APUNTES SECEGRIN MICROSCOPIA ELECTRONICA Ing. Mara Julia Yez Prof.

Viviana Sorrivas de Lozano

INTRODUCCION Un microscopio es, bsicamente, un sistema ptico que transforma un objeto en una imagen, la cual amplifica (magnifica) detalles caractersticos del objeto. Con el microscopio de luz se resuelven detalles del orden del micrn, mientras que con el microscopio electrnico se alcanzan a resolver objetos del orden de los angstrom. En el microscopio electrnico, un haz de electrones incide sobre una muestra y de la interaccin de estos electrones con los tomos de la misma, surgen seales que son captadas por algn detector o bien, proyectadas directamente sobre una pantalla. Dentro de la familia de microscopios electrnicos, se encuentran el microscopio electrnico de transmisin (TEM) y el microscopio electrnico de barrido (SEM). Cada uno de ellos, permite el estudio de diferentes caractersticas de una muestra. El SEM provee informacin sobre morfologa y caractersticas de la superficie, mientras que con el TEM podemos observar la estructura interna y detalles ultraestructurales. Un gran avance se ha alcanzado con la incorporacin de tcnicas de procesamiento de imgenes para revelar detalles especficos de inters, algunos de ellos ligados a la ultraestructura de la muestra. COMPARACION ENTRE MICROSCOPIOS DE LUZ Y ELECTRONICO Los microscopios de luz y electrnico son esencialmente, idnticos. Tanto uno como otro nos permiten amplificar aquellos objetos que son indistinguibles a nuestro ojo. La diferencia fundamental entre los dos es la fuente de iluminacin. Mientras el microscopio de luz utiliza un haz de luz en el rango de las longitudes de onda del visible, el microscopio electrnico emplea un haz de electrones de muy corta longitud de onda que permite obtener una mayor resolucin. Una tabla comparativa, entre ambos microscopios se muestra a continuacin. Cabe destacar que la misma, involucra caractersticas generales de los microscopios electrnicos y no considera las diferencias particulares entre TEM y SEM. MICROSCOPIO DE LUZ Iluminacin Longitud onda Haz de luz de 2000 - 7500 MICROSCOPIO ELECTRONICO Haz de electrones 0.037 - 0.086

Lentes Medio Resolucin Magnificacin Focalizacin Contraste

Vidrio Atmsfera 2000 10 x - 2000 x Mecnica Absorcin - Reflexin

Electromagnticas Vaco 3 100 x x 450000

Elctrica Scattering

RESOLUCION El concepto de resolucin est relacionado con la capacidad de distinguir detalles finos en una imagen. En otras palabras, es la distancia mnima r1 a la cual podemos distinguir, claramente, dos puntos como entidades separadas. La resolucin terica del microscopio electrnico es:

Para valores de = 0.037 y = 0.1 radianes, la resolucin nominal es 0.2 . NATURALEZA DE LAS ONDAS DE ELECTRONES De Broglie mostr que una partcula movindose a una velocidad cercana a la de la luz tena una forma de radiacin asociada con ella. Esta relacin est expresada por:

donde es la longitud de onda, h la costante de Plank, m la masa de la partcula y v su velocidad. Si la partcula es un electrn y su velocidad 1/3 de la velocidad de la luz, = 0.05 A. que es 100.000 veces ms corta que la luz verde. Por lo tanto, la resolucin de un microscopio que emplee este tipo de radiacin ser mucho mejor que la de un microscopio de luz. La naturaleza precisa de estas ondas de electrones es difcil de entender en trminos de la fsica clsica y su descripcin se hace mediante la mecnica cuntica. Las ondas de electrones se pueden pensar como un quantum o paquete de radiacin que acompaa a cada electrn en su trayectoria, es parte de l y permanece con l. Las caractersticas de estas ondas dependen de la posicin exacta de un dado electrn en el espacio y en el tiempo; puede expresarse como la probabilidad de encontrar al electrn en esa posicin. Las ondas de electrones no deben confundirse con radiacin electromagntica, como la que se produce cuando un haz electrnico interacta con la materia, pierde energa y produce una

radiacin cuya longitud de onda pertenece al espectro electromagntico. MICROSCOPIO ELECTRONICO DE TRANSMISION EL INSTRUMENTO El sistema ptico-electrnico del microscopio electrnico de transmisin est constitudo por las siguientes partes: 1. Can de electrones 2. Sistema de lentes 3. Pantalla fluorescente Estos componentes estn ensamblados en una columna vertical la cual se encuentra en alto vaco. El can de electrones, es la fuente emisora del haz de electrones. Se encuentra ubicado en la parte superior de la columna. Est constitudo por un filamento (ctodo), un cilindro con una apertura central, llamado cilindro de Wehnelt que rodea al filamento y tiene un potencial ligeramente ms negativo que ste. El nodo se encuentra por debajo del cilindro de Wehnelt. El filamento es calentado por el pasaje de corriente (alrededor de 2800 K). Los electrones emitidos termoinicamente por el ctodo son acelerados hacia el nodo, pasan por la apertura circular central de ste y un haz de alta energa es emitido hacia la columna del microscopio. El sistema de lentes est formado por lentes condensadores objetivo, intermedia y proyectora. Las lentes condensadoras, en los microscopios, ms modernos son dos. La primera, proyecta la imagen punto de entrecruzamiento demagnificada (spot size), mientras que la segunda controla su dimetro y el ngulo de convergencia en que incide sobre la muestra. limita al haz que incide sobre la muestra. La lente objetivo forma la primera imagen, localizada debajo del especmen. Es considerada el componente ms importante del microscopio electrnico. Cualquier defecto en sta, ser magnificado y transmitido al resto del sistema ptico. Por lo tanto, de ella dependen, en gran medida, la resolucin final y la correccin de las aberraciones. Las lentes intermedia y proyectora son las encargadas de amplificar la imagen dada por la lente objetivo y proyectarla sobre la pantalla fluorescente. La pantalla del microscopio electrnico de transmisin est recubierta por una pintura de fluoruros de Zn y Cd, que fluoresce cuando es bombardeada por electrones, generando una imagen en el rango de las longitudes de onda del visible.

