III Simposio Biofabricas

Aislamiento y determin ac in de la estr uctur a d el gen qu e c odific a par a la esterol 14 dem etilasa de Myc osphaerella fijien sis . Mn ic a Jul ian a An gari ta Vel s qu ez, Juan Man u el Restrep o Flrez .

Bioagric ultura u rbana. Lu c a At eho rt a Ga rc s

Es calad o d el pr oceso discontin uo alimentado por pu lsos con r etencin celular c ompleta de 2 0 a 2 00 litros par a la pr oduccin d e Bacillus th uring ien sis serov ar kurs taki en la planta piloto de la C orpor ac in para Investig acion es Biolgicas -CIB -. Mad alyd Yuran i Ve ra Pe a.

Es tab lecim ien to d e s uspensiones c elu lar es de boroj (Borojoa patinoi Cuatrec). Cata lin a G iral do Es trada .

Es tan darizacin d e u n protocolo par a la obtencin de c allos fr iab les d e B oroj (Borojoa patin oi ) F ase I. Mau ri ci o Ma rt n ez Du qu e.

Ev aluacin d e la coloniz acin y producc in del hongo Lentinula edodes Pegler en bloques ar tificiales a base de residuos agr oindustr iales . Va les ka Vi lle gas Es cob ar

Ev aluacin in vitr o d e la accin d el cido 2 ,4 diclorofenoxiacetico (2, 4-d) y el thidiazur on (tdz) en la pr oduccin de c allos em briogenicos en el pltano v ariedad Domin ic o (aab) F as e I. Si lvi a Eli sa Buit rago Gi rald o

Modelam iento d e la estru ctura trid imensional de la es ter ol 14 dem etilasa del hon go fitopatgeno Myc osphaerella fijiensis . Ju an Man ue l Rest repo Flrez , M ni ca Ju li an a Ang arita Ve ls qu ez

III Simposio Biofabricas

Promoc in d e la pr imera biofbr ica de la O rinoq ua colombiana para la propagacin m asiva de esp ec ies v egetales promisor ias. Gel ver Ra l Hered ia P ast or

Tr ansformacin g en tica de caa de azcar (Saccharum spp.): r equisito esenc ial p ar a s u uso como futura biofbrica. Fern an do Ange l S.

III Simposio Biofabricas

Aislamiento e identificacin de cepas microbianas nativas del corozo chiquito (Bactris minor), cosechado en el departamento de Crdoba y su potencial uso en la produccin de vinos. Deivis Enrique Lujn Rhenals

Aislamiento y caracterizacin de bacteriocinas producidas por Lactobacilllus plantarum LPBM10 en suero de leche. Pedro Felipe Feria Cceres

Diseo de experimentos aplicado a la produccin biolgica de cido fumrico. Oscar Hernn Vasco Echeverri

Efecto de las condiciones de hidratacin del grano de soya sobre las caractersticas de la bebida fermentada. Mara Anglica Benavides Martn

Iniciativas para el uso de Genmica Nutricional para reducir la deficiencia de micronutrientes en humanos. Joe M. Tohme

Obtencin de protena unicelular a partir de desechos agroindustriales como el bagazo de caa. Luz Adriana Gutirrez Ramrez

Produccin de cido l-asprtico por mtodos biolgicos. Juan C. Oviedo Lopera

Produccin de protena pigmentada a partir de Rhodotorula mucilaginosa. Camilo Fernndez Martnez

III Simposio Biofabricas

Aislamiento y evaluacin de microorganismos celulolticos a partir de residuos vegetales frescos y en compost generados en un cultivo de crisantemo (Dendranthema grandiflora). Adriana Matiz Villamil

Biodegradacin de cianuro empleando clulas inmovilizadas. Catalina Giraldo Estrada

Caractersticas fisicoqumicas y microbiolgicas de biomasa inmovilizada sobre soportes de PVC en un reactor anaerobio horizontal Daro Gallego S., Maria Elena Gonzlez

Comportamiento de un humedal artificial de flujo vertical (HVF) con variaciones de carga hidrulica: aspectos microbiolgicos. Diana Luca Cristancho M.

Cuantificacin de microorganismos involucrados en el ciclo del nitrgeno de tres humedales artificiales de Ginebra (Valle del Cauca). Irma Janeth Sanabria

Establecimiento de un modelo matemtico a escala laboratorio del proceso de produccin de un polmero tipo polihidroxialcanoato (pha), utilizando la cepa nativa Burkholderia cepaci. Magnolia Acosta Barn

Evaluacin de la capacidad de sorcin del alga Gracilaria mammillaris para plomo (II) y cromo (III). Cherlys Infante Jimnez

Evaluacin de la higuerilla como materia prima para una biorefineria sostenible Carlos Andrs Snchez Pedraza

Modelo fenomenolgico y diseo de planta compacta para tratamiento biolgico de agua residual domstica. Luz Adriana Quintero Rendn

III Simposio Biofabricas

Obtencin de L y D lactatos pticamente puros en Eschericchia coli. Alfredo Matnez Jimnez.

Proceso fotocataltico y biolgico como alternativa para la degradacin de cianuro presente en aguas residuales. Catalina Giraldo Estrada

Produccin de abonos y enmiendas orgnicas a partir del aprovechamiento de los bioslidos generados en la planta de San Fernando (Medelln-Colombia). Carlos Alberto Pelez Jaramillo.

