PRACTICA N.

1 ANALISIS DE TOMATE

PAPA.

El interior de frutas frescas y vegetales usualmente es estril. Entonces tales tejidos pueden ser removidos aspticamente, pueden ser usadas como medios de tejidos aplicando tratamiento trmico y ser incubada para demostrar su esterilidad. Entonces la piel de la mayora de los vegetales y frutas contienen todos los organismos presentes, la cuenta de organismos de cada vegetal y frutas pueden ser expresados en trminos del rea de piel examinada.
OBJETIVO:

Mtodo de prueba para el anlisis microbiolgico del tomate. I.- Superficie del tomate: (usualmente tomates obtenidos directamente del campo) A.- Con un cuchillo estril corte una pulgada cuadrada de piel junto con tejido. B.- Muela la muestra en un mortero estril que contiene arena. C.- Transfiera tejidos y arena a 99 ml. de agua destilada estril y agtese vigorosamente. D.- Haga las diluciones necesarias. E.- Transfiera a caja de petri las diluciones 1: 100 y 1: 1000, en agar cuenta estndar. Incube por 5 das a temperatura ambiente o a 30 C por 2 das. F.- Reporte las cuentas de microorganismos por pulgada cuadrada de diferentes tipos de microorganismos que aparecen (hongos, bacterias cromgenas, etc.) . II.- Prueba de esterilidad de tejidos interiores. A.- Tomate. 1.- limpiar la superficie sana del tomate con algodn humedecido con etanol al 95 % y adems flamee el mismo lado. 2.- Del lado flameado de la piel tome la muestra y colquela en un tubo de boca ancha con una pipeta estril tome 5 ml. del jugo del tomate. 3.- Ponga un ml. en cada tubo que contiene agar para cuentas en placa. Agite y homogenice y vierte el contenido en cajas de petri. 4.- Incube 5 das a temperatura ambiente o 30 32 C por 48 horas, y observe el crecimiento. Haga las observaciones necesarias al microscopio.

B.- Papa. 1.- Cerca de un mechero, limpie la superficie de la papa. Haga un corte profundo y tome un pedazo aspticamente con una esptula estril. Coloque cuidadosamente en una caja de petri estril y agrega agar papa cida. 2.- Con otra esptula estril, corte un pequeo pedazo del tejido interior de la Papa. 3.- Incube 10 tubos con caldo nutritivo con pedazos del tejido interior de la Papa. Incubar 5 das a temperatura ambiente o 30 32 C por 48 horas y observe su crecimiento. Exprese resultados como: Tubos positivos y tubos negativos.
PARTE II MICROBIOLOGIA DE HORTALIZAS Y VERDURAS (TOMATE Y PAPA)

INTRODUCCION: Entre las hortalizas y verduras se incluyen adems de las papas, a todas aquellas plantas herbceas tiles, de uno a varios aos que se consumen, ya al natural, ya cocidas o tratadas por otros procedimiento. Segn la parte de la planta que se emplea, se diferencian en : races y tubrculos (zanahoria, remolacha roja, apio, rbano, nabo y otra), bulbos (cebolla, cebolletas), hojas y tallos tiernos (espinaca, esprrago y otros), frutos de hortalizas (pepino, tomate, calabaza, guisante), etc. Las verduras crecen casi exclusivamente en contacto inmediato con el suelo, jugando un gran papel las contaminaciones con tierra, las races y tubrculos tienen siempre gran cantidad de microorganismos del suelo, entre ellos bacterias esporuladas muy resistentes de los gneros Bacillus y Clostridium. Con el polvo y la lluvia los microorganismos del suelo, llegan tambin indirectamente a las hortalizas, por lo que las partes externas contienen siempre un gran numero de microorganismos que las partes internas.

Las huertas regadas con agua con contenido fecal constituyen un gran peligro. Pueden servir de vehiculo de microorganismos intestinales como Salmonella Typhi, que permanece con vida en el suelo hasta por cinco semanas junto a estreptococos y enterobacterias. Tambin las hortalizas pueden llevar huevecillos de helminton que llegan a producir epidemias. Las especies de Pseudomonas hortalizas, Una vez muerta, la vegetacin en vas de descomposicin se transforma en una fuente importante de microorganismos aerobia, acutica y Edafoportadores, que producirn la contaminacin de las plantas el ao siguiente. OBJETIVO: Aplicacin de un mtodo de prueba para determinar la calidad sanitaria de verduras y hortalizas MATERIAL Y REACTIVOS: Mechero Microscopio Tubos de ensayo de 16x125 Cajas de petri Mortero y mazo de mortero Pipetas de 10, 5 y 1.0 ml graduadas Incubadora Contador de colonias Algodn Alcohol 95 Matraz Erlenmeyer de 250 ml. Navaja, bistur. Arena con mucho predominantes en las

Agar para mtodos estndar Caldo nutritivo

PROCEDIMIENTO: I .- EXAMEN DE LA SUPERFICIE DEL TOMATE. (use tomates obtenidos directamente del campo de cultivo). A.- Con una navaja estril corte una rea de 2.3cm de piel y tejido contiguo. B.- Muela enteramente en un mortero estril que contenga arena estril. C.- Transfiera la arena y tejidos a 99 ml de agua destilada estril y agite vigorosamente. D.- Haga las disoluciones necesarias E.- En cajas de petri por duplicado, simbrelas disoluciones 1:100 y 1:1000 su medio de agar para mtodos estndar. Incube por 5 das a temperatura ambiente o 48 horas a 30 C. F.- Reporte cuenta de microorganismos por cm. y diferencie entre levaduras, hongos, bacterias cromogenicas y otro tipo de bacterias. II.- PRUEBA DE ESTERILIDAD DE TEJIDOS INTERNOS. A).- TOMATE 1.- humedezca la superficie de un lado de un tomate sano con alcohol de 95, con un mechero de alcohol flamee toda la misma rea. 2.- penetre o agujere con un tubo de boca ancha o con una pipeta de 10 ml. en el rea de la piel flameada y tome 5 ml de pulpa y jugo del interior del tomate. 3.- en cajas de petri por duplicado ponga 1 ml. de jugo y agregue 15 ml. de agar para mtodos estndar.

