UNIVERSIT DEGLI STUDI DI NAPOLI FEDERICO II

FACOLT DI SCIENZE BIOTECNOLOGICHE

CORSO DI LAUREA IN BIOTECNOLOGIE BIOMOLECOLARI E INDUSTRIALI

DIPARTIMENTO DI SCIENZE FISICHE

ELABORATO FINALE
STUDIO DELLATTIVITA ENZIMATICA DELLA GLUCOSIO-OSSIDASI MEDIANTE TECNICHE DI FLUORESCENZA RISOLTA IN TEMPO
Relatore Ch.mo Prof. re Raffaele Velotta Correlatore Dott. Rosario Esposito Candidato Gennaro Antonio Apuzzo Matr. 497/000154

ANNO ACCADEMICO 2008/2009

A voi, che siete stati il motore di tutto

INDICE
SCOPO DEL LAVORO INTRODUZIONE Il Biosensore La Fluorescenza Enzima Glucosio Ossidasi Il FAD 3 4 4 5 6 8 11 13 18 19

MATERIALI E METODI RISULTATI E DISCUSSIONE CONCLUSIONI BIBLIOGRAFIA

SCOPO DEL LAVORO

Il mio lavoro si inserisce nellambito di un progetto di ricerca di nuovi biosensori ottici ad alta sensibilit indirizzati allindustria biomedica che vede in collaborazione il Dipartimento di Scienze Fisiche dellUniversit Federico II e il Dipartimento di Medicina Sperimentale della Seconda Universit di Napoli. In questa fase preliminare si sta focalizzando lattenzione sullenzima GOD (Glucosio Ossidasi) e sugli spettri di assorbimento/emissione ad una data lunghezza donda. Lobiettivo della mia esperienza di laboratorio consistita nella misurazione del tempo di vita medio di fluorescenza mediante risoluzione in tempo, allo scopo di poter determinare la cinetica enzimatica e il tempo di vita media di fluorescenza associato alle varie concentrazioni di glucosio.

INTRODUZIONE
Nellambito di ricerca di nuove metodologie investigative, un particolare interesse rivolto alle tecniche di imaging basate su processi di fluorescenza, sia come strumento di indagine in biologia, sia come ausilio diagnostico in medicina. In biologia la fluorescenza utilizzata per visualizzare sovrastrutture molecolari o per identificare i protagonisti delle vie metaboliche. In medicina invece, i processi di fluorescenza vengono sfruttati sia nella ricerca che a livello clinico, come strumento di imaging per la rivelazione di patologie o di particolari condizioni fisiologiche. Nelle misure ambientali, inoltre le misure di fluorescenza vengono sfruttate per il monitoraggio delle condizioni igieniche, come ad esempio analisi di contaminazioni batteriche nei cibi o dellinquinamento delle acque. Il Biosensore Un biosensore un particolare trasduttore costituito da un elemento sensibile biologicamente attivo (enzimi, cellule, anticorpi ecc.) e da una parte elettronica. Il principio di funzionamento molto semplice: l'elemento biologico interagisce specificamente con il substrato da analizzare e un sistema di trasduzione (sensore) converte la risposta biochimica in un segnale elettrico. In fig.1 rappresentato lo schema di un classico biosensore.

Fig.1 Schema di un biosensore

Nel nostro caso la componente biologica data dalla GOD mentre quella trasducente data dallapparecchiatura laser utilizzata per la rivelazione del segnale. La Fluorescenza La fluorescenza la capacit di alcuni materiali di emettere luce quando vengono colpiti da raggi ultravioletti o da altri tipi di radiazioni, anche luce visibile, sempre ad una lunghezza donda pi alta (corrispondente ad energia pi bassa). Il nome fluorescenza deriva dalla fluorite, minerale di calcio e fluoro, alcuni campioni del quale sono, appunto, fluorescenti, ed stato proprio nella fluorite che il fenomeno stato scoperto. La fluorescenza uno dei due processi radiativi con cui si pu verificare il rilassamento di una molecola eccitata, laltro la fosforescenza. La distinzione tra i due processi fu originariamente fatta in base al tempo di vita della radiazione: nella fluorescenza la luminescenza cessa quasi subito dopo aver eliminato la

radiazione eccitante, mentre nella fosforescenza la radiazione continua ad essere emessa, almeno per un breve lasso di tempo, anche dopo aver eliminato la sorgente eccitante.

