EFECTO TXICO DE ACEITES ESENCIALES USADOS PARA EL CONTROL DE LA ASCOSFAEROSIS SOBRE HUEVOS EN COLONIAS DE Apis mellifera L.

Francisco Jos Reynaldia, Ariel Guardia Lopzb, Mara Susana Rc, Marcelo Arturid, Graciela Noem Albob.
a Becario Conicet. CIDEFI. UNLP, b Monogstricos, c Qumica Agrcola, dClculo Estadstico y Biometra . FCAyF. UNLP. 1900. La Plata, Argentina. Calles 60 y 119 s/n, cc 31 E-mail: zooamg@ceres.agro.unlp.edu.ar

RESUMEN La cra yesificada en Apis mellifera, L., es producida por el hongo Ascosphaera apis Maassen ex Claussen (Olive &Spiltoir). La principal consecuencia de la enfermedad es el debilitamiento de la colonia. Los aceites esenciales extrados de plantas aromticas poseen efectos antimicrobianos in vitro y han sido utilizados con xito en colmenas para cra yesificada. Los objetivos del presente trabajo fueron: 1) determinar la toxicidad larval en colmenas de abeja melfera de las esencias de lemon grass (Cymbopogon citratus ), ajedrea (Satureia hortensis ), tomillo (Thymus vulgaris ), organo ( Origanum vulgare ) y la mezcla lemon grass - tomillo para el control de cra yesificada y 2) determinar el tiempo de consumo de las esencias en colmenas. Se efectuaron 3 experiencias de toxicidad de esencias sobre huevos de A. mellifera. Los tratamientos se aplicaron en forma de jarabe y las esencias fueron preparadas en alcohol etlico de 70 disuelto en sacarosa al 50%. Los resultados indicaron que todas las esencias presentaron tendencia de mayor toxicidad que los testigos en huevos de abeja melfera en colmenas, aunque slo la ajedrea present diferencias significativas. PALABRAS CLAVES: cra yesificada, aceites esenciales, toxicidad, Apis mellifera SUMMARY Ascosphaera apis Maassen ex Claussen (Olive &Spiltoir) is the causal agent of chalk brood disease of honey bees (Apis mellifera L.) producing weakening in bee colonies. Essential oils from aromatic plants present antimicrobial activities in vitro and have been successfully used for the control of chalk brood disease. The present work tried to determine: 1) Toxicity of some essential oils on bee larvae. Essential oils from lemon grass (Cymbopogon citratus ), savory (Satureia hortensis ), thyme (Thymus vulgaris ), oregano ( Origanum vulgare ) and the blend thyme - lemon grass, were tested. 2) Time of consumption of essences in bee hives. Three experiences of essences toxicity on A. mellifera eggs were tried. Treatments on larvae were applied in syrup form using ethylic alcohol 70 in 50% sacharose solution for control. Trials indicated that all essences showed higher toxicity than controls, but only savory showed statistical differences. KEYWORDS: chalk brood disease, essential oils, toxicity, Apis mellifera INTRODUCCION La cra yesificada en abeja melfera (Apis mellifera) es una patologa fngica que afecta sus larvas cuyo agente etiolgico es Ascosphaera apis (Spiltoir, 1955). Es un hongo heterotlico, que forma esporas solo cuando se cruzan los micelios plus y minus. Un efectivo control de la enfermedad probablemente requiera de la combinacin de estrategias de control. Ha sido demostrado que el control qumico deja residuos en la

