BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Tumbuhan Jengkol 2.1.1. Morfologi Tumbuhan Jengkol

Tumbuhan Jengkol atau lebih dikenal dengan tumbuhan Jering adalah termasuk dalam Famili Fabaceae (suku biji-bijian). Tumbuhan kulit buah jengkol atau Jering dengan nama latinnya yaitu (Pithecellobium lobatum Benth.) dengan sinonimya yaitu A. Jiringa, Pithecollobioum jiringa dan Archindendron pauciflorum adalah tumbuhan khas di wilayah Asia Tenggara. Jengkol merupakan salah satu tumbuhan dengan ukuran pohon yang tinggi yaitu 20 m , tegak bulat berkayu, licin, percabangan simpodial, cokelat kotor. Bentuk majemuk, lonjong, berhadapan , panjang 10 - 20 cm, lebar 5 - 15 cm, tepi rata, ujung runcing, pangkal membulat, pertulangan menyirip, tangkai panjang 0,5 1 cm, warna hijau tua. Struktur majemuk, berbentuk seperti tandan, diujung dan ketiak daun, tangkai bulat, panjang 3 cm , berwarna ungu kulitnya, bentuk buah menyerupai kelopak mangkok, benang sari kuning, putik silindris, kuning mahkota lonjong, putih kekuningan. Bulat pipih berwarna cokleat kehitaman, berkeping dua dan berakar tunggang. Pohon Jengkol sangat bermanfaat dalam konservasi air disuatu tempat hal ini dikarenakan ukuran pohonnya yang sangat tinggi.

2.1.2. Klasifikasi Ilmiah Jengkol adalah sebagai berikut : Kingdom Subkingdom Divisi Kelas Ordo Famili Genus Spesies : Plantae : Tracheobionta : Magnoliophyta (berbunga) : Magnoliopsida (dikotil) : Fabales : Mimosaceae (polong-polongan) : Pithecollobium : Pithecollobium lobatum (Benth.) (Steenis, V., 2005)

Universitas Sumatera Utara

2.1.3. Manfaat kulit buah tumbuhan Jengkol

Salah satu tumbuhan yang digunakan sebagai tumbuhan obat adalah kulit buah tumbuhan Jengkol (Pithecollobium lobatum Benth.). Bagian dari Jengkol yang digunakan adalah kulit buahnya yang dapat dimanfaatkan sebagai obat diabetes (gula darah).(id.wikipedia.org/wiki/Jering) dan dapat digunakan sebagai herbisida alami untuk menekan pertumbuhan gulma yang mengganggu pertanian. (http://bdpunib.org/bdp/abstrak/2005/budinur.html)

2.2. Senyawa Flavonoida

2.2.1. Pendahuluan

Istilah senyawa fenol meliputi aneka ragam senyawa yang berasal dari tumbuhan, yang mempunyai ciri sama yaitu cincin aromatik yang mengandung satu atau dua penyulih (pengganti) hidroksil. Senyawa fenol cenderung mudah larut dalam air karena umumnya mereka sering kali berikatan dengan gula sebagai glikosida, dan biasanya terdapat vakuola sel (membran sel).

Beberapa ribu senyawa fenol alam telah diketahui strukturnya. Flavonoida merupakan golongan terbesar, tetapi fenol monosiklik sederhana, fenilpropanoida, dan kuinon fenolik juga tertdapat dalam jumlah besar. Beberapa golongan bahan polimer penting alam tumbuhan lignin, melanin, dan tanin adalah senyawa polifenol dan kadang-kadang satuan fenolik dijumpai pada protein, alkaloida, dan diantara terpenoida. Peranan beberapa golongan senyawa fenol sudah diketahui (misalnya lignin sebagai bahan pembangun dinding sel, antosianin sebagai pigmen bunga), sedangkan peranan senyawa yang termasuk golongan lain masih merupakan hasil dugaan belaka. Flavonol. Misalnya, tampaknya penting pada pengaturan pengendalian tumbuh pada tanaman kacang, Pisum sativum. Pengaruhnya yang merugikan terhadap kebiasaan makan serangga telah menunjukkan bahawa flavonoida mungkin merupakan faktor pertahanan alam.

Universitas Sumatera Utara

Bagi biokimiawan tumbuhan, senyawa fenol tumbuhan dapat menimbulkan gangguan besar karena kemampuannya membentuk kompleks dengan protein melalui ikatan hidrogen. Bila kandungan sel tumbuhan bercampur dan membran menjadi rusak selama proses isolasi, senyawa fenol cepat sekali membentuk kompleks dengan protein. Akibatnya, sering terjadi hambatan terhadap kerja enzim pada ekstrak tumbuhan kasar. Sebaliknya, fenol sendiri sangat peka terhadap oksidasi enzim dan mungkin hilang pada proses isolasi akibat kerja enzim fenolase yang terdapat dalam tumbuhan. Ekstraksi senyawa fenol-tumbuhan dengan etanol mendidih biasanya mencegah terjadinya oksidasi enzim, dan prosedur ini seharusnya dilakukan secara rutin.

Cara klasik untuk mendeteksi senyawa fenol sederhana ialah dengan menambahkan larutan besi (III) klorida 1% dalam air atau etanol kepada larutan cuplikan, yang menimbulkan warna hijau, merah, ungu, biru, atau hitam yang kuat. Cara ini, yang dimodifikasi dengan menggunakan campuran segar larutan besi (III) klorida 1% dalam air dan kalium heksasianoferat (III) 1%, masih tetap digunakan secara umum untuk mendeteksi senyawa fenol pada kromatogram kertas. Tetapi, kebanyakan senyawa fenol (terutama flavonoida) dapat dideteksi pada kromatogram berdasarkan warnanya atau fluoresensinya dibawah lampu UV, warnanya diperkuat atau berubah bila diuapi amonia. Pigmen fenolik berwarna dan warnanya ini dapat terlihat jadi, mudah disimak (dipantau) selama proses isolasi dan

pemurnian.(Harborne, 1987)