Fig.2 Differenze energetiche tra fosforescenza e fluorescenza. rappresentano l'energia dell'elettrone in funzione della distanza tra gli atomi della molecola, mentre le linee orizzontali all'interno delle curve sono i livelli di energia corrispondenti alle loro vibrazioni

Nella fluorescenza un elettrone molecolare viene investito da un'onda elettromagnetica della radiazione eccitante e assorbendone l'energia si sposta sullorbitale pi esterno, ma l'eccessiva energia vibrazionale improvvisamente acquisita dalla molecola viene dispersa in brevissimo tempo nell'ambiente, lasciando l'elettrone in un particolare stato instabile dal quale torner nella posizione originaria, emettendo un fotone, nel giro di una frazione infinitesima di secondo. Diversamente per la fosforescenza, lelettrone dopo lassorbimento di energia viene spinto su un orbitale esterno; da qui, come indicato dalle frecce piccole della figura, perde energia, fino a raggiungere lo stato di vibrazione a energia pi bassa. Per una sostanza fosforescente esiste un orbitale intermedio pi stabile e quindi l'elettrone sar costretto a spostarsi su quest'ultimo. Tale orbitale intermedio molto stabile e ci permette allelettrone di rimanervi per parecchio tempo prima di ricadere nellorbitale di partenza. Questo e il motivo per cui la luce di fosforescenza pu essere emessa anche molto tempo dopo la fine delleccitazione. La lunghezza d'onda della radiazione tanto pi corta quanto pi il salto energetico. Quindi lenergia di assorbimento dovr essere sempre maggiore dellenergia dell emissione che andremo a leggere.

Enzima Glucosio Ossidasi Il diabete una malattia diffusa in tutto il mondo e colpisce milioni di persone. Una dieta attenta e farmaci opportuni possono ridurre molte delle complicazioni del diabete. Questi trattamenti prevedono il continuo monitoraggio dei livelli di glucosio nel sangue in modo da poter intervenire tempestivamente se diventano troppo alti. L'enzima glucosio ossidasi ha reso la misura della concentrazione di glucosio veloce, facile ed economica. Esistono, infatti, biosensori amperometrici presenti in commercio che misurano la differenza di potenziale che si ha quando lenzima reagisce con il glucosio.

Fig.3 Struttura tridimensionale della Glucosio Ossidasi

La glucosio ossidasi utilizzata per i nostri esperimenti stata estratta dal fungo Aspergillus Niger; esso si sviluppa come muffa e viene utilizzato a livello industriale per la produzione di acido citrico, acido gluconico ed altri enzimi come glucoamilasi e -galattosidasi. L'enzima un omodimero le cui due subunit sono costituite da due glicoproteine da 80 kDa ciascuna che espongono in superficie residui di NAG (N-Acetil-Glucosammina), e e D-mannosio. La glucosio ossidasi un enzima appartenente alla classe delle ossidoreduttasi, esso in grado di ossidare il glucosio ad acido gluconico e perossido didrogeno (acqua ossigenata). Essa fa parte della famiglia delle flavoproteine perch sfrutta il coenzima FAD (Flavina Adenina Dinucleotide), indicato in rosa nella Fig.3. La glucosio ossidasi si trova, oltre che sulla superficie di alcuni funghi, dove contribuisce a combattere le infezioni batteriche, anche nel miele dove agisce da conservante naturale: la produzione di perossido di idrogeno risulta infatti essere tossica per molti batteri.