4.- Incube por 5 das a temperatura ambiente o por dos das a 30C. Observe el crecimiento. Si es necesario haga observaciones al microscopio. B.- PAPA. 1.- Con la flama de un mechero bunsen limpie la superficie de una papa de tamao mediano.

PRACTICA N. 2 INTRODUCCIN:

ANALISIS BACTERIOLOGICO

DEL

AGUA.

El agua de consumo humano debe ser de calidad potable, es decir, cumplir con los requerimientos fsicos, qumicos y bacteriolgicos especificados por la agencia de salud que aseguran que dicho producto es inocuo para el hombre. En nuestro pas, dichos requerimientos se encuentran publicados en el cdigo sanitario mexicano. Los anlisis microbiolgicos del agua, estn encaminados principalmente a determinar si el agua contiene contaminacin fecal reciente o de materia orgnica, considerando la mayora de los pases es determinar el grupo coniforme y la cuenta en placa anaerbica. Los organismos coniformes, son indicadores de contaminacin fecal reciente en agua y su importancia radica en el que en este grupo se encuentran especies intestinales, que aunque son dainas para el hombre, indican que puedan haber otro organismo de origen intestinal, cepa patgenas de Escherichia coli y de otras bacterias, as como de amibas patgenas, huevesillos de gusanos intestinales o vivas causantes de enfermedades gastroenteritis. Los coliformes fecales se investigan por la tcnica del nmero ms probable de coliformes, basadas en la fermentacin de lactosa. Adems de las coliformes, algunos investigadores recomiendan investigar los enterococos (estreptococos de laucefield) como indicadores de contaminacin fecal. En agua de pozo, corriente de agua, agua potable, agua residual que contenga cloro, a si como balnearios, piscinas, por ser este organismo resistente a diversos procesos. Clostridium perfringens se investiga en agua que han recibido tratamientos para purificarlas, como formas indicadoras de desinfeccin adecuada. En nuestro pas, el cdigo sanitario mexicano especifica la investigacin de coliformes, la cuenta en placa de bacterias aerobias y bacterias licuantes de gelatina, con mal olor o pigmentadas. La cuenta en placas de bacterias mesofilas aerobias, es til para determinar la contaminacin por materia orgnica o de otras fuentes, debiendo ser bajas o inexistentes. OBJETIVO: Toma de muestra: a).- Frascos de vidrios, limpios, estriles, de volumen mximo de 120 ml de boca ancha.

b).- Si el agua contiene cloro, aada a los frascos una solucin de tiosulfato de sodio al 10 % (100mg/lt) en la siguiente proporcin:

0.1

ml. a frascos de 120 ml.

0.25 ml a frascos de 250 ml. 0.5 ml a frascos de 500ml. c).- Si el agua contiene metales pesados como cobre o zinc, agregue 0.3 ml de EDTA al 15 % a frascos de 120 ml. d).- Limpie con alcohol el grifo por dentro y fuera y flamee si es de metal, deje corre el agua de 5 -10 minutos para que arrastre los microorganismos adheridos a la suciedad. e).- Retire la tapa del frasco, sin exponerlo al contacto con la mano u otro material. Retire la tapa solo el tiempo necesario para calentar la muestra. f).- Llene poco mas de la tercera parte del frasco, para dejar espacio suficiente para homogenizar la muestra. g).- Transporte la muestra al laboratorio en condiciones de refrigeracin y analice lo antes posible, para evitar disminuciones en el numero de bacterias. Nunca deje la muestra por ms de 24 horas sin analizar.

MATERIAL Y EQUIPO: - autoclave. - incubadora. - bao Maria. - balanza granataria. - licuadora completa. - contador de colonias. - utensilios necesarios para la toma de muestra. - Frascos de vidrio con tapa de rosca de 125 ml de capacidad conteniendo 90 ml de buffer de fosfato ph 7.2, estril. - Tubos de 16 x 150 con 9 ml de buffer de fosfato, ph 1.2, estril. - pipetas bacteriolgicas de 10 ml y 1 ml graduadas. - cajas de petri. - agar para mtodo estndar.

- Solucin amortiguadora de fosfatos. - NUMERO MS PROBABLE DE COLIFORMES. - autoclave. - incubadora. - bao Mara. - balanza granataria. - licuadora. - contador de colonias. - utensilios necesarios para la toma de muestra. - Frascos de vidrio de 125 ml de capacidad conteniendo 90 ml de buffer de potasio, ph 7.2, estril. - Tubos de 16 x 150 con 9 ml de buffer de fosfato, ph 1.2, estril. - pipetas bacteriolgicas de 10 ml y 1 ml. - tubo de ensayo de 22 x 175 mm. - tubos darhen. - caldo lactosado. - caldo lauril triptosa sulfato. - caldo bela verde brillante. - caldo E. C. - CUENTA DE ENTEROCOCOS: - autoclave. - incubadora. - bao Maria. - balanza granataria. - licuadora. - contador de colonias. - utensilios necesarios para la toma de muestra.

