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Coccidios
intestinales:
Los parsitos del Phylum Apicomplexa se caracterizan por presentar un complejo apical, conjunto formado por el conoide, anillo polar, roptrias, micronemas y microporos, cuya estructura se puede apreciar al microscopio electrnico.(Grfico 1) Son uninucleados, carecen de cilias y flagelos, se mueven por procesos de torsin u ondulaciones del cuerpo celular. Los protozoarios apicomplexa que tienen importancia en parasitologa humana son coccidios y comprenden principalmente organismos de los gneros Toxoplasma, Plasmodium, Cryptosporidium, Cyclospora, Isospora, Sarcocystis. Los ltimos cuatro gneros estn involucrados, a travs de diferentes especies, en parasitosis intestinales.
Grafico 1. Esquema de un trofozoto de un de un organismo del Phylum Apicomplexa Los coccidios son parsitos intracelulares durante la mayor parte de sus ciclos evolutivos y estn caracterizados por presentar dos tipos de reproduccin en esos ciclos: asexuada y sexuada. La reproduccin asexuada, esquizogonia o merogonia es siempre intracelular y comienza con la penetracin de un esporozoto (forma trofozotica) en la clula hospedadora. Se caracteriza por la fisin mltiple del ncleo y la posterior migracin de stos a la periferia del citoplasma, constituyendo el esquizonte inmaduro. Luego, cada ncleo se rodea de una porcin de citoplasma y se forma un nmero determinado de merozotos segn la especie (esquizonte maduro), los que se liberan al romperse la clula hospedadora. Los merozotos liberados penetran a nuevas clulas para repetir el proceso esquizognico. Algunos de estos merozotos inician la fase sexuada de reproduccin y evolucionan hacia la formacin de gametos (gametogonia). As se generan el macrogametocito femenino, precursor del microgameto, ovalado y relativamente inmvil dentro de la clula hospedadora, y el microgametocito masculino, precursor de un nmero variable de microgametos alargados, flagelados y mviles. La gamogonia o singamia o fertilizacin ocurre dentro de la clula en la que se encuentra el microgameto y as se forma el cigoto. Este segrega una membrana translcida envolvente y da origen al ooquiste, redondeado u ovalado.
El cigoto inicia luego la esporogonia. En cada gnero el ooquiste evolucionar de manera diferente hacia el ooquiste maduro con o sin esporoquistes conteniendo un nmero definido de esporozotos en su interior. Cuando el ooquiste o el esporoquiste (formas infectivas) ingresan al hospedador adecuado, se liberan los esporozotos y se reinicia el ciclo evolutivo. Criptosporidiosis: Los parsitos del gnero Cryptosporidium son zoonticos, intracelulares. Las principales especies que afectan al hombre son C. parvum y C. hominis, aunque en pacientes inmunocomprometidos se han registrado casos de infeccin por C. felis, C. meleagridis, C. canis, C. muris y C. baileyi. Entre las especies reconocidas se cuentan:
Especie C. parvum C. hominis C. muris C. canis C. wrairi C. baileyi C. meleagridis C. serpentis C. nasorum C. felis C. galli C. saurophilum C. molnari C. andersoni
Hospedador habitual humanos y bovinos humanos roedores y bovinos cnidos cobayos pollos aves de corral reptiles peces gatos pjaros reptiles peces bovinos
Ciclo evolutivo: Los organismos del gnero Cryptosporidium son monoxenos (completan todo su ciclo en un solo hospedador). Su ciclo es similar al que se describi para otros coccidios intestinales. El ooquiste esporulado constituye la forma infectiva, contiene en su interior 4 esporozotos, libres, sin esporoquistes, dentro de una pared de dos capas, y se elimina con las heces del hospedador, ya en forma infectiva, madura. Este ooquiste es esfrico y mide entre 4 y 6 de dimetro. El ciclo se inicia con la ingesta o segn algunos por aspiracin de estos ooquistes.(Grfico 2) La exquistacin es mediada por enzimas pancreticas y sales biliares, y potenciada por condiciones reductoras. La liberacin de esporozotos ocurre en el intestino delgado, invadiendo luego las clulas epiteliales del tracto gastrointestinal e incluso del respiratorio en ciertas circunstancias. El desenquistamiento puede ocurrir tambin en soluciones acuosas a temperaturas adecuadas, lo que permitira la infeccin o autoinfeccin en localizaciones extraintestinales como tracto respiratorio, vejiga, ovario, testculos, ganglios linfticos, tero, etc.
Grafico 2. Ciclo evolutivo de Cryptosporidium spp El extremo anterior de los esporozotos se adhiere a las clulas blanco hasta que las microvellosidades los rodean tal que el parsito queda con una localizacin intracelular, pero extracitoplsmtica, dentro de una vacuola parasitfora. Para su nutricin, crea un organoide de nutricin que se desarrolla entre el parsito y el citoplasma de la clula hospedadora. A nivel del contacto parsito hospedador la membrana se repliega varias veces aumentando as su capacidad de nutricin. Cada esporozoto en la vacuola parasitfora crece y, madura y se transforma en un trofozoto esfrico uninucleado de 2 a 2,5 de dimetro. Cada trofozoto sufre una reproduccin asexuada o esquizogonia dando origen a merozotos fusiformes de 2,5 por 0,4 constituyendo los merontes o esquizontes de primera generacin o de tipo I que contienen 6 u 8 merozotos en su interior. La clula hospedadora se destruye y se liberan los merozotos que pueden infectar a nuevas clulas epiteliales o enterocitos.(Foto 1,2,3) As se desarrollan nuevos esquizontes de tipo I o por el contrario pueden desarrollarse los de tipo II. Estos ltimos contienen en su interior 4 merozotos que al liberarse e infectar nuevos enterocitos llevan a cabo una reproduccin sexuada diferencindose en macro y microgametocitos .Estos maduran hacia los gametos femenino y masculino respectivamente. Cada microgametocito de 4 a 5 genera entre 14 y 16 microgametos sin flagelos que emergen de la clula
Manifestaciones
clnicas:
El periodo de incubacin de la criptosporidiosis suele ser de 7 a 10 das desde la ingestin de los quistes. En los inmunocompetentes el proceso es autolimitado, de una semana de duracin; excepcionalmente, puede prolongarse varias semanas y los sntomas ms frecuentes son nuseas, fiebre, dolor abdominal y diarrea acuosa de 2-10 deposiciones diarias. Las heces contienen principalmente agua y moco y poca
materia fecal, pero muy raramente sangre o leucocitos. Algunos pacientes slo presentan sntomas leves, mientras que otros requieren rehidratacin oral o parenteral y la diarrea persiste por encima de las cuatro semanas; esto ocurre especialmente en ancianos y en nios. Tambin se ha relacionado la infeccin por este parsito con infecciones pulmonares, sinusitis y laringotraquetis y con la enfermedad respiratoria que a menudo acompaa a la diarrea en nios malnutridos, as como con trastornos del crecimiento en las infecciones crnicas. En los inmunodeprimidos, la duracin y gravedad de la enfermedad diarreica depende del estado inmune del paciente. La infeccin puede ser asintomtica o manifestarse como diarrea aguda, intermitente o crnica, conduciendo incluso a la muerte en pacientes inmunodeprimidos graves. Los linfocitos CD4+ son mediadores inmunolgicos importantes en el control de la infeccin, y se ha demostrado experimentalmente la asociacin entre el dficit de estos linfocitos T y la persistencia de la infeccin. As, en enfermos de SIDA, se produce una infeccin crnica con la sintomatologa ya descrita, pero acompaada de malabsorcin y deshidratacin grave, con 5-20 deposiciones diarias y a veces prdida de hasta 20 litros al da. En ocasiones, la diarrea coleriforme se prolonga durante semanas o meses, provocando prdidas de peso de hasta el 50%. La persistencia de la diarrea por Cryptosporidium durante ms de 30 das en los pacientes infectados por el VIH es un criterio diagnstico de SIDA. En estos pacientes suele remitir el proceso si los CD4+ se elevan por encima de 200 linfocitos CD4+/mm3. Adems, en pacientes inmunocomprometidos, Cryptosporidium puede producir infecciones extraintestinales como las que afectan a la va biliar (dilatacin biliar intraheptica o extraheptica y colangitis esclerosante asociada al SIDA en enfermos con menos de 50 CD4+/ mm3). El mecanismo patognico por el que parasita la va biliar no es bien conocido. El reservorio biliar contribuye a la cronicidad de la infeccin y a la incapacidad de erradicar el microorganismo. En estos pacientes puede tambin producir hepatitis o pancreatitis aguda y afectacin respiratoria (laringotraquetis, sinusitis, tos o disnea del esfuerzo). El proceso puede remitir si los CD4+ se elevan por encima de 200 linfocitos CD4+/mm3. Adems, en torno al 25% de los casos, se asocia a una infeccin por microsporidios. La incidencia de esta enfermedad ha disminuido con la aparicin de los nuevos tratamientos antirretrovirales, ya que mejoran el estado inmunitario de estos enfermos. La capacidad de eliminar al parsito depende de la naturaleza del dficit inmune. Se ha descrito infecciones importantes por este parsito en casos de hipogammaglobulinemia congnita, deficiencia de IgA, infecciones virales, cncer, talasemia, diabetes mellitus dependiente de insulina, y en los transplantados. Prcticamente no existe una terapia medicamentosa exitosa para erradicar la infeccin.