Glucosio + FAD Gluconolattone + FADH2 FADH2 + O2 FAD + H2O2 Gluconolattone + H2O Acido Gluconico

In totale: glucosio + O2 + H2O ac. gluconico + H2O2

Fig.4 Reazione complessiva catalizzata dalla GOD

Il gluconolattone si idrolizza spontaneamente ad acido gluconico mentre il coenzima ridotto riossidato a spese dellossigeno atmosferico con formazione di H2O2. Questo enzima, anche se svolge un ruolo di secondo piano in natura, diventato il centro di un'attivit industriale biotecnologica da 5 miliardi di dollari. Viene usato in biosensori che misurano la concentrazione del glucosio nel sangue. Le misurazioni da noi effettuate in fluorescenza risolta in tempo sfruttano le propriet spettroscopiche del cofattore flavinico e le diverse intensit di emissione di fluorescenza in assenza ed in presenza di glucosio. Il FAD Il FAD, Flavina Adenina Dinucleotide, un importante coenzima ossido riduttivo che funge da accettore di elettroni e protoni. Le due basi azotate che lo compongono sono la flavina (o gruppo isoalloxazinico) e ladenina, legati a due zuccheri, rispettivamente il ribitolo e il ribosio, formando cos i due nucleosidi, la riboflavina e ladenosina, tenuti insieme da un pirofosfato mediante due legami fosfoesterici.

Fig.5 Struttura del FAD

Come indicato in fig.5, per gli scopi di cui sopra descritti, sfruttiamo la diversa colorazione del FAD in forma ossidata (prima della reazione) e in forma ridotta (durante la reazione). In particolare nella reazione studiata il FAD, covalentemente legato allenzima, funge da accettore di idrogeni ossidando cos il glucosio a gluconolattone. Lossigeno in soluzione ossider a sua volta il FAD, trasformandosi cos in perossido di idrogeno. Il FAD cos riossidato pronto per catalizzare di nuovo la reazione (Fig.4)

Fig.6 Spettro di assorbimento del FAD disciolto in tampone fosfato

Lo spettro di assorbimento del FAD consiste di due picchi piuttosto marcati situati a circa 220 nm e 260 nm (imputabili alladenina), e di altri due picchi a 380 nm e 450 nm (imputabili al gruppo isoalloxazinico)

Fig.7 Spettro di fluorescenza del FAD disciolto in tampone fosfato

Il picco di emissione di fluorescenza per il FAD eccitato a 450 nm 525 nm.

Fig.8 Esempio di assorbimento ed emissione di fluorescenza nello spettro visibile

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MATERIALI E METODI

La GOD stata acquistata dalla Sigma-Aldrich come Glucose Oxidase from Aspergillus Niger, cod.49180 . Per la misurazione dellattivit enzimatica stato necessario utilizzare soluzioni a diverse concentrazioni di glucosio. Anzich preparare diverse soluzioni a differenti concentrazioni di glucosio, risultato pi pratico preparare una soluzione ad alta concentrazione di glucosio, in particolare 50mM, opportunamente aliquotata (a seconda della concentrazione richiesta per la misurazione) e posta nella cuvetta contenente lenzima in tampone fosfato. Le misure di fluorescenza sono state effettuate in una cuvetta di quarzo avente un cammino ottico di 1 cm.

Filtro passabanda @520nm

Lente focalizzatrice Cuvetta contenente il campione

Fibra ottica

Lente focalizzatrice

Fig.9 Schema del Set-up sperimentale

La sorgente luminosa di eccitazione un laser costituito da un diodo ad arseniuro di gallio, comandato da un driver modello PDL 800-B della Picoquant (lunghezza donda: 405 nm, larghezza dellimpulso: 80 ps FWHM, frequenza di ripetizione: 40 MHz, potenza media: 1 mW).

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Il rivelatore TCSPC (Time-Correlated Photon Counting) consiste di un tubo fotomoltiplicatore accoppiato con un Micro Channel Plate (MCP-PMT) Hamamatsu C4878 (risoluzione temporale di circa 30 ps, range temporale variabile tra 5 e 50 ns, analizzatore a 4096 canali). Il sistema alimentato da un Hamamatsu C3360 a -3 kV e provvisto di ununit di raffreddamento per limitare il rumore dovuto ad effetto termoionico. Il fascio luminoso proveniente dalla sorgente laser attraversa una lente di focalizzazione. La luce arriva quindi al campione posto nella cuvetta. Il segnale di fluorescenza emesso viene raccolto a 90 per mezzo di una C seconda lente di focalizzazione, cos da poter rivelare solo la fluorescenza e non il fascio luminoso del laser. Il segnale viene quindi inviato tramite fibra ottica al rivelatore. Il rivelatore connesso al driver della sorgente laser, per la rivelazione dellimpulso di eccitazione. I dati raccolti vengono elaborati da un software dedicato.

