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Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 2007, 146, 271-288

VALUATION DE LEFFET ANTIMYCOBACTRIEN DE PLANTES DU CENTRE-NORD DU MAROC(*)

Hakima SQALLI ( 1 ) , Asmae EL OUARTI ( 1 ) , Abd eslam ENNABILI ( 2 ) , S aad IBNSOUDA ( 1 ) , Abdellah FARAH ( 2 ) , Abdellati f HAGGOUD ( 1 ) , Abdellah HOUARI ( 1 ) , Moh ammed IRAQUI ( 1 ) Trente-six espces de plantes correspondant vingt-deux familles de la rgion Centre-Nord du Maroc ont t testes pour leur activit antimycobactrienne. Des extraits aqueux et thanoliques de chaque plante ont t tests contre la croissance des mycobactries : M. aurum, M. smegmatis, M. kansasii, M. bovis et M. vaccae. Quatorze espces se sont rvles inhibitrices : Juniperus oxycedrus, Pistacia lentiscus et Ruta montana dj cites dans des travaux antrieurs, et Populus alba, Cistus albidus, C. monspeliensis, C. salviifolius, Pistacia atlantica, Tamarix africana, Rubia peregrina, Thymus pallidus, Vitex agnus-castus, Verbascum sinuatum et Dittrichia viscosa.

(*)

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Manuscrit reu le 27 mars 2007. Laboratoire de Biotechnologie Microbienne, Facult des Sciences et Techniques de Fs, Universit Sidi Mohammed Ben Abdellah, BP 2202, Fs, Maroc. hsqalli2004@yahoo.fr, ibnsouda@hotmail.c o m , ahaggoud@yahoo.fr, houariab@hotmail.com, mhiraqui@yahoo.fr Institut National des Plantes Mdicinales et Aromatiques, Universit Sidi Mohammed Ben Abdellah, BP 159 Taounate Principale, Maroc. aennabili@yahoo.fr, hybride_farah@yahoo.fr

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INTRODUCTION

La tuberculose, due plusieurs espces de mycobactries et particulirement Mycobacterium tuberculosis, demeure de nos jours incontestablement une maladie sociale proccupante. Lamlioration de lhygine et la dcouverte de traitements efficaces (streptomycine, thambutol, isoniazide, pyrazinamide et rifampicine), ainsi que la dcouverte de vaccins antituberculeux ont permis de rduire lincidence de cette maladie, surtout dans les pays dvelopps. On a pens un moment que ce flau tait vaincu [25]. Cependant, au dbut des annes 90, on a observ une augmentation de lincidence de cette maladie lchelle mondiale suite la mobilit croissante, aux migrations dorigine conomique et politique et aux dficiences des programmes de lutte, de nombreux patients ne recevant pas un traitement adquat. Cela a favoris lapparition problmatique de mycobactries multirsistantes aux antituberculeux [25 ]. En outre, les patients immunodprims, surtout ceux infects par le VIH, sont particulirement menacs [36]. En 1990, lOMS [59] estimait quun tiers de la population mondiale tait infect par le bacille de Koch, 8 millions de cas de tuberculose taient dclars dont 95 % dans les pays en voie de dveloppement, et 3 millions de dcs sont survenus du fait de cette maladie. Les prvisions vont dans le sens dune dtrioration de la situation. Ainsi, toujours selon lOMS, en 2005, la situation sest aggrave : le nombre annuel de nouveaux cas de tuberculose dpassait les 10 millions et le nombre de dcs a atteint 3,5 millions. La tuberculose prdomine dans le tiers monde, particulirement dans certaines rgions dAfrique et dAsie, o lpidmie du SIDA continue se dvelopper [70-71]. Les prvisions de lOMS estiment que pour la priode 2000-2020, un milliard de personnes seront nouvellement infectes par Mycobacterium tuberculosis, 200 millions dvelopperont la maladie et 35 millions mourront de tuberculose si aucune amlioration n'est apporte dans le traitement et le contrle de cette infection [46 ]. Pour mieux contrler les infections mycobactriennes et diminuer la frquence des souches multirsistantes, il est donc urgent de mettre en vidence de nouveaux agents antimycobactriens efficaces [43].