Senyawa-senyawa flavonoida adalah senyawa-senyawa polifenol yang mempunyai 15 atom karbon, terdiri dari dua cincin benzene yang dihubungkan menjadi satu oleh rantai linier yang terdiri dari tiga atom karbon. Senyawa-senyawa flavonoida adalah senyawa 1,3 diaril propana, senyawa isoflavonoida adalah 1,1 diaril propana. Istilah flavonoida deiberikan pada suatu golongan besar senyawa yang berasal dari kelompok senyawa yang paling umum, yaitu senyawa flavon; suatu jembatan oksigen terdapat diantara cincin A dalam kedudukan orto, dan atom karbon benzil yang terletak disebelah cincin B. Senyawa heterosiklik ini, pada tingkat oksidasi yang berbeda terdapat dalam kebanyakan tumbuhan. Flavon adalah bentuk

Universitas Sumatera Utara

yang mempunyai cincin C dengan tingkat oksidasi paling rendah dan dianggap sebagai struktur induk dalam nomenklatur kelompok senyawa-senyawa ini. (Manitto, 1981)

Semua varian falvonoida saling berkaitan karena alur biosintesis yang sama, yang memasukkan substrat dari alur sikimat dan alur asetat-malonat (Hahlbrock & Grisebach, 1975; Wong, 1976), flavonoida pertama dihasilkan segera setelah kedua alur itu bertemu. Sekarang, flavonoid yang dianggap pertama kali terbentuk pada biosintesis ialah khalkon (Hahlbrock, 1980), dan semua bentuk lain diturunkan darinya melalui berbagai alur. Modifikasi flavonoida pengurangan) hidroksilasi; metilasi gugus hidroksil atau inti flavonoida; isoprenilasi gugus hidroksil atau inti flavonoida; metilenasi gugus ortodihidroksil; dimerisasi (pembentukan

biflavonoida); pembentukan bisulfate; dan

3' 2' 8
7

(8a) 1 9 O C

B 2 3 1' 6'

4' 5'

A 6 5 10 (4a)

4
O

yang terpenting, glikosilasi gugus hidroksil (pembentukan flavonoida O-glikosida) atau inti flavonoida (pembentukan flavonoida C-glikosida). (Markham, 1988)

2.2.2. Struktur dasar Senyawa Flavonoida

Senyawa flavonoida adalah senyawa yang mengandung C15 terdiri atas dua inti fenolat yang dihubungkan dengan tiga satuan karbon. Struktur dasar flavonoida dapat digambarkan sebagai berikut :

Universitas Sumatera Utara

A
C C C

Kerangka dasar senyawa flavonoida Cincin A adalah karakteristik phloroglusinol atau bentuk rosorsinol tersubstitusi.

HO A

HO A

C3 OH

C6 (B)

C3

C6 (B)

Namun sering terhidroksilasi lebih lanjut :

HO A HO OH C3 C6 (B)
H3CO OCH3

O
OCH3 H3CO A C3 C6 (B) O

Cincin B adalah karakteristik 4-,3,4-,3,4,5- terhidroksilasi

R

(A) C6

C3

R = R' =H, R' = OH R = H, R' = R" = OH R = R' = R" = OH (juga, R = R' = R"= H)

(Sastrohamidjojo, 1996)

2.2.3. Klasifikasi Senyawa Flavonoid

Flavonoid mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi sehingga menunjukkan pita serapan yang kuat pada daerah spektrum sinar ultraviolet dan spektrum sinar tampak, umumnya dalam tumbuhan terikat pada gula yang disebut dengan glikosida. (Harborne, 1996). Pada flavonoida O-glikosida, suatu gugus hidroksil flavonoida (atau

Universitas Sumatera Utara

lebih) terikat pada satu gula (lebih) dengan ikatan yang tahan asam. Glukosa merupakan gula yang paling umum terlibat dan gula lain yang sering juga terdapat adalah galaktosa, ramnosa, silosa, arabinosa, dan rutinosa. Waktu yang diperlukan untuk memutuskan suatu gula dari suatu flavonoida O-glikosida dengan hidrolisis asam ditentukan oleh sifat gula tersebut.

Pada flavonoida C-glikosida, gula terikat pada atom karbon flavonoida dan dalam hal ini gula tersebut terikat langsung pada inti benzene dengan suatu ikatan karbon-karbon yang tahan asam. Gula yang terikat pada atom C hanya ditemukan pada atom C nomor 6 dan 8 dalam inti flavonoida, misalnya pada orientin. (Markham, 1988).

Flavonoid memiliki dua cincin benzene yang dipisahkan oleh sebuah unit propane dan diturunkan dari senyawa flavone. Secara umum merupakan golongan senyawa yang mudah larut dalam air. Kebanyakan senyawa terkonjugasi yang pada umumnya berwarna cerah. Secara umum dapat dijumpai pada tumbuhan sebagai glikosidanya yang meiliki struktur yang rumit. Perbedaan kelas antara golongan senyawa flavonoida ini adalah adanya tambahan oksigen yang terikat pada cincin heterosiklik dan gugus hidroksil. Senyawa yang termasuk dalam golongan tersebut adalah katekin, leukoantosianidin, flavanone, flavanonol, flavone, antosianidin, flavonol, khalkone, aurone, dan isoflavone. Struktur antara katekin dan

leukoantoasianidin memiliki struktur yang mirip dan jarang dijumpai bentuk glikosidanya. Dan akan mengalami polimerisasi membentuk tanin yang terkandung pada daun teh.