- Frascos de vidrio de 125 ml de capacidad conteniendo 90 ml de buffer de fosfato, ph 7.2, estril. - Tubos de 16 x 150 con 9 ml de buffer de fosfato, ph 1.2, estril. - pipetas bacteriolgicas de 10 ml y 1 ml. - tubo de ensayo de 22 x 175 mm. - caldo KFS. - caldo azida dextrosa. - BACTERIAS LICUANTES DE GELATINA: - autoclave. - incubadora. - bao maria. - balanza granataria. - licuadora. - contador de colonias. - utensilios necesarios para la toma de muestra. - Frascos de vidrio de 125 ml de capacidad conteniendo 90 ml de buffer de fosfatos, ph 7.2, - Tubos de 16 x 150 con 9 ml de buffer de fosfatos. - pipetas bacteriolgicas de 10 ml y 1 ml. - tubo de ensayo de 22 x 175 mm. - gelatina nutritiva. PROCEDIMIENTO: CUENTA EN PLACA DE BACTERIAS MESOFILICAS AEROBIAS: 1.- Para agua de alberca, arroyo o lagos, tome un ml. de la muestra para cuenta directa y 0.1 ml para la dilucin 10^-1. Para agua de laya o ros realice diluciones mayores. a).- homogenic la muestra y realice las diluciones necesarias utilizado la solucin amortiguadora.

b).- Transfiera a placas de petri, alcuota de 1 ml de las diluciones 1:10 a 1:100000 (10^-1 a 10^ 5). Estas diluciones se recomiendan en las cosas que no se conozcan previamente el numero aproximado de microorganismos presentes en el alimento, pero pueden modificarse siempre que los aconseje la cifra de microorganismos esperada. c).- Verter en cada caja inoculada, de 15 20 ml de medio de cultivo fundido y templado a 45 C. Mezcle el medio y el inoculo impreso en la placa movimientos de vaivn en diferentes direcciones. d).- Una vez solidificado el medio de cultivo, invierta las placas e incbelas a 35 C, durante 24 horas. - NMP DE COLIFORMES: La presente tcnica es la especificada en la norma mexicana para el anlisis bacteriolgico de agua. a).- agregue 10 ml. de la muestra de agua, a cada uno de cinco tubos de caldo de lactosa (doble concentracin) con tubos o campana para captacin de gas invertido. Incubar de 24 a 48 horas a 35 - 37C. b).- Siempre una o dos asadas de cada tubo que presenta formacin de gas a caldo bilis verde brillante con tubo captor invertido y siempre por estra en caja que contenga agar-endo o agar enzimas azul de metileno (EMB). c).- De los tubos con caldo bilis verde brillante que presenta gas, siempre una asada en caldo lactosa (simple) incubar por 24 48 horas a 35 37 C y observe la formacin de gas. d).- De los tubos que resulten positivos en la formacin de gas, siempre por azada en tubos con agar nutritivo inclinado. Haga las tincion de Gram. y pruebas de IMVIC. e).- Consulte la tabla para obtener los resultados del numero mas probable (NMP). - NMEROS MS PROBABLES DE ENTEROCOCOS. Prueba presuntiva: a).- Muestra slida: Transfiera un ml de las diluciones 1:10, 1:100 y 1:1000 a serie de tres tubos de cultivo con caldo KFS o caldo azida dextrosa. b).-Transfiera un 10 directamente de la muestra a una serie de tres tubos de cultivo contenido 20 ml con caldo KFS o caldo azida dextrosa de concentracin normal o bien 10 ml de muestra a cada uno de una serie de tres tubos conteniendo 10 ml del medio de cultivo de concentracin doble.

c).- Transfiera 1 ml especficamente a serie de tres tubos conteniendo 10 ml del mismo medio. d).- Transfiera 0.1 de la muestra a tres tubos respectivamente conteniendo 10 ml del mismo medio. e).- Incube los tubos durante 48 horas a 35 C. La turbidez de la muestra indica que la prueba es positiva. PRUEBA CONFIRMATORIA: a).- Agite suavemente los tubos con caldo que resultaron positivos y a partir de cada uno de ellos inocule por azada, tres tubos conteniendo 10 ml de caldo violeta de etilo o caldo azida prpura de bromoexeol. b).-Incube durante 24 48 horas a 35 C. La presencia de un botn prpura en la parte inferior del tubo en el medio violeta de etilo hace la prueba positiva. En el caso de haber usado el medio caldo azida prpura de bromocresol, el cambio del indicador a amarillo hace positiva la prueba. c).- Determine el numero mas probable de enterococos por gramo o mililitro. - BACTERIAS LICUANTES DE GELATINA. a).- agregue un ml de agua de muestra a una caja de petri estril y vierta 20 ml de gelatina nutritiva. b).- mezcl por difucion e incube de 24 48 horas a temperatura de 20 C. c).- Cuente las colonias en la placa de gelatina y comprela con las de agar para cuentas en placa. d).- Observe si aparecen colonias que licuen rpidamente la gelatina, desprenda mal olor o son coloridas, lo que hace desfavorable esta prueba. NORMA MICROBIOLGICA MEXICANA: a).- Menos de 20 organismos de los grupo coli y coniformes por litro de muestra. b).- menos de 200 colonias bacterianas por centmetro cbico de muestra, en las placas de agar incubarlas a 37 C por 24 horas. c).- ausencia de colonias bacterianas licuantes de gelatina, cromgenas o ftidas en la siembra de un centmetro cbico de muestra en gelatina inoculada a 20 C por 48 horas.