Fig.10 Foto dellapparato sperimentale

Lanalisi dei dati sperimentali stata condotta attraverso una tecnica nota come riconvoluzione ai minimi quadrati. A tal proposito stato sviluppato un programma con il software MatLab, testato preliminarmente su dati simulati al calcolatore e successivamente sui dati sperimentali.
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RISULTATI E DISCUSSIONE

Le misure di fluorescenza sono state effettuate prima in assenza di substrato, poi con soluzioni a concentrazioni di glucosio crescenti: 0.7mM, 0.8mM, 0.9 mM, 1 mM e 1.2 mM.

700 600

Intensit di Fluorescenza (u.a.)

500 400 300

b
200

a
100 0 480 500 520 540 560 580

(nm )

Fig.11 Spettro di emissione della GOD in fase stazionaria

In fig.11 riportato lo spettro di emissione di fluorescenza: (a) del FAD ossidato quindi in assenza di glucosio e (b) ridotto, in presenza di glucosio.

Segnale (conteggi) in scala log

G O D + G LU 1m M GOD

100

10 0 2000 4000 6000

tem po (p s)

Fig.12 Conteggio fotoni per GOD free e GOD+GLU

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In fig.12 osserviamo il tempo di decadimento del segnale di fluorescenza in funzione del numero di conteggi. In rosso sono indicati i conteggi di fotoni ottenuti con lenzima senza il substrato, mentre in blu conteggi in presenza di glucosio ad una concentrazione di 1mM. Come si pu osservare la seconda parte della curva di fit segue allincirca lo stesso andamento. La differenza tra le due riguarda invece il primo tratto: dalla diversa pendenza notiamo infatti la comparsa di un tempo di vita medio veloce non presente nellenzima libero.

400 350 300 250

Glu 0,7mM

tau1

tau1 (ps)

200 150 100 50 0 0 200 400

Tem po (s)
Fig.13 Andamento del 1 con glucosio a concentrazione 0,7mM
400 350 300 250

Glu 1,2mM

tau1 (ps)

tau1
200 150 100 50 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

T em po (s)
Fig.14 Andamento del 1 con glucosio a concentrazione 1,2mM

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Osservando landamento del 1 al procedere del tempo di acquisizione, alle concentrazioni rispettive di 0,7mM e 1,2mM, le due curve sembrano avere un andamento molto simile. E possibile confrontarle, aggiungendo unulteriore curva relativa alla concentrazione di glucosio di 1mM, sovrapponendole (fig.15).
400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 500 1000 1500 2000

tau1 (ps)

1.2 mM 1.0 mM 0.7 mM

Tempo (s)
Fig.15 Andamento dei 1 a tre differenti concentrazioni di glucosio

In tutti e tre i casi il 1 risulta essere compreso tra 300 e 350 ps. Quello che cambia il tempo in cui presentano questo , funzione del tempo necessario a convertire tutto il glucosio: aumenta con laumentare della concentrazione di glucosio, perch allaumentare del numero di molecole di glucosio, aumenta la frazione di enzimi che forma il complesso ES (enzima-substrato) e di conseguenza lequilibrio tra la forma ridotta/ossidata del FAD si sposta verso la forma ridotta. Quando tutto il glucosio stato convertito in gluconolattone, lequilibrio si sposter verso la forma ossidata e il 1 si

minimizzer prima, poi tender a 0 se si attende un tempo sufficientemente lungo. E plausibile che una piccola frazione di gluconolattone subisca la reazione inversa, essendo gli enzimi capaci di abbassare lenergia di attivazione sia in un verso che nellaltro: in questo caso il segnale di fluorescenza dovrebbe aumentare temporaneamente, ma dato il basso numero di molecole catalizzate, il segnale potrebbe essere basso tanto da non essere rivelabile.
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E inoltre possibile analizzare lampiezza a1 e a2 rispettivamente di 1 e 2, normalizzati rispetto allampiezza totale a1+a2 (fig.16).