Flavanon dan flavanonol jarang dijumpai dalam bentuk glikosidanya. Flavon dan flavonol secara luas terdistribusi sebagai senyawa fenolik. Antosianin adalah pigmen tumbuhan yang secara umum berwarna merah dan jarang dijumpai berwarna biru pada suatu bunga. Dan dapat dihasilkan sebanyak 30% dari bunga kering. Dapat dijumpai sebagai glikosida. Khalkone termasuk butein, dengan cincin furan ditemukan dalam senyawa flavonoid, meskipun hal ini sering digunakan sebagai titik pengkontrol

Universitas Sumatera Utara

untuk pH. Auron merupakan pigmen berwarna kuning emas yang secara umum dijumpai pada bunga. (Kaufman,P. 1999). Isoflavone yang lebih dikenal sebagai 3- phenylkromon Dapat diketahui ada sekitar 35 jenis isoflavone yang dikenal, yang mana contoh umumnya sebagai berikut :Daidzein, Genistein, Tianlancuayin. Isoflavone dapat mengalami degradasi dengan danya penambahan basa sehingga menghasilkan Desoxybenzoin dan asam formiat selanjutnya Desoxybenzoin terpisah dan mengalami fusi (penggabungan dua inti ringan menjadi inti yang lebih berat molekulnya) basa dan metilasi. Isoflavone banyak digunakan sebagai estrogenic, insectidal, dan sebagai anti jamur, beberapa dari senyawa itu adalah berpotensi dihasilkan dari racun ikan. (Raphael,I. 1991)

Menurut Robinson (1955), flavonoid dapat dikelompokkan berdasarkan keragaman pada rantai C3 yaitu :

1. Flavonol Flavonol paling sering terdapat sebagai glikosida, biasanya 3-glikosida, dan aglikon flavonol yang umum yaitu kamferol, kuersetin, dan mirisetin yang berkhasiat sebagai antioksidan dan antiimflamasi. Flavonol lain yang terdapat di alam bebas kebanyakan merupakan variasi struktur sederhana dari flavonol. Larutan flavonol dalam suasana basa dioksidasi oleh udara tetapi begitu cepat sehingga penggunaan basa pada pengerjaannya masih dapat dilakukan.

H O

OH H O

Struktur Flavonol

Universitas Sumatera Utara

2. Flavon Flavon berbeda dengan flavonol dimana pada flavon tidak terdapat gugusan 3hidroksi. Hal ini mempunyai serapan UV-nya, gerakan kromatografi, serta reaksi warnaya. Flavon terdapat juga sebagai glikosidanya lebih sedikit daripada jenis glikosida pada flavonol. Flavon yang paling umum dijumpai adalah epigenin dan luteolin. Luteolin merupakan zat warna yang pertama kali dipakai Eropa. Jenis yang paling umum adalah 7-glikosida dan terdapat juga flavon yang terikat pada gula melalui ikatan karbon-karbon. Contohnya luteolin 8-C-glikosida. Flavon dianggap sebagai induk dalam nomenklatur kelompok senyawa flavonoid.

3' 2' 1
8 7

4' 5' 6'

1' 2

6 5

10

Struktur Flavon

3. Isoflavon Isoflavon merupakan isomer flavon, tetapi jumlahnya sangat sedikit dan sebagai fitoaleksin yaitu senyawa pelindung yang terbentuk dalam tumbuhan sebagai pertahanan terhadap serangan penyakit. Isoflavon sukar dicirikan karena reaksinya tidak khas dengan pereaksi warna manapun. Beberapa isoflavon (misalnya daidzein) memberikan warna biru muda cemerlang dengan sinar UV bila diuapi ammonia, tetapi kebanyakan yang lain tampak sebagai bercak lembayung yang pudar dengan ammonia berubah menjadi cokelat.

Universitas Sumatera Utara

Struktur Isoflavon 4. Flavanon

Flavanon terdistribusi luas di alam. Flavanon terdapat di dalam kayu, daun dan bunga. Flavanon glikosida merupakan konstituen utama dari tanaman genus prenus dan buah jeruk; dua glikosida yang paling lazim adalah neringenin dan hesperitin, terdapat dalam buah anggur dan jeruk.

Struktur Flavanon

5. Flavanonol Senyawa ini berkhasiat sebagai antioksidan dan hanya terdapat sedikit sekali jika dibandingkan dengan flavonoid lain. Sebagian besar senyawa ini diabaikan karena konsentrasinya rendah dan tidak berwarna.

OH O

Struktur Flavanonol

Universitas Sumatera Utara

6. Katekin Katekin terdapat pada seluruh dunia tumbuhan, terutama pada tumbuhan berkayu. Senyawa ini mudah diperoleh dalam jumlah besar dari ekstrak kental Uncaria gambir
dan daun teh kering yang mengandung kira-kira 30% senyawa ini. Katekin berkhasiat sebagai antioksidan.
OH OH

HO

OH HO

Struktur Katekin

7. Leukoantosianidin Leukoantosianidin merupakan senyawa tidak berwarna, terutama terdapat pada tumbuhan berkayu. Senyawa ini jarang terdapat glikosida, contohnya melaksidin, apiferol.

OH HO OH

Struktur Leukoantosianidin

8. Antosianin Antosianin merupakan pewarna yang paling penting dan paling tersebar luas dalam tumbuhan. Pigmen yang berwarna kuat dan larut dalam air ini adalah penyebab hampir semua warna merah jambu, merah marak, ungu,. dan biru dalam daun, bunga, dan buah pada tumbuhan tingkat tinggi. Secara kimia semua antosianin merupakan turunan suatu struktur aromatik tunggal yaitu sianidin, dan semuanya terbentuk dari

Universitas Sumatera Utara

pigmen sianidin ini dengan penambahan atau pengurangan gugus hidroksil atau dengan metilasi atau glikosilasi.
O

OH

Struktur Antosianin

9. Khalkon Khalkon adalah pigmen fenol kuning yang berwarna cokelat kuat dengan sinar UV bila dikromatografi kertas. Aglikon flvon dapat dibedakan dari glikosidanya, karena hanya pigmen dalam bentuk glikosida yang dapat bergerak pada kromatografi kertas dalam pengembang air. (Harborne, 1996).