273 Le rgne vgtal est une source inpuisable de nouveaux agents antituberculeux. Des plantes mdicinales et aromatiques pourraient permettre le traitement ou la prvention de maladies chroniques et/ou graves, et rsoudre le problme de la rsistance bactrienne vis--vis des agents antibactriens actuels. Les recherches sur les activits antimycobactriennes, le mode daction et la composition chimique des plantes connaissent un regain dintrt [43]. Cest dans ce cadre que sinscrit le prsent travail. Nous avons test laptitude dextraits de diverses plantes marocaines inhiber la croissance de mycobactries.

MATRIEL ET MTHODES

Matriel vgtal En 2005, diverses parties de 36 espces de plantes ont t collectes (Tableau I). 31 ont t rcoltes entre 150 et 425 m dans la rgion de Bellota, faisant partie du site dintrt biologique et cologique de Brikcha/Chefchaouen. Thymus pallidus provient de la rgion de Boufekrane/Mekns et les quatre espces restantes dun herboriste de Fs : Rubia peregrina, Origanum majorana, Anacyclus pyrethrum et Matricaria recutita. Ces chantillons ont t schs lombre et lair libre puis broys. Des spcimens ont t conservs lherbier de lInstitut national des Plantes mdicinales et aromatiques Mezraoua-Taounate (Maroc). Ces espces correspondent 22 familles : une de Gymnospermes (Cupressaceae), 5 de Monocotyldones et 16 de Dicotyldones. Prparation des extraits Diffrents extraits aqueux ou thanoliques ont t prpars raison de 15 g de poudre pour 100 ml deau ou dthanol : Infusion : la poudre est infuse 24 heures dans leau, puis filtre ; Dcoction : la poudre mlange leau bouillante est porte bullition pendant quinze minutes, puis filtre ;

274 Extraction lthanol : la poudre est macre 24 heures dans lthanol absolu lombre. Aprs filtration, le solvant est vapor sec et sous vide au rotavapor 37C. Lextrait est ensuite repris dans 5 ml deau distille strile. La filtration des diffrents extraits est assure par filtration sous vide avec une pompe eau et un filtre Millipore de porosit 0,45 m. Le pH de chaque extrait est neutralis en cas de besoin. Ces extraits sont incorpors dans le milieu de culture Sauton [6,48] base de 160 mg de matire sche/ml, concentration relativement leve. En effet, lutilisation de concentrations plus faibles pourrait rendre impossible la mise en vidence de leffet antimycobactrien dans les extraits des plantes dont le principe actif est prsent en trs faible quantit. De plus, plusieurs travaux antrieurs ont utilis la matire sche des concentrations suprieures ou gales 100 mg/ml [4,14,45]. Mycobactries testes Les mycobactries utilises sont : - Mycobacterium aurum A+, mycobactrie non pathogne temps de gnration denviron 6 h, espce modle qui peut tre utilise pour valuer leffet des substances actives sur la croissance de M. tuberculosis [11] - Mycobacterium smegmatis MC2 155, mycobactrie atypique non pathogne et temps de gnration denviron 3 h - Mycobacterium kansasii ATCC 12478, mycobactrie atypique causant des infections opportunistes - Mycobacterium bovis BCG IPP - Mycobacterium vaccae ATCC 1548314. Ces mycobactries ont t aimablement fournies par Dr. S. David (Centro de Tuberculose e Micobactrias, Instituto Nacional de Sade Dr. Ricardo Jorge Delegao do Porto, Portugal). Elles ont t cultives sur le milieu Sauton 37C [6,48]. Screening de lactivit antimycobactrienne Les titres des diffrentes cultures mycobactriennes sont environ 106 UFC/ml. Des aliquotes de 100 l de ces cultures ont t tales sur les boites renfermant 15 ml de milieu Sauton prpares avec les extraits de

275 plantes et non contamines aprs princubation 24 h 37C. Les boites tmoins contiennent du milieu Sauton dpourvu dextrait de plante. Les boites ainsi prpares ont t incubes 37C. La lecture des rsultats a t faite quotidiennement durant six jours pour les mycobactries croissance rapide (M. smegmatis, M. aurum et M. vaccae). Pour M. kansasii et M. bovis, les rsultats sont nots aprs 7 et 21 jours dincubation. Le screening de lactivit antimycobactrienne a t galement ralis par la mthode de diffusion. Des disques de papier Whatman de 6 mm de diamtre ont t striliss, puis poss sur des boites pralablement inocules par les souches mycobactriennes. Les disques ont t imprgns ensuite avec lextrait thanolique raison de 160 mg de matire sche / disque. Le tmoin correspond un disque imprgn deau distille. Les conditions de culture et les titres bactriens utiliss sont identiques aux prcdents.