0,3

Ampiezza normalizzata a1/(a1+a2)

0,2

1.2 mM 1.0 mM 0.7 mM

0,1

0,0 0 500 1000 1500 2000

Tempo (s)
Fig.16 Andamento delle ampiezze dei tempi di vita medi a diverse concentrazioni di glucosio

Possiamo notare come le ampiezze hanno un valore minimo che non va mai a zero, nemmeno quando il glucosio totalmente esaurito. Utilizziamo queste ampiezze e quelle di altre concentrazioni cinque concentrazioni per costruire di un curva che interpoli meglio possibile i punti ottenuti (fig.17).
0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

ampiezza normalizzata

concentrazione glucosio (mM)

Fig.17 Grafico delle ampiezze in funzione della concentrazione di glucosio

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Tale curva descrivibile dalla seguente equazione:

A1 C [S ] = +B A1 + A2 [S ] + K M
Il fattore B rappresenta lampiezza minima che osserviamo anche in assenza di glucosio. Come si pu osservare, questa curva segue un andamento analogo a quello di una Michaelis-Menten, ci nonostante non ci possibile ottenere una Vmax, che ricordiamo essere data dallequazione: Vmax = K2 [E]0 in quanto non conosciamo la costante di velocit K2. Nel nostro caso la costante K2 risulta essere funzione della concentrazione di ossigeno: questo si comporta da substrato limitante e in sua assenza lenzima, o pi specificamente il coenzima, non in grado di ritornare nella sua forma ridotta per poter catalizzare una nuova reazione. Ci aspettiamo che lampiezza del decadimento di fluorescenza si prolunghi indefinitamente, in assenza di ossigeno, perch supponiamo che il complesso ES si formi comunque, e che la maggior parte dellenzima totale si trovi cos complessato. Per poter verificare questipotesi necessario eliminare lossigeno dalla soluzione acquosa, usando un composto che non assorba ed emetta nei range di lunghezza donda utilizzati per lesperimento, che non interferisca con lattivit enzimatica e che sia di facile manipolazione per consentire veloci repliche delle misurazioni .

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CONCLUSIONI

Le analisi finora effettuate, che hanno compreso anche una fase di analisi della fluorescenza del solo coenzima FAD e delle sue conformazioni al variare di pH, allo scopo di poter stabilire linee guida e protocolli per le successive analisi. Lo step successivo di questa ricerca quello di effettuare le misure con lenzima immobilizzato mediante intrappolamento in membrane di gelatina. Ci si aspetta infatti che la sensibilit per lenzima immobilizzato sia maggiore di quella ottenuta per lenzima libero. Questo risultati sono molto incoraggianti soprattutto in vista di un utilizzo di questo metodo per la realizzazione di sensori per la determinazione di glucosio nei fluidi biologici, per i quali la fluorescenza stazionaria nellUV darebbe risultati poco specifici a causa della presenza di numerose proteine. Una volta ottenuta maggiore sensibilit con la glucosio ossidasi

immobilizzata, si pu procedere alla ricerca di nuovi enzimi che presentino affinit maggiore per il substrato offrendo, una volta immobilizzati, unottima risposta lineare e una sensibilit molto elevata.

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BIBLIOGRAFIA

1. J.R. Lakowicz, Principles of fluorescence spectroscopy, Kluwer Academica Plenum Publisher, 1999. 2. Nelson, Cox, Lehninger principles of biochemistry, 4th edition, 2004. 3. A. Haouz, C. Twist, C. Zentz, P. Tauc, B. Alpert, Dynamic and structural properties of glucose oxidase enzyme, Eur Biophys J (1998) 27: 19 25 4. C. M. Wong, K. H. Wong, X. D. Chen, Glucose oxidase: natural occurrence, function, properties and industrial application, Appl Microbiol Biotechnol (2008) 78:927-938 5. S. Ghisla, V. Massey, J.M. Lhoste, S.G. Mayhew, Fluorescence and Optical Characteristics of Reduced Flavine and Flavoproteins, Biochemistry 1974 vol13 no.3: 589-596 6. B.E.P. Swoboda, V. Massey, Unkown constituent of glucose oxidase from Aspergillus Niger, Flavins and Flavoproteins 1966, 263-269

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