Remocin de nitratos y fosfatos de aguas residuales de tratamiento primario de la microalga Dunaliella salina. Alejandro Acosta Crdenas

Remocin simultnea de materia orgnica, nitrgeno y fsforo mediante una serie de procesos biolgicos unitarios. Julio Cesar Saldarriaga Molina

III Simposio Biofabricas

Detoxificacin de jarabe de la planta de banano con hidrxido de calcio Ca(OH)2 para fermentacin alcohlica. Sandra Liliana Daza Levaza

Diseo de procesos biotecnolgicos empleando una estrategia basada en optimizacin: aplicacin preliminar en la produccin de bioetanol. scar Julin Snchez Toro

Estabilidad de biorreactores convencionales y no convencionales. Isabel Cristina Paz Astudillo

Estado del arte para la obtencin de etanol a partir de residuos agroindustriales. Alfredo Matnez Jimnez.

Estudio de viabilidad tcnica de la produccin de 1,3 propanodiol (1,3 PD) a partir de glicerol con nuevas cepas colombianas de Clostridium sp a nivel laboratorio. Oscar Leonardo Aragn Caicedo

Ingeniera gentica en rutas metablicas de Saccharomyces cerevisiae para incrementar la productividad de etanol. Jorge Alberto Vsquez Castillo

III Simposio Biofabricas

Adaptacin de microorganismos compatibles con Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans a un sustrato de carbn con alto contenido de azufre. Isabel Cristina Cardona Rendn

Diseo de un reactor de tanque agitado para un proceso de biooxidacin de sulfuros. Diana Arroyave Gmez

Evaluacin de un proceso de biodesulfurizacin de carbones caucanos en una columna empacada. Gerardo Andrs Caicedo Pineda

Influencia del tamao de grano en la oxidacin bacteriana de galena (pbs), por Acidithiobacillus ferrooxidans, mediante anlisis de microscopia electrnica de barrido y FTIR 1. Marco Antonio Mrquez Godoy

III Simposio Biofabricas

Exploracin de la inmovilizacin y determinacin de la vida til de la lipasa b de la Candida antarctica para la epoxidacin del aceite de palma. Gabriel Leonardo Lozano Betancourt

Hidrlisis enzimtica de compuestos cianognicos presentes en almendras y maracuy utilizando (-glucosidasa- emulsina) Guillermo Arrzola Paternita

Licuefaccin enzimtica de pulpa de banano verde con alfa amilasa. Janet Cristina Serna Porras

Modelamiento matemtico de la produccin de la enzima recombinante iduronato 2-sulfato sulfatasa (IDShr) en Pichia pastoris. Diego Fernando Mendoza Muoz

Obtencin de enzimas pectolticas en fermentacin sumergida a partir de Aspergillus niger para aplicaciones en la industria de alimentos. Lena Prieto Contreras

Obtencin de pectinasas a partir de residuos agroindustriales. Mabel Milena Torres Taborda.

Un medio de cultivo econmico para producir renina microbiana. Natalia Andrea Gmez Vanegas, Anglica Mara Miranda Villamil

III Simposio Biofabricas

Biomateriales y microfabricacin en terpias regenerativas y reparativas. Daniel Gallego Prez

Cambios en aminocidos cercanos a los residuos catalticos, modifican el peso molecular de los productos de la inulosacarasa de L. citreum. Mara Elena Rodrguez Alegra

Caracterizacin analtica de protenas recombinantes usadas como biofrmacos. Norma Adriana Valdez Cruz

Cultivo autlogo de condrocitos para tratamiento de lesiones condrales en pacientes con trauma articular. Mnica Echeverry Rendn

Del gen al biofrmaco: expresin de protenas heterlogas. Norma Adriana Valdez Cruz

Diseo de un sistema de biorreaccin para la produccin de escopolamina por cultivo in vitro de races de Brugmansia candida. ngela Mara Otlvaro lvarez

Diseo y construccin de una matriz tridimensional de hidroxiapatita sinttica macroporosa para su aplicacin en ingeniera de tejidos. Alejandra Rodrguez Barrera

Los cultivos de alta densidad celular en la produccin de biofrmacos. Mauricio Alberto Trujillo Roldn

Obtencin de clulas madre mesenquimatosas de la mdula sea humana y su potencial uso como modelo de evaluacin de biomateriales. Catalina Pineda Molina

Produccin de biomasa del hongo medicinal Ganoderma lucidum en reactores a escala de laboratorio y determinacin de la demanda especifica de consumo de oxgeno. Ana Mara Torres Lpez

III Simposio Biofabricas

Produccin de interferon beta 1b recombinante en cultivos alimentados de Escherichia coli. Mauricio Alberto Trujillo Roldn

Produccin de melanina con bacterias. Alfredo Martnez Jimnez

Produccin de protenas recombinantes teraputicas en sistemas microbianos. Mauricio Alberto Trujillo Roldn

Produccin de un pigmento a partir de una cepa nativa bacteriana. Daro Naranjo Fernndez

Produccin del factor estimulante de colonias de granulocitos humano recombinante (rhugcsf) en lote alimentado con fermentacin de alta densidad celular de Escherichia coli. Mauricio Alberto Trujillo Roldn

Sntesis y caracterizacin de un co-polmero biocompatible para ser usado como soporte de cultivo celular. Natalia Becerra

III Simposio Biofabricas

Anlisis de parmetros fsicos/fsicoqumicos en el aislamiento de bacterias con propiedades magnetotcticas. Viviana Karina Morillo Lpez

Biotica global: desde las races de Margaret Mead hasta las proyecciones de la intuicin de Van Rensselaer Potter. Carlos Eduardo de Jess Sierra Cuartas

Clculo de la solubilidad de protenas en soluciones acuosas: un enfoque termodinmico. Jorge Ivn Rossero Agudelo

Conozcamos nuestra biodiversidad para desarrollar productos biotecnolgicos. Dolly Montoya Castao.

Cultivo de bacterias magnetotcticas. Alejandro Salazar V.

El papel de la propiedad intelectual y las biofbricas de biotecnologa vegetal en el desarrollo de las economas universitarias dentro del mercado mundial de las ideas. Gustavo Adolfo Garca Arango

De la Ciencia Abierta y Cercana a la Ciencia en Bicicleta. Luz Marina Restrepo M.