RSULTATS

Sur les 36 espces vgtales testes pour leur activit contre la croissance des cinq espces de mycobactries, 22 sont dnues deffet. Parmi les 14 autres ayant montr une activit, 13 sont rcoltes et une provenait de chez lherboriste (Tableau I). Lactivit se traduit par linhibition totale de la croissance des bactries sur les milieux de culture contenant les diffrents extraits 160 mg/ml (Tableau I). La mthode de diffusion en milieu glos confirme ces rsultats. Les espces vgtales non actives nont montr la formation daucune aurole dinhibition ; par contre, les extraits des espces actives ont abouti lapparition dun halo dinhibition. Les espces inhibitrices correspondent aux Cupressaces (Juniperus oxycedrus) , Salicaces (Populus alba), Cistaces (Cistus albidus, C. monspeliensis et C. salviifolius), Anacardiaces (Pistacia atlantica et P. lentiscus), Rutaces (Ruta montana), Tamaricaces (Tamarix africana), Rubiaces (Rubia peregrina), Lamiaces (Thymus pallidus, Vitex agnuscastus), Scrofulariaces (Verbascum sinuatum) et Astraces (Dittrichia viscosa).

276 Tableau I : Effet antimycobactrien des extraits de plantes du Centre-Nord marocain.

Famille Espce Partie utilise Nbre essais Effet antimycobactrien I D E

Juniperus oxycedrus F 4 Asparagus stipularis F 2 + + + Cyperus longus PA 3 + + + Scirpoides holoschoenus PA 3 + + + Charybdis maritima Hyacinthaceae B 2 + + + Phragmites australis Poaceae PA 2 + + + Ruscus hypophyllum Ruscaceae F 2 + + + Viburnum tinus Adoxaceae F 2 + + + Pistacia atlantica Anacardiaceae F 4 Pistacia lentiscus RF 2 Visnaga ammoides Apiaceae RF 2 + + + Asteraceae Anacyclus pyrethrum PS 2 + + + Dittrichia viscosa F 2 Matricaria recutita RF 2 + + + Sonchus oleraceus RF 3 + + + Cistus albidus Cistaceae F 2 Cistus monspeliensis RF 2 Cistus salviifolius F 2 Sedum sediforme Crassulaceae BF 2 + + + Dipsacus fullonum Dipsacaceae F 2 + + + Centaurium erythraea Gentianaceae F 2 + + + Lavandula stoechas Lamiaceae F 2 + + + Origanum majorana F 3 + + + Teucrium fruticans F 3 + + + Thymus pallidus F 4 Calamintha nepeta RF 2 + + + Vitex agnus-castus RF 3 Clematis cirrhosa Ranunculaceae T 2 + + + Clematis flammula F 2 + + + Clematis vitalba PA 2 + + + Rubiaceae Rubia peregrina PS 3 Ruta montana Rutaceae F 2 Populus alba Salicaceae F 3 Salix pedicellata PA 2 + + + Scrophulariaceae Verbascum sinuatum F 2 Tamarix africana Tamaricaceae F 4 : Plante rcolte dans la rgion de Bellota/Chefchaouen B = bulbe, F = feuilles, RF = rameaux feuills, PA = parties ariennes, PS = parties souterraines, T = tiges I : infus, D : dcoct, E : extrait thanolique ; la concentration de matire sche est de 160 mg/ml de milieu de culture - : Inhibition totale de la croissance des cinq mycobactries testes + : Croissance des cinq mycobactries testes. Cupressaceae Asparagaceae Cyperaceae

