Separacioncromatograficamanual 2008

1
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA DEPARTAMENTO DE FARMACIA
MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA Y FITOQUMICA 200 8
Recopilado y revisado por: ALEJANDRO MARTINEZ M. GLORIA AMPARO VALENCIA P. NORA JIMENEZ U. MONICA MESA ELKIN GALEANO J.
Medelln, Mayo de 2008
PROGRAMA DEL CURSO DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA Y FITOQUMICA 200 8 Objetivo general Al finalizar el curso el estudiante estar en capacidad de evaluar, extraer, aislar, caracterizar e ident ificar sustancias naturales de origen biolgico.
Temas del curso 1. INTRODUCCIN. Duracin: 6 Horas Presentacin del curso Entrega de Equipos Normas de laboratorio 2. RECONOCIMIENTO DE LA FLORA UNIVERSITARIA. TAXONOMIA VEGETAL. PRESENTACIN DE UN EJEMPLAR CON SU CLASIFICACIN. Duracin: 6 Horas 3. RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS. Duracin: 6 Horas 4. TECNICAS GENERALES DE AISLAMIENTO, SEPARACIN Y PURIFICACIN (CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA Y EN COLUMNA). Duracin: 12 Horas
5. RECONOCIMIENTO DE ADULTERACI ONES Y/O FALSIFICACIONES (OBSERVACIN DE DROGAS PULVERIZADAS). Duracin: 6 Horas 6. RECONOCIMIENTO CROMATOGRFICO DE PLANTAS MEDICINALES APROBADAS EN COLOMBIA. Duracin: 6 Horas 7. FENILPROPANOS (ACEITES ESENCIALES). Duracin: 12 Horas 8. TECNICAS GENERALES DE E XTRACCIN Y VALORACION DE UNA DROGA Duracin: 12 Horas 9. MARCHA FITOQUIMICA. Duracin: 18 Horas
10. PRACTICA ESPECIAL. Duracin: 60 Horas Revisin bibliogrfica y elaboracin de un anteproyecto. Duracin: 12 Horas Trabajo en el Laboratorio (Desarrollo exper imental). Duracin: 36 Horas Pster: Elaboracin 6 Horas, Presentacin: 6 Horas Contenido: Elaboracin de un fitofrmaco. Aislamiento y caracterizacin de metabolitos secundarios.
PRESENTACIN Este MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA Y FITOQUMCA 200 8, corrige y modifica parcialmente el manual publicado en marzo de 2003 (ISBN 958 -655-682-4). CONTENIDO Pg. PRACTICA No. 1 PRACTICA No. 2 PRACTICA No. 3 PRACTICA No. 4 PRACTICA No. 5 RECONOCIMIENTO DE LA FLORA UNIVERSITARIA, TAXONOMA VEGETAL, PRESENTACIN DE UN EJEMPLAR CON SU CLASIFICACIN RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS TCNICAS GENERALES DE AISLAMIENTO, SEPARACIN Y PURIFICACIN (CROMATOGRAFA EN CAPA FINA Y EN COLUMNA) RECONOCIMIENTO DE ADULTERACIONES Y/O FALSIFICACIONES (OBSERVACIN MICROSCPICA DE DROGAS PULVERIZADAS) RECONOCIMIENTO CROMATOGRFICO DE PLANTAS MEDICINALES APROBADAS EN COLOMBIA RECONOCIMIENTO POR CCF DEL AJENJO RECONOCIMIENTO POR CCF DEL AJO RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA ALCACHOFA RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA ALBAHACA RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA HIERBABUENA RECONOCIMIENTO POR CCF DEL HINOJO RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA MALVA RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA MANZANILLA
19
22
38 38 38 39 40 40 41 42 43
PRACTICA No. 6 PRACTICA No. 7
MATRICARIA RECONOCIMIENTO PO R CCF DEL ROMERO RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA SABILA RECONOCIMIENTO POR CCF DE FLORES DE SAUCO RECONOCIMIENTO POR CCF DE HOJAS DE TORONJIL RECONOCIMIENTO POR CCF DE VALERIANA FENILPROPANOS (ACEITES ESENCIALES) TCNICAS GENERALES DE EXTRACCIN Y VALORACIN DE UNA DROGA: VALORACION DE ALCALOIDES DEL TROPANO, VALORACION DE RUTINA, VALORACION DE ANETOL MARCHA FITOQUMICA PRACTICA ESPECIAL Pautas para la elaborac in del informe de laboratorio
43 44 45 45 46 47 52
PRACTICA No. 8 PRACTICA No. 9
68 80
PRACTICA N 2 RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS OBJETIVO Distinguir y clasificar los diferentes metabolitos secundarios presentes en el tejido vegetal por medio de pruebas qumicas de coloracin y precipitacin.