Parmetros de un modelo UNIQUAC extendido para sistemas electrolticos para la lipasa de Candida rugosa a partir de una relacin de equilibrio termodinmico. Jorge Andrs Moncada Escudero

Procesos de biotransformacin mediante hongos fitopatgenos una alternativa para la obtencin de productos qumicos especializados. Ivn Daro Valverde Pedraza

Produccin biolgica de mezcla acetona butanol Diana Marcela Vanegas Hernndez

Resumen Simposio Biofbricas Titulo: Estudio de la viabilidad tcnica de la produccin de 1,3 propanodiol (1,3-PD) a partir de glicerol con nuevas cepas colombianas de Clostridium sp. a nivel laboratorio Autores: Dolly Montoya Castao (*), Oscar Aragn Caycedo Institucin: Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogot. Instituto de Biotecnologa rea temtica: Bioprocesos Direccin: Universidad Nacional de Colombia, A. A. 14490, Bogot D. C., Colombia Telfono: (57)(1)3165000 extensin 16951 fax: 3165415 Correo electrnico: dmontoyac@unal.edu.co Palabras clave: Keywords: Resumen: El propsito de este trabajo es valorizar el glicerol crudo proveniente de la industria de biodisel a travs de su conversin biotecnolgica a 1,3-propanodiol, un solvente de alto valor agregado. Para lo anterior se evalo el potencial de produccin del diol a partir de glicerol USP de 13 cepas nativas pertenecientes a un nuevo tipo de bacterias, aisladas de suelos colombianos, relacionadas con Clostridium butyricum, a nivel laboratorio. Se analizaron diferentes condiciones de fermentacin, ya optimizadas en un medio de cultivo diseado para la fermentacin acetobutlica, para observar su efecto sobre la produccin del diol, con una cepa nativa promisoria. De las condiciones de operacin analizadas (concentracin de glicerol, velocidad de agitacin y pH de fermentacin) se determino que la cepa nativa IBUN 158B en fermentacin por lote, presenta un mayor rendimiento molar (0.71 mol de PDO/ mol de glicerol) y una mayor productividad volumtrica (1.23 g PDO / Lh) en las condiciones de operacin del medio optimizado para la fermentacin acetobutlica (50 g/L de glicerol USP, 200 rpm y pH 7.0). Los resultados obtenidos mejoran o superan a otras cepas silvestres internacionalmente reconocidas como buenas productoras de 1,3-propanodiol. Por lo anterior se concluy que la produccin del diol con esta cepa nativa presenta viabilidad tcnica y se continuarn estudios enfocados hacia la optimizacin de la fermentacin y el proceso de separacin del metabolito de inters. (*) a quien la correspondencia debe ser dirigida. Clostridum sp, Cepas nativas colombianas, glicerol, 1,3-propanodiol, biodisel, fermentacin Clostridum sp, Colombian native strains, glycerol, 1,3-propanediol, biodiesel, fermentation

Estudio de la viabilidad tcnica de la produccin de 1,3 propanodiol (1,3-PD) a partir de glicerol con nuevas cepas colombianas de Clostridium sp. a nivel laboratorio

Dolly Montoya Castao (*), Oscar Aragn Caycedo

Instituto de Biotecnologa Universidad Nacional de Colombia. A. A. 14490, Bogot D. C., Colombia dmontoyac@unal.edu.co 2007

Palabras clave: Keywords:

Clostridum sp, Cepas nativas colombianas, glicerol, 1,3-propanodiol, biodisel, fermentacin Clostridum sp, Colombian native strains, glycerol, 1,3-propanediol, biodiesel, fermentation

(*) a quien la correspondencia debe ser dirigida.