INTERPRETACIN DE DATOS: a).- En Mxico el agua potable debe cumplir con los requeridos de la norma microbiolgica mexicana, mencionada arriba y, debiendo ser negativo los cinco tubos de caldo lactosado, ya que esto indica menos de 20 organismos coniformes por litro. b).- En estados unidos y otros pases los coniformes se determinan 3 series de 5 tubos o 3 series de 3 tubos de caldo lactosado, siendo esta tcnica mas frecuente y precisa, por lo que recomendamos seguirla para mayor seguridad de la potabilidad del agua. En esta variante todos los tubos negativos indican menos de 3 o menos de 2 coliformes por 100 ml experimentalmente. c).- Si el agua analizada contiene menos de 3 coliformes por la tcnica del NMP no requiere de ningn tratamiento para consumirlo. d).- Si el agua contiene hasta 50 coliformes por 100 ml, requiere cloracion. Mayor nmero de coniformes requiere otros tratamientos. e).- Los enterococos son ms resistentes a condiciones adversas que los coliformes. Por lo tanto pueden ser tiles como indicadores de desinfeccin inadecuadas o de contaminacin fecal no reciente en algunas aguas como las de pozo o de albercas, sin embargo, esta determinacin no debe excluir la de coliformes.

ANALISIS MICROBIOLOGICO DE ALIMENTOS ENLATADOS

INTRODUCCION: El enlatado es una forma de conservacin de los alimentos que consiste en envasarlo en un recipiente metlico con cerradura hermtica y sometida a procesos de calentamiento y presin por un tiempo determinado. El anlisis microbiolgico tiene por objeto determinar la presencia de organismos viables latentes que pudiera haber resistido el tratamiento y en que en determinadas circunstancias pudieran desarrollarse produciendo alteraciones en el alimento o un riesgo para el consumidor, o bien microorganismos que penetren en la lata despus del tratamiento, por defecto de la cerradura, golpes, etc. Conocimiento de la naturaleza del alimento y el tratamiento a que fue sometido es posible predecir el tipo de microorganismos respetables de la alteracin. Numerosas investigaciones han demostrado, que el tipo de alteracin guarda relacin con la acidez del alimento, por lo tanto se clasifican en alimentos de acidez baja aquellos cuyos PH es mayor de 4.5 y alimentos cidos cuyo PH es menor de 4.5.

OBJETIVOS: Aplicacin de un mtodo de prueba para el anlisis microbiolgico de alimentos enlatados.

I.- ALIMENTOS DE ACIDEZ BAJA. 1.- MATERIAL y EQUIPO; REACTIVOS -incubadoras a 35 y 55 c -autocable -potencimetro -abrelatas -microscopio -pinzas, cucharas, esptulas. -pipetas de 5 ml graduadas -tubos de ensayo de 18x150

-portaobjetos -punzon para latas -embudo -cepillo de cerda fina -mechero -agar triptona -caldo hgado -caldo prpura de bromocresol -solucin de azul de metileno -solucin de yodo al 2% en alcohol de 70% 2.-PREPARACION DE LA MUESTRA. a).- OBSERVACION DE LA LATA: Anote todos los datos que aparezcan en la etiqueta incluyendo el nmero del Lote. Quite la etiqueta e identifique la lata mediante una clave o nmero. Anotar los defectos fsicos de la lata tales como: defectos en la cerradura, abolladuras, golpes, derrames, abombamientos, etc. Clasificar la lata como sigue: -Abandonamiento ligero: Grado I. solo un de los extremos de la lata se encuentra ligeramente alombado pero puede comprimirse fcilmente. -Abombamiento elastico: Grado II. Uno de los extremos se encuentra abombado, pero al presionar el extremo opuesto se abulta. -Hinchazon: Grado III. Ambos extremos se encuentran abombados, pero puede comprimirse o cede ligeramente a la presin. 3.- INCUBACION DE LA LATA. Analizar una lata de inmediato e incubar el resto de las latas (si se dispone de ella) no alteradas o con abombamiento de grado I a 35C y 55C por 10 a 14 das. Las latas con abombamiento de grado II y III no deben incubarse. 4.- APERTURA DE LAS LATAS. Lavar las latas con un cepillo, utilizando agua caliente y jabn, enjuagar y secar. Si la lata esta abombada, mantenerla en el refrigeracin antes de abrirla.

Esterilizar y flamear el extremo de la lata que este marcado con la clave o nmero de lote. Si la lata esta fuertemente abombada NO FLAMEAR, esterilizar con yodo al 2% en alcohol de 70% limpiando con una gasa estril. Para detectar la presencia del hidrogeno, hacer una pequea presin en la superficie esterilizada de la lata, recibir el gas dentro de un tubo de ensayo invertido e inmediatamente trasladar la boca del tubo a la flama, una pequea explosin indica la presencia de hidrgeno. NO DEBE FLAMEARSE DIRECTAMENTE EL ORIFICIO DE LA LATA. Desalojar el gas antes de abrir la lata. 5.- PROCEDIMIENTO. Abrir la lata entre dos mecheros o bajo flujo laminar. Tomar porciones del contenido solido y liquido (si es posible homogenizar) utilizando adecuadamente dependiendo del tipo de muestra y tomar el Ph de la misma. Dejar una pequea porcin de la muestra en un frasco estril para efectuar pruebas biolgicas si es necesario. Hacer un frotis del contenido de la lata ya que muchas veces los microorganismos causantes del deterio mueren durante el almacenamiento y solo el examen microscpico puede dar una idea de los microorganismos involucrados en la descomposicin. Si el alimento es solido o muy espeso, agregar una pequea cantidad de agua estereil. Si es muy grasoso agregar un poco de xilal una vez fijado el fretis por calor y teir con solucin de azul de metileno. Transferir aproximadamente 2 gramos o 2 ml de la muestra a cuatro tubos con caldo hgado, previamente calentadas a 100C para expulsar el oxigeno disuelto y enfriados a temperatura ambiente. Estratificar despus de la incubacin con agar triptona a 45C. Inocular con la misma cantidad de muestra cuatro tubos con caldo prpura de bromocxesol. Incubar dos tubos con caldo hgado a 35C durante 96 horas para determinar mesesifilicar aerobios; dos tubos con caldo hgado a 55C durante 72 horas para determinar termofilicar aerobios: dos tubos con caldo prpura de bromocsesol a 35C durante 48 horas para determinar mesofilico aerobios y dos tubos con caldo prpura de bromocresal a 55C durante 48 horas para la deteccin de termfilas aerobios. Una vez tomada la muestra, anotar el estado del alimento, como olor, calor, consecuencias, etc. NO DEBE PROBARSE. Observar los tubos de caldo hgado despus de la incubacin. Los tubos que presentan gas, lo que se observa por el desplazamiento de la capa de agar, se considera positivas. Hacer fretis de los tubos positivos y conservarlos para en animales.