Struktur Khalkon

10. Auron Auron berupa pigmen kuning emas yang terdapat dalam bunga tertentu dan briofita. Dalam larutan basa senyawa ini berwarna merah ros dan tampak pada kromatografi kertas berupa bercak kuning, dengan sinar ultraviolet warna kuning kuat berubah menjadi merah jingga bila diberi uap amonia. (Robinson, 1995)

O HC

Struktur Auron

Universitas Sumatera Utara

Menurut Harborne (1996), dikenal sekitar sepuluh kelas flavonoida dimana semua flavonoida, menurut strukturnya, merupakan turunan senyawa induk flavon dan semuanya mempunyai sejumlah sifat yang sama yakni :
Golongan Flavonoida Antosianin Penyebaran Ciri Khas

Pigmen bunga merah marak, dan Larut dalam air, maks 5 1 5 -545 biru juga dalam daun dan jaringan nm, bergerak dengan BAA pada lain. kertas. Terutama tidak berwarna dalam Menghasilkan antosianidin tumbuhan berkayu. (warna dapat diekstraksi dengan amil alkohol) bila jaringan dipanaskan dalam HCl 2M selama setengah jam. Terutama ko-pigmen tidak Setelah hidrolisis, berupa bercak berwarna dalam bunga sianik dan kuning murup pada kromatogram Forestal bila disinari dengan sinar asianik; tersebar luas dalam daun. UV; maksimal spektrum pada 330-350. Seperti flavonol Setelah hidrolisis, berupa bercak cokelat redup pada kromatogram Forestal maksimal spektrum pada 330-350 nm. Seperti flavonol Mengandung gula yang terikat melalui ikatan C-C; bergerak dengan pengembang air, tidak seperti flavon biasa. Tidak berwarna; hampir Pada kromatogram BAA berupa seluruhnya terbatas pada bercak redup dengan Rf tinggi. gimnospermae(tumb.berbiji terbuka) Dengan ammonia berwarna merah; maksimal spektrum 370410 nm.

Proantosianidin

Flavonol

Flavon

Glikoflavon

Biflavonil

Khalkon dan Auron

Flavanon Isoflavon

Kadang-kadang terdapat juga dalam jaringan lain. Tidak berwarna; dalam daun dan buah (terutama dalam Citrus) tidak berwarna; sering kali akar; hanya terdapat dalam satu suku, Leguminosae(tumb. Kacangkacangan).

Berwarna merah kuat dengan MgHCl kadang-kadang sangat pahit. Bergerak pada kertas dengan pengembang air, tak ada uji warna yang khas.

Universitas Sumatera Utara

2.2.4. Metoda Isolasi Senyawa Flavonoida

Isolasi konstituen flavonoida dari tumbuhan akar serabut Glyccyrrhiza glabra pada isolasi ini yang diisolasi adalah senyawa licoagrodin dan turunannya. Pada dasarnya ekstrak methanol akar serabut tumbuhan G. glabra yang dipartisi antara air dan etil asetat.Ekstrak etil asetat diteruskan untuk dipisahkan dengan menggunkan kromatografi kolom dengan menggunakan silika gel dan selanjutkan dimurnikan dengan menggunakan Fase-Normal HPLC untuk menghasilkan 5 jenis flavonoida baru, licoagrodin, licoagrokalkone B, licoagrokalkone C, licoagrokalkone D , licoagroaurone dan 4 flavonoid yang dikenal lainnya ialah licoakalkone C. Lapisan air dilanjutkan untuk dianalisa dengan kromatografi kolom Daion HP-20, yang dielusi dengan menggunakan methanol. Eluate methanol dievaporasi vakum untuk menghasilkan sebuah fraksi glikosida. Fraksi tersebut akan dianalisa dengan kromatografi kolom ODS. (Yoshikawa,T.2000).

2.2.5. Sifat Kelarutan Flavonoida

Aglikon Flavonoida adalah polifenol dan karena itu mempunyai sifat kimia senyawa fenol, yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa. Tetapi harus diingat, bila dibiarkan dalam larutan basa, dan di samping itu terdapat oksigen, banyak yang terurai. Karena mempunyai sejumlah gugus hidroksil yang tak tersulih(terganti), atau suatu gula, flavonoida merupakan senyawa polar, dan seperti kata pepatah lama mengatakan suatu golongan akan melarutkan golongannya sendiri maka umumnya flavonoida larut cukupan dalam pelarut polar seperti etanol (EtOH), methanol(MeOH), butanol(BuOH), aseton, dimetilsulfoksida(DMSO),

dimetilformamida(DMF), air, dan lain-lain. Adanya gula yang terikat pada flavonoida (bentuk yang umum ditemukan) cenderung menyebabkan flavonoida lebih mudah larut dalam air dan dengan demikian campuran pelarut diatas dengan air merupakan pelarut yang lebih baik untuk glikosida. Sebaliknya, aglikon yang kurang polar seperti isoflavon, flavanon, dan flavon serta flavonol yang termetoksilasi cenderung lebih mudah larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform.

Universitas Sumatera Utara

2.3. Teknik Pemisahan Tujuan dari teknik pemisahan adalah untuk memisahkan komponen yang akan ditentukan berad dalam keadaan murni, tidak tercampur dengan komponen-komponen lainnya. Ada 2 jenis teknik pemisahan : 1. Pemisahan Kimia Pemisahan ini berdasarkan adanya perbedaan yang besar dari sifat-sifat fisika komponen dalam campuran yang akan dipisahkan. 2. Pemisahan Fisika Pemisahan ini berdasarkan pada perbedaan-perbedaan kecil dari sifat-sifat fisik antara senyawa-senyawa yang termasuk dalam suatu golongan. (Muldja, 1995).

2.4. Kromatografi Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara 2 fase, satu dari fase-fase ini membentuk lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat. Fase stasioner mungkin suatu zat padat atau suatu cairan dan fase yang

bergerak mungkin suatu cairan atau suatu fase gas. Cara-cara kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan sifat-sifat dari fase diam, yang dapat berupa zat padat atau zat cair. Jika fase diam berupa zat padat disebut kromatografi serapan, jika berupa zat cair atau gas maka ada empat macam system kromatografi yaitu : 1. Fase gerak cair-fase diam padat (kromatografi serapan) a. Kromatografi Lapis Tipis b. Kromatografi Penukar Ion 2. Fase gerak gas-fase diam padat, yakni kromatografi gas padat 3. Fase gerak cair-fase diam cair (kromatografi partisi), yakni kromatografi kertas 4. Fase gerak gas-fase diam zat cair, yakni : a. Kromatografi Gas-Cair b. Kromatografi Kolom Kapiler

Universitas Sumatera Utara

Semua pemisahan dengan kromatografi tergantung pada kenyataan bahwa senyawasenyawa yang dipisahkan terdistribusi diantara fase gerak dan fase diam dalam perbandingan yang sangat berbeda-beda dari suatu senyawa terhadap senyawa yang lain. (Sastrohamidjojo, 1991).