Introduccin Con excepcin de la hidroelectricidad y la energa nuclear, la mayor parte de la energa consumida a nivel mundial viene del petrleo. Sin embargo, estos recursos son limitados y se estima que sern consumidos para finales del siglo XXI (Shuchardt et al., 1998). Por lo tanto, se requieren combustibles que provengan de fuentes renovables para enfrentar las necesidades energticas del mundo, tales como el etanol y el biodisel. En la produccin de 100 libras de biodisel se consumen aproximadamente 100 libras de aceites vegetales y 10 libras de metanol, obtenindose como subproducto 10 libras de glicerol (Zappi et al., 2003). La industria de biodisel, en Europa y Estados Unidos, ha tenido un rpido desarrollo por lo cual la cantidad de glicerol como subproducto de la transesterificacin se incrementa constantemente. Este incremento masivo hace que el precio del glicerol en el mercado colapse (Hirschmann et al., 2005). Colombia tambin ha entrado en un proceso de sustitucin de combustible diesel por biodisel a partir de aceite de palma, ya que el gobierno nacional ha desarrollado estrategias para impulsar la produccin de biodisel a nivel nacional (ANDI, 2005) y evitar que el pas se convierta en importador neto de petrleo desde el ao 2009 (Colciencias, 2004). Es necesario encontrar estrategias de conversin para este glicerol de forma que se convierta es una fuente de ingresos clave para las industrias de biodisel (Zappi et al., 2003; Holbein et al., 2004) y no permitir que este subproducto se convierta en un problema ambiental en el pas. Una alternativa para este glicerol no purificado, es ser usado como un excelente sustrato de fermentacin para la produccin de 1,3-propanodiol (1,3-PD) y cido ctrico (Zeng & Biebl, 2002; Cameron & Koutsky, 1994; Barbirato et al., 1998; Biebl et al., 1999; Papanikolaou et al., 2000; Gonzlez Pajuelo et al., 2004; Gonzlez Pajuelo et al., 2005a; Gonzlez Pajuelo et al., 2005b; Papanikolaou et al., 2002). El 1,3-propanodiol es un glicol usado como lubricante, como solvente (Papanikolaou et al., 2000), como estabilizador de detergentes, anticongelante, humectante de cosmticos, intermediario qumico (Cameron & Koutsky, 1994) y principalmente como monmero en la sntesis de polisteres y poliuretanos de alto valor agregado (AAFC, 2002; Papanikolaou et al., 2000; Gong et al., 2004; Li et al., 2001; Haas et al., 2005; Besson et al., 2003; Crissafis et al., 2006), que exhiben mejores propiedades de producto y mayor estabilidad a la luz que aquellos producidos con 1,2propanodiol, butanodiol o etilenglicol (Papanikolaou et al., 2000; Li et al., 2001; Haas et al., 2005; Besson et al., 2003; Crissafis et al., 2006). Los procesos qumicos de produccin masiva para el 1,3-propanodiol, desarrollados en la dcada de los 90 (Haas et al., 2005), usan en sus etapas intermedias hidrgeno a altas presiones, costosos catalizadores, manejan altas temperaturas y producen intermediarios txicos, por lo cual tienen altos costos de produccin (Zeng & Biebl, 2002; Bock, 2004; Crissafis et al., 2006). En contraposicin, los procesos biotecnolgicos de fuentes renovables son mas amigables con el ambiente y pueden ser econmicamente competitivos con las vas qumicas (Hirschmann et al., 2005). Las especies anaerobias y aerobias facultativas capaces de producir 1,3-propanodiol incluyen a Klebsiella pneumoniae, Enterobacter agglomerans, Citrobacter freundii, Lactobacilli brevis, L. buchneri, Clostridium butyricum y C. pasterianum (Barbirato et al., 1998; Biebl et al., 1999; Gonzlez Pajuelo et al., 2005a; Papanikolaou et al., 2000; Xiu et al., 2004; Zeng & Biebl, 2002, Barbirato et al., 1996; Cheng et al., 2005b). Dependiendo del microorganismo involucrado la distribucin de los productos vara: en el caso de Klebsiella pneumoniae adems del 1,3-propanodiol se produce 2,3-butanodiol, acetato, lactato y etanol por la va del piruvato (Chen et al., 2003a; Chen et al., 2003b; Cheng et al., 2005a; Barbirato et al., 1996, Hartlep et al., 2002). En las fermentaciones realizadas por Clostridium butyricum los productos principales son el 1,3-propanodiol, acetato y butirato (Gonzlez Pajuelo et al., 2004; Forsberg, 1987; Biebl et al., 1992; Solomon et al., 1995; Abbad-Andaloussi et al., 1995; Reimann et al., 1996; Barbirato et al., 1998; Colin et al., 2001). En este articulo se evala el potencial de produccin del solvente 1,3-propanodiol a partir de glicerol de 13 cepas nativas pertenecientes a un nuevo tipo de bacterias, aisladas de suelos colombianos y posible nueva especie, relacionadas con Clostridium butyricum (Montoya et al., 1999; Surez, 2004; Montoya et al., 2000a; Montoya et al., 2001; Jaimes et al., 2005; Arvalo et al., 2002; Quilaguy et al., 2006) a nivel laboratorio. Se analizan diferentes condiciones de fermentacin, ya optimizadas en un medio de cultivo diseado para la fermentacin acetobutlica (Montoya et al., 2000b), para observar su efecto sobre la produccin del diol, con una cepa nativa promisoria y determinar si la produccin biotecnolgica del diol con la nueva cepa tiene viabilidad tcnica.

Materiales y Mtodos Organismos. Cepas nativas, aisladas de suelos colombianos, pertenecen a la familia Bacillaceae de gnero Clostridia, caracterizadas bioqumica y molecularmente (Montoya et al., 1999; Surez, 2004; Montoya et al., 2000a; Montoya et al., 2001; Jaimes et al., 2005; Arvalo et al., 2002; Quilaguy et al., 2006 ) y su especie est relacionada a C. butyricum (Surez, 2004): IBUN 13 A, 22 A, 158 B, 137 K, 140 B, 64 A, 125 C, 95 B, 18 S, 62 F, 62 B, 18 Q y 18 A. Las cepas Clostridium butyricum DSM 2478, Clostridium butyricum DSM 523 y Clostridium diolis DSM 5431 fueron compradas a la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virgina, Estados Unidos de Amrica. Medio y condiciones de cultivo. Las condiciones de fermentacin en vial y los componentes del medio de cultivo fueron descritas anteriormente (Crdenas et al., 2006). El cultivo por lote fue realizado en el reactor R'ALF Plus Bioengineering AG . Los componentes del medio fueron los mismos utilizados en vial. Despus de esterilizacin (120 C, 25 min), el reactor con 3,6 litros de medio fue gaseado con nitrgeno estril libre de oxgeno hasta que la temperatura de operacin fue alcanzada. Un cultivo en fase exponencial fue usado como inculo (10.0 %). La concentracin inicial de glicerol fue de 50 g/L, temperatura fue mantenida a 37 C a travs de un bao recirculante de calentamiento, la agitacin fue de 200 rpm durante toda la fermentacin y el pH se mantuvo en 7.0 a menos que se indique lo contrario. El tiempo de fermentacin fue de 72 horas, tomando muestras cada 12 horas. Las condiciones de fermentacin que fueron evaluadas se presentan en la tabla 1. Determinacin de parmetros cinticos. Los metabolitos: 1,3-propanodiol, glicerol, cido butrico y cido actico, fueron cuantificados a travs de una metodologa desarrollada dentro del grupo de investigacin (datos no publicados), por cromatografa lquida de alto rendimiento (HPLC) con un detector de ndice de refraccin (Waters ) y una columna AMINEX HPX 87H (Biorad ) a 50 C con fase mvil de cido sulfrico 5 mM y una flujo de 0.6 ml/min. Con un tiempo de corrida de 25 minutos. El software integrador es Varian Star chromatography workstation 4.0. El crecimiento del microorganismo fue monitoreado por medio de la densidad ptica a una longitud de onda de 680 nm, en un espectrofotmetro BioRad y se correlacion con peso seco de biomasa determinado directamente. Diseo experimental. Las variables de proceso (pH de fermentacin, velocidad de agitacin y concentracin de glicerol) se evaluaron independientemente. Los valores probados se muestran en la tabla 1. El modelo estadstico escogido para cada variable fue un Diseo completamente al azar (DCA). Las variables de respuestas escogidas para el modelo estadstico de cada uno de los tratamientos fueron la productividad volumtrica (Q) en gramos de 1,3-propanodiol producido por hora - litro (g PD/ L - h) y el rendimiento de producto en sustrato (Yp/s) como moles de 1,3-propanodiol producido por moles de glicerol consumido (mol PDO / mol Glicerol). Con los resultados se realiz un anlisis de varianza (ANOVA) a una sola va. La hiptesis nula planteada fue que las medias de los tratamientos eran iguales. Cuando la diferencia entre las medias fue significativa ( = 0.05) se compararon las medias a travs de la prueba de comparaciones mltiples con el mejor (MCB por sus siglas en ingls) de Hsu con un nivel de significancia de = 0.05. Todas las fermentaciones se realizaron por duplicado. Tabla 1. Condiciones de fermentacin analizadas en reactor por lotes. Variable (factor) Niveles Menor Medio pH de fermentacin 6,5 7,0 Velocidad de agitacin (rpm) Concentracin de glicerol (g / L) 150 50 200 60

