Gentica molecular (I)

EXPERIMENTO DE GRIFFITH (1928)

Vdeo En las bacterias virulentas S muertas haba algo capaz de transformar a las bacterias R, inocuas, en bacterias virulentas S. Ese algo, llamado por Griffith factor transformante, tena informacin para producir un carcter heredable en las bacterias R, que era la presencia de la cpsula (responsable de la virulencia). Se trataba, por lo tanto del material gentico. Bacterias con cpsula= cepa S Bacterias sin cpsula= cepa R

EXPERIMENTO DE AVERY, MAC LEOD Y MC CARTY (1944) Avery, Mac Leod y Mc Carty fraccionaron las bacterias S muertas por el calor y probaron una a una cada fraccin obtenida utilizndolas como factor transformante en bacterias R. Solo el ADN produjo la transformacin, por lo que quedaba demostrado que era el ADN el material gentico.

Oswald T. Avery

MacLeod

McCart y

EXPERIMENTO DE HERSHEY Y CHASE. 1952 (I) Hershey y Chase trabajaban con bacterifagos o fagos, que son virus que infectan bacterias. Saban que un fago tenia una capa externa de protena y un ncleo interno de DNA. Adems, de las observaciones con el microscopio electrnico, tambin saban que durante la infeccin el virus ataca a la bacteria por sus colas e introduce su material gentico en la bacteria para multiplicarse utilizando su maquinaria metablica. Conocan los trabajos de Avery y trataban de determinar cual era la causa de la transformacin de la bacteria en una factora de fagos: el ADN o la protena. .

Alfred Hershey y Martha Chase

Informacin

Animacin del experimento de Hershey y Chase

EXPERIMENTO DE HERSHEY Y CHASE (II)

Marcaron radiactivamente dos grupos de fagos: uno con 32P (que marca solo el DNA) y otro con 35S (que marca solo las protenas). En dos experimentos paralelos, infectaron bacterias con virus marcados en su DNA y con virus marcados en sus protenas. Agitaron los cultivos con una batidora para separar las partculas vricas de las cubiertas bacterianas. Luego realizaron una centrifugacin para separar los fagos de las bacterias, de modo que las bacterias, ms grandes y ms pesadas, quedan en el sedimento, mientras que los fagos se quedan en el sobrenadante. Encontraron que la radiactividad del 35S apareca en el sobrenadante mientras que la del 32P apareca en el sedimento, a partir del cual aparecieron nuevas partculas vricas marcadas radiactivamente, lo que demostraba que el ADN era el material gentico.

FLUJO DE INFORMACIN GENTICA EN LOS SERES VIVOS La replicacin del ADN es necesaria para que la informacin gentica de la clula se transmita a la siguiente generacin. En las clulas, la informacin gentica se utiliza para sintetizar protenas. La informacin fluye en una direccin: del ADN al ARN, mediante el proceso de Transcripcin, y del ARN a la protena, mediante el proceso de Traduccin.

Este esquema de flujo de la informacin gentica fue pronto modificado, ya que en algunos virus cuyo material gentico es ARN, existen enzimas para su replicacin. Adems, en algunos casos, la informacin no fluye del ADN al ARN, sino en sentido contrario, mediante un proceso denominado Retrotranscripcin o transcripcin inversa, que fue descubierto en los virus de ARN denominados Retrovirus.

"Dogma Central de la Biologa Molecular"

LA REPLICACIN DEL ADN ES SEMICONSERVATIVA Cuando Watson y Crick propusieron el modelo de estructura en doble hlice del ADN, sugirieron tambin un posible mecanismo para la replicacin de esta molcula: -No se escapa a nuestra comunicacin que el emparejamiento especfico que hemos postulado sugiere inmediatamente un mecanismo copiador para el material gentico. (traduccin de su artculo en Nature 25-Abril-1953). Cinco semanas despus de la publicacin de este artculo publicaron nuevamente en Nature otro artculo explicando ese posible mecanismo de replicacin: Nature, 30-Mayo-1953 Debido a la complementariedad de las cadenas, cada una de ellas podra servir de molde para la sntesis de una nueva cadena complementaria. De esta manera se obtendran dos molculas de ADN idnticas a la molcula original, cada una de las cuales contendra una cadena del ADN original y otra de nueva sntesis. Este modelo de replicacin es conocido como Replicacin Semiconservativa, para indicar que cada molcula hija solo conserva la mitad (una de las dos cadenas) de la molcula original.

