0,5 nm Repetibilidad de la longitud de onda 0,25nm Rejillas controladas por el ordenador entre 0,5 y 16 nm Correccin de excitacin y emisin de todo el espectro. Soporte para una celda termoestable. Existen, como opcin, soportes para 2 y 4 celdas. Cuatro canales de medida independientes, asignables por el usuario y que se pueden relacionar matemticamente. Dos entradas para seales analgicas (0-1 V, 0-10 V). Medidor de horas de la lmpara continua. Salida de la seal del fotomultiplicador para monitorizacin externa. Sistema automtico de diagnstico del hardware con el encendido del instrumento. Comunicacin con el ordenador mediante interfase IEEE. Monitor externo de encendido de la lmpara. Almacenamiento de mtodos de anlisis con la nica limitacin de la capacidad del disco duro del ordenador. El Instrumento est controlado totalmente desde ordenador mediante un programa en WINDOWS. El software estndar incluye las siguientes funciones:
o o o o o o o o o o o

Barra de herramientas para las funciones ms habituales. Ayuda en lnea. Matemticas entre espectros y entre espectros y escalares (suma, resta, divisin, etc.) Suavizado 1 a 4 derivada. Estadsticas. Integracin de picos. Anlisis cuantitativos Anlisis en clulas mediante sondas (FURA, INDO, etc.) Soporta ficheros de 2D y 3D con zoom en ambos casos y posibilidad de crear ficheros 3D a partir de ficheros 2D. Medidas automticas de polarizacin y anisotropa de un solo punto de hasta 100 muestras mediante la adicin de polarizadores opcionales, con ptica en L o en T segn configuracin del instrumento. Factores G comunes o mltiples. Medidas de polarizacin y anisotropa en funcin del tiempo con ptica en L o T segn configuracin del instrumento. Factores G comunes o mltiples.

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o o

Posibilidad de efectuar diferentes tipos de adquisiciones en 1 hasta 200 muestras sin intervencin del usuario. Adquisicin simultnea de datos de hasta 4 reacciones cinticas mediante soporte opcional para 2 o 4 celdas.

El compartimiento de muestra es amplio y permite la incorporacin de mltiples accesorios originales tales como: _ Soporte de cubetas termoestable por circulacin de agua, de una, dos o cuatro cubetas, todas ellas pueden incorporar agitador individual. _ Soporte para muestras slidas o celdas, de ngulo variable. _ Polarizacin automtica mediante polarizadores de calcita para UV-VIS o de pelcula para VIS. _ Soporte de ngulo variable para medida en clulas adheridas a cubreobjeto. _ Tapas con inyectores, para aadir reactivos con jeringa o con pipeta en hasta cuatro celdas. _ Sistema de toma de muestra automtica, con muestreador opcional de 114 muestras. _ Accesorio para espectroscopa remota, con fibras pticas. _ Accesorio de flujo detenido (stopped flow). _ Accesorio para trabajar a baja temperatura con nitrgeno lquido. _ Placa frontal para medidas en transmisin. _ Celdas de flujo de varios tipos para HPLC, FIA, Quimioluminiscencia, etc.

32 X 26 pulgadas Espectrofluormetro QM-4/2005 de Photon technology international, Inc. 1. Lmpara de arco 2. Hendiduras ajustables 3. Monocromador de excitacin 4. Compartimiento de la muestra 5. Baffle 6. Contenedor de filtros 7. ptica de excitacin/emisin 8. Contenedor de la celda 9. Obturador 10. Unidad de correccin de excitacin 11. Monocromador de emisin 12. Detector TFM.

Especificaciones bsicas:

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Sensibilidad (Banda de Raman de agua medida con 350nm de excitacin y nominal 397nm de emisin con un pase de banda de 5nm) QuantaMaster QM-4/2005... SNR = 6,000:1 typ. QuantaMaster QM-4/2005SE.. SNR = 10,000:1 typ. Rango de adquisicin de datos: 1000 puntos/seg. a 1 punto/100 seg. Rango de longitude de onda: 180 nm to 24 microns. Ancho de banda: 0 a 25 nm, continuamente variable. Rango de deteccin: 185 a 650 nm con un TFM estndar 1527 (Rango extendido a cerca del IR) Rango de alto voltaje: -200 a -1,100 VDC Resolucin: 0.2 nm Exactitud: +/-0.5 nm
_

QM-8/2005
Iluminador: 31 X10 in Muestra/deteccin: 26 X 18 in

Espectrofluormetro QM-8/2005 de Photon technology international, Inc. 1. Lmpara de arco 2. Hendiduras ajustables 3. Monocromador de acceso aleatorio 4. Gua de luz lquida grado UV 5. Adaptador de gua de luz lquida 6. Compartimiento de la muestra 7. Buffer 8. Contenedor de filtros 9. ptica de excitacin/emisin 10. Contenedor de la celda 11. Monocromador de emisin 12. Detector TFM.

Especificaciones bsicas: Caractersticas de adquisicin de datos: Rango (excitacin sencilla, emisin sencilla): 1000 puntos/seg. a 1 punto/100 seg. Rango (excitacin dual, emission sencilla): arriba de 250 razones/seg. Capacidad de excitacin multilongitud de ondas: arriba de 10 pares de longitudes de onda aleatorias (software limitado) Rango dinmico: FURA-2 Rmax/Rmin = 40 typ. Excitacin: Rango de longitude de onda: 250 A 650 nm Rango de barrido ptimo: 300 a 600 nm Velocidad de transicin: <3 milliseg punto a punto. Resolucin: <1 nm Exactitud: +3/-1 nm Ancho de banda: 1-40 nm, continuamente variable

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Emisin: Rango de longitude de onda: 180 nm a 24 microns.(Deteccin til de rango de longitude de onda dependiente del TFM) Ancho de banda: 0 a 25 nm, continuamenete variable. Rango de deteccin: 185 a 650 nm con TFM estndar 1527 (rango extendido cercano al IR) Rango de alto voltaje: -200 a -1,100 VDC Resolucin: 0.2 nm Accesorios opcionales: Deteccin cerca del IR. Iluminador DeltaScan Contendor de muestra slida. Imagen de fluorescencia mejorada. Microcelda Emisin dual (formato-T) Guas de longitud de luz extendida Deteccin remota de fibra. Contenedor Powder de muestra Deteccin de microscopio mejorado (Upgrade) Fosforescecia mejorada. Glan Thompson o lamina polarizada Vista de video simultnea Accesorio de Langendorff Whole Organ.