Alto 7,5 250 100

Resultados Seleccin de cepa promisoria Los resultados de la seleccin de la cepa nativa promisoria se observan en la tabla 2. A las 24 horas de fermentacin se pudieron observar dos grupos definidos dentro de las cepas nativas. En el primero se agrupan 5 cepas que presentaron una productividad superior a 0.095 g/L-h de PDO, siendo la cepa IBUN 158B en la que se observo la productividad mas alta. El segundo grupo corresponde a cepas que crecieron levemente y sus productividades fueron en promedio de tan solo 0.005 g/L-h de PDO. La nica cepa patrn que creci para este tiempo fue la cepa DSM 5431 con una productividad menor (0.063 g/L-h de PDO) a las cepas nativas del primer grupo. A las 72 horas, diez cepas nativas crecieron presentando una productividad superior a 0.029 g/L-h de PDO, siendo la de mayor valor la cepa IBUN 137K seguida por la cepa IBUN 158B. Para este tiempo de fermentacin solo tres cepas nativas crecieron levemente presentando una productividad promedio de 0.002 g/L-h de PDO. Dos de las cepas patrn (DSM 5431 y DSM 2478) a las 72 horas de fermentacin presentaron una productividad similar a las cepas nativas, aunque menor y la cepa DSM 523 presento una productividad de solo 0.001 g/L-h de PDO. Las cepas que presentaron una alta productividad de 1,3-propanodiol produjeron como metabolitos secundarios cido actico y cido butrico en diferentes proporciones a las 72 horas de fermentacin. Los rendimientos molares de produccin de 1,3-PD respecto al glicerol consumido son variados dentro de las cepas nativas y aunque existen cepas con valores altos de rendimiento molar, el glicerol consumido por estas cepas es bajo comparado con las cepas que presentaron mejores productividades volumtricas. Tabla 2. Resultados de las fermentaciones en vial para seleccin de cepa. Agitacin: 200 rpm, Temperatura: 37 C y pH: 7.0 Tiempo 24 h 72 h Glicerol Glicerol Yp/s (mol.mol Yp/s (mol.molOrigen Cepa consumido Q (g.L-1.h-1) consumido Q (g.L-1.h-1) 1 1 ) ) -1 -1 (g.L ) (g.L ) Nativa IBUN 158 B 14,2 0,435 0,212 16,5 0,384 0,073 Nativa IBUN 18 A 7,8 0,562 0,151 10,3 0,462 0,055 Nativa IBUN 22 A 5,8 0,712 0,141 23,4 0,108 0,029 Nativa IBUN 13 A 3,7 0,765 0,097 6,3 0,951 0,069 Nativa IBUN 140 B 7,8 0,359 0,096 11,3 0,357 0,046 Nativa IBUN 18 S 4,2 0,052 0,008 7,1 0,660 0,054 Nativa IBUN 137 K 4,4 0,037 0,006 11,1 0,627 0,080 Nativa IBUN 62B 5,1 0,028 0,005 5,6 0,022 0,001 Nativa IBUN 62F 6,0 0,023 0,005 10,9 0,012 0,002 Nativa IBUN 95 B 5,5 0,023 0,004 9,7 0,370 0,041 Nativa IBUN 64 A 0,2 0,636 0,004 10,1 0,607 0,070 Nativa IBUN 18Q 3,7 0,035 0,004 5,7 0,023 0,002 Nativa IBUN 125 C 1,2 0,084 0,003 5,9 0,593 0,040 Patrn DSM 5431 12.7 0.144 0.063 23.4 0.111 0.030 Patrn DSM 2478 1,2 0,201 0,008 7,8 0,380 0,034 Patrn DSM 523 1,8 0,057 0,004 6,3 0,020 0,001 Se compararon las productividades a travs de un ANOVA con un nivel de significancia de 0.05, para establecer la igualdad de las medias y posteriormente se utilizo la prueba de comparaciones mltiples de Hsu para determinar un valor mximo. Se realizo el anlisis de las productividades a las 24 y 72 horas. Los resultados mostraron en ambos casos que las medias de las cepas son diferentes con la significancia seleccionada. A las 24 horas las cepas 158B y 18A aparecen como las mejores y a las 72 horas las mejores cepas son la IBUN 137K, 158B, 64A y 13A. Teniendo en cuenta los resultados anteriormente presentados se decidi trabajar con la cepa 158B para analizar los factores de fermentacin, debido a su rpido crecimiento y buena productividad volumtrica.