TRES MODELOS DE REPLICACIN DEL ADN Frente al modelo Semiconservativo propuesto por Watson y Crick (1953) se propusieron otros posibles modelos de replicacin del ADN: el modelo conservativo y el modelo dispersivo

MESELSON Y STAHL DISEARON UN EXPERIMENTO PARA DETERMINAR COMO SE REPLICABA LA MOLCULA DE ADN Para investigar como se replicaba el ADN, Meselsohn y Stahl disearon un experimento basndose en las siguientes premisas: 1-El nitrgeno es uno de los principales elementos del ADN. 2-El nitrgeno posee dos istopos: el 14N, que es el ms abundante y el 15N (no es radiactivo) ms pesado, que puede incorporarse al ADN. 3-La densidad de las molculas de ADN puede determinarse usando la tcnica de centrifugacin en gradiente de densidad,lo que permitira distinguir el DNA ligero, con 14 N del pesado con 15N. Para obtener el gradiente de densidad sometieron una solucin de cloruro de cesio (Cs Cl) a una ultracentrifugacin durante varias horas. Se alcanza as un equilibrio entre la difusin y la fuerza centrfuga de manera que se establece un gradiente de densidad en el tubo con una concentracin creciente de Cs Cl desde la boca hasta el fondo del tubo. Si se aade ADN se concentrar y formar una banda en el punto del tubo donde su densidad sea igual a la del Cs Cl en ese punto. Si hay varios ADN con densidades distintas, formarn varias bandas. Las bandas se pueden detectar observando los tubos con luz ultravioleta de longitud de onda de 260 nm, que es absorbida fuertemente por los cidos nucleicos.

EXPERIMENTO DE MESELSON Y STAHL (1958) Comenzaron su experimento cultivando bacterias E. Coli en un medio con 15N. Despus de varias generaciones todo el ADN de las bacterias era pesado, ms denso que el normal. Meselson y Stahl transfirieron las bacterias con ADN pesado a un medio con 14N (ligero) y observaron la densidad del ADN de las bacterias al cabo de distintas generaciones. Los resultados obtenidos eran compatibles nicamente con un modelo semiconservativo de replicacin

CONCLUSIONES DEL EXPERIMENTO -Si la replicacin fuese coservativa apareceran dos bandas del ADN de la primera generacin (una de ADN pesado y otra de ADN ligero). -Si la replicacin fuese dispersiva no obtendran una banda de ADN ligero en la segunda generacin. -Los resultados obtenidos solo son compatibles con el modelo de replicacin semiconservativa.

La replicacin es semiconservativa
Animacin del experimento Otra animacin

COMIENZO DE LA REPLICACIN

La replicacin del ADN es un proceso muy complejo, en el que participan muchas enzimas y protenas distintas, cada una con una funcin especfica, cuyo conjunto se conoce con el nombre de Replisoma. El comienzo de la replicacin requiere el reconocimiento por protenas iniciadoras de una secuencia nucleotdica que constituye el origen de relicacin. En Procariotas hay un solo origen pero en Eucariotas hay mltiples puntos de origen. Una vez reconocido el origen se produce la separacin de las dos cadenas en ese punto, formndose as una burbuja cuyos extremos se denominan horquillas de replicacin.

LA REPLICACIN ES UN PROCESO BIDIRECCIONAL La replicacin es un proceso bidireccional, por tanto, las horquillas avanzan en sentidos opuestos, como dos cremalleras que se abren a partir del mismo punto inicial. En las bacterias, al ser circular el cromosoma, la replicacin termina cuando se encuentran las dos horquillas. En los cromosomas eucariotas la replicacin se inicia simultaneamente en millares de orgenes y termina cuando confluyen los millares de burbujas de replicacin.