Patogenia: La diarrea acuosa asociada con la criptoporidiosis ha sugerido la presencia de una enterotoxina, sin embargo no se ha identificado an ninguna. Existen evidencias experimentales que sugieren una disminucin de la absorcin de glucosa acoplada a Na+ y un aumento en la secrecin de Cl-. As la diarrea sera primariamente de naturaleza osmtica. Conjuntamente con la alteracin de la funcin del enterocito, existe un acortamiento de las vellosidades y una hiperplasia de las criptas. La parasitacin de las clulas intestinales por los criptosporidios y su ciclo biolgico, conduce a la muerte de las mismas, lo que dispara un aumento en la divisin celular en la regin de las criptas para reemplazar a las clulas daadas.(Foto 4) La combinacin de la destruccin de las clulas absortivas en el tope de las vellosidades y un incremento en la secrecin de cloruro en las criptas conduce a un incremento global de la secrecin. Adems se observa un aumento en la permeabilidad intracelular y procesos inflamatorios en la mucosa hasta la lmina propia. Este fenmeno puede contribuir tambin al proceso secretorio a travs de citoquinas y neurhormonas. Por ejemplo, los macrfagos al secretar el factor de necrosis tumoral (TNF- ) y otras citoquinas pueden estimular a los fibroblastos y otras clulas en la lmina propia para secretar prostaglandinas (PGE) y otros
Epidemiologa
prevencin:
La infeccin puede transmitirse de animal a persona, de persona a persona, a travs del agua y los alimentos contaminados con material fecal, o por contacto con superficies medioambientales contaminadas. La transmisin animal ha sido claramente documentada con los dos genotipos predominantes de C. parvum. Los grandes brotes se han asociado fundamentalmente al agua, ya sea aguas de bebida (corriente, lagos, arroyos) o por contacto con aguas de recreo. Se han demostrado pocos brotes por ingesta de alimentos y slo un brote en Maine, EEUU, fue definitivamente asociado con jugo fresco de manzana. En otros brotes alimenticios se ha implicado a los manipuladores de alimentos. La alta prevalencia de animales infectados aconseja prudencia en la ingesta de leche no pasteurizada, incluso en poblacin sana. Cryptosporidium hominis afecta nicamente al hombre y ha sido responsable de muchos brotes en todo el mundo, mientras que C. parvum es capaz de infectar tambin a todas las especies de mamferos, especialmente a animales recin nacidos; el genotipo 1 es el que ms se asla en humanos en la mayora de los estudios y se asocia a una mayor intensidad y duracin de la parasitosis. Otras especies de Cryptosporidium no se consideraban hasta hace poco patgenas para el hombre. Sin embargo, en los ltimos aos, se han descrito ms de 40 casos de infeccin por C. felis, C. meleagridis, C. canis, C. muris
y C. baileyi, todos ellos en pacientes infectados por el virus de la inmunodefieciencia humana (VIH). Las enfermedades transmitidas a travs del agua, como la criptosporidiosis, estn influenciadas por factores biolgicos, medioambientales y comunitarios. La elevada incidencia de la infeccin en la poblacin y en los animales, el alto porcentaje de excrecin de quistes y la estabilidad e infectividad de los mismos [dosis infectiva del 50% (ID50): 10-1042 ooquistes] son los factores biolgicos que contribuyen a la alta concentracin de parsitos en las aguas medioambientales y a la diseminacin de la enfermedad. La procedencia del agua es uno de los factores clave en la transmisin; as, por ejemplo, las aguas residuales y las que reciben heces de ganado tienen una concentracin diez a cien veces mayor de ooquistes. Las aguas de bebida de origen superficial son ms susceptibles de contaminacin que las profundas. Los factores climticos que se asocian a elevadas concentraciones de ooquistes en el agua son la temperatura (incrementan su supervivencia las bajas temperaturas) y las lluvias. El tipo de clima ha sido considerado, como un factor mayor en la transmisin de la criptosporidiosis. Se ha descrito relacin entre el incremento de lluvias torrenciales y la elevacin de la concentracin de ooquistes de Cryptosporidium y quistes de Giardia en aguas de ros. Existen numerosos reportes donde se pone de manifiesto el aumento significativo de nmero de casos de esta coccidiosis en las estaciones clidas. Las aguas de bebida responsables de estos brotes incluyen aguas superficiales (lagos, ros, arroyos), pozos y manantiales. Sin embargo, sucede que aunque en la mayora de los pases ocurren brotes, muy pocos han sido identificados como causados por Cryptosporidium. El mayor brote documentado es el de Milwaukee, EEUU, en 1993; la combinacin de una primavera muy lluviosa y el deshielo, con fallos en los procesos de floculacin y filtracin en una planta de tratamiento de aguas llevaron a la contaminacin del lago Michigan, provocando 403.000 casos aproximadamente y 67 muertes. La concentracin de ooquistes estimada fue de 6,7 a 13,2/100 L (se estudi a partir de los cubitos de hielo preparados con esa agua). Asociados a aguas de bebida se han descrito otros brotes en EEUU, Inglaterra, Canad, Japn y Brasil; en la India, Sudfrica y Mjico tambin se han demostrado brotes asociados significativamente a lluvias estacionales. Las prevalencias en nios son muy variables. Algunos trabajos indican que en pases industrializados es del orden del 2,2% y en los pases en desarrollo de 8,5%. Mediante estudios serolgicos se ha demostrado la presencia de anticuerpos en el 25-35% de los habitantes de los pases desarrollados y en el 60-75% de los de pases pobres. En los pacientes inmunocomprometidos, se han encontrado prevalencias del 6,6% en Europa, 22% en Congo, 48% en Uganda, 42% en Hait. Finalmente, entre los factores comunitarios, se incluyen los sistemas de distribucin de las aguas de bebida y de recreo, que condicionan la probabilidad de que los ooquistes se diseminen en el medio ambiente. Del tipo de tratamiento del agua potable (filtracin y desinfeccin) y de la precisin del mismo depender el impacto del patgeno en el agua. Brotes transmitidos por el agua se han descrito por todo el mundo. En general, puede decirse que las lluvias torrenciales son una importante variable en los brotes por aguas de bebida y los accidentes fecales en los brotes por aguas de recreo. Brotes importantes se han relacionado con piscinas y parques acuticos. En efecto, las aguas recreativas son frecuentemente origen de brotes, principalmente piscinas contaminadas accidentalmente por heces, pero tambin aguas de lagos probablemente contaminados de forma accidental por aguas fecales. De todo esto se deduce la importancia de controlar la presencia de quistes de Cryptosporidium en este tipo de agua. Los ooquistes permanecen viables en el ambiente durante meses y son muy resistentes a los desinfectantes. Slo se destruyen con formol al 10% con amonaco al 5-10% y temperaturas superiores a los 65C durante 30C o ms. Otras formas de tratamientos para su inactivacin son: clorinacin a razn de 80 ppm de cloro activo a 25C y ozonizacin a razn de 1 ppm durante 6-10 minutos. La filtracin con filtros con tamao de poro 1m o menos remueven la mayor parte de los ooquistes. En los pacientes inmunodeprimidos deben minimizarse los riesgos de contagio. La prevencin de la criptosporidiosis incluye la informacin sobre las distintas vas de transmisin de la infeccin y, adems, el consejo sobre la prctica de ciertas medidas preventivas como : hervir el agua al menos 1 minuto,