Espectrofluormetro Shimadzu RF-3501 PC. Este aparato sirve para la medicin de compuestos que emiten un determinado tipo de radiacin al ser excitados o irradiados por una luz con una longitud de onda concreta. Este equipo es capaz de seleccionar las radiaciones de emisin y excitacin (lo cual amplia el tipo de muestras analizables con este instrumento) as como de realizar "barridos", es decir, lecturas de espectros de luz.

INSTRUMENTO MARCA MODELO N de SERIE Especificaciones tcnicas: Rango de lectura Amplitud de banda Precisin Velocidades de barrido Sensibilidad Respuesta Fuente de radiacin 220 - 900 nm 1.5, 3, 5, 10, 15 y 20 nm 1.5 nm 7 seleccionables Alta y baja (alta = 50 x baja)

ESPECTROFLUORIMETRO SHIMADZU RF-5301-PC A40193600553

8 seleccionables (0.02, 0.03, 0.1, 0.25, 0.5, 2, 4 y 8 segundos) Lmpara de xenon de 150W

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Software y PC

Disponibles con conexin a red

Espectrofluormetro SLM-AMINCO, modelo Aminco-Bowman Series 2

ptica prepara para medidas en T. Lmpara continua de Xenn de 150W y/o pulsante segn configuracin. Medida de fluorescencia, quimioluminiscencia y, con lmpara pulsante, de fosforescencia. Rango ptico de 220 a 850 nm. Sensibilidad mejor de 3000:1 RMS medido en la lnea de Raman del agua con excitacin a 350 nm, emisin a 397 nm, rejillas de excitacin y emisin a 4 nm y tiempo de integracin de 1 segundo. Velocidad de barrido de 3 a 6000 nm/min. Posibilidad de medir barridos repetitivos y/o sincrnicos. Incremento mnimo de longitud de onda de los monocromadores de 0,2 nm. Precisin de la longitud de onda 0,5 nm Repetibilidad de la longitud de onda 0,25nm Rejillas controladas por el ordenador entre 0,5 y 16 nm Correccin de excitacin y emisin de todo el espectro. Soporte para una celda termoestable. Existen, como opcin, soportes para 2 y 4 celdas. Cuatro canales de medida independientes, asignables por el usuario y que se pueden relacionar matemticamente. Dos entradas para seales analgicas (0-1 V, 0-10 V).

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 Medidor de horas de la lmpara continua. Salida de la seal del fotomultiplicador para monitorizacin externa. Sistema automtico de diagnstico del hardware con el encendido del instrumento. Comunicacin con el ordenador mediante interfase IEEE. Monitor externo de encendido de la lmpara. Almacenamiento de mtodos de anlisis con la nica limitacin de la capacidad del disco duro del ordenador. El Instrumento est controlado totalmente desde ordenador mediante un programa en WINDOWS. El software estndar incluye las siguientes funciones:
o o o o o o o o o o o

Barra de herramientas para las funciones ms habituales. Ayuda en lnea. Matemticas entre espectros y entre espectros y escalares (suma, resta, divisin, etc.) Suavizado 1 a 4 derivada. Estadsticas. Integracin de picos. Anlisis cuantitativos Anlisis en clulas mediante sondas (FURA, INDO, etc.) Soporta ficheros de 2D y 3D con zoom en ambos casos y posibilidad de crear ficheros 3D a partir de ficheros 2D. Medidas automticas de polarizacin y anisotropa de un solo punto de hasta 100 muestras mediante la adicin de polarizadores opcionales, con ptica en L o en T segn configuracin del instrumento. Factores G comunes o mltiples. Medidas de polarizacin y anisotropa en funcin del tiempo con ptica en L o T segn configuracin del instrumento. Factores G comunes o mltiples.

Posibilidad de efectuar diferentes tipos de adquisiciones en 1 hasta 200 muestras sin intervencin del usuario.

Adquisicin simultnea de datos de hasta 4 reacciones cinticas mediante soporte opcional para 2 o 4 celdas.

El compartimiento de muestra es amplio y permite la incorporacin de mltiples accesorios originales tales como: _ Soporte de cubetas termoestable por circulacin de agua, de una, dos o cuatro cubetas, todas ellas pueden incorporar agitador individual. _ Soporte para muestras slidas o celdas, de ngulo variable. _ Polarizacin automtica mediante polarizadores de calcita para UV-VIS o de pelcula para VIS.

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_ Soporte de ngulo variable para medida en clulas adheridas a cubreobjeto. _ Tapas con inyectores, para aadir reactivos con jeringa o con pipeta en hasta cuatro celdas. _ Sistema de toma de muestra automtica, con muestreador opcional de 114 muestras. _ Accesorio para espectroscopa remota, con fibras pticas. _ Accesorio de flujo detenido (stopped flow). _ Accesorio para trabajar a baja temperatura con nitrgeno lquido. _ Placa frontal para medidas en transmisin. _ Celdas de flujo de varios tipos para HPLC, FIA, Quimioluminiscencia, etc.

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