Animacin (procariotas) Animacin (en eucariotas) Elige el cromosoma a la derecha

LA ENZIMA HELICASA SEPARA LAS DOS CADENAS DEL ADN Y LAS PROTENAS SSB ESTABILIZAN LAS CADENAS SENCILLAS Las helicasas son las enzimas encargadas de abrir la doble hlice, rompiendo los puentes de hidrgeno. Para ello utilizan la energa del ATP. Su actuacin crea una horquilla de replicacin. Como consecuencia, se genera un superenrollamiento por delante de la horquilla y, por tanto, una tensin que ser aliviada por las topoisomerasas. Las protenas SSB (single-stranded DNA binding proteins o protenas de union a cadena sencilla de ADN) son protenas encargadas de la estabilizacin del ADN monocatenario generado por la accin de las helicasas, impidiendo as que el ADN se renaturalice o forme estructuras secundarias, de manera que ste pueda servir de molde para la replicacin de la doble hlice

HELICASA SSB

LAS TOPOISOMERASAS ALIVIAN TENSIONES POR DELANTE DE LA HORQUILLA DE REPLICACIN A medida que la enzima helicasa abre la doble hlice, las enzimas topoisomerasas van disminuyendo la tensin torsional acumulada por el superenrollamiento en el sector no replicado de la doble hlice. Lo hacen cortando una o las dos hebras por delante de la horquilla de replicacin, dejando que giren y volviendo a unir.

Accin de las topoisomerasas sobre el ADN

CARACTERSTICAS DE LAS DNA-POLIMERASAS Las enzimas que desempean el papel principal en la sntesis de las nuevas cadenas de ADN son las ADN-polimerasas. Presentan las siguientes caractersticas: -Necesitan una cadena molde, frente a la cual enlazan nucletidos complementarios. -Utilizan desoxirribonuclesidos trifosfato (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) cuya hidrlisis (separacin de pirofosfato) proporciona la energa necesaria para la formacin de los enlaces fosfodister. -Sintetizan una cadena complementaria a la molde en direccin 5-3,es decir, catalizan la formacin de enlaces fosfodister entre el grupo fosfato 5 del nucletido entrante y el extremo 3OH del nucletido anterior de la hebra en crecimiento. -No pueden iniciar por s solas la sntesis de una cadena, precisan un extremo 3OH libre, de un oligonucletido o pequeo fragmento de cadena, al que unir el grupo fosfato del primer nucletido que colocan y as poder avanzar. Este fragmento se denomina cebador o primer y, en la replicacin, lo coloca una enzima RNA-pol llamada Primasa. El cebador ser pues un oligonucletido de ARN que deber ser posteriormente eliminado y sustitudo por ADN. -Tienen actividad exonuclesica, es decir, pueden hidrolizar los nucletidos terminales de cualquier extremo de una cadena de ADN. Esta actividad permitir la correccin de errores durante la replicacin y la eliminacin de los cebadores de ARN.

Las DNA-polimerasas requieren una cadena molde de ADN y sintetizan la cadena complementaria utilizando para ello los desoxirribonuclesidos trifosfato. La energa para la formacin de los enlaces fosfodister la proporciona la separacin de pirofosfato por cada nucletido aadido. Estas enzimas no pueden iniciar la sntesis de una cadena si no existe previamente un extremo 3OH libre al que enlazar el primer nucletido que colocan.Trabajan pues en direccin 5-3.
Animacin

La enzima Primasa sintetiza cebadores (oligonucletidos de RNA) antes de la actuacin de la DNA-polimerasa, proporcionando as un extremo 3-OH libre que esta enzima pueda alargar

LA REPLICACIN ES CONTINUA EN UNA CADENA Y DISCONTINUA EN LA OTRA La DNA-pol sintetiza las nuevas cadenas de ADN en direccin 5-3. Al ser las cadenas del ADN antiparalelas, una de ellas servir de molde para la sntesis de una nueva cadena que crecer en sentido 5-3, de forma continua a medida que avanza la horquilla, pero la otra debera ser sintetizada en sentido 3-5, lo cual no es posible. Aqu, la DNA-pol debe realizar la copia en direccin contraria al avance de la horquilla de replicacin, por lo que se sintetiza de forma discontinua, en forma de fragmentos cortos, a partir de sucesivos cebadores colocados por la Primasa. Estos fragmentos se denominan, en honor a los investigadores japoneses que los descubrieron, fragmentos de Okazaki. La replicacin se lleva pues a cabo de forma continua en una de las hebras, denominada hebra lder, conductora o adelantada, y de forma discontinua en la otra, denominada habra retardada o retrasada.