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DISCUSSION ET CONCLUSION

Sur les 36 plantes marocaines testes, 14 possdent une activit antimycobactrienne. Les principes actifs sont solubles dans leau et lthanol et leur activit ne disparait pas aprs traitement des extraits 15 min 100C. Les rsultats ont t compars avec ceux de la littrature traitant de lactivit antimycobactrienne dune centaine despces vgtales appartenant aux familles testes (Tableau II). Juniperus oxycedrus [16 ], Pistacia lentiscus [47 ] et Ruta montana [47 ] ont dj t signales comme renfermant un ou plusieurs principes actifs antimycobactriens. Ces auteurs ont utilis les mmes parties de la plante, sauf Pistacia lentiscus pour laquelle nous avons test les rameaux feuills au lieu des feuilles. Populus alba, Pistacia atlantica et lespce endmique Thymus pallidus ont un potentiel inhibiteur de la croissance des mycobactries. Aux Astraces antimycobactriennes dj signales [5,9,14,20,24,3031,37,41,43,56,61,64-65,68-69], on peut ajouter Dittrichia viscosa. Cette espce est utilise en mdecine traditionnelle marocaine dans le traitement de la tuberculose et des affections pulmonaires [8]. Nous ajoutons Tamarix africana aux Tamaricaces, Rubia peregrina aux Rubiaces, Vitex agnus-castus aux Lamiaces et Verbascum sinuatum aux Scrofulariaces. Le genre Cistus, avec ses trois espces inhibitrices, apparait trs prometteur. Les genres Cyperus [39 ], Clematis [43 ] et Salix [43] prsentent des espces antimycobactriennes, mais les plantes marocaines examines dans ce travail se sont rvles inactives. Il en est de mme pour les genres Lavandula [43], Origanum [1 7 , 4 9 ] et Teucrium [43 ] de la famille des Lamiaces.

278 Tableau II : Principales espces reportes comme antimycobactriennes appartenant aux familles testes.
Famille, ordre
Cupressaceae

Prsent travail
Juniperus oxycedrus

Autres travaux
Chamaecyparis nootkatensis [12] Juniperus communis [24,42-43] Juniperus excelsa [43,67] Juniperus oxycedrus [16] Juniperus procera [40, 43] Allium cepa [22] Allium sativum [15,42,50-51] Allium schoenoprasum [22] Aloe chinensis [43] Aloe succotrina [43] Aloe vera [19] Chlorophytum inornatum [44] Pancratium maritimum [72] Cyperus articulatus [39] Avena sativa [35] Mangifera indica [43] Pistacia lentiscus [47] Pistacia terebinthus [17] Schinus molle [69] Spondias mombin [13] Angelica pancini [57] Azorella madreporica [43] Centella asiatica [43] Ducrosia anethifolia [57] Ferula communis [40, 43] Glehnia littoris [43] Heracleum maximum [43] Lomatium dissectum [43] Peucedanum ostruthium [54] Pimpinella aurea [62] Pimpinella corymbosa [62] Pimpinella isaurica [62] Achillea millefolium [9] Achillea wilhelmsii [68] Arctotis auriculata [52] Arnica montana [43] Artemisia ludoviciana [24] Artemisia monosperma [56] Balzoamorhiza sagittata [43] Bidens pilosa [43] Borrichia frutescens [43] Calendula suffruticosa [68] Camchaya calcarea [69]

Asparagales

Asparagus stipularis Charybdis maritima Ruscus hypophyllum

Cyperaceae Poaceae Anacardiaceae

Cyperus longus Scirpoides holoschoenus Phragmites australis Pistacia atlantica Pistacia lentiscus

Apiaceae

Visnaga ammoides

Asteraceae

Anacyclus pyrethrum Dittrichia viscosa Matricaria recutita Sonchus oleraceus

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Chaenactis douglasi [43] Chromolaena odorata [60] Chrysoma pauciflosculosa [43] Chrysanthum sinense [43] Chrysanthemum morifolium [5] Chrysanthemum segetum [43] Erigeron philadelphicus [43] Erigeron strigosus [43] Euthamia leptocephala [43] Flourensia cernua [37] Haplopappus sonorensis [41] Helichrysum crispum [52] Helichrysum melanacme [30-31] Inula helenium [43] Nidorella anomala [31] Rudbeckia subtomentosa [43] Santolina chamaecyparissus [43] Saussurea lappa [43] Senecio chionophilus [20] Solidago arguta [43] Solidago canadensis [43] Solidago rugosa [43] Sphagneticola trilobata [64] Spilanthes mauritiana [43] Tanacetum argyrophyllum [68] Tridax procumbens [65] Vernonia amygdalina [14] ---