Consultar: Domnguez, X. 1973.Captulo 3. A., Mtodos de Investigacin Fitoqumica, Ed.Limusa,Mxico,
MARCO TERICO Metabolitos Primarios: Son los productos qumicos necesarios para la vida, resultantes del metabolismo vital de todo ser vivo, son: lo s carbohidratos, los lpidos, las protenas y los cidos nucleicos. Metabolitos Secundarios: Otros compuestos llamados metabolitos secundarios son subproductos de rutas metablicas normales que ocurren en ciertas especies, siendo particulares dentro de un grupo taxonmico, estado de vida o tejido presentando una distribucin restringida dentro del Reino Vegetal dando origen a la quimiotaxonoma. Su ocurrencia depende de condiciones externas tales como ataques de patgenos, predadores, cambios trmicos o l umnicos, deficiencias nutricionales o presencia de otros organismos intra o interespecficos. El metabolismo secundario es una caracterstica fundamental de la especializacin, es decir que el compuesto resultante, puede no ser importante para la clula pero s para el organismo como un todo. Los metabolitos secundarios pueden ser bioactivos, pero no jugar un papel esencial en los procesos fisiolgicos del organismo. Algunos metabolitos secundarios son residuos bioqumicos, es decir, productos de activ idad enzimtica de substratos no apropiados o productos de destoxificacin o desecho de importancia para la supervivencia y la buena condicin de los organismos. Con pocas excepciones, los metabolitos secundarios pueden clasificados dentro de cinco grupos, de acuerdo con su base biosinttica: fenilpropanos, acetogeninas, terpenoides, esteroides y alcaloides. Reconocimientos de Metabolitos: El reconocimiento de metabolitos secundarios se realiza por medio de pruebas fitoqumicas preliminares, las cuales son una prueba qumica de caracterizacin consistente en una reaccin qumica que produce alteracin rpida en la
estructura molecular de un compuesto, por ejemplo, la modificacin de un grupo funcional, la apertura de un sistema anular, la formacin de un ad ucto o un complejo, lo cual da por resultado una manifestacin sensible como el cambio de un color, la formacin de un precipitado o el desprendimiento de un gas, dndonos indicios de la presencia o ausencia de un metabolito secundario en particular. Reconocimiento de Alcaloides: Los alcaloides son sustancias bsicas que contienen nitrgeno en un anillo heterocclico, son derivados de aminocidos, presentan distribucin taxonmica limitada y se encuentran en plantas superiores como sales de un cido org nico.
N CH3 N
Nicotina Atendiendo a su solubilidad, propiedad empleada para extraerlos y purificarlos, la base del alcaloide es soluble en solventes orgnicos y pueden formar sales solubles en solventes polares cuando se encuentra en cidos minerales diluidos.
Reconocimiento de Flavonoides: (+)-Catequina

O
OH
Los Flavonoides son compuestos polifenlicos con quince tomos de carbono, cuya estructura consta de 2 anillos de benceno unidos por una cadena lineal de tres carbonos. El esqueleto de los flavonoides se representa por el sistema C6 C3 C6. Reconocimiento de Cardiotnicos: Una aglicona cardiotnica, estructuralmente esta constituida por el sistema anular esteroidal (ciclo pentano perhidrofenantreno) con los grupos metilos C18 y C-19,
un grupo hidroxilo en el carbono 3 y un anillo lactnico carbonos unido al carbono 17 del ncleo esteroidal.