2.4.1. Kromatografi Lapis Tipis

Teknik kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan oleh Egon Stahl dengan menghamparkan penyerap pada lempeng gelas, sehingga merupakan lapisan tipis. KLT merupakan kromatografi serapan, tetapi dapat juga merupakan kromatografi partisi karena bahan penyerap telah dilapisi air dari udara. Sistem ini segera popular karena memberikan banyak keuntungan, misalnya peralatan yang diperlukan sedikit, murah, sederhana, waktu, analisis cepat dan daya pisah cukup baik. (Sudjadi, 1986)

2.4.1.1 Pembuatan Lapisan Tipis

Dalam pembuatan lapisan tipis digunkan plat-plat kaca yang memiliki ukuran 20 x 5 cm atau 20 x 20 cm, dan ukuran ini dianggap standart. Plat ini dicuci terlebih dahulu dengan air dan detergen kemudian dikeringkan dengan aseton. Selanjutnya membuat penyerap menjadi bubur dengan air, biasanya dalam perbandingan x gram penyerap dan 2x ml air. Bubur diaduk dengan baik dan dibentangkan di atas plat kaca dengan berbagai cara. Tebal standart adalah 250 mikron. Lapisan-lapisan yang lebih tebal (0,5 2,0 mm) digunakan untuk pemisahan-pemisahan yang sifatnya besar, dengan menggunakan penyerap hingga 250 mg untuk plat dengan ukuran 20 x 20 cm. Salah satu keukaran dengan lapisan tebal ialah adanya tendensi mengelupas bila kering.(Sastrohamidjojo, 1985)

Beberapa contoh penyerap yang digunakan untuk pemisahan dalam kromatografi lapis tipis adalah sebagai berikut :

Universitas Sumatera Utara

1. Silika gel Ada beberapa jenis silika gel, yaitu : a. Silika gel G Silika gel G adalah silika gel yang mengandung 13 % kalsium sulfat sebagai perekat. Jenis silika gel ini biasanya mengandung ion logam, terutama ion besi. Kandungan ion besi dapat dihilangkan dengan mengembangkan plat TLC silika gel G dengan sstem pelarut metanol : asam HCl pekat 9 : 1.

b. Silika gel H Perbedaan silika gel G dan silika gel H ialah, bahwa silika gel H tidak menngandung perekat kalsium sulfat. Silika gel H dipakai untuk pemisahan yang bersifat spesifik, terutama lipida netral.

c. Silika gel PF Jenis silika gel ini diketemukan belakangan, yang dibuat sedemikian rupa sehingga senyawa-senyawa organik terikat pada plat ini dapat mengadakan fluoresensi. Oleh karena itu visualisasinya dapat dikerjakan dengan menempatkan plat yang telah dikembangkan di dalam ruangan gelap atau dengan sinar ultra violet yang bergelombang pendek.

2. Alumina Penggunaan alumina dalam TLC, yang semula diperkenalkan oleh peneliti dari Cekoslowakia, tidak sesering silika gel. Sebenarnya alumina netral mempunyai kemampuan untuk memisahkan bermacam-macam senyawa, seperti terpena, alkaloid, steroid, dan senyawa-senyawa alisklik, alifatik, serta aromatik. Sebagai zat perekat alumina tidak mengandung zat perekat, memepunyai digunakan baik tanpa maupun dengan aktivasi. sifat alkalis dan dapat

Universitas Sumatera Utara

3. Kieselguhr Kieselguhr merupakan adsorben yang lebih lemah dari silika gel dan alumina, oleh karena itu lebih cocok untuk memisahkan senyawa-senyawa polar. (Adnan, M., 1997)

Nilai utama KLT pada penelitian flavonoid ialah sebagai cara analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit. Menurut Markham, KLT memiliki peranan penting dalam metoda pemisahan dan isolasi yaitu : a. Mencari pelarut untuk kromatografi kolom b. Analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom c. Menyigi arah atau perkembangan reaksi seperti hidrolisis atau metilasi d. Identifikasi flavonoida secara ko-kromatografi e. Isolasi flavonoida murni skala kecil.

2.4.2. Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom atau tabung merupakan salah satu jenis pemisahan dengan menggunakan prinsip aliran zat cair (pelarut) yang dipengaruhi oleh gaya tarik bumi (gravitasi bumi) atau dikenal dengan sistem bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi keran jenis tertentu pada bagian bawahnya untuk mengatur aliran pelarut.(Gritter, 1991) . Pada isolasi flavonoida sebaiknya digunakan kolom skala besar karena hal ini dapat meningkatkan proses pemisahan yang baik. Pada dasarnya cara ini meliputi penempatan campuran flavonoida (berupa larutan) di atas kolom yang berisi serbuk penyerap (seperti selulose, silika, atau poliamida), dilanjutkan dengan elusi beruntun setiap komponen memakai pelarut yang cocok. Kolom yang digunakan umumnya terbuat dari kaca yang dilengkapi dengan keran pada salah satu ujung, dan ukurannya sedemikian rupa sehingga nisbah garis tengah terhadap panjang kolom dalam rentang 1:10 sampai 1:30. Kemasan kolom harus dipilih dari jenis yang dipasarkan khusus untuk kromatografi kolom karena ukuran partikel penting. Jika ukuran partikel terlalu kecil, laju aliran pengelusi mungkin terlalu lambat, sedangkan bila terlalu besar, mungkin pemisahan komponen secara