The Okazakis and Kornbergs. From left, Reiji and Tsuneko Okazaki, Alfred and Sylvy Kornberg. c1975

Animacin

ELIMINACIN DE CEBADORES Y UNIN DE FRAGMENTOS

Una DNA-polimerasa con actividad exonuclesica 5-3, se encarga de ir eliminando los cebadores de ARN y sintetizando al mismo tiempo pequeos fragmentos de ADN para rellenar los huecos. Finalmente es una enzima Ligasa la que cataliza la formacin de los enlaces entre los fragmentos resultantes.
Animacin

ESQUEMA GENERAL DE REPLICACIN

Animacin de replicacin

Otra animacin

Vdeo de replicacin en youtube

PROTENAS Y ENZIMAS

FUNCIN EN LA REPLICACIN

Protenas iniciadoras Helicasas

Reconocen el origen de replicacin (secuencia de nucletidos) Separan las dos hebras de ADN, consumiendo ATP para romper los enlaces de hidrgeno. Se forman as las horquillas de replicacin Se fijan a las cadenas separadas impidiendo la renaturalizacin del ADN (reasociacin de las cadenas por apareamiento de bases) Alivian los estados de superenrollamiento del ADN por delante de la horquilla de replicacin, cortando una o las dos hebras, permitiendo el giro y volviendo a sellar Inician la copia de la hebra molde colocando un oligonucletido cebador de ARN Replican el ADN en direccin 5-3 de forma continua en una de las hebras (cadena adelantada) y discontinua en la otra (cadena retardada) mediante fragmentos de Okazaki. Adems tienen actividad exonuclesica, lo que permite la correccin de errores. Una DNA-Pol elimina cebadores y rellena los huecos con oligonucletidos de ADN.

Protenas SSB

Topoisomerasas

RNA-Primasas DNA-Polimerasas

DNA-Ligasas

Unen los fragmentos en la hebra retardada

CORRECCIN DE ERRORES DURANTE LA REPLICACIN

Si durante la replicacin la DNA-pol inserta un nucletido errneo, puede reconocer su incapacidad para enlazarse al nucletido complementario de la hebra molde. Entonces retrocede y elimina por hidrlisis el nucletido errneo, gracias a su actividad exonuclesica 3-5. A continuacin introduce el nucletido correcto. La adicin de cada nucletido es comprobada a medida que la DNA-pol se desplaza a lo largo de la cadena molde, lo que garantiza la fidelidad de la replicacin, que transcurre con un error no superior a 1 por cada 109 -1010 nucletidos.

LA DNA-POLIMERASA DEBERA TRABAJAR EN DIRECCIONES OPUESTAS A MEDIDA QUE AVANZA LA HORQUILLA DE REPLICACIN

COORDINACIN DE LA DIRECCIN DE SNTESIS DE AMBAS CADENAS DE ADN (mediante la formacin de un bucle en el molde de la cadena retardada)

Animacin de coordinacin

ESQUEMA GENERAL DEL PROCESO DE REPLICACIN

PROBLEMAS EN LA REPLICACIN DE LOS EXTREMOS DEL ADN EUCARITICO Las molculas lineales de ADN tienen problemas para replicar sus extremos, ya que las ADN polimerasas necesitan un extremo 3' OH al que ir aadiendo nucletidos. Uno de los extremos de cada molcula (el extremo 5') se puede copiar sin problemas debido a que viene cebado desde atrs, sin embargo, el extremo contrario (extremo 3') no podra replicarse ya que no puede ser cebado desde atrs. Como consecuencia quedara un corto segmento al final sin copiarse y se ira acortando el ADN por ese extremo en cada ronda de replicacin

SOLUCIN A LOS PROBLEMAS DE REPLICACIN DE LOS EXTREMOS DE LOS CROMOSOMAS EUCARITICOS: LA ENZIMA TELOMERASA Los telmeros eucariticos (extremos de los cromosomas) contienen una secuencia corta rica en Guanina repetida cientos de veces. Esta secuencia es aadida por una enzima denominada Telomerasa. La telomerasa es una enzima transcriptasa inversa que lleva una corta secuencia de ARN que sirve de molde para sintetizar esa secuencia repetida. La adicin de estas secuencias cortas que lleva a cabo la Telomerasa contrarresta la tendencia al acortamiento de los telmeros durante la replicacin normal. En las clulas somticas no hay actividad telomerasa. Esta est presente en tejidos fetales, clulas madre y tambin en clulas tumorales. Animacin de Telomerasa