- insaturado de cuatro
O O
H3 C H O
Digoxin
O
OH CH3
CH3 OH
3
OH O
Estas agliconas toman el nombre de cardenlidas por presentar acti vidad estimulante sobre el msculo cardiaco, cuando estn en forma de glicsidos. Reconocimiento de Saponinas: Las saponinas son un grupo de glicsidos solubles en agua, que tienen la propiedad de hemolizar la sangre y disminuir la tensin superficial d el agua, formando espuma abundante. Las saponinas por hidrlisis se desdoblan en carbohidratos y una aglicona llamada sapogenina.
CH3 H3C CH3 O CH3 O
Diosgenina
HO
La sapogenina puede tener el sistema anular esteroidal o el de un triterpeno pentacclico. Los anillos E y F de la saponina estereoidal conforman el llamado sistema espirostanal. El en lace glicosdico siempre se forma con el oxigeno del carbono 3.
Reconocimiento de Cumarinas: Las cumarinas son un grupo muy amplio de principios activos fenlic os y tienen en comn la estructura qumica de 1 -benzopiran-2-ona. Se caracterizan porque presentan fluorescencia bajo la luz ultravioleta a 365 nm.
O
Reconocimiento de Taninos:
Los taninos son productos de excrecin de muc has plantas, involucrados en mecanismos de defensa de las mismas, contra organismos parsitos. Se encuentran ms comnmente en hojas, ramas y debajo de la corteza. Qumicamente los taninos son polmeros de polifenoles, sustancias con alto peso molecular (comprendido entre 500 a 3000), se clasifican en: Taninos Hidrosolubles o Piroglicos: Son steres fcilmente hidrolizables formados por una molcula de azcar (en general glucosa) unida a un nmero variable de molculas de cidos fenlicos (cido glico o su dmero, el cido elgico). Son comunes de observar en plantas Dicotiledneas.
OH COOH O OH HO O OH
c. Glico
Leucoantocinidina
HO OH OH HO OH O
c. Elgico
OH OH
OH
Flavan 3,4-diol Leucopelargonidin
Taninos no Hidrosolubles Condensados : Tienen una estructura qumica similar a la de los flavonoides. Por hidrlisis dan azcar y cido elgi co, algunos taninos condensados son conocidos como pro -antocianidinas porque por hidrlisis cida producen antocinidinas y leucoantocinidinas.
Reconocimiento de Esteroides y/o Triterpenoides:

CH3 H3C CH3 CH3 CH3
CH3
Ergosterol
HO
Los esteroides son compuestos cuya estructura presenta el sistema anular del ciclopentano perhidrofenantreno, metilos en los carbonos 10 y 13 y un radical lineal en el carbono 17. Reconocimiento de Quinonas: Las quinonas son dicetonas cclicas insaturadas que por reduccin se convi erten en polifenoles, siendo reversible esta reaccin. Las quinonas derivan su nombre del miembro ms simple de la serie: la p -benzoquinona obtenida en 1838 por Woskresensky, como producto de oxidacin del cido qunico.
O
Antraquinona
Las quinonas, por el sistema aromtico que dan al reducirse se pueden clasificar en Benzoquinonas, Naftoquinonas, Antraquinonas (las ms numerosas) y Fenantroquinonas (las menos numerosas). Reconocimiento de Antocianinas: Las antocianinas son pigmentos fla vonoides que se comportan como indicadores cido base debido al proceso:
10
Pelargonidina
OH
+
HO
HO
HO
HOOH OH
HOOH OH
H+
H+
OH
pH < 3 Catin cianina
pH 8.5 Base cianina
pH > 11 Anin cianina
Estos pigmentos suelen presentarse en forma de glucsidos, lo que explica su solubilidad en agua y la fcil extractabilidad por solventes acuosos. Se encuentran en la savia de las plantas, y a menudo en forma de slidos amorfos o cristalinos en las hojas de tejido leoso y frutos. Su color esta algunas veces enmascarado pro otros pigmentos, como la clorofila.