Mediante el microscopio electrnico de transmisin podemos estudiar la ultraestruacura de un material orgnico oinorgnico. Para esto, existen diferentes formas de operacin que posibilitan el estudio de una caracterstica en particular. Entre las aplicaciones del TEM para el estudio de materiales no- biolgicos y biolgicos podemos nombrar : 1. Determinacin de estructura cristalina en minerales, metales, etc. 2. Estudio de catalizadores. 3. Determinacin de impurezas, precipitados,etc. 4. Identificacin de bordes de grano e interfaces en metales. 5. Estudio de fases y zonas cristalinas en polmeros. 6. Determinacin de tamao de partcula en catalizadores, minerales,etc. 7. Identificacin de planos cristalinos. 8. Cambios estructurales de materiales sometidos a diferentes tratamientos trmicos. 9. Realizacin de estudios de histoqumica para identificxar compuestos especficos. 10. Estudios de ultraestructura de tejidos vegetales y animales. 11. Reconocimiento de virus. 12. Estudios de citoqumica. 13. Estudios de estructuras moleculares. MICROSCOPIA ELECTRONICA DE BARRIDO (SEM). El microscopio electrnico de barrido (SEM) es similar al microscopio electrnico de transmisin. Ambos tienen ciertas caractersticas comunes tales como un can de electrones donde se genera el haz de electrones, lentes condensadoras y objetivo, sistema de vaco. La diferencia principal entre ellos es la manera en que forman y magnifican la imagen. Esto hace que la informacin que se obtenga de cada uno sea distinta. Mientras el TEM permite el estudio de la ultraestructura de muestras delgadas, el SEM posibilita conocer la morfologa superficial.

En el microscopio electrnico de barrido, el haz electrnico, atraviesa la columna y llega a la muestra. Un generador de barrido es el responsable de producir el movimiento del haz , de manera que barra la muestra punto a punto. De la interaccin entre los electrones incidentes con los tomos que componen la muestra se generan seales, las cuales pueden ser captadas con detectores adecuados para cada una de ellas. El detector capta una seal y las convierte en una seal electrnica que es proyectada en un tubo de rayos catdicos (CRT). El barrido del haz est sincronizado con el barrido del CRT y produce una relacin uno a uno entre puntos de la muestra y puntos en el CRT. Un esquema del SEM se muestra en la siguiente figura.

Mediante el SEM se estudian: 1. Morfologa superficial de minerales, catalizadores, etc. 2. Electrodepsitos 3. Adherencia fibra-matrz en polmeros. 4. Cambios morfolgicos de materiales sometidos a tratamientos qumicos. 5. Formas de cristalizacin de minerales. 6. Control de calidad de catalizadores industriales. 7. Morfologa superficial interna de partculas polimricas. 8. Morfologa de tejidos u rgano animales y vegetales. 9. Estudio de molculas 10. Reconocimiento de fsiles. INTERACCION HAZ INCIDENTE - MUESTRA EN EL SEM. Naturaleza de la interaccin: Cuando el haz de electrones choca contra la muestra, ocurren interacciones entre dichos electrones y los tomos que componen la muestra. De all surgen seales tales como: electrones secundarios, electrones retrodifundidos, rayos x caractersticos, electrones Auger, catodoluminiscencia. Todas estas seales se producen simultneamente pero cada una de ellas son captadas por detectores diferentes. Uno de los detectores ms comunes es el de electrones secundarios. Los mismos son emitidos desde la muestra como consecuencia de las ionizaciones surgidas de las interacciones inelsticas.

Por esta razn, poseen baja energa (50 ev). Ellos brindan una imagen de la morfologa superficial de la muestra. UNIDADES DE MEDIDA EN MICROSCOPIA La unidad que se usa en microscopa de luz es el micrn () que es la milsima parte del milmetro. En microscopa electrnica la unidad ms conocida es el angstrom (), definido como la diez millonsima parte del milmetro. Tambin se emplea el nanometro (nm), que es la millonsima parte del micrn.

1 mm = 103 = 106 nm = 107

As, por ejemplo, la resolucin de un microscopio de luz es 0.25 2500 ; y la de un microscopio electrnico de 2.5 PEQUEA GALERA DE IMGENES DE MICROSCOPA ELECTRNICA

Detalle de epidermis de semilla de justicia. Fotografia tomada con el microscopio electrnico de barrido. (1cm=10 micras)

Micrografa electrnica de Transmisin de un polmero. (1cm=0.2 micras)

Vista general de un piojo (20X).(1cm=300 micras)

Detalle de ala de mariposa (220X). (1cm=30 micras)

Detalle de bacterias (bacilos) a 10000X. Las bacterias miden aproximadamente una micra.

Detalle de fibras de algodn (600X). (1cm= 10 micras)