miel, provoca resistencia en el hongo y puede ser txico para larvas (Naumann et al. 1996). En recientes estudios se ha demostrado la efectividad in vitro de las esencias de lemon grass y ajedrea para el control de loque americana (Alippi et al, 1999a), y de cra yesificada (Albo et al 2003a). Asimismo se ha estudiado la toxicidad de esencias sobre abejas adulta para loque americana (Albo et al 2003b). Los objetivos del presente trabajo fueron: 1) determinar la toxicidad larval en colmenas de abeja melfera de las esencias de lemon grass, ajedrea, tomillo, organo y la mezcla lemon grass - tomillo para el control de cra yesificada y 2) determinar el tiempo de consumo de las esencias en colmenas. MATERIALES Y MTODOS Los aceites esenciales empleados fueron: tomillo (Thymus vulgaris L., fam. Lamiaceae), lemon grass o pasto limn (Cymbopogon citratus (D.C.) Stapp., fam. Poaceae), organo (Origanum vulgare L., fam. Lamiaceae), ajedrea (Satureia hortensis L., fam. Lamiaceae). Los ejemplares de ajedrea provinieron de Calingasta, Prov. de San Juan, Argentina y las restantes especies de la zona de La Plata, Prov. de Buenos Aires, Argentina. Las esencias se extrajeron mediante destilacin por arrastre con vapor de agua en destilador de vidrio y trampa tipo Clevenger. Las formulaciones de aceites esenciales se realizaron con agua bidestilada estril utilizando alcohol de 70. Los experimentos de toxicidad larval sobre colmenas de abeja melfera se efectuaron durante el 2004 en la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, Universidad Nacional de La Plata. Se emplearon 24 cmaras de cra de Apis mellifera ligustica, L., conformadas por 20.000 individuos adultos, 5-7 cuadros de cra (2 de cra abierta), 2 de alimento y cuadros vacos, y tratadas para varroasis con Amivar. Las colonias se distribuyeron en un diseo enteramente al azar. Las reinas pertenecan a la misma lnea materna. Para evaluar la toxicidad en huevos de las esencias, se utiliz la tcnica de Oomen (1999), con modficaciones. Las esencias se suministraron en alimentador Boardman, cubierto con papel de aluminio por nica vez y fueron disueltas en 40 cm3 de alcohol de 70 por frasco. Las dosis fueron calculadas en base a estudios previos in vitro (Alippi et al,1999a). En el da 0 (cero) del experimento, se eligi una seccin de 50 celdas con cra (huevos) en la parte media del cuadro de cra central. Sobre el rea elegida se calcaron las celdas con huevos. A los das 7 y 14 se superpuso el calco sobre la seccin elegida el da cero, remarcando aquellas celdas que contenan estados vivos. El resto de las celdas se consideraron muertas. Se evaluaron las diferencias entre tratamientos en el nmero medio de individuos sobrevivientes a los 7 y 14 das. Se utiliz el Anlisis de Varianza para Medidas Repetidas (Von Ende, 1993), tomando a los tratamientos como factor entre sujetos y al tiempo como factor intrasujetos, mediante un diseo completamente al azar. El ajuste de los datos a los supuestos de este anlisis se evalu mediante la Prueba de Esfericidad de Mauchly (Von Ende, 1993). Posteriormente se aplic una Prueba de Comparaciones Mltiples de Tuckey para evaluar las diferencias entre medias de los tratamientos a los 7 y 14 das (Steel y Torrie, 1992). Primer experimento: ensayo de toxicidad larval con lemon-grass y ajedrea. Se efectuaron 3 tratamientos con 3 repeticiones. Tratamiento A: 1 gr. de lemon grass; Tratamiento B: 2 gramos de ajedrea, ambos diluidos en 750 cm3 de jarabe al 50% de sacarosa y agua, y Tratamiento C: Testigo con 750 cm3 de jarabe al 50% de sacarosa y agua.