Universitas Sumatera Utara

kromatografi tidak baik. Kemasan niaga biasanya dalam ukuran 100-300mesh. (Markham, 1988)

2.4.2.1. Pengisian Kolom

Pengisian kolom harus dikerjakan dengan seragam.Setelah adsorben dimasukkan dapat diseragamkan kepadatannya dalam kolom dengan menggunakan vibrator atau dengan plunger (pemadat). Selain itu dapat juga dikerjakan dengan memasukkan adsorben dalam bentuk larutan (slurry) dan partikelnya dibiarkan mengendap. Pengisian kolom yang tidak seragam akan menghasilkan rongga-rongga di tengah-tengah kolom. Cara untuk mengatasi masalah ini adalah dengan mengadakan back fushing , sehingga terjadi pengadukan, yang seterusnya dibiarkan lagi mengendap. Pada bagian bawah (dasar) dan atas dari isian kolom diberi wol kaca (glass wool) atau sintered glass disc untuk menyangga isian. Bila kolom telah diberi bahan isian, permukaan cairan tidak boleh dibiarkan turun dibawah permukaan bahan isian bagian atas, karena akan memberikan peluang masuknya gelembung udara masuk ke kolom. (Adnan,M., 1997)

2.4.2.2. Memilih Kemasan Kolom

Kemasan kolom yang tersedia sangatlah banyak dan senarai di bawah memberikan pedoman mengenai pemakaian dan cirri sejumlah jenis kemasan yang berguna. Selulosa Pemakaian selulosa serupa dengan kertas, yaitu ideal untuk memisahkan glikosida yang satu dengan yang lain, atau memisahkan glikosida dari aglikon, serta untuk memisahkan aglikon yang kurang polar. Kapasitasnya rendah. Silika Bahan ini paling berguna untuk memisahkan aglikon yang kurang polar, misalnya isoflavon, flavanon, metal flavon, dan flavanol. Kapasitas pertengahan.

Universitas Sumatera Utara

 Poliamida Bahan ini cocok untuk memisahkan semua flavonoid, meski juga ideal untuk memisahkan glikosida. Merupakan pelengkap untuk KKt karena melibatkan penyerap dan pengembang yang berlainan. Sebelum dipakai harus dicuci dengan MeOH dan H2O agar poliamida yang larut tidak mencemari semua fraksi. Kapasitas tinggi. Gel sephadex (deret G) Bahan ini dirancang untuk memisahkan campuran, terutama berdasarkan pada ukuran molekul (bila digunkan pelarut air); molekul besar terlebih dahulu. Sephadex berguna untuk memisahkan poliglikosida yang berbeda bobot molekulnya. Kapasitasnya lebih besar karena ukurannya lebih teratur.

2.4.3. Kromatografi Preparatif

Salah satu metode pemisahan yang memerlukan pembiayaan yang paling murah dan memakai peralatan yang paling dasar ialah kromatografi lapis titpis preparatif (KLTP). Walaupun KLTP dapat memisahkan bahan alam dalam jumlah gram, sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah milligram. KLTP bersama-sama dengan kromatografi kolom terbuka, masih dijumpai dalam sebagian besar publikasi mengenai isolasi bahan alam, terutama dari laboratorium yang tidak dilengkapi dengan cara pemisahan modern. Akan tetapi, seperti yang akan diterangkan kemudian, tertdapat banyak masalah pada KLTP. Penyerap Dalam KLTP digunakan ketebalan adsorbent yang paling sering dipakai yaitu 0,5-2 mm. ukuran plat kromatografi biasanya 20 x 20 cm atau 20 x 40 cm. Peneyerap yang paling umum ialah silika gel dan dipakai untuk pemisahan campuran senyawa lipofil maupun campuran senyawa hidrofil. Penotolan Cuplikan

Universitas Sumatera Utara

Cuplikan dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan pada plat KLTP. Pelarut yang baik ialah pelarut atsiri/organik (heksana, diklorometana, etil asetat), karena jika pelarut kurang atsiri maka akan terjadi pelebaran pita. Konsentrasi cuplikan harus sekitar 5-10%. Pemilihan Fase Gerak Pilihan pelarut ditentukan berdasarkan pemeriksaan pendahuluan memakai KLT analitik. Karena ukuran partikel penyerap kira-kira sama, pelarut yang dipakai pada plat KLT dapat dipakai langsung pada KLTP. Pengembangan pelat KLTP biasanya dilakukan dalam bejana kaca yang dapat menampung beberapa plat. Isolasi senyawa yang sudah terpisah Kebanyakan penyerap KLTP mengandung indikator fluoresensi yang membantu mendeteksi kedudukan pita yang terpisah sepanjang senyawa yang dipisahkan menyerap sinar UV. Akan tetapi, beberapa indikator menimbulkan masalah yaitu bereaksi dengan asam kadang-kadang bahakan dengan asam asetat. Untuk senyawa yang tidak menyerap sinar UV, ada beberapa pilihan : a). Menyemprot dengan air (misalnya saponin) b). Menutup pelat dengan sepotong kaca menyemprot salah satu sisi dengan pereaksi semprot c). Menambahkan senyawa pembanding. (Hostettman,K.,1995)

2.4.4. Harga Rf ( Retension factor)

Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah pada lapisan tipis lebih baik dikerjakan dengan pereaksi lokasi kimia dan reaksi warna. Lazimnya identifikasi menggunakan harga Rf meskipun harga-harga Rf dalam lapisan tipis kurang tepat bila dibandingkan pada kertas.