almacenarla en recipientes limpios y con tapa, evitar cualquier tipo de manipulacin del interior y la tapa, o filtrarla con filtros adecuados, no consumir cubitos de hielo fabricados con agua corriente, no beber directamente agua de ros, lagos, piscinas, parques acuticos, fuentes ornamentales y playas, incluso de agua salada, pelar la fruta y lavar con agua segura los vegetales que sern consumidos crudos. Otras medidas de prevencin son comunes a las de las otras parasitosis intestinales transmitidas por fecalismo. Es conveniente conocer que los productos lcteos pasteurizados aseguran la erradicacin total de Cryptosporidium, pues el calor destruye los ooquistes, y que las bebidas carbonatadas embotelladas o enlatadas, tales como gaseosas o cerveza, son, por lo general, calentadas o filtradas en forma suficiente durante su produccin, como para eliminar los ooquistes. Diagnstico de laboratorio:
El diagnstico de laboratorio de la criptosporidiosis requiere la obtencin correcta de las heces, siendo necesarias, generalmente, un mnimo de tres muestras para descartar la infeccin. Se recomienda efectuar una recleccin en fresco y otra seriada, como para otras protozoosis intestinales. Conviene recordar que el nmero de quistes suele estar relacionado con la consistencia de las heces: a ms diarrea ms ooquistes. En caso de diarrea acuosa es conveniente recoger las partes mucosas, que son especialmente ricas en quistes. Tambin pueden investigarse los quistes en biopsias gastrointestinales, en bilis o en muestras respiratorias. En los enfermos infectados por el VIH con diarrea, debe investigarse sistemticamente la presencia de Cryptosporidium. Puesto que los ooquistes eliminados en las muestras son infecciosos, se recomienda el uso de un fijador como el SAF (acetato de sodio, cido actico, formol) o el PVA (alcohol polivinlico), aunque este ltimo puede interferir en el mtodo de concentracin formol-ter y en ciertas tinciones. Para el resto de las muestras (biopsias, secreciones respiratorias y bilis), se aconseja una solucin salina formolada al 5 10%. Aunque el diagnstico de la criptosporidiosis puede realizarse tras la observacin microscpica directa en fresco de las heces, generalmente es necesario el uso de tcnicas de concentracin. Los mtodos de enriquecimiento por sedimentacin y por flotacin estn indicados para aumentar la sensibilidad de la deteccin. A partir del material enriquecido se realiza el examen microscpico en preparaciones hmedas con o sin lugol (Fotos 5, 6) y tinciones como Kinyoun, Ziehl Neelsen modificados, safranina y otras variantes para organismo cido-alcohol-resistentes (Fotos 7,8) o inmunofluorescencia (IF).(Foto 11) Las tinciones con fluorocromos (auramina-rodamina) requieren confirmacin mediante una tincin de ZiehlNeelsen modificada.
Foto 8. Ooquistes de Cryptosporidium spp. Coloracin de Ziehl Neelsen modificada. Ntese la variabilidad de la coloracin y la presencia de fantasmas
Los ooquistes de Cryptosporidium son esfricos, miden entre 4-6 m, contienen cuatro esporozoitos y en la observacin en fresco con lugol permanecen incoloros, caracterstica que los diferencia de las levaduras. Las tinciones cido-resistentes son las de referencia para la identificacin de los ooquistes, empleando como decolorante cido sulfrico o clorhdrico durante breves segundos. Es importante tener en cuenta que en las tinciones cido-resistentes los ooquistes pueden confundirse con ciertos artefactos, de diferentes tamaos y teidos intensamente de rojo de manera uniforme, que aparecen en ocasiones.(Foto 9). Es tambin importante sealar que muchos de los ooquistes excretados no presenta cido-resistencia. Los verdaderos ooquistes de Cryptosporidium toman la tincin irregularmente, de forma que al microscopio se observan quistes teidos de rojo, otros de rosa y el resto sin teir (formas "fantasma"). (Fotos 7,8) .Algunos aconsejan un tratamiento previo a la tincin, con agua oxigenada (concentracin final de 5 volmenes) durante 10 minutos para aumentar la capacidad de tomar la coloracin por parte de los ooquistes. La coloracin tricrmica no es recomendable para la tincin de estos parsitos.(Foto 10)
Foto 9. Artefacto coloreado con coloracin de Ziehl Neelsen modificada Ntese la homogeneidad de la coloracin
Cuando se realiza el diagnstico mediante la microscopa ptica, debe informarse el hallazgo de ooquistes de Cryptosporidium spp, pues morfolgica y tintorialmente las especies que con ms frecuencia afectan al hombre, C hominis y C. parvum, son indistinguibles. La viabilidad de los ooquistes puede determinarse con el empleo del colorante DAPI (diamidino-fenilindol). Las tcnicas de deteccin de Cryptosporidium mediante inmunoensayos son ms sensibles y especficas que la microscopa, aunque ms costosas. Las tcnicas de IF alcanzan hasta un 100% de sensibilidad y de especificidad y el lmite de deteccin son 10.000 ooquistes/g de heces diarreicas o 50.000/g de heces consistentes. Las de enzimoinmunoanlisis, alcanzan del 66,3 al 100% de sensibilidad y del 93 al 100% de especificidad. Algunas de estas tcnicas, particularmente las que combinan la identificacin de Cryptosporidium y G. lamblia, pueden resultar de gran utilidad en los laboratorios. Finalmente, las tcnicas de biologa molecular son mucho ms sensibles que las precedentes (hasta 1-10 ooquistes/g de heces, segn algunos estudios), y especficas. Permiten identificar especies y genotipos, cuantificar , analizar tejidos, realizar estudios retrospectivos sobre muestras de archivo y, sobre todo, caracterizar brotes epidmicos, pero an, no son tcnicas prcticas para el diagnstico clnico por su complejidad y el requerimiento de equipamiento especial. Se han empleado mtodos de hibridacin con sondas de DNA y de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de diversos fragmentos de cidos nucleicos, como 18S rRNA, los genes HSP70, COWP (codifica la protena externa de membrana) y TRAPC1(codifica la thrombospondin-related adhesive protein C1) y tcnicas de RAPD (random amplification of polymorphic DNA fragments).