Reportar: Mesofilicos anaerobios a 35C positivos o negativos. Termofilar anaerobios a 55C positivos o negativos Observar los tubos de caldo prpura de bromocxesol despus de la incubacin. Los tubos que presentan un en el indicador del medio de cultivo, de violeta a amarillo y entubamiento del medio. Comprobar el crecimiento transfiriendo con un asa, una pequea porcin del cultivo a otro tubo con caldo prpura de bremocresol e incubarlo por 48 horas. Observar el y el entubamiento del medio y efectuar frotis de los tubos positivos. Reportar: positivos o negativos Termofilicar positivos o negativos aerobios a 55C mesofilicos aerobios a 35C

II.- ALIMENTOS ACIDOS (ACIDEZ ALTA) 1.- MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS -El material y equipo es sealado en el inicio I. -caldo caldo extracto de malta. 2.- PREPARACION DE LA MUESTRA. Indicado en el inicio I. 3.- PROCEDIMIENTO. Abrir la lata entre dos mecheros o bajo flujo laminar. Tomar porciones del contenido slido y liquido (si es posible homogeneizar), utilizando adecuadas en base al tipo de la muestra. Transferir apticamente aproximadamente 1 gr. 1 ml del alimento a 4 tubos conteniendo 10ml del caldo cido. Incubar dos tubos a 30C durante 96 horas para detectar mesofilicos aerobios y dos tubos a 55C durante 48 horas para determinar termofilicos aerobios causantes de la descomposicin plana. Observar la turbidez en los medios y para confirmar la prueba, transferir con el aza pequeas porciones de cultivo a tubos con el mismo medio e incubar a las mismas temperaturas por 48 horas. Reportar: mesofilicos aerobios, positivos o negativos. cido

Termofilicos aerobios, positivos o negativos Transferir 1 gr o 1ml de la muestra a dos tubos conteniendo 10ml de caldo extracto de malta. Incubar a 30C durante 96 horas y observar el tipo de crecimiento. Confirmar la prueba si es necesario. Reportar: Hongos, lavaduras o lactebacilos positivos o negaticos. Uno de los puntos mas importantes en el anlisis de alimentos enlatados es la seleccin de la muestra, pues un resultado negativo en una muestra aislada, solo tiene significado para esa muestra en particular y no para el lote correpondiente por lo tanto debe seguirse mas muestras adecuadas de probabilidades, que esa confiable, para asegurar la esterilidad de un lote.

DETERMINACIN DE CONTENIDO MICROBIANO EN ENVASES PARA ALIMENTOS CUENTAS DIRECTAS DETERMINACIN DE BACTERIAS Y HONGOS. INTRODUCCIN Es importante poder qu tan contamindo o libre de microorganismos se encuentran un envase para alimentos., puesto que hay procesos en las cuales el alimento se introduce al recipiente ya no es sometido a ningun tratamiento. Ademas aun en el caso de que sea pasteurizado o esterilizado, conviene para ver la carga de microorganismos que aporta el envase para planear el tratamiento a seguir. I.- DETERMINACIN DE BACTERIAS A.- METODO DE LAS BOTELLAS RODADAS (TIEMPO: 72 H.) MATERIAL - Botellas clars o recipientes de plasticos - Tubos con 10-25 ml de medio para cuenta en placa. - Bao maria a 45 0C - Tubos de ensayo con boca de igual tamao que las botellas tapadas con algodn y esterilizados. - Estufa o incubadora a 32 0 - 35 0C. PROCEDIMIENTO 1.- Se toma una botella de las que se unan para envasar alimentos y bebidas y y segn sea su tamao se vierte de 10 a 25 ml. De medio para cuenta placa fundido. Se esparce rapidamente el medio en la botella haciendola girar de manera que quede una capa ligera o delgada perfectamente pareja en el fondo y paredes de la botella. Se deja solidificar sobre un lado y se encuba a 32 0 - 35 0C. 2.- Segn la temperatura de incubacin la lectura se hace respectivamente a los 3 das o a las 24 y 48 h. Si se desea conocer otro tipo de microorganismos, como por ejemplo termfilos, la temperatura de incubacin es de 55 0C. y el tiempo 24 a 48 h.