Efecto del cambio en la velocidad de agitacin Al realizar la fermentacin en un reactor de 4 litros, con tres diferentes velocidades de agitacin (150, 200 y 250 rpm) se pudo observar un marcado efecto en el valor de la productividad y del rendimiento molar (Tabla 3). A 150 rpm la productividad y el rendimiento fueron menores que a 200 rpm. Los perfiles de fermentacin, indicaron que la concentracin de propanodiol obtenido es inferior al valor obtenido con 200 rpm y se presenta una fase lag de 18 horas. La concentracin de biomasa es similar a la obtenida a la alcanzada con 200 rpm pero las concentraciones de cido actico y cido butrico son tan solo de 3,0 g/L. y 3,5 g/L respectivamente. Con 250 rpm la situacin no mejoro respecto a la obtenida con 200 rpm. Se presento una fase lag de un tiempo similar a la obtenida con 150 rpm, aunque las concentraciones de cido actico, cido butrico y propanodiol superan a las obtenidas en el nivel mas bajo de velocidad de agitacin analizado. Realizando un ANOVA a una sola va analizando si existen diferencias entre las medias de los diferentes niveles de agitacin se obtuvo que para las variables rendimiento molar de propanodiol y productividad volumtrica, los tratamientos son significativamente diferentes y en ambos casos el tratamiento que maximiza ambas variables es el de 200 rpm. Tabla 3. Resultados anlisis de factores de fermentacin en reactor de 4 litros. Temperatura: 37 C, pH: 7,0, Agitacin: 200 rpm a menos que si indique lo contrario Glicerol consumido Tiempo de fermentacin Factor Yp/s (mol/mol) Q (g.L-1.h-1) (g.L-1) (h) Medio optimizado pH 7,0 200 rpm 50 0,71 1,26 24 50 g/L de glicerol Variaciones pH 6,5 pH 7,5 150 rpm 250 rpm 60 g/L de glicerol 100 g/L de glicerol 50 50 50 50 60 82 0,63 0,66 0,62 0,65 0,67 0,58 1,19 0,76 0,86 0.75 1,50 0,47 22 36 30 36 22 84

Efecto del cambio en el pH de fermentacin En la tabla 3, se observan los resultados promedio obtenidos al someter la cepa IBUN 158B a crecer en tres niveles diferentes de pH (6,5; 7,0 y 7,5). En todos los casos se consumieron 50 g/L de fuente de carbono. En el pH cido, la cepa consumi el glicerol ligeramente ms rpido que en el neutro. La productividad volumtrica obtenida es similar en ambos casos pero el rendimiento molar es menor en un 13 % en el medio cido. Para el medio bsico, se ven afectadas ambas variables analizadas (productividad y rendimiento molar), los valores a un pH de 7,5, son menores que en el valor neutro y la fase exponencial termina solamente hasta las 36 horas de fermentacin. La concentracin de biomasa al final de la fase exponencial es similar para los tres niveles de pH analizados. Los valores de concentracin alcanzados de cido actico son tambin similares, pero el acido butrico presenta una produccin mucho menor cuando el pH de fermentacin es de 7,5. Al comparar los valores de rendimiento molar y productividad volumtrica de los tres niveles de pH aplicados a la fermentacin, a travs de un anlisis de varianza para sus medias, se observa que estas son significativamente diferentes y que el mejor tratamiento para ambas variables es cuando se utiliza un pH neutro para la fermentacin. Efecto del cambio en la concentracin de inicial de glicerol Se utilizaron tres concentraciones iniciales de fuente de carbono (50 g/L, 60 g/L y 100 g/L de glicerol USP). Los resultados de productividad y rendimiento molar se observan en la tabla 3. Respecto al glicerol consumido en los dos primeros valores evaluados se consumi todo el glicerol suministrado al inicio de la fermentacin, pero cuando se suministraron 100 g/L de glicerol solo el 82% de este fue consumido. En la concentracin mas alta de glicerol la productividad decreci debido a una extensa fase lag de mas de 24 horas y el rendimiento molar tambin fue menor que lo observado en las otras dos concentraciones analizadas. Entre 50 y 60 g/L la produccin