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Protozoarios Intestinales
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Isosporiosis Isospora belli es un protozoo coccidio taxonmicamente relacionado con los gneros Cryptosporidium, Cyclospora y Toxoplasma pertenecientes al phylum Apicomplexa. Fue descrito por primera vez en 1860 por Virchow, pero no fue denominado como tal hasta 1923. Es la nica especie de Isospora que parasita al hombre, puesto que la especie inicialmente descrita como Isospora hominis es actualmente una especie del gnero Sarcocystis. En los inmunocompetentes la infeccin se autolimita, pero en inmunocomprometidos, el cuadro diarreico que produce puede ser grave. Ha sido tambin implicado como agente etiolgico en la diarrea del viajero. El hombre es el nico hospedador conocido de I. belli, aunque se desconoce si algunos animales podran actuar como hospedadores paratnicos o de transporte, lo que explicara su transmisin por un mecanismo distinto a la contaminacin fecal del agua o alimentos en reas con adecuadas condiciones sanitarias. Los quistes son muy resistentes a las condiciones medioambientales, pudiendo permanecer viables durante meses en ambientes frescos y hmedos. Tambin ha sido descrita la transmisin sexual como consecuencia de prcticas de sexo oral. Ciclo biolgico:
La infeccin se adquiere por ingestin del ooquiste esporulado maduro a partir de agua o alimentos contaminados. El ooquiste se exquista liberando esporozotos en el intestino delgado que penetran a travs de las clulas epiteliales de la mucosa intestinal del duodeno distal y de los enterocitos del yeyuno proximal donde se desarrollan en trofozotos. (Foto 12) En el interior de esas clulas se desarrolla tanto la reproduccin asexuada como la sexuada. Los trofozotos por divisin nuclear dan lugar a esquizontes y luego se liberarn los trofozotos (merozotos) por ruptura de la clula hospedadora. Estos merozotos invadirn nuevas clulas repitiendo el ciclo esquizognico de multiplicacin asexual.
Foto 12. Isospora belli en corte de intestino delgado Algunos merozotos estn determinados para sufrir una fase de desarrollo sexual dando micro y macrogametocitos que producirn microgametos flagelados (masculinos) y microgametos (femeninos), que por fusin darn lugar al cigoto, que luego derivar en ooquiste. Esta fase se denomina gamogonia. Los ooquistes formados son eliminados a travs de las heces (Foto 13), madurando en el exterior en 2-3 das.(Fotos 14,15) La fase exgena del ciclo de vida de los coccidios se denomina esporogonia y corresponde a la produccin de esporozotos infectivos en el interior de los esporoquistes del ooquiste. El ooquiste maduro contiene 2 esporoquistes con cuatro esporozotos cada uno. (Relacin 1:2:4)(Grfico 4)
Foto 15. Ooquiste maduro con 2 esporoquistes con 4esporozotos de I. belli. Preparacin hmeda Foto 14. Ooquiste inmaduro con 2 esporoblastos de I. belli. Preparacin hmeda
Manifestaciones
clnicas:
La sintomatologa de la infeccin por I. belli aparece aproximadamente una semana despus de la ingestin de los ooquistes. Se caracteriza por diarrea acuosa y voluminosa, dolor abdominal, meteorismo, nuseas, vmitos, febrculas en los primeros das, prdida de peso y deshidratacin, observndose en alrededor del 50% de los pacientes, eosinofilia perifrica del orden del 15 % o mayor an. Esta es la nica protozoosis intestinal con esta manifestacin sangunea. La intensidad y gravedad de los sntomas depender del estado inmunolgico del paciente En pacientes inmunocompetentes el sntoma principal es una diarrea intensa con 6 a 10 deposiciones acuosas diarias acompaadas de malabsorcin, sin sangre ni leucocitos. Las heces pueden llegar a ser tambin lientricas y pastosas segn el grado de malabsorcin. Clnicamente la parasitosis es difcil de distinguir de criptosporidiosis y microsporidiosis. La enfermedad se autolimita en un perodo de 2-3 semanas, si bien la eliminacin de ooquistes puede persistir durante 2-3 semanas ms. Se han descrito formas crnicas con eliminacin de ooquistes durante meses, siendo comunes las recurrencias. La enfermedad es ms grave en nios y adolescentes. Los pacientes inmunodeprimidos, especialmente pacientes con SIDA, presentan sntomas graves que pueden persistir durante meses o indefinidamente y producir deshidratacin, requiriendo incluso hospitalizacin. En pacientes con diarrea crnica por isosporosis de ms de un mes de duracin, debe sospecharse una alteracin en el estado inmunolgico, por ejemplo por infeccin con HIV. Hay dolor abdominal severo y la anorexia y la prdida ponderal son muy acentuadas. En pacientes con SIDA se han documentado infecciones extraintestinales, se han descrito colangiopata y colecistitis acalculosa por I. belli, como se ha registrado en otras coccidiosis intestinales y en microsporidiosis. Patologa: Los parsitos se localizan dentro de las clulas epiteliales del intestino delgado (Foto 12), a las cuales destruyen, con produccin de reaccin inflamatoria y abundantes eosinfilos. La invasin puede incluso llegar a la lmina propia y al intestino grueso. En pacientes inmunocomprometidos, las lesiones intestinales son ms intensas y de mayor duracin, encontrndose en algunos casos al parsito dentro de los vasos linfticos. Dentro de los enterocitos se encuentran merozotos, gametocitos, y ooquistes en desarrollo. La mucosa intestinal puede aplanarse con hipertrofia de las criptas y sufrir algn grado de necrosis. Los mecanismos ntimos por los que Isospora provoca el dao no se conocen y aparentemente la invasin celular desencadenara los procesos inflamatorios por mediadores celulares ms que por la existencia de toxinas propias del parsito. En este contexto los eosinfilos tendran una participacin activa. Diagnstico: El examen directo de las heces frescas o concentradas es el mtodo de deteccin de la infeccin por I. belli, puesto que los ooquistes son visibles al microscopio ptico sin teir. Es frecuente la aparicin en materia fecal de cristales de Charcot-Leyden, producto de la degradacin de los eosinfilos.(Foto 18).