Segundo experimento: ensayo de toxicidad larval con lemon-grass + tomillo. Se utiliz la metodologa antes detallada. Se efectuaron dos tratamientos con tres repeticiones cada una. Tratamiento D: 2,25 gr. de tomillo + 1,125 gr. de lemon-grass, y Tratamiento E: Testigo con 750 cm3 de jarabe al 50% de sacarosa y agua. Tercer tratamiento: ensayo de toxicidad larval con organo y tomillo. Se utiliz la metodologa antes detallada. Se efectuaron tres tratamientos con tres repeticiones cada una. Tratamiento F: 3 gr. de organo; Tratamiento G: 1 gr. de tomillo, y Tratamiento H: Testigo con 750 cm3 de jarabe al 50% de sacarosa y agua. RESULTADOS El resultado de toxicidad del primer tratamiento sobre colmenas de abeja melfera para el control de cra yesificada, mostr diferencias significativas (p<0.05). La Prueba de Mauchly indic que los datos se ajustaban a los supuestos del Anlisis de Varianza para Medidas Repetidas (Chi-cuadrado = 3.1, grados de libertad = 2, p>0.2). El Anlisis de Varianza indic la existencia de una interaccin significativa Tratamientos x Tiempo (F4, 12=4.1, p<0.05). La Comparacin de Medias del Anlisis de Tuckey demostr que el nmero de sobrevivientes fue mayor en el testigo que en el tratamiento ajedrea en los das 7 y 14 (p<0.05). El tratamiento lemon no se diferenci significativamente del testigo ni de ajedrea (Figura 1).
55 50 45 Nmero de individuos 40 35 30 25 20 15 10 Da 0 Ajedrea Lemon Testigo Da 7 Da 14 B AB B AB

A A A

A A

Figura 1: Promedios de individuos sobrevivientes en el estado de huevo en cada tratamiento y en cada fecha de evaluacin Letras distintas indican diferencias significativas (Tukey, p< 0,05) entre tratamientos dentro de cada fecha de evaluacin

En el segundo experimento, a pesar que los datos se ajustaban a los supuestos del Anlisis de Varianza para Medidas Repetidas, no se encontraron diferencias significativas entre tratamientos (p = 0,078) ni en la interaccin Tratamiento x Tiempo (p = 0,13) (Figura 2a). Asimismo en el tercer experimento tampoco se hallaron diferencias en los tratamientos (p = 0,78) ni en la interaccin Tratamiento x Tiempo (p = 0,82) (Figura 2b).

60
S o b re v iv ie n te s (N ro . d e h u e vo s)

Lemon Tomillo

Testigo
S obrev iv iente s (N ro. d e hu ev os )

60 50 40 30 20 10 0 0

Oregano

Testigo

Tomillo

50 40 30 20 10 0 0 5
Das

10

15

5 Das

10

15

Figura 2a: Promedios de individuos sobrevivientes en el estadio de Huevo en cada tratamiento y en cada fecha de evaluacin.

Figura 2b: Promedios de individuos sobrevivientes en el estado de Huevo en cada tratamiento y en cada fecha de evaluacin.

Por otra parte, a pesar que no existen diferencias significativas en el consumo de las esencias para los tres experimentos (p = 0.84; p = 1 y p = 0.68 respectivamente), se pueden observar ciertas tendencias importantes, como que la ajedrea (Figura 3a) y el organo (Figura 3c) son las esencias que ms tardaron en consumirse. En el caso de la mezcla lemon grass-tomillo (Figura 3b), su consumo fue ptimo ya que se comporto de de igual forma que el testigo.
Consumo promedio de esencias Primer Experimento
800 700 600 500 400 300 200 100 0 Volumen inicial (ml.) 1 Evaluacion 26/04/04 2 Evaluacion 03/05/04 3 Evaluacion 10/05/04
Lemon Ajedrea Test igo

Volumen

Fechas de evaluacin

Figura 3 a: Consumo promedio de esencias y testigo en el Primer experimento.

Consumo promedio de esencias Segundo Experimento

800 700 600

Volumen

500 400 300 200 1 00 0 Vo lumen inicial (ml.) 1 Evaluacio n 09/03/04 2 Evaluacio n 23/03/04 3 Evaluacio n 30/03/04

Fechas de evaluacin

lemon- t omillo t est igo

Figura 3 b: Consumo promedio de esencias y testigo en el Segundo experimento.