de cidos y propanodiol no son radicalmente diferentes, aunque en la segunda concentracin se presenta una ligera disminucin en el rendimiento molar y una visible mejora en la productividad del proceso. Al realizar el anlisis estadstico de estas concentraciones como tratamientos independientes se observa que las medias de los rendimientos molares y de las productividades volumtricas no se pueden considerar equivalentes y al buscar cual es el mejor de los valores a travs de comparaciones mltiples se encuentra que el tratamiento a 50 g/L es el mas conveniente cuando se habla de obtener el mejor rendimiento molar, pero para la productividad volumtrica el mejor tratamiento es el de 60 g/L de glicerol. Comparacin de las mejores condiciones con una cepa patrn Finalmente se comparo la dinmica de fermentacin de la cepa nativa IBUN 158B con la cepa patrn C. diolis DSM 5431 en las condiciones originales del medio optimizado con glicerol comercial, ya que estas resultaron ser las condiciones en las que se presentaron los mejores resultados para la produccin de 1,3-propanodiol. Los rendimiento molares en ambas cepas son similares pero la productividad es mas alta para la cepa nativa. Tabla 4. Comparacin de la fermentacin de la cepa nativa IBUN 158B con cepas patrn en cultivo por lote con glicerol comercial. Cepa IBUN 158B C. diolis DSM 5431 Anlisis Seleccin cepa nativa En este estudio se ha mostrado que las cepas nativas de Clostridium sp. aisladas de suelos colombianos en el Instituto de Biotecnologa de la Universidad Nacional de Colombia (Montoya et al., 2001) tienen la capacidad de asimilar glicerol y producir el solvente 1,3-propanodiol en mayores proporciones que cepas patrn. Una de estas cepas patrn se encuentran dentro del grupo de cepas silvestres de Clostridium sp. que han sido aisladas durante los ltimos 20 aos, por su alta capacidad de fermentar glicerol a 1,3-propanodiol: C. diolis DSM 5431 (Biebl et al., 1992); C. diolis E5 (Petitdemange et al., 1995); C. butyricum VPI 3266 (Saint Amans et al., 1994); C. butyricum CNCM 1211 (Barbirato et al., 1998); C. butyricum F2b (Papanikolaou et al., 2000) y C. butyricum IK124 (Hirschmann et al., 2005). La cepa IBUN 158B fue escogida como representante del grupo de cepas nativas debido a su capacidad para asimilar glicerol con una productividad volumtrica y rendimiento molar de 1,3-propanodiol superior a las dems cepas analizadas tanto a las 24 horas como a las 72 horas de crecimiento. Un criterio similar fue utilizado por Biebl y colaboradores, para la seleccin de la cepa C. diolis DSM 5431 dentro del grupo de aislamientos estudiado, debido a que mostr una mayor velocidad de crecimiento en el medio de cultivo, a pesar de que no produca la mas alta concentracin del diol al final de la fermentacin (Biebl et al., 1992). Efecto del pH de fermentacin Al probar los tres valores de pH (6.5, 7.0 y 7.5) se presento una fuerte inhibicin al crecimiento en el pH superior (7,5), producindose una menor concentracin de cido butrico, pero una similar de cido actico. En el rango de 6,5 a 7,0 el valor de la productividad fue del mismo orden en ambos casos, pero se presento un mayor valor de rendimiento molar a un pH de 7,0. Estos valores concuerdan con lo observado con otros investigadores para la fermentacin de glicerol. Por ejemplo, para la cepa C. diolis DSM 5431 se ha encontrado que se tiene una buena produccin entre pH 6.0 y 7.5 (Biebl et al., 1992), estando los mejores resultados en un rango de pH 6,6 a 7,0 a una escala de 2 m3 (Gunzel et al., 1991). En estas investigaciones se ha observado un cambio en la produccin de cidos en funcin de la acidez del medio. As, en pH cidos existe una mayor produccin de cido butrico y en pH bsicos se fomenta la produccin de actico (Biebl et al., 1992). Con la cepa C. butyricum CNCM 1211 se Glicerol consumido (g.L1) 50 50 Yp/s (mol PDO/mol Gli) 0,71 0,73 Q PDO(g.L1.h-1) 1,26 1,09 Tiempo de fermentacin 24 28

encontr que el pH ms favorable para la fermentacin de glicerol es 7,0, ya que se obtuvo un tiempo mas corto de fase lag, un aumento en la produccin de acetato, disminucin en la concentracin de butirato y un mayor rendimiento molar de propanodiol comparado con pH mas cidos (6,0 y 6,5) (Colin et al., 2001). Ferchichi analizando la produccin de hidrogeno variando el valor de pH inicial (5 a 8,5) en una fermentacin de pH no controlado encontr un valor de mayor produccin entre pH 7 y 8,5 disminuyendo el rendimiento en valores cidos (Ferchichi et al., 2005). Para la produccin de cido butrico desde glucosa con la cepa Clostridium butyricum ZJUCB, se estudio el mejor valor de pH para produccin en un rango de 6,0 a 7,5. Se encontr que un mximo de cido butrico fue producido a un de pH 6.5 (He et al., 2005) Efecto de la velocidad de agitacin Cuando se analiz el efecto de la velocidad de agitacin (150, 200 y 250 rpm) sobre la fermentacin de 1,3propanodiol. En este estudio se observ que a un valor de agitacin de 200 rpm maximizaba la produccin de propanodiol de la cepa nativa IBUN 158B disminuyendo a valores menores (150 rpm) mayores (250 rpm). Los resultados obtenidos son similares a los encontrados por Ferchichi, quien estudio la produccin de hidrgeno en diferentes niveles de agitacin (100, 150, 200 y 400 rpm) y llego a la conclusin que con valores menores de 150 rpm la generacin de hidrogeno no se vea fuertemente afectada y la agitacin colaboraba a fomentar la produccin del gas. Para valores mayores a 150 rpm, este autor observ que la produccin de hidrogeno disminua posiblemente por la fragmentacin y el dao de corte a las clulas microbiales. Por lo que propuso que para la cepa C. saccharoperbutylacetonicum ATCC 27021 se deba encontrar un balance que asegurara la mxima productividad sin daar las clulas (Ferchichi et al., 2005). Pero, por otro lado, los resultados con la cepa nativa son opuestos a los presentados por otros investigadores como Biebl y Gunzel. Biebl realiz fermentaciones a 100 rpm y 400 rpm, con la cepa C. diolis DSM 5431 encontrando una ligera disminucin en el rendimiento molar (0.69 a 0.64) y sin cambio importante en la productividad del cultivo (Biebl et al., 1992). Gunzel trabajando con la misma cepa desarrollo fermentaciones en reactores agitados de 2 m3 y encontr que la velocidad del agitador (150 a 475 rpm) no tiene un efecto significante en la produccin de propanodiol (Gunzel et al., 1991). Efecto de la concentracin de glicerol Cuando el proceso fue escalado a 4 litros con pH controlado se probaron tres concentraciones de glicerol (50, 60 y 100 g/L), la dinmica del proceso ndico que a 100 g/L tanto el rendimiento molar como la productividad se ve fuertemente disminuida. Entre 50 y 60 g/L el rendimiento se mantiene y la productividad aumenta. Por lo que se considera que un rango de trabajo para la cepa nativa en fermentacin por lote debe estar dentro de estos dos valores de glicerol inicial (50 y 60 g/L) para fermentacin por lote. Los resultados obtenidos concuerdan con los presentados por otros investigadores por ejemplo: Colin encontr que la tasa de crecimiento disminuye a medida que aumenta la concentracin de glicerol. Por otro lado el propanodiol aumenta hasta una concentracin cercana a 65 g/L, con 120 g/L de glicerol inicial en fermentacin por lote. Posteriormente la produccin de propanodiol disminuye aceleradamente con lo cual ya no se presenta crecimiento a una concentracin de glicerol inicial de 160 g/L con la cepa C. butyricum CNCM 1211 (Colin et al., 2000). Similares resultados se encontraron comparando la fermentacin de cepas C. diolis E5 y C. diolis DSM 5431 en diferentes concentraciones de glicerol inicial. Pero se observo que a una concentracin de 200 g/L de glicerol la inhibicin para la cepa E5 era solo del 66% mientras para la cepa DSM 5431 fue de 110%. Lo cual indica que los valores inhibitorios difieren de una cepa a otra (Petitdemange et al., 1995). En un estudio realizado por Biebl con la cepa C. diolis DSM 5431 se observo el efecto de la concentracin de glicerol en fermentaciones por lote sobre el rendimiento y la productividad volumtrica. Se encontr que a medida que aumentaba la concentracin de glicerol (26 a 110 g/L) el rendimiento de propanodiol disminuyo ligeramente (0.57 a 0.51 g/g) y la productividad tuvo un mximo en la concentracin de glicerol media (52 g/L) siendo menor este valor en las dems concentraciones analizadas (Biebl et al., 1992). Papanikolaou y colaboradores, trabajando con la cepa C. butyricum F2b, realiz una anlisis similar en tres diferentes concentraciones (39, 50 y 90 g/L de glicerol) encontrando un mximo de productividad volumtrica y rendimiento molar a una concentracin de 50 g/L en cultivo por lote (Papanikolaou et al., 2004). Comparacin con otras cepas nativas