Foto 18. Cristal de Charcot Leyden Los coccidios se identifican a nivel de especie por la estructura de su ooquiste esporulado. En las heces recin emitidas los ooquistes inmaduros de I. belli son ovalados, de 20-33 por 10-19 y, generalmente, contienen uno o dos esporobalstos inmaduros. (Fotos 14,15) . El ooquiste maduro, que a su vez incluye dos esporoquistes con cuatro esporozotos cada uno, aunque se desarrolla en el medio externo, puede ocasionalmente observarse en las heces si no se mantuvieron con un conservante adecuado, siendo la forma infecciosa para el hombre.(Foto 15) Los mtodos de concentracin son ms sensibles que los exmenes directos sobre heces frescas, siendo los mtodos de flotacin de Sheather (sacarosa) o Flleborn Sulfato de zinc), o Willis (cloruro de sodio), excelentes para la deteccin de I. belli. Algunos conservantes como el alcohol polivinlico pueden deformar la pared del ooquiste siendo difcil de observar su estructura. Los mtodos de tincin sobre frotis de muestras concentradas pueden ayudar a la deteccin de los ooquistes de I. belli. Los ooquistes son Acido-alcohol resistentes. La tincin de cido-alcohol resistencia modificada (Ziehl-Neelsen modificado, Kinyoun) tie los ooquistes de rosa y los esporoblastos de rojo. (Fotos 16,17) Los ooquistes tambin se tien mediante el mtodo de la auramina-rodamina, apareciendo fluorescentes. Con la tincin de Giemsa los ooquistes y esporoblastos se tien de azul mientras que la tincin tricrmica es de poca utilidad para identificar I. belli. De todas formas los ooquistes se ven bien en los preparados hmedos, sin coloracin.
Foto 16. Ooquiste inmaduro con un esporoblasto de I. belli. Coloracin cido alcohol resistente
Los aspirados duodenales y las muestras de biopsia de intestino delgado pueden utilizarse cuando existe sospecha de infeccin por I. belli y los exmenes de las heces no detectan la presencia del protozoario. Los ooquistes de I. belli se observan en los aspirados duodenales, mientras que en las muestras de biopsia pueden identificarse distintas fases de desarrollo del parsito mediante tinciones histolgicas, o bien observarse lesiones caractersticas. (Foto12) Los principales cambios microscpios son la atrofia de las vellosidades y la hiperplasia de las criptas, pudiendo existir gran nmero de eosinfilos en la lmina propia, junto con clulas plasmticas, linfocitos y leucocitos polimorfonucleares. No existen pruebas serolgicas disponibles para diagnosticar la infeccin. La diferenciacin microscpica entre I. belli y Cryptosporidium resulta sencilla, ya que los ooquistes de I. belli son ovalados, de mayor tamao y contienen generalmente dos esporoblastos, mientras que los de Cryptosporidium spp. aparecen como formaciones redondeadas (4) con cuatro esporozotos. La diferenciacin con ooquistes de Sarcocystis spp. tambin es muy sencilla ya que, aunque los ooquistes son ovalados y contienen dos esporoquistes en su interior, es muy frecuente que stos sean liberados del ooquiste, apareciendo como estructuras libres aisladas. Estas estructuras son de mayor tamao que los
ooquistes de Cryptosporidium spp., por lo que es rara la confusin entre ellos. Los ooquistes de Cyclospora cayetanensis son redondeados, con un tamao que duplica al de los de Cryptosporidium spp y al momento de su eliminacin con las heces no estn esporulados.(Foto 27)
Foto 27. Los tres coccidios que afectan ms frecuentemente a los humanos, en frotis con tincin cidoresistente (A, C y F), en campo brillante con contraste diferencial de fases (B, D y G) y con epifluorescencia (E y H).
Epidemiologa
prevencin:
Las infecciones por I. belli, aunque de distribucin cosmopolita, son ms frecuentes en regiones tropicales y subtropicales, especialmente en Hait, Mxico, Brasil, El Salvador, Africa tropical y sureste asitico y se han asociado con brotes diarreicos en instituciones cerradas, inmigrantes y pacientes infectados por el VIH. El nmero de casos de isosporiosis descritos ha aumentado en los ltimos aos, coincidiendo con el aumento de casos de SIDA, pasando de ser una parasitosis rara a considerarse causa frecuente de diarrea en inmunodeprimidos. La incidencia de infeccin por I. belli vara de un 0,2-3% en pacientes con SIDA en EEUU a un 8-20% en Africa. Entre los pacientes con SIDA en EEUU la isosporiosis parece estar relacionada con viajes y/o inmigracin reciente de pases de alta prevalencia. El contagio se produce principalmente por la ingesta de agua o alimentos contaminados o por persona a persona por contaminacin fecal. La prevencin se basa en todas las medidas generales aplicables a las enfermedades de transmisin fecal. Las frecuentes recadas en casos de SIDA se previenen con trimetoprim.-sulfametoxazol (TMS)
Ciclosporosis
Cyclospora cayetanensis es un coccidio intestinal denominado anteriormente Cianobacterium like body (CLB) u organismo semejante a las algas verdosas. Las primeras observaciones en humanos datan de 1977, pero recin en 1993 Ortega y colaboradores le dieron la denominacin actual. Se lo considera un parsito patgeno emergente, de distribucin cosmopolita, que afecta tanto a individuos inmunocompetentes como inmunocomprometidos, de todas las edades. Se han reportado casos de ciclosporosis en todo el mundo, pero es endmica en reas de Per, Nepal, Guatemala, Hait, etc. Produce diarreas acuosas, voluminosas y prolongadas como los coccidios intestinales Isospora belli y Cryptosporidium spp. El hombre es el nico husped susceptible y en el que se lleva a cabo todo el ciclo evolutivo. Ciclo biolgico: Como todos los coccidios, C. cayetanensis presenta ciclos de reproduccin asexuada y sexuada, que se desarrollan en vacuolas parasitforas dentro de los enterocitos del intestino delgado. (Grfico 5)Como producto de reproduccin sexuada se forman ooquistes que se eliminan inmaduros con las heces. Estos ooquistes son esfricos, hialinos, no refrctiles y miden de 8 a 10 de dimetro. Una vez en el exterior sufren un proceso de maduracin o esporulacin transformndose en infectivos al cabo de 5 a 13 das segn las condiciones ambientales. Los ooquistes maduros contienen 2 esporoquistes con 2 esporozotos cada uno (1:2:2). Los esproquistes miden 3,4 x 6,3 y los esporozotos de su interior, 1,2 de ancho por 9 de longitud y presentan un complejo apical constituido por roptrias y micronemas.