Consumo promedio de esencias Tercer Experimento

800 700 600

Volmenes

500 400 300 200 100 0 Volumen inicial (ml.) 1 Evaluacion 26/04/04 2 Evaluacion 03/05/04 3 Evaluacion 10/05/04

Fechas de evaluacin

Test igo Or gano Tomillo

Figura 3 c: Consumo promedio de esencias y testigo en el Tercer experimento.

DISCUSIN Teniendo en cuenta que el estado de huevo no recibe ningn tipo de alimentacin y que al 4 da se transforma en larvas, podra inferirse que el estado larval de 1 a 3 das es el ms susceptible a la toxicidad de las esencias, y que la va de ingreso al tracto digestivo de las larvas sera a travs de la jalea real suministrada por las nodrizas. De todos los experimentos realizados se deduce que la esencia ajedrea fue la nica que presento diferencias significativas con el testigo, a pesar de tener un consumo moderado en relacin a las otras esencias, su mortalidad fue alta. Es importante tener en cuenta que el modo de administracin utilizada fue jarabe, lo cual asegura un consumo rpido y podra potenciar la toxicidad de estos productos. En ensayos realizados a campo con esencias sobre loque americana, se demostr la ineficacia del control de la enfermedad, evaluando como posible causa la toxicidad de estas sustancias. Albo et al., (2003b). demostraron que las colonias tratadas con esencias presentaron al momento de la evaluacin mayor nmero de larvas infectadas de loque americana, que las testigo sin

tratamiento. Por este motivo se podra inferir que las esencias presentan un efecto txico sobre larvas y lo que las hace ms susceptibles a la enfermedad (Naumann et al., 1996). 4. CONCLUSIONES Se observ una tendencia de mayor mortalidad de huevos con esencias que con el testigo, aunque slo la ajedrea present diferencias significativas con el mismo. Con respecto al consumo, la mezcla de lemon grass-tomillo present la mejor palatabilidad entre los tratamientos ensayados, con un consumo del 100% a los 7 das de aplicada. BIBLIOGRAFIA 1. Albo, G., Carranza, M., Cerimele, E., Henning, C., R, M. S., Ringuelet, J. & De Giusti, M. 2003a. Control in vitro de Ascosphaera apis con aceites esenciales y biocidas y toxicidad de estas substancias para Apis mellifera, L. 26 Congreso Argentino de Produccin Animal, Mendoza, Argentina. OD293 2. Albo, G.N.; Henning, C; Ringuelet, J.; Reynaldi,F.J.; De Giusti, M.R. & Alippi, A.M. 2003b. Evaluation of some essential oils and blends of essential oils for the control of American Foulbrood of honey bees. Apidologie. Francia 3. Alippi, A.M., Ringuelet, J.A., Henning, C.P. & Bandoni, 1999a. In vitro evaluation of some essential oils and mixtures for the control of Paenibacillus larvae subsp. larvae, the causative agent of AFB. Actas XXXVI Apimondia Congress. Vancouver, Canada,. Pg. 260. 4. Alippi, A.M., Albo, G.N., Leniz, D., Rivera, I., Zanelli, M., Roca, A.E., 1999b. Comparative study of tylosin, erythromycin and oxytetracycline to control American Foulbrood of honey bees. Journal of Apicultural Research, 38 (3-4) 149-158. 5. Naumann, K. & M.B. Isman. 1996. Toxicity of neem (Azadirachta indica A. Juss) seed extracts to larval honeybees and estimation of dangers from field applications. Amer. Bee J.136: 518-520. 6. Oomen, P. A., De Ruijter, A. & Van Der Steen, J.1992. Method for honeybee brood feeding tests with insect growth-regulation insecticides.Bulletin.OEPP/EPPO.22:613-616. 7. Steel, R. G. & Torrie, J. H. 1992. Bioestadstica: principios y procedimientos. 2 edicin. Mc Graw-Hill, New York, 613 pp. 8. Von Ende, C. N., 1993. Repeated-measures analysis: Growth and other timedependent measures, in Desing and analysis of ecological experiments, S. M. Scheiner & J. Gurevitch, New York, pp. 113-137.