Cistaceae

Crassulaceae Dipsacales Gentianaceae

Cistus albidus Cistus monspeliensis Cistus salviifolius Sedum sediforme Dipsacus fullonum Viburnum tinus Centaurium erythraea

Lamiaceae

Calamintha nepeta Lavandula stoechas Origanum majorana Thymus pallidus Teucrium fruticans Vitex agnus-castus

--Lonicera japonica [43] Valeriana laxiflora [21] Canscora decussata [43] Swertia purpurascens [43] Swertia randaiensis [29] Ajuga remota [10] Hyssopus officinalis [42] Lantana hispida [24] Lavandula angustifolia [43] Leucas volkensii [43] Mentha piperita [42,55] Origanum sp. [49] Origanum vulgare [17] Orthosiphon labiatus [23] Rosmarinus officinalis [17,32] Salvia aethiopis [68] Salvia africana-lutea [23] Salvia forskahlei [68]

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Salvia hypargeia [43] Salvia kronenburgii [68] Salvia macrochlamys [63] Salvia miltiorrhiza [33] Salvia multicaulis [43] Salvia officinalis [43] Salvia przewalskii [33] Stachys sylvatica [68] Tetradenia riparia [43] Teucrium chamaedrys [42-43] Thymus eigii [66] Thymus revolutus [28] Thymus vulgaris [31] Actaea spicata [43] Clematis integrifolia [43] Clematis virginiana [43] Coptis coinensia [43] Hydrastis canadensis [43] Nigella sativa [42] Morinda citrifolia [53] Neonauclea sessilifolia [26] Pentas longiflora [43] Prismatomeris fragrans [27] Amyris elemifera [43] Aegle marmelos [42] Clausena excavata [61] Coleonema album [18] Commiphora mukul [42] Evodia elleryana [7] Evodia rutaecarpa [2] Galipea officinalis [43] Lunasia amara [3] Micromelum hirsutum [34] Pilocarpus racemosus [43] Ruta montana [47] Tetradium daniellii [1] Triphasia trifolia [43] Populus tremuloides [43] Salix caprea [43] Leucophyllum frutescens [38] Scrophularia deserti [58] Verbascum thapsus [42] ---

Ranunculaceae

Clematis cirrhosa Clematis flammula Clematis vitalba

Rubiaceae

Rubia peregrina

Rutaceae

Ruta montana

Salicaceae Scrophulariaceae

Populus alba Salix pedicellata Verbascum sinuatum Tamarix africana

Tamaricaceae

: Espces examines dans le prsent travail et se rvlant antimycobactriennes.

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Parmi les Asparagales, les Gentianaces et les Apiaces cites dans plusieurs travaux [15,19,22,29,40,42-44,50-51,54,57,62,72], nous navons pas trouv de nouvelles espces possdant une activit antimycobactrienne. Les Poaces, Crassulaces et Dipsacales testes nont pas permis de trouver in vitro de proprits antimycobactriennes. La toxicit et leffet in vivo des plantes dont les extraits sont capables de bloquer la croissance mycobactrienne mriterait dtre tudie. Les principes des extraits non toxiques et actifs in vivo pourraient ensuite tre purifis et identifis.

RFRENCES

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ABSTRACT
Evaluation of antimycobacterial plants originating from centre north Morocco Thirty-six plant species belonging to 22 families were collected from Central North Morocco. The aqueous and ethanolic extracts were tested against the mycobacteria M. aurum, M. smegmatis, M. kansasii, M. bovis and M. vaccae. Thus, 14 plants were able to inhibit the growth of mycobacteria. Besides Juniperus oxycedrus, Pistacia lentiscus, and Ruta montana, 11 species (Populus alba, Cistus albidus, C. monspeliensis, C. salviifolius, Pistacia atlantica, Tamarix africana, Rubia peregrina, Thymus pallidus, Vitex agnus-castus, Verbascum sinuatum and Dittrichia viscosa) are reported here for the first time as having antimycobacterial activity. Key-words: antimycobacterial properties, Cistus, Mycobacterium __________