Nota Tcnica

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TRANSFECCIN
Las tcnicas de transfeccin celular, que se han desarrollado fundamentalmente para permitir la introduccin de cidos nucleicos en el interior de las clulas, han permitido en gran medida ampliar los conocimientos acerca de la regulacin gnica y de la funcin de las protenas en los sistemas celulares. Actualmente se emplean en gran nmero de aproximaciones experimentales, en la generacin de animales transgnicos, en la seleccin de lneas celulares modificadas, etc... La introduccin de una construccin de DNA recombinante en la que se ha situado el CDS (secuencia codificante) de un gen reportero (luciferasa, 'green fluorescent protein', beta-galactosidasa, cloramfenicol acetiltransferasa -CAT-, etc..) bajo una secuencia de regulacin que se desea estudiar permite medir con facilidad tasas de expresin gnica en diferentes situaciones experimentales. Por el contrario, la introduccin de un plsmido que contienen la secuencia codificante (CDS) de una protena de inters bajo el control de un promotor (constitutivo, regulado, etc...) permite la produccin de la protena deseada que puede estar o no etiquetada ('tagged). En este caso se emplea la clula como una factora de sntesis de protenas a la que se le introduce en forma de plsmido la informacin de la protena que se desea sintetice. Tanto en el primero como en el segundo caso puede ser importante seleccionar las clulas que han adquirido el plsmido. Para facilitarlo se incluyen en stos genes de resistencia a drogas que permiten a las clulas que los han adquirido sobrevivir en medios selectivos. Uno de los sistemas de seleccin ms empleado es el de la resistencia a G418 (resistencia a neomicina) que permite seleccionar clones celulares de expresin estable. As diferenciaremos entre la transfeccin temporal o transiente y la transfeccin estable o de larga duracin.

Las tcnicas de transfeccin actuales se pueden clasificar en:

MTODOS QUMICOS.
Basados en la formacin de complejos que las clulas sean capaces de adquirir e incorporar, bien sea directamente mediante la ruta endoctica (fosfato clcico, DEAE dextrano) o a las membranas (lipofeccin). o MTODO DEL FOSFATO CLCICO. Basado en la obtencin de un precipitado entre el cloruro de calcio y el DNA en una solucin salina de fosfatos. En esta situacin co-

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precipitan formando unos agregados que son endocitados/fagocitados por las clulas. Aparentemente el agregado con calcio protege al DNA de la degradacin por las nucleasas celulares. El tamao y la calidad del precipitado es crtico para el xito del proceso, que se ve afectado por factores tales como pequeos cambios en el pH de la solucin, etc...

MTODO DEL DEAE DEXTRANO. Basado en la obtencin de complejos entre la resina DEAE y el DNA. Los polmeros de DEAE dextrano o polybreno tienen una carga que les permite unirse a las muy negativamente cargadas molculas de DNA. El DNA acomplejado se introduce en las clulas mediante choque osmtico mediante DMSO o glicerol. El uso de DEAE dextrano se limita a las transfecciones transientes.

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MTODO DE LIPOFECCIN. Se basa en la foamcin de complejos entre lpidos catinicos y DNA. El complejo tiene afinidad por la membrana y permite la entrada del DNA en el citosol. Una de las posibles vas es la incorporacin de liposomas a la membrana y la entrada flip-flap. Existen un gran nmero de lpidos que se emplean en lipofeccin, aunque existe una estructura consenso de un lpido catinico sinttico, a partir de la cual se han diseado muchas variantes (por ej. DOPE). Es esencial optimizar las condiciones especficas de transfeccin para obtener buenas eficiencias, que suelen ser en buenas condiciones de entre el 70 y el 90% de las clulas de la placa. Las desventajas del mtodo es, aparte del elevado precio de los lpidos, el hecho de que no todos los lpidos funcionan en todos los tipos celulares, y que hay que optimizar el ensayo para cada tipo celular. Los parmetros a optimizar son la relacin entre lpido y DNA (relacin de cargas), la cantidad de DNA empleado, el tiempo que se exponen las clulas al complejo y la presencia o ausencia de suero. Tienes una buena revisin en la pgina de la Universidad Vanderbilt dedicada a los lpidos catinicos.

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MTODOS FSICOS.
Basados en la introduccin mecnica de las molculas en el interior de la clula. o MICROINYECCIN DIRECTA. Es una tcnica muy efectiva aunque laboriosa. Es el mtodo que se emplea en la introduccin del DNA recombinante en las clulas embrionarias en el proceso de obtencin de animales transgnicos. ELECTROPORACIN. 'biolistic particle delivery'. Introduccin del DNA adherido a micropartculas que se disparan sobre las clulas.

Una vez introducida la molcula de DNA recombinante en el interior de las clulas producir su efecto permitiendo, por ejemplo : o seleccionar clulas que hayan incorporado el DNA. Este sera el caso del aislamiento de clones celulares que presentaran expresin de un determinado producto. Es posible por la incorporacin en el propio vector de marcadores de seleccin, tpicamente la resistencia de G418 (neomicina), ... a las pocas horas o das detectar la presencia de la protena codificada por el plsmido.

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