Como se puede observar en la tabla 5, cuando se compara la cepa nativa IBUN 158B en una fermentacin por lote usando las condiciones que maximizan la produccin de 1,3-propanodiol determinadas en este estudio, se tiene que su rendimiento molar es similar o mejor a otra cepas silvestres de Clostridium sp. que han sido evaluadas por diferentes investigaciones. Por otro lado, su productividad volumtrica es similar a la mayora de las productividades presentadas por los otros microorganismos de la tabla 5. Con lo anterior se demuestra que la cepa nativa silvestre IBUN 158B se puede considerar una cepa promisoria para la produccin de 1,3-propanodiol. Tabla 5. Comparacin de la fermentacin de la cepa nativa IBUN 158B con cepas patrn en cultivo por lote con glicerol comercial. Glicerol Yp/s Q PDO(g.LTiempo de Acetato/Butirato Cepa consumido (g.L- (mol PDO/mol Autor 1.h-1) fermentacin (mol/mol) 1) Gli) IBUN 158B 50 0,71 1,26 24 1.36 Este estudio C. diolis DSM 50 0,73 1,09 28 0.59 Este estudio 5431 C. diolis DSM 52 0,69 2.3 13 2.80 Biebl et al., 1992 5431 Petitdemange et C. diolis E5 48.8 0.62 1.04 24 7.11 al., 1995 Petitdemange et C. diolis E5 52.6 0.67 1.22 24 0.80 al., 1995 Papanikolaou et 40 0.67 1.2 26 0.46 C. butyricum F2b al., 2000 C. butyricum Barbirato et al., 70 0.64 1.32 28 0.70 CNCM 1211 1998 C. butyricum Himmi et al., 46 0.59 1.15 20 0.73 CNCM 1211 1999 C. butyricum VPI Saint-Amans et 65 0.65 0.72 48 3266 al., 1994 Conclusiones De las 13 cepas nativas de Clostridium sp. estudiadas, 9 de ellas fermentaron glicerol comercial a 1,3propanodiol, siendo la cepa IBUN 158B quien presento mayor productividad volumtrica a las 24 horas de fermentacin sin control de pH. Se determino que la cepa IBUN 158B en fermentacin por lote con pH controlado, presenta un mayor rendimiento molar (0.71 mol de PDO/ mol de glicerol) y una mayor productividad volumtrica (1.23 g PDO / L- h) en las condiciones de operacin del medio optimizado para la fermentacin acetobutlica (50 g/L de glicerol, pH 7.0, y 200 rpm de agitacin). Finalmente al comparar el desempeo de la cepa nativa IBUN 158B para fermentar glicerol a 1,3-propanodiol con otras cepas silvestres de Clostridium sp. que han sido evaluadas por diferentes investigaciones se observa que es similar o mejor, por lo cual se considera que la cepa nativa presenta una alta viabilidad tcnica para la produccin de 1,3-propanodiol a partir de glicerina y se hace necesario continuar estudios enfocados hacia la optimizacin de la fermentacin y el proceso de separacin del metabolito de inters. Bibliografa Abbad-Andaloussi, S., Manginot-Durr, C., Amine, J., Pettitdemange, E., Petitdemange, H. (1995) Isolation and characterization of Clostridium butyricum DSM 5431 mutants with increased resistance to 1,3propanediol and altered production of acids. Applied and Environmental Microbiology. 61 (12), 4413-4417 Agriculture and Agri-Food Canada (AAFC). (2002). Strategic Market Management System Bioplastics. June 25, 2002. http://www.agr.gc.ca/misb/spec/bio/pdf/plast_e.pdf [Consulta: 2005-11-06]

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