B. METODO DE HISOPO

MATERIAL - Envases tetrapak - Hisipos esteriles con algodn o alginato en la punta. - H2 O2 al 10% - Lampara con tayos ultravioleta - Tubos con 10 ml. De solucin ringer o agua peptonada al 0.1 % - 3 cajas de petin. - 1 pipeta de 1 ml. - 3 tubos con 12 ml. Medio para cuenta en placa fundido - Bao maria a 45 0C. - 1 tubo con 10 ml. De agor bilaneo. - Estufa o incubadoras a 5 0C,- 35 0C y 55 0C. - Contador de colonias quebee. PROCEDIMIENTO 1.- Se utiliza este mtodo para frotar cualquier superficie y determinar su grado de contaminacin. En el caso de los envases tetrapak, se aconseja hacer una determinacin en el cartn tal cual llega de la fabrica y otra despues de simular los tratamiento a los cuales se someten estos recipientes en la fabrica de alimentacin, a para ver; a) Aumersin en una solucin de H2 O2 o aplicacin de rayas ultravioleta. 2.- Con un hisopo esteril frotar la superficie de la lata o recipiente tetrapak 5,15 17 lugares 1 cm2 c/u. 3.- Colocar el hisopo en un tubo con solucin ringer (si se uns hisopo con alginato) o su agua peptonada al 0.1 % 4.- Tomar un ml. De la suspencin y sembrar en una caja de petin. Hacer un duplicado hacer un blaneo con un ml. De solucin sin suspencin de microorganismos. Verter a continuacin medio para cuenta eb placa y homogeneizar perfectamente. Dejar enfriar y una vez polidificado colocar una ligera capa de agor blanco po encima y dejar solidificar. 5.- Incubar a 5, 35 o 55 oC segn el tipo de microorganismos que se desea investigar. 6.- Contar el nmero de microorganismos con ayuda de un contador de colonisa quebec, si es a 5 o C observar cada 48 hs, hasta que se vean las colonias, si es a 35 o C a 55 o C a las 24 y 48 h.

C) DETERMINACIN DE BACTERIAS ANAEROBIAS MATERIAL. MATERIAL - Suspensin obtenida en el inicio B. - 1 pipeta de un ml. - Cajas de petri esteriles - Frasco con agua esteril - Tubos con medio para cuenta en placa - Tubos con medio para anaerobiosis. - Bao maria a 45 o C - Indicadores para anaerobiosis PROCEDIMIENTO 1.- Tomar un ml. De la suspensin y colocarlo en una caja de petri. 2.- Agregar el medio para anaerobiosis en las cajas dejar solidificar y colocar en la jarra para anaerobiosis. 3.- Incubar a 35 o C a 55 o C y hacer el recuento apartir del tercer da hasta que haya pasado siete dias. 4.- Contar aquellas cajas en las que haya de 30 a 300 colonias. D) DETERMINACIN DE BACTERIAS EN CORCHOLATAS MATERIAL: - Botellas o recipientes tapados con corcholatas - Algodn con alcohol al 70% - Destapador de botellas flameadas - Pingos esterilizadas - Mechero - Cajas de petri esterilizadas - Tubos con medio para cuenta en placa. - Bao Maria a 45 oC PROCEDIMIENTO 1.- Limpiar el exterior de la corcholata con un algodn diluido en alcohol al 70 % o flamear ligeramente el exterior de la corcholata.

2.- Destapar la botella 3.- Tomar la corcholata con unas pinzas y colocarla con el interior hacia arriba dentro de una caja de petri. 4.- Verter medio para cuanta en placa 5.- Dejar solidificar e incubar de 35 a 55 oC. 6.- Contar las colonias III.- DETERMINACIN DE HONGOS Y LEVADURAS MATERIAL: - El mismo que se utiliza en el inicio A B de la parte I. - Medio de Agor Para destrozar Agor extracto de malta. PROCEDIMIETO 1.- Seguir el procedimiento del inicio A B de la parte I. 2.- Incubar a 32 oC. o a temperatura ambiente y empezar a observar a partir del 3er da.

ANLISIS MICROBIOLGICO DE PRODUCTOS CARNICOS INTRODUCION Los productos carnicos, curada, cosida o ensalada, son alimentos a base de carne fresca de origen porcino o bovino principalmente; grasa, especias y otros aditivos pueden estar embutidos o no . El embutido se hace en tripa u otras membranas naturales o artificiales. Estos alimentos se someten a procesos de curacin (con sales), coccin y a veces ahumado. La carne curada presenta una gran variedad de microorganismos contaminantes, provenientes de diferentes. Una vez que la carne ha sido sometida a tratamiento de sales de cura inhiben el crecimiento de bacteria, y el cocimiento destruyen la flora bacteriana exceptuando las esporas. Por lo tanto, la cuentas total de las colonias en este tipo de productos no deben ser mayor de 10,000 colonias por gramo. La cuenta de colonias a altos niveles pueden indicar que hubo fallas en el proceso de coccin o cura, que el almacenamiento ha sido prolongado o se ha llevado a cabo a temperaturas inadecuadas , o en general que ha sido manejado en malas condiciones sanitarias. Al poner es frecuente que cuando se alteran los embutidos o los productos carnicol curados o salados y cocidos , los organismos responsables de este deterioro sean miembros de la familia LACTOBACTERIACEA ( SREPTOCOCCUS FAECIUM , S. FECALIZ y ciertas especies de LACTOBACILLUZ). Estos organismos son relativamente termo resistentes inclusos en la forma vegetativa y , de ah , que sobreviven cuando mueren las bacterias responsables de las alteraciones ordinarias (PSEUDOMONA Y ACHROMOBACTER). Los organismos lcticos son relativamente tolerantes frente a la sal, y los productos curados contienen suficiente sal para evitar el crecimiento de ciertas especies de PSEUDOMONA Y ACHROMOBACTER), en otro caso, quiz proliferasen causando el deterioro correspondiente antes de que el crecimiento de la LACTOBACTERIACEA hubiera sido suficientemente amplia para determinar la alteracin del producto. Las bacterias lcticas son anaerbicas facultativas, pudiendo crecer bajo las cuales las especies de PSEUDOMONAS y ACHRUMOBACTER no podran proliferar o, en todo caso , lo harian a un ritmo reducido. Muchas especies o cepas de la lactobacteriaceace crece a temperatura por debajo de 7.2 C .
MATERIAL Y EQUIPO