Universitas Sumatera Utara

Dapat didefenisikan sbb : Harga Rf =

Faktor-faktor yang memepengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapis tipis yang juga mempengaruhi harga Rf :

1). Struktur kimia dari senyawa yang dipisahkan 2). Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya 3). Tebal keraataan dari lapisan penyerap 4). Pelarut (dan derajat kemurniannya) fasa gerak 5). Derajat kejenuhan dari uap 6). Jumlah cuplikan yang digunakan 7). Suhu 8). Kesetimbangan 9). Teknik percobaan (Sastrohamidjojo, 1985)

2.4.5. Ekstraksi Ekstraksi dapat dilakukan pada bahan tumbuhan yang akan diisolasi. Umumnya kita perlu membunuh jaringan tumbuhan untuk mencegah terjadinya oksidasi enzim atau hidrolisis. Mencelupkan jaringan daun segar atau bunga, bila perlu dipotong-potong,. Kedalam etanol mendidih adalah salah satu cara yang baik untuk mencapai tujuan. Selanjutnya, bahan dapat dimaserasi dalam suatu pelumat, lalu disaring. Bila mengisolasi senyawa dari jaringan hijau, keberhasilan ekstraksi dengan alkohol berkaitan langsung dengan seberapa jauh klorofil tertarik oleh pelarut itu. Bila ampas jaringan, pada ekstraksi ulang, sama sekali tak berwarna hijau lagi, dapat dianggap semua senyawa berbobot molekul rendah telah terekstraksi. (Harborne, 1987)

Universitas Sumatera Utara

2.5. Teknik Spektroskopi Teknik spektroskopi adalah salah satu teknik analisis kimia-fisika yang mengamati tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik. Ada dua macam instrumen pada teknik spektroskopi yaitu spektrometer dan spektrofotometer. Instrumen yang memakai monokromator celah tetap pada bidang fokus disebut sebagai\ spektrometer. Apabila spektrometer tersebut dilengkapi dengan detektor

yang bersifat fotoelektrik maka disebut spektrofotometer. (Muldja, 1955)

Informasi Spektroskopi Inframerah menunjukkan tipe-tipe dari adanya gugus fungsi dalam suatu molekul dan Resonansi Magnetik Inti yang memberikan informasi tentang bilangan dari setiap tipe dari atom hidrogen dan juga memberikan informasi yang menyatakan tentang lingkungan dari setiap tipe dari atom hidrogen. Kombinasinya dan data yang ada kadang-kadang menentukan struktur yang lengkap dari molekulnya yang tidak diketahui. (Pavia, 1979)

2.5.1. Spektroskopi Ultra Violet-Visible

Spektrofotometer UV-Vis adalah pengukuran panjang gelombang dan intensitas sinar ultraviolet dan cahaya tampak yang diabsorbsi oleh sampel. Sinar ultraviolet dan cahaya tampak memiliki energi yang cukup untuk mempromosikan electron pada kulit terluar ke tingkat energi yang lebih tinggi. Spektroskopi UV-Vis biasanya digunakan untuk molekul dan ion anorganik atau kompleks di dalam larutan. Sinar ultraviolet berada pada panjang gelombang 200-400 nm sedangkan sinar tampak berada pada panjang gelombang 400-800 nm. (Dachriyanus, 2004)

Spektrum flavonoida

bisanya ditentukan dalam larutan dengan pelarut

methanol (MeOH, AR atau yang setara) atau etanol (EtOH), meski perlu diingat bahwa spektrum yang dihasilkan dalam etanol kurang memuaskan. Spektrum khas terdiri atas dua maksimal pada rentang 240 285 nm (pita II) dan 300-550 nm (pita I). Kedudukan yang tepat dan kekuatan nisbi maksimal tersebut memebrikan informasi

Universitas Sumatera Utara

yang berharga mengenai sifat flavonoida dan pola oksigenasinya. Ciri khas spektrum tersebut ialah kekuatan nisbi yang rendah pada pita I dalam dihidroflavon, dihidroflavonol, dan isoflavon serta kedudukan pita I pada spektrum khalkon, auron, dan antosianin yang terdapat pada panjang gelombang yang tinggi.

Tabel Rentangan serapan spektrum UV-tampak flavonoida Pita II (nm) 250-280 250-280 250-280 245-275 275-295 230-270 (kekuatan rendah) 230-270 (kekuatan rendah) 270-280 Pita I (nm) Jenis flavonoida

310-350 Flavon 330-360 Flavonol (3-OH tersubstitusi) 350-385 Flavonol(3-OH bebas) 310-330 bahu kira- Isoflavon kira Isoflavon (5-deoksi-6,7-deoksigenasi) 320 puncak Flavanon dan dihidroflavanol 300-330 bahu Khalkon 340-390 Auron 380-430 Antosianidin dan antosianin 465-560 (Markham, 1988)

Dibawah ini daftar beberapa pengaruh substituent untuk senyawa aromatik. Hal ini dapat menjadi catatan bahwa ion phenoxide (-O-), yang dapat dijunpai dalam larutan basa senyawa fenol, dimana dapat menyerap panjang gelombang yang lebih panjang dari pada senyawa induk fenol (-OH). Secara umum menyumbangkan elektron dan substituent pasangan sunyi (lone pair) yang dapat menyebabkan pergeseran kimia berwarna merah dan penyerapan yang lebih tinggi. Senyawa kompleks memiliki pergeseran kimia yang meningkat saat ada sejumlah lebih substituent yang terikat.

Universitas Sumatera Utara

Tabel. Absorbsi max untuk beberapa monosubstitusi benzene Ph-R (methanol : air) R -H -CH3 -Cl -OH -OCH3 -CO2-COOH -NH2 -O maksimum (nm) 204 254 207 261 210 264 211 270 217 269 224 271 230 280 230 280 235 287 (Kealey,D. 2002) Absorbsi radiasi UV oleh senyawa aromatik yang terdiri dari cincin benzene terpadu bergeser ke panjang gelombang yang lebih panjang dengan bertambah banyaknya cincin itu karena bertambahnya konjugasi dan membesarnya stabilisasi-resonansi dari keadaan eksitasi. Daerah yang paling berguna dari spektrum UV adalah daerah dengan panjang gelombang di atas 200 nm. Dalam absorbsi yang ditimbulkan oleh senyawa aromatik dihasilkan warna dalam spektrum tampak. Warna merupakan hasil dari suatu perangkat kompleks (dari) respons faali maupun psikologis terhadap panjang gelombang cahaya antara 400-750 nm, yang jatuh pada selaput jala. Tabel. Warna dalam spektrum tampak maks (nm) 400-424 424-491 491-570 570-585 585-647 647-700 Ungu Biru Hijau Kuning Jingga Merah Warna Warna komplementer(substraksi) Hijau-kuning Kuning Merah Biru Hijau-biru Hijau (Fessenden,F. 1986)

Universitas Sumatera Utara

Tabel Pita absorbsi UV dari flavonoida

No.