Tanto los ooquistes inmaduros como los inmaduros presentan una envoltura fibrilar de 63 nm de espesor, por debajo de la cual se localiza una pared de 50 nm de espesor. Manifestaciones clnicas:
Producida la infeccin, el perodo de incubacin vara entre 1 a 11 das. La infeccin puede cursar en forma asintomtica o sintomtica. Los sntomas incluyen diarrea acuosa y profusa con un promedio de 7 deposiciones diarias, acompaada de dolor abdominal, nuseas, vmitos, fatiga, astenia, fiebre y prdida del apetito. Estos sntomas, as como la infeccin se autolimitan luego de aproximadamente 50 das en pacientes inmunocompetentes. Se han observado recidivas en algunos de ellos. La resolucin de los sntomas se produce de forma abrupta y se asocia con la desaparicin de los ooquistes fecales En inmunocomprometidos, al igual que en otras coccidiosis intestinales, la sintomatologa mencionada suele ser ms prolongada, insidiosa, con tendencia a la cronificacin y muy severa, producindose malabsorcin y significativa prdida ponderal. Patologa y patogenia: En el duodeno, localizacin habitual d este protozoario, se observa por endoscopa, eritema e inflamacin.(Foto 19) Las biopsias muestran un aplanamiento de las vellosidades con hiperplasia de las criptas Este compromiso del intestino delgado proximal produce defectos de absorcin. Se han reportado casos de presencia de ooquistes de Cyclospora en esputo y en heces en forma concomitante, lo que sugerira la posibilidad de diseminacin broncopulmonar. Aunque C. cayetanensis es un patgeno intestinal primario, tambin ha sido relacionado con la produccin de colecistitis alitisica en pacientes infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana, y con los sndromes de Reiter y de Guillain-Barr.
Foto 19. Cyclospora cayetanensis en corte de intestino delgado An no se ha establecido fehacientemente la patogenia del dao intestinal, pero se ha propuesto una cascada de sucesos que se desarrollan cuando los parsitos intracelulares obligados invaden a los enterocitos. Luego de que los esporozotos ingresan en los enterocitos, stos liberan citoquinas (IL-8) que activan a fagotitos locales; stos atraen y reclutan a otros fagotitos desde el torrente sanguneo hacia la lmina propia. Los leucocitos activados liberan factores solubles que incrementan la secrecin intestinal de cloruros y agua e inhiben su absorcin. Algunos mediadores, como la histamina, la serotonina y la adenosina, afectan la secrecin y absorcin porque actan de manera indirecta sobre las clulas epiteliales. Adems, el factor activador de plaquetas, prostaglandinas y leucotrienos ejercen su accin sobre los nervios entricos, que inducen secrecin intestinal mediada por neurotransmisores. Por otra parte, la invasin, multiplicacin y liberacin de los parsitos daan directamente a los enterocitos al someterlos a la lisis
celular. En forma adicional, los linfocitos T activados afectan el crecimiento de las clulas epiteliales y producen atrofia de las vellosidades e hiperplasia de las criptas, sucesos que llevan, por un lado, al aumento del peristaltismo y, por otro, a la disminucin de la absorcin de los nutrientes. Diagnstico: El estado diagnstico es el ooquiste inmaduro, no esporulado que se elimina con las heces. El examen microscpico en fresco a partir de heces no conservadas permite la observacin de estructuras esfricas de 8-10 , hialinas, no refrctiles, que contienen una mrula de color verdoso, de aproximadamente 6-7 de dimetro, con varios glbulos, de aspecto lipdico, de unos 2 , dispuestos en racimo o roseta.(Foto 20,22) La morfologa interna es observable slo en las heces recin emitidas, y se conserva nicamente manteniendo las heces en agua, ya que la adicin de conservantes provoca la coalescencia de los glbulos intramorulares y da lugar a un nmero variable de cuerpos irregulares mal definidos.
Se pueden buscar los ooquistes en preparaciones hmedas, previo enriquecimiento.. Son impermeables al Lugol, pero pueden efectuarse tinciones como la de Ziehl Neelsen u otras de fundamento similar. En este caso aparecen como esferas cido alcohol resistentes variables, coloreadas desde rojo intenso a plido, con un aspecto vidriado. (Fotos 24,25)). Este ooquiste inmaduro debe ser diferenciado de los de otros coccidios intestinales, fundamentalmente por su forma y tamao, ya que comparten comportamientos tintoreales semejantes siendo cido- alcohol- resistentes.
Foto 25. Ooquistes de Cyclospora cayetanensis. Ntese la variabilidad en la coloracin cido alcohol resistente.
Los ooquistes de C. cayetanensis son esfricos y miden 8-10 de dimetro, los de Cryptosporidium spp, esfricos de 4 de dimetro y los de I. belli son elipsoidales de 20-33 por 10-19 .(Foto 27) Para el diagnstico puede aprovecharse otra caracterstica particular del parsito como es su capacidad de autofluorescer, observndose a los ooquistes de color azul brillante cuando los preparados hmedos se exponen a la luz UV con filtros de excitacin en el rango de 330 a 380 nm. (Foto 26) o verdes con filtros de 450 a 490 nm
Foto 26. Ooquistes de Cyclospora cayetanensis. Epifuorescencia Los ooquistes inmaduros pueden madurarse in vitro incubando una muestra en fresco en solucin de dicromato de potasio al 2,5 5 % a temperatura ambiente durante 5 a 15 das a 25-37C, luego de lo cual aparecern los ooquistes con dos esporoquistes conteniendo dos esporozotos en cada uno de ellos.(Fotos 21,23)
Foto 23. Ooquiste maduro de Cyclospora cayetanensis .Contraste de fase Foto 21. Ooquiste maduro de Cyclospora cayetanensis .Preparacin hmeda
Tambin puede efectuarse una reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) para C. cayetanensis, mtodo
que puede aplicarse tanto a muestras de materia fecal como de aguas contaminadas con el parsito. Epidemiologa: Como todas las parasitosis de transmisin fecal-oral, la ciclosporosis es ms frecuente en los pases subdesarrollados y en reas con deficiente saneamiento ambiental, mala higiene y hacinamiento. Se ha descrito en la mayora de los pases latinoamericanos y la prevalencia en la poblacin vara desde 2% hasta 20%, segn los grupos estudiados. La mayora de los casos se presentan despus de las pocas lluviosas y en los meses ms clidos. Se han registrado brotes epidmicos en personas que han consumido alimentos crudos, especialmente frutas y verduras y aguas no tratadas. Es probable que los insectos acten como vectores mecnicos. En los pases desarrollados se han registrado casos de viajeros que regresan de zonas endmicas y se han descrito numerosos brotes epidmicos en Estados Unidos y Canad por el consumo de frambuesas importadas de Guatemala. La dosis infectiva no se conoce exactamente, pero extrapolando del conocimiento de algunos brotes epidmicos y del comportamiento comparativo con otros coccidios intestinales, se supone que es baja. El contagio se produce por va oral mediante la ingesta de ooquistes maduros, provenientes de frutas o verduras, as como de agua de bebida contaminadas. Las medidas de prevencin se incluyen en las generales para otros parsitos intestinales de transmisin fecal-oral.
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Protozoarios Intestinales
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Sarcocistosis: Esta parasitosis, tambin llamada sarcosporidiosis, es una zoonosis producida por varias especies del gnero Sarcocystis, principalmente S. suihominis y S. bovihominis (antes denominadas Isospora hominis). Estos coccidios son capaces de realizar parte de su ciclo evolutivo en el tracto intestinal del husped humano. Durante la infeccin actan dos tipos de hospedadores, el intermediario y el definitivo. Este ltimo, un carnvoro, es el depredador de aqul. En el caso de la infeccin por S. suihominis o S. bovihominis, el hombre acta como hospedador definitivo (en l se desarrolla el ciclo de reproduccin sexuada) y el cerdo y el ganado bovino respectivamente, como intermediarios (fase de reproduccin asexuada). El hombre acta como husped intermediario en el caso de contagiarse con S. lindemani (grupo de especies an no completamente clasificadas), en cuyo caso los huspedes definitivos son felinos o cnidos. El parsito tiene caractersticas similares a Toxoplasma gondii. Posee anillos polares y apicales, conoide, roptrias, micronemas, microporos y mitocondrias. Los estados de desarrollo de Sarcocystis en orden secuencial son: esporozoto, esquizonte, merozoto, gametocito, gameto, ooquiste y nuevamente esporozoto.