- bao maria - licuadora completa

- balanza granataria - utencilios esteriles para corte - pipetas bacteriologicas de 10 ml graduadas - frasco de vidriio de boca ancha de 250ml con 90ml de solucion reguladora de fosfato - contador de colonias - cajas petri - frascos de boca ancha de 125ml de capacidad - mechero REACTIVOS Agar para mtodos standard. Medio de Baird Porker Infusin cerebro corazn Agar salmonella shigella Caldo tetrationato Caldo selenita cistena Agar verde brillante Agar con sulfito de bismuto Agar xilosa lisina desoxicolato (X.L.D) Agar de triple azcar y hierro (T.S.I) Agar hierro lisina(L.I.A) Caldo surraco Indicador azul de timol Caldo manitol Medio sim Caldo dulcitol Caldo malonato Solucin de verde brillante al 0.1%

Solucin de Iodo yoduro Reactivo de Kovac Solucin salina al 0.85% Solucin reguladora de fosfato I.- PREPARACION DE LA MUESTRA Cortar la envoltura con tijeras o cuchillo tomando las mayores precauciones asepticas posibles. Tomar de varias unidades si son pequeas o de diferentes partes de muestra de mayor volumen, alrededor de 250 gramos de producto , homogenizar perfectamente , pesar 10 gramos y transferir a un vaso de licuadora, agregar 90ml de la solucin reguladora de fosfato y licuar por 2 minutos; esto constituye la dilucin 1:10. Preparar las diluciones decimales transfiriendo 10 ml del homogenizado en 90ml de solucin reguladora de fosfato (diluciones 10-2, 10-3,10-4,10-5) No olvide agitar cada dilucin antes de hacer la transferencia con movimientos de arriba hacia abajo. II.-PROCEDIMENTO a).- CUENTA DE PLACAS DE MICDRORGANISMOS MESOFILOS AEROBIOS. Transferir un ml de cada una de las diluciones a cajas petri marcadas . Agregar de 15 18 ml del medio agar para cuenta estndar Mezclar perfectamente con movimiento de rotatorio en una superficie lisa Incubar las cajas en posicin invertida por 72 horas a 22C. Contar las colonias que crezcan sobre el medio y multiplicar por la reciproca de la dilucin Informar: cuenta de organismos mesofilicas aerbicas a 22C por 72C/gramo. b).-CUENTA DE STAPHYLOCOCUS AUREUS. Transferir 0.1ml de cada una de las diluciones (10-1,10-2,10-3) a placas con agar de baird Parker. Distribuir el inoculo sobre la superficie del agar con una varilla de vidrio doblada en angulo recto , utilizado una para cada una dilucin. Mantener las placas en esta posicin hasta que el inoculo sea absorbido totalmente, las placas puedan colocarse en una incubadora por aproximadamente una hora. Invertir las placas e incubar por 48 horas a 35C.

Seleccionar las placas que tengan entre 20 y 200 colonias, o tienen las placas de diluciones altas aunque tengan mas de 200 colonias que sean tpicas de S. AUREUS. Las colonias tpicas son negras circulares , brillante convenxas, de 2 a 3 mm de dimetro y rodeadas de una zona clara en el fondo de el medio opaco. En este tipo de alimentos las colonias pueden ser atpicas. Haga una observacin microscpica. Seleccionar el numero de colonias de acuerdo con el siguiente cuadro y realice la prueba de coagulaza y termonucleaza. N DE COLONIAS SOSPECHOSAS Menos de 50 51----------------100 101---------------200 N DE COLONIAS POR PROBAR 3 5 7

PRUEBA DE COAGULAZA Sembrar el numero de colonias que corresponden en tubos con 0.5ml de infusin cerebro corazn incubar a 35C durante 24horas . Agregar .2 ml de plasma diluido de volumen a volumen con disolucin salina esteril. Incubar en un bao de agua a 35-37 C y observar a intervalos de una hora hasta seis. Reportar positiva la prueba si hay formacin de cuagulo total de la mezcla. PRUEBA DE TERMONUCLEASA La producion de nucleasa termoestable es una propiedad caracterstica de casi todas las cepas de S.AUREUS. Transferir 3.2ml de cultivo de S. AUREUS en caldo de infusin cerebro corazn a un tubo de ensayo de 13X100. En un porta objetos limpio agregar 3 ml de medio agar azul toluidina DNA fundido. Esparcirlo por toda la superficie y dejar solodificar hacer perforaciones de 2ml de dimetro con un pipeta pasteur. Calentar el cultivo de caldo en bao de agua a 100C durante 15minutos. Transferir una gota de cada tubo a un orificio de la laminilla sin olvidar los testigos.