BLACKBURN, GREIDER Y SZOSTAK RECIBIERON EL NOBEL EN 2009 POR SUS TRABAJOS SOBRE LOS TELMEROS Y LA TELOMERASA Elizabeth Blackburn y Carol Greider descubrieron en 1984, la enzima telomerasa, que aislaron un ao despus. Por este descubrimiento recibieron, junto a Jack Szostak, el Premio Nobel de Medicina en 2009.

LA REPLICACIN DEL ADN EUCARITICO SE ACOMPAA DE LA REPLICACIN DE LAS HISTONAS PARA FORMAR LA CROMATINA

Durante la replicacin del DNA eucaritico son necesarias, adems de las enzimas estudiadas, las enzimas para sintetizar las histonas que forman parte de los nucleosomas. Las histonas que ya estaban presentes permanecen en la hebra conductora y las recin sintetizadas forman nuevos nucleosomas en la cadena retardada.

COMPARACIN DEL PROCESO DE REPLICACIN EN PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS

Procariotas
Un solo origen de replicacin

Eucariotas
Mltiples orgenes de replicacin

Fragmentos de Okazaki ms grandes (de 1000 a 2000 nucletidos) Ms rpido (500 nucletidos/seg) DNA sin histonas

Fragmentos de Okazaki ms pequeos (de 100 a 400 nucletidos) Unas 10 veces ms lento (50 nucletidos/seg) DNA con histonas

REPLICACIN DE ADN IN VITRO: LA PCR (REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA) Es una tcnica desarrollada por Kary Mullis en 1983 (por la que recibi el premio Nobel de Qumica en 1993) que permite obtener un gran nmero de copias a partir de un fragmento de ADN, aunque se encuentre en cantidad mnima, en un corto intervalo de tiempo. Para esta reaccin se necesita disponer, adems de la muestra de ADN que se va a amplificar, de: -Iniciadores o cebadores: pequeas molculas de ADN de cadena sencilla complementarias a cada uno de los extremos 3 de la regin que se quiere copiar. -Una ADN-polimerasa termorresistente, aislada de la bacteria termfila Thermus aquaticus, llamada Taq-polimerasa, capaz de resistir las elevadas temperaturas a las que se somete la mezcla de reaccin. -Una mezcla equimolecular de los cuatro nucletidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Los tubos de la mezcla de reaccin se introducen en un aparato llamado termociclador que, de forma automtica, realiza ciclos de tres pasos. Cada ciclo dura unos 5 minutos, y con 20 a 30 ciclos se dispone de suficiente material para el anlisis posterior.
Kary Mullis.

CICLOS DE LA PCR

EL termociclador realiza ciclos de tres pasos: 1-Desnaturalizacin, elevando la temperatura a 94C durante aprox. 1 minuto. 2-Apareamiento de los cebadores con los extremos 3, al bajar la temperatura hasta 40-60C, durante unos 0,5-2 minutos. 3-Extensin o replicacin, catalizada por la Taq-pol, aumentando la temperatura a 72C durante 1-2 min.

Animacin de la PCR Otra animacin

ALGUNAS APLICACIONES DE LA PCR 1.Secuenciacin: la PCR permite obtener suficiente cantidad de ADN molde para su secuenciacin. 2.Estudios evolutivos: la PCR permite amplificar genes de organismos ya extinguidos o de restos antiguos humanos para compararlos con los genes semejantes de organismos actuales y poder reconstruir rboles filogenticos. La PCR tambin se ha utilizado para conseguir el mapa del genoma humano. 3.Huellas genticas. La PCR permite amplificar muestras de ADN para la determinacin de las huellas genticas . Esta tcnica se aplica en Medicina legal, con el fin de identificar individuos a partir de muestras biolgicas, como sangre, semen, piel o cabellos. Tambin se utiliza en las pruebas de paternidad. 4.Deteccin de infecciones vricas, antes de que causen sntomas o se desarrolle una respuesta inmunitaria. 5.Diagnstico prenatal de enfermedades genticas.