Generacin

de animales transgnicos

Animal transgnico: Es aquel, al que se le ha modicado su genoma, introduciendo un DNA forneo, mediante el uso de tecnologa de DNA recombinante. Para considerar que la modicacin es estable, esta debe transferirse a las prximas generaciones

Un poco de historia:
1970: Produccin de primer ratn quimrico. Al estado de 8 clulas se unieron blastmeros de dos cepas disJntas para generan as un ratn adulto quimrico. 1982. Primer ratn transgnico

Brinster y Palmiter group fuse elements of a gene that can be regulated by dietary zinc to a rat growth-hormone gene, and inject it into ferJlized mouse embryos. The resulJng mice, when fed with extra zinc, grow to be huge.

Animales transgnicos en biomedicina

Ratn Conejo Oveja Cabra Vaca Cerdo Pollo Peces

Existen, al menos, tres formas de generar transgnicos: 1.-Microinyeccin de DNA 2.-Transferencia de genes mediante clulas madres 3.-Transferencia de genes por retrovirus.

Microinyeccin de DNA
Este mtodo consiste en la microinyeccin de un determinado constructo de DNA (promotor, un gen o mas de un cDNA) en los proncleos de un huevo ferJlizado o directamente en el cigoto. La insercin del DNA ocurre mediante un proceso random, por lo que existe una alta probabilidad que el DNA introducido no se incorpore al genoma o que se inserte en un lugar donde no se llegue a expresar. En el caso de los mamferos el huevo ferJlizado es transferido al oviducto de una hembra receptora para que ste se desarrolle. La mayor ventaja de este mtodo es que se puede aplicar en una amplia variedad de especies.

Ratones.modelo ideal para generar animales transgnicos?

El primer animal transgnico fue un ratn Representan el 95% de los animales transgnicos utilizados en investigacin biomdica 80% de los genes presentes en ratn tienen la misma funcin que en humanos El ciclo de reproduccin del ratn es corto en comparacin a otros mamferos y sus huevos relativamente fciles de manipular

Te prohbo que juegues con l, es un ratn WT

Inyeccin a nivel de cigoto

Desventajas de este mtodo: -Solo se pueden incorporar genes, no eliminarlos

-Bajo porcentaje de animales transgnicos y solo una parte de ellos expresa el gen incorporado (entre 1 y 4% de eficiencia).

Asociadas a mamferos:
-Ineficiencias asociadas con la recoleccin, cultivo de los huevos fertilizados y transferencia de los embriones hacia las hembras receptoras -Largo perodo de gestacin y bajo nmero de animales por generacin.

Como alternativa al ratn, surge el pez cebra

Generacin de transgnicos por microinyeccin de DNA en el pez cebra

Microinyeccin de plsmidos lineales

Elemento regulador Promotor bsico
Protena fluorescente Verde (GFP)

Promotor especfico
Protena fluorescente Verde (GFP)

Promotor ubicuo/especfico

cDNA

Protena fluorescente Verde (GFP)

Transgnesis por elementos transponibles (sistema Tol2) Transposon aislado desde medaka
transposasa

Vector tol2 mnimo

Elementos tol2 mnimos

Transposasa cataliza las inserciones del vector tol2 en el genoma gracias a que en los extremos de la secuencia del vector estan elementos tol2 mnimos.

Microinyeccin de plasmidos mosaisismo (10%GFP) ms de una copia DNA

Sistema Tol2 mosaisismo (80% GFP) una copia DNA

expresin variable

expresin consistente

1% efiencia

30% efiencia

Transgnesis clsica

Transgnesis sistema Tol2

Transferencia de genes mediante clulas madres

Esta tecnologa se basa en la recombinacin homloga y posibilita modificaciones genticas muy finas en el genoma del animal. Se incorpora una copia nica en un sitio predeterminado del cromosoma (se controla el nmero de copias del transgen y el sitio de la insercin) Con esta tcnica se obtienen ratones Knockout. Desventajas: Limitada a mamferos (preferentemente ratn) por la disponibilidad de clulas madre. Tcnica cara y engorrosa Eficiencia 10-20%

Generacin de Ratones Knockout

Herpes timidin kinasa, en presencia de ganciclovir clulas mueren

Clulas resistentes a neomicina y ganciclovir, contienen vector insertado en lugar correcto

Deteccin de insercin (in)correcta Seleccin Positiva-Negativa

Primer ratn Knockout fue creado en 1989, se elimin la funcin de p53.

Prize motivation: "for their discoveries of principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells"

Transferencia de genes por inyeccin retroviral

Insercin ocurre por recombinacin homloga y al azar, lo que genera descendencia en mosaico Se integra una sola copia Transgen debe ser menor a 8kb Muy difcil obtencin del virus Eficiencia 10-15%

Normalmente los retrovirus utilizados solo tienen la capacidad de infectar a clulas en divisin, lo que limita su uso.

Los lentivirus son retrovirus no oncognicos que producen enfermedades en mltiples rganos caracterizadas por perodos de incubacin prolongados e infeccin persistente. HIV-1 es la especie tpica. Como caracterstica especial poseen la capacidad de infectar clulas en divisin y que no se dividen. Esto aumenta el potencial de la tcnica ya que permite modificar clulas como neuronas.

Obtencin de de vector retroviral

Lentiviral vectors are usually created in a transient transfection system in which a cell line is transfected with three separate plasmid expression systems. These include the transfer vector plasmid ( portions of the HIV provirus), the packaging plasmid, and a plasmid with the heterologous envelop gene (ENV) of a different virus

Primary steps involved in the production of transgenic pigs by somatic cell nuclear transfer (SCNT), pronuclear injection (PNI), and lentiviral transduction (LVT). Each procedure requires the surgical isolation of oocytes or embryos. SCNT requires the production of transgenic donor cells, which can be augmented by transposonmediated transgenesis (TnT). The donor cells are injected into enucleated oocytes, which are then fused and activated before embryo transfer into a recipient. PNI involves the injection of DNA into the male pronuclei before nuclei fusion. PNI can be augmented by TnT. LVT occurs by injection into the peri-vitelline space of staged embryos.

Heritable T-cell malignancies are transplantable and can be easily visualized by fluorescent protein expression in leukemic cells (modified from Frazer et al.41). Green fluorescent protein (GFP+) leukemias from shrek (srk; AC), hulk (hlk; DF), and oscar the grouch (otg; GI) mutants were transplanted into irradiated wild-type hosts. At 1 week, GFP+ cells were seen at the site of transplantation (A, D, G). Subsequently, tumors spread locally (B, E, H) and then disseminated widely (C, F, I).

Lneas transgnicas utilizadas para estudiar el cncer en pez cebra

1.-Leucemia Tg(rag2:Myc) 2.-Linfomas Tg(rag2:bcl-2) 3.-Melanoma Tg(mitfa:BRAF) 4.-Desordenes mieloproliferativos Tg(-actin:LoxP-EGFP-LoxP-KRASG12D)

Screening de drogas anti metastaticas

Neutrfilos en homeostasis

Reclutamiento de neutrfilos a la zona de dao

Participacin de macrfagos en la resolucin de la infamacin

neutrfilos macrfagos

LyC::DsRed/SqET4

LyC::DsRed/SqET4