Jenis Flavonoida

Struktur Umum
3' 2' 1
8 7

Pita II

Pita I

4' 5' 6'

1 2

'

10 5

1.

Flavon

240-285

304-350

OH

2.

Flavonol

240-285

352-390

3.

Flavanon
R2

270-295
O

300-350

OH

4.

Dihidroflavonol

R1

270-295

300-320

5.

Khalkon
O

220-270

340-390

HC

6.

Auron

220-270

370-430

7.

Antosianidin

OH

270-280

465-550

(Sujata,V., 2005)

Universitas Sumatera Utara

2.5.2. Spektrofotometri Infra Merah (FT-IR)

Radiasi infra merah ditemukan oleh Sir William Hercshel pada tahun 1880, yang melaporkan penemuannya kepada Royal Society. Pada waktu itu para saintis belum memahami secara jelas keadaan transisi. Daerah inframerah terletak antara spektrum electromagnetic cahaya tampak dan spektrum radio; yakni antara 4.000-400 cm-1. Mulai tahun 1903 William dan N. Coblentz mahasiswa di Cornel University memperbaiki teknik-teknik percobaan dan menyusun sederetan spectra serapan zat murni.

a. Ada beberapa daerah penyerapan terpenting dalam Spektrum Infra Merah : 1. Daerah vibrasi regang hidrogen : 3.700-2.700 cm-1. 3.700 3.100 cm-1, serapan oleh vibrasi regang O-H dan N-H. Serapan oleh vibrasi lentur O-H biasanya terdapat pada bilangan gelombang

lebih besar dan pita serapannya dalam spektrum sering lebih lebar dari pita serapan N-H. 3.200 2.850 cm-1, daerah vibrasi regang C-H alifatik.

2. Daerah vibrasi regang ikatan ganda tiga, 2.700 1.850 cm-1 Gugus fungsional yang menyerap di daerah ini terbatas, karena itu ada atau tidaknya serapan tersebut dalam suatu molekul dapat dilihat.

3. Daerah ikatan ganda dua, 1.950 1.550 cm-1 Vibrasi regang untuk ikatan ganda dua, yaitu : - C = C , - C = N -, 1690 1600 cm-1 1.650 1.450 cm-1, puncak serapan dalam daerah ini memberi keterangan yang penting mengenai cincin aromatik.

Universitas Sumatera Utara

4. Daerah sidik jari finger print, 1.500 700 cm-1

Beberapa frekuensi gugusan (group frequency) juga bisa ditemukan di daerah sidik jari ini : C-O-C (vibrasi regang) dalam eter, ester kira-kira 1.200 cm-1 dan vibrasi regang C-Cl pada 700 800 cm-1 . Pada bilangan gelombang dibawah 1.200 cm-1 terdapat puncak-puncak serapan beberapa gugusan anorganik seperti : sulfat, fosfat, nitrat dan karbonat.

b. Vibrasi kerangka suatu molekul (skeletal vibrations) Vibrasi kerangka terletak di derah spektrum lebih dari 1.500 cm-1. Kelompikkelompok vibrasi di daerah spektrum kecil dari 1.500 cm-1 adalah : a. Vibrasi regang (stretching) ikatan ganda yang tidak mengandung atom C b. Vibrasi regang ikatan tunggal c. Vibrasi-vibrasi lentur (bending) (Noerdin, 1985) 2.5.3. Spektrofotometri Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)

Spektrometri Magnetik Inti (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) merupakan alat yang berguna pada penentuan struktur molekul organik. Teknik ini memberikan informasi mengenai berbagai jenis atom hidrogen dalam. Struktur NMR memberikan informasi mengenai lingkungan kimia atom hidrogen, jumlah atom hidrogen dalam setiap lingkungan dan struktur gugusan yang berdekatan dengan setiap atom hydrogen.(Cresswell,1982)

Pergeseran kimia adalah pengukuran medan dalam keadaan bebas. Semua proton-proton dalam satu molekul yang ada dalam lingkungan kimia yang serupa kadang-kadang menunjukkan pergeseran kimia yang sama. Setiap senyawa memberikan penaikan menjadi puncak absorbsi tunggal dalam spektrum

NMR.(Bernasconi,1995)

Senyawa yang paling lazim dan paling berguna dipakai sebagai acuan adalah tetrametilsilana (TMS). Senyawa ini mempunyai beberapa kelebihan; lamban secara

Universitas Sumatera Utara

kimia, isotop magnet, serta larut dalam kebanyakan pelarut organik; TMS meberikan puncak serapan tajam tunggal serta menyerap pada medan lebih tinggi daripada semua proton organik. (Silverstein, 1974).

CH3 H3C

Si CH3

CH3

Pada

spektormetri

NMR

integrasi

sangat

penting.

Harga

integrasi

menunjukkan daerah atau luas puncak dari tiap-tiap proton. Sedangkan luas daerah atau luas puncak tersebut sesuai dengan jumlah proton. Dengan demikian perbandingan tiap integrasi proton sama dengan perbandingan jumlah proton dalam molekul. (Muldja, 1955) Di dalam medan magnet, perputaran elektron-elektron valensi dari proton menghasilkan medan magnet yang melawan medan magnet yang digunakan. Hingga setiap proton dalam molekul dilindungi dari medan magnet yang digunakan dan bahwa besarnya perlindungan ini tergantung pada kerapatan elektron yang mengelilingnya. Makin besar kerapatan elektron yang mengelilingi inti, maka makin besar pula medan yang dihasilkan yang melawan medan yang digunakan. Akibat secara keseluruhan adalah inti/proton merasakan adanya pengurangan medan yang mengenainya. (Sastrohamdijojo, 1991)

Universitas Sumatera Utara