Incubar en cmara humeda durante 4 horas a 35C. La aparicin de un halo color de rosa alrededor de la perforacin se considera positivo. Computar el contenido de microrganismos en el producto tomando en cuenta el numero de colonias, la dilucin selecionada y el volumen incubado. Informar cuenta de S.AUREUS, coagulasa positiva colonias / gramos o ml de alimento. c).-INVESTIGACION DE SALMONELLA. Pesar 25 gramos de muestra , adicionar 225ml de caldo lactosado licuar durante 1-2 minutos. Incubar a 35 C por 24 horas. Transferir un ml a 10 ml de caldo selenito cistina y a 10 ml de caldo tetrationato . Incubar a 43C por 24 horas. Continuar con una fase de aislamiento . Si se trata de embutidos crudos, carne cruda o vsceras procede como sigue: ENRIQUECIMIENTO: pesar 15 gramos de muestra homognea por duplicado. Transferir a un vaso de licuadora, agregar 125ml de caldo tetrationato con verde brillante y yodo. Licuar durante 1 minuto. Incubar a 43C por 24 horas. Repetir la operacin agregando a los 15 gramos de muestra 125ml de carne selenito cistina. AISLAMIENTOAgitar los frascos del cultivo anterior y por medio de una asa sembrar por estria de manera de obtener colonias bien aisladas, sobre la superficie de cuando menos 2 cajas de medios diferenciales selectivos por cada frasco. Los medio se cultivo utilizados pueden ser agar verde brillante , agar sulfito de bismuto, agar XLD agar SS. Incubar a 35C durante 24 horas. Observar los cultivos para ideintificar colonias sospechosas de salmonella como sigue: 1.- AGAR VERDE BRILLANTE

Colonias rojas o rosas rodeadas por medio rojo, las bacterias fermentadoras de lactasa dan colonias amarillas. 2.-AGAR SULFITO DE BISMUTO Colonias rosas rodeadas por medio rojo, las colonias negras con sin brillo metalico, rodeadas de un halo caf que posteriormente se transforma en negro. 3.-AGAR XLD Colonias de color rojo generalmente presentan el centro negro por producion de H2S 4.- AGAR SS Las colonias son translucidas, transparentes u opacas algunas veces centro negro. Las colonias formadoras de la lactasa son rojas. IDEINTIFIACION BIOQUIMICA Seleccionar al menos 2colonias sospechosas de cada placa que se encuentren bien aisladas. Transferir a cada una, con asa, a una serie de tubos de cultivos tocando se lo una vez la colonia. Incubar a 35C durante 24horas. INTERPRETACION DE RESULTADOS. 1.-AGAR TSI. En el fondo se observa la fermentacin de la glucosa, puede haber burbujas de gas y coloracin negra por la coloracin de H2S, la superficie del medio no debe de cambiar por no haber fermentacin de lactosa 2.-AGAR LIA. Coloracin purpura del medio por descarboxilacion de la lisina a veces se observa coloracin negra por produccin de H2S. 3.- AGAR SIM Se observa producion de H2S (coloracin negra, produccin de indol negativo, reactivo de kovac). Se observa movilidad por crecimiento nebuloso. 4.-CALDO SURRACO No cambia la coloracin del medio por no fermentar las sacarosa y no hidrolizar la urea .

5.-CALDO MANITOL Fermentacin positiva con aire del indicador a amarillo

PRACTICA N0. 7 ANALISIS DE ALIMENTOS CONGELADOS INTRODUCCION: Estndares bacteriolgicos son recomendados para alimentos congelados y son adaptados por varios laboratorios. Estos estndares incluyen los lmites en el nmero de cuenta total, limites en el nmero de bacterias coliformes y la ausencia tanto de bacterias entericas y estafilococos. OBJETIVO: La aplicacin de un metodo de prueba para el analisis microbiologico de alimentos congelados. I.- VEGETALES CONGELADOS A) PREPRACION DE LA MUESTRA 1. Para chicharo, lima, habas, maz en grano, abra el paquete que los contiene y tome la muestra con cuchara o bistur estril de diferentes partes del paquete. 2. Para espinacas, coliflor, brcoli, descongelar a temperatura ambiente por 2 horas. Tome la muestra de diferentes partes del paquete. 3. Pese 50 gr y colquelos en 450 ml en un vaso de licuadora estril y licue por 2 minutos deje reposar 2 minutos. Resuspenda 11 ml en 99 ml de agua destilada estril (1:10) (si el licuar no es posible; pese 11 gr del vegetal y colquelo en un mortero con arena estril y muela vigorosamente; transfiera a agua destilada estril (1:10). B) CUENTA TOTAL: Use las disoluciones 1:100 y 1:1000 en cajas de petri con agar cuenta estndar por duplicado. Incubar a 32C de 3 a 4 dias. C) CUENTA DIRECTA AL MICROSCOPIO Mezcle 50 gr del vegetal con 100 ml de agua destilada estril por 2 minutos. Con una pipeta de Breed tome 0.01 ml y distribuya en 1 cm 2 tia con colorante aceite alinina norte azul de metileno por 1 minuto enjuagu, seque y cuente 100 campos. Reporte microorganismos ms por gramo. II.- FRUTAS CONGELADAS

A) PREPARACION DE LA MUESTRA:

Despus de descongelar por 2 horas a temperatura ambiente, muestree proporcionalmente partes de fruta y jugo del paquete, proceda como en la parte IA, 3. B) Cuenta total: procede como en la parte I-B. C) Cuenta microscpica directa: Proceda como en la parte I-C. III.-ALIMENTOS PRECOCIDOS CONGELADOS A) PREPARACION DE LA MUESTRA: Proceda como en la parte I, excepto sin descongelar, use una parte de la comida o toda. B) CUENTA TOTAL: Proceda como en la parte I-B. C) CUENTA DE HONGOS Y LEVADURAS: Las caja de petri para la siembra con agar papa dextrosa acidificada se incuban a 21C por 3 a 5 dia, por duplicado. Exprese sus resultados como hongos y levaduras por gramo de producto. D) Cuenta directa al microscopio. Proceda como en la parte I-C. IV. PESCADO O CARNE CONGELADA (CRUDO O PRECOCIDO). Siga el procedimiento descrito en la parte I.