La forma infectiva para el husped intermediario, cerdo o vaca, es el ooquiste maduro que contiene los 2 esporoquistes con 4 esporozotos en su interior (1:2:4). La forma infectiva para el husped definitivo es un quiste denominado sarcoquiste localizado en el msculo esqueltico del cerdo o los bovinos, segn la especie, y que contiene decenas de cientos de merozotos. Ciclo biolgico:
El husped definitivo, carnvoro, se infecta al ingerir carne cruda o poco cocida de de un animal que sus msculos alberga a los sarcoquistes. Al pasar por el estmago, se destruye la pared qustica y los merozotos liberados llegan al duodeno. A lo largo del intestino delgado, los merozotos penetran las vellosidades intestinales, en particular a nivel de la lmina propia, se introducen en las clulas del husped. Dentro de cada clula, el merozoto sufre una diferenciacin biolgica para transformarse en una clula con carcter sexual, el macro o el microgametocito. Se ha observado que 6 horas despus de la ingestin tiene lugar esta diferenciacin. El microgametocito tiene forma ovoide y mide 7 x 5 . El macrogametocito tiene forma similar, pero su tamao es mayor, 10 a 20 de dimetro. El microgametocito sufre varias divisiones y produce una clula con ms de 16 ncleos, que se dirigen a la periferia de la clula y finalmente se liberan para dar lugar a tantos microgametos como ncleos. Mientras tanto el microgametocito se transforma en microgameto maduro. Todos estos procesos ocurren en el interior de las clulas del tejido subepitelial del intestino del husped. Al salir de esa clula, el microgameto, penetra otra clula y, si encuentra en su interior a un microgameto, lo fecunda, generndose un cigoto. Este se rodea de una pared, formando as el ooquiste. Estos procesos de gametogonia y fecundacin transcurren en alrededor de 24 horas. Cada ooquiste sale de la clula husped y recorre la luz del intestino. En el trayecto se forman en su interior dos esporoquistes con 4 esporozotos cada uno. La mayora de las veces, la pared del ooquistes se desintegra en el intestino grueso, eliminndose con las heces algunos ooquistes intactos y principalmente esporoquistes libres, que pueden contaminar aguas y alimentos. El perodo prepatente abarca alrededor de 7 a 14 das, despus de la ingesta de carnes con sarcoquistes. El husped intermediario se infecta por la ingesta de los esporoquistes, que al pasar por el estmago pierden su pared y en el duodeno, los esporozotos penetran en la mucosa y por va sangunea alcanzan la microcirculacin de diversos rganos. A continuacin se introducen en las clulas endoteliales en donde se multiplican rpidamente, hasta ocuparlas completamente y destruirlas, parasitando sucesivamente nuevas clulas endoteliales. As se llevan a cabo varios ciclos de reproduccin asexuada. Posteriormente y debido probablemente al desarrollo de inmunidad por parte del husped, los trofozotos resultantes se distribuyen en el interior de la musculatura estriada, cardaca y sistema nervioso, procediendo ahora a multiplicarse lentamente dentro de una vacuola parasitfora, constituyendo quistes hsticos con cientos o miles de trofozotos en su interior. Estas estructuras qusticas tienen pared propia, son esferoidales o fusiformes, miden desde 30 hasta 130 de largo y estn provistos de una cpsula que posee digitaciones externas y tabicaciones parciales internas entre las cuales se ubican los parsitos.(Foto 28) Se cree que estos quistes msticos tienen una vida media de seis meses.
Foto 28. Sarcoquiste en msculo. En el ciclo silvestre actan el depredador y la presa; en el caso del ser humano, el contagio se produce con la ingesta de carne vacuna o porcina cruda o insuficientemente cocida, cerrndose el ciclo.(Grfico 6)
Cuadro
clnico:
En la gran mayora de los casos sintomticos, se observa un sndrome gastrointestinal agudo, inespecfico y de corta duracin, por lo cual muchas veces no se alcanza a precisar la etiologa del cuadro actual. Luego de un perodo de incubacin de 6 a 24 horas, se inicia un cuadro de intensidad variable con el nmero de organismos infectantes presentes, consistente en dolor abdominal, meteorismo, vmitos, diarrea acuosa, fiebre moderada y sudoracin. Ocasionalmente puede presentarse deshidratacin e hipotensin arterial. El perodo de estado dura entre12 y 24 horas, para luego ir declinando la sintomatologa en forma paulatina y espontnea. Algunos pacientes presentan en las dos o tres semanas posteriores, episodios de diarrea leve que coinciden con el perodo de mxima excrecin de parsitos con las heces. Patogenia: Los mecanismos que influyen ara provocar la enfermedad an no han sido dilucidados completamente. Cuando el hombre acta como husped definitivo, el parsito se localiza en el intestino delgado, a nivel de la lmina propia. El resultado de la reproduccin parasitaria es la secrecin o excrecin (o ambas) de
sustancias resultantes del metabolismo de Sarcocysti,s que induce a su vez la liberacin de mediadores de la inflamacin. En consecuencia se produce enteritis con presencia de eosinfilos y polimorfonucleares. Hay necrosis por mecanismos an desconocidos, tal vez por una reaccin inmunitaria. Estos fenmenos son los desencadenantes del dolor abdominal, meteorismo y diarrea. Diagnstico: Para la sarcocistosis intestinal son de utilidad los exmenes coproparasitolgicos, empleando tcnicas de enriquecimientote materia fecal, especialmente los de flotacin. Se observan esporoquistes (Foto 31) y con menor frecuencia, ooquistes en las preparaciones fecales (Fotos 29,30) La eliminacin de estos elementos parasitarios persiste por meses despus de la infeccin. En el diagnstico es importante tener en cuenta los antecedentes de consumo de carnes vacuna o porcina con deficiente coccin o cruda.
Foto 29. Ooquiste maduro de Sarcocystis spp. Preparacin hmeda Foto 30. Ooquiste maduro de Sarcocystis spp
Epidemiologa y prevencin:
A nivel mundial, la prevalencia de sarcocistosis intestinal humana no ha sido estudiada en forma sistemtica puesto que en general cursan forma subclnica u oligosintomtica, por lo que evidentemente existe un subregistro.En estudios realizadis en el Tibet se observ una frecuencia de 21,8% para S. suihominis y del 7% para S. bovihominis, en tanto en Laos la frecuencia para el ltimo fue de 10%. En general no hubo diferencias con respecto al sexo y la presentacin fue ms frecuente en adultos. La frecuencia de la infeccin por S. suihominis debera ser, como en el caso de triquinosis, mayor en climas y
estaciones fros, ya que en estas circunstancias es mayor el consumo de carne porcina. Anlisis efectuados en ganado han determinado elevadas frecuencias de sarcocistosis muscular, aunque son varias las especies que la producen y algunas no dan infeccin humana. Los esporoquistes y ooquistes que no son infectantes para el hombre, pero s para los huspedes intermediarios, son capaces de permanecer viables por varios meses en el ambiente, mientras no se expongan a la desecacin, la luz UV o temperaturas extremas. Los quistes titulares resisten aproximadamente 18 das en condiciones de refrigeracin (2C), pero son destruidos por congelamiento a -20C o por coccin a temperatura mayores de 60C durante 1 minuto. Para la prevencin es muy importante el cocimiento completo de las carnes vacuna y de cerdo con la finalidad de eliminar los sarcoquistes (15 minutos a 60C). Es importante la adecuada eliminacin de excretas pues la materia fecal humana puede ser fuente de contaminacin con esporoquistes y ooquistes que infectan a los huspedes intermediarios y as mantener el ciclo evolutivo de esta parasitosis.
Tinciones
especiales modificado:
Etanol al 50%. Guardar a temperatura ambiente. Carbofucsina de Kinyoun: 1. Disolver 4g de fucsina bsica en 20ml de etanol al 95% (Solucin A). 2. Disolver 8g de cristales de fenol en 100ml de agua destilada (Solucin B). 3. Mezclar las soluciones A y B. 4. Guardar a temperatura ambiente. Estable 1 ao. Solucin de cido sulfrico al 1% 1. Agregar 1ml de cido sulfrico concentrado a 99ml de agua destilada. 2. Conservar a temperatura ambiente. Estable 1 ao. Azul de metileno alcalino de Leffler 1. Disolver 0,3g de azul de metileno en 30ml de etanol al 95%. 2. Agregar 100ml de solucin de KOH diludo (0,01%) 3. Conservar a temperatura ambiente. Estable 1 ao.
Procedimiento: 1. Efectuar extendidos en portaobjetos comunes con una gota de la muestra (que no sea demasiado grueso, debe poder verse a su travs antes de que se seque.) 2. Fijar con metanol absoluto 1 minuto. 3. Cubrir el extendido con solucin de carbofucsina de Kinyoun y dejar 5 minutos en contacto. 4. Lavar el preparado brevemente (3-5 segundos) con etanol al 50% 5. Lavar con agua. Escurrir. 6. Decolorar con solucin de cido sulfrico al 1% durante 2 minutos o hasta que no salga color del preparado. 7. Lavar con agua. Escurrir.
8. Colorear con el contracolorante azul de metileno alcalino durante 1 minuto. 9. Lavar con agua. Secar al aire. 10. Examinar al microscopio. Para poder observar la estructura de los ooquistes, observar por inmersin a 1000X. Ziehl Neelsen modificado: Reactivos:
Carbofucsina: 1. Solucin A: Disolver 0,3g de fucsina bsica en 10ml de etanol al 95% 2. Solucin B: Disolver 5g de cristales de fenol en 100ml de agua destilada (A veces se requiere un calentamiento suave). 3. Mezclar las soluciones A y B. 4. Conservar a temperatura ambiente. Estable 1 ao. Solucin de cido sulfrico al 5%. 1. Agregar 5ml de cido sulfrico concentrado a 95ml de agua destilada. 2. Conservar a temperatura ambiente. Estable 1 ao. Azul de metileno: 1. Disolver 0,3g de azul de metileno en 100ml de agua destilada. 2. Conservar a temperatura ambiente. Estable 1 ao.
Procedimiento: 1. Preparar dos extendidos con dos gotas de la muestra en un portaobjetos y dejar secar al aire. 2. Calentar en una placa caliente (70C) durante 5 minutos. 3. Retirar y cubrir con carbofucsina. Con un hisopo encendido calentar hasta la emisin de vapores blancos. No llegar a ebullicin. 4. Dejar 5 minutos colorendose sin calentar. 5. Lavar con agua. Escurrir. 6. Decolorar con la solucin de cido sulfrico al 5% durante 30 segundos. 7. Lavar con agua destilada. Escurrir. 8. Cubrir con solucin de azul de metileno durante 1 minuto. 9. Lavar con agua destilada, escurrir y dejar secar al aire. 10. Observar primero con 400X y luego con 1000X por inmersin.
Carbofucsina-Dimetilsulfxido (DMSO) 1. Disolver 4g de fucsina bsica en 25ml de etanol al 99%. 2. Agregar 12g de cristales de fenol fundidos en BM 3. Mezclar bien con varilla de vidrio 4. Agregar 25ml de glicerol puro, 25ml de DMSO y 75ml de agua destilada 5. Mezclar bien y dejar en reposo 30 minutos y filtrar. 6. Mantener en frasco color caramelo. Decolorante-Contracolorante 1. Mezclar bien 220ml de solucin acuosa al 2% de verde de malaquita, 30ml de cido actico glacial y 50ml de glicerol. No es necesario filtrar.
Procedimiento:
1. 2. 3. 4. 5.
Preparar dos extendidos con dos gotas de la muestra en un portaobjetos y dejar secar al aire. Calentar en una placa caliente (70C) durante 5 minutos. Fijar con metanol absoluto durante 5-10 segundos. Colorear con carbofucsina-DMSO durante 10 minutos Lavar inmediatamente con agua corriente hasta que el lquido de lavado salga sin color (10-30 segundos) 6. Cubrir con el decolorante-contracolorante durante 1 minuto o hasta aparicin de color verde de fondo 7. Lavar con agua durante 10 segundos 8. Dejar secar al aire y observar al microscopio.
Observaciones: Con todas estas coloraciones los ooquistes de los diferentes coccidios intestinales se vern de color rosa a prpura intenso, sobre un fondo azul o verde segn el contracolorante empleado. SE sugiere no emplear para esta coloracin, muestras conservadas en PVA. S son adecuadas las conservadas en SAF. Las muestras conservadas en formal al 10%, especialmente si estn envejecidas, pueden dar una disminucin en la captacin del colorante. En muchos casos los ooquistes de Cryptosporidium se ven como cido- alcohol- resistente variables, observndose muchos sin teir, como fantasmas. Los ooquistes de Cyclospora son tambin cido- alcohol- resistente variables, vindose a estos elementos parasitarios con diferente grado de captacin del colorante, por lo que se vendedse rosa muy plido a prpura intenso. En los ooquistes de Isospora se ven muy coloreados los esporoblastos o los esporoquistes internos. Coloracin rpida con Safranina-Azul de metileno: 1. Preparar extendidos de materia fecal y dejar secar al aire 2. Fijar al calor pasando el extendido brevemente por la llama de un mechero. 3. Fijar los extendidos de materia fecal con una solucin formada por HCl al 3% y metanol (7ml de HCl concentrado,36% densidad 1,19g/ml con 93ml de metanol) durante 4 minutos. 4. Lavar con agua corriente durante 2 minutos 5. Cubrir con solucin de safranina al 1% (colorante 1rio) durante 1 minuto. 6. Calentar hasta aparicin de vapores blancos (sin hervir) 7. Enfriar y lavar con agua corriente 8. Cubrir con el contra colorante , solucin de azul de metileno al 1% durante 1 minuto. (puede emplearse solucin acuosa al 1% de cristal violeta, no as verde de malaquita que en este caso no colorea el fondo en forma satisfactoria) Los ooquistes de los diferentes coccidios se vern en este caso de color naranja brillante sobre un fondo azul o violeta segn el contra colorante empleado.
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