Procedimiento Experimental 1. Recolectar y preparar las muestras frescas 2. Reconocimiento de alcaloides Desmenuzar finamente en un mortero, unos 10 g. de muestra fresca y colocarlos en un erlenmeyer. Aadir un volumen suficiente de HCl al 5% para que toda la muestra est en contacto con la solucin cida. Calentar con agitacin al bao mara durante unos 5 minutos. Enfriar. Filtrar. Colocar en 4 tubos de ensayo 2 ml de filtrado cido fro. Aadir a cada uno 2 gotas de los reactivos de Dragendorff, Mayer, Valser y Reineckato de amonio. Si se observa turbidez o precipitados en por lo menos 3 tubos, se considera que la muestra contiene alcaloides. Nota: antes de realizar el ensayo con la muestra biolgica, ensayar con un estndar de quinina en solucin cida. 3. Reconocimiento de Flavonoides. Leucoantoc ianidinas y Cardiotnicos En un erlenmeyer colocar unos 10 g. de muestra fresca finamente desmenuzada. Aadir un volumen suficiente de alcohol etlico que cubra toda la muestra y le confiera fluidez. Calentar al bao mara durante unos 5 minutos, con agita cin. Enfriar. Filtrar. Si hay presencia de clorofilas, al filtrado aadirle un volumen igual de solucin de acetato de plomo al 4% que contenga cido actico al 0.5 %,
11
agitar, dejar reposar 15 minutos y filtrar. Con el filtrado realizar ensayos de reconocimiento de flavonoides, leucoantocianidinas y cardiotnicos. a) Ensayo para flavonoides Colocar varias limaduras de magnesio en un tubo de ensayo. Aadir unos 2 ml del filtrado y por la pared del tubo, gota a gota dejar caer varias gotas de HCl concentrado. La aparicin de colores naranja, rosado, rojo o violeta es prueba positiva para la existencia de flavonoides en la muestra. Nota: antes de realizar el ensayo con la muestra biolgica, ensayar con un estndar de rutina o quercetina en solucin acuo -alcohlica. b) Ensayo para Leucoantocianidinas Colocar unos 2 ml del filtrado en un tubo de ensayo. Aadir 1 ml de cido clorhdrico concentrado. Calentar en bao de agua hirviendo durante 15 minutos. La aparicin de
coloraciones rojas es prueba positiva d e la existencia de leucoantocianidinas en la muestra. c) Ensayo para Cardiotnicos En un tubo de ensayo colocar 1 ml de filtrado. Aadir 0.5 ml de Reactivo de Kedde (mezclar 1 ml de solucin A con 1 ml de solucin B para preparar este reactivo antes de su uso). La aparicin de coloraciones violetas o prpuras es prueba positiva de la existencia de cardiotnicos en la muestra. 4) Ensayo para saponinas Desmenuzar con ayuda de un mortero unos 10 g de muestra fresca, con ayuda de unos pocos ml de agua. Filtr ar. Agitar en un tubo de ensayo tapado, unos 4 ml de filtrado acuoso, vigorosamente durante un minuto. La formacin de una espuma abundante y estable es prueba presuntiva de la presencia de saponinas en la muestra. 5) Ensayo para taninos Desmenuzar con ay uda de un mortero unos 10 g de muestra fresca, con ayuda de unos pocos ml de agua. Filtrar. Tomar 1 mL de filtrado acuoso en un tubo de ensayo. aadir 1 ml del Reactivo Gelatina -Sal. Si se forma un precipitado, centrifugar a 2000 RPM durante 5 minutos. Des echar el sobrenadante. Redisolver
12
el precipitado en 2 mL de Urea 10M. Aadir 2 -3 gotas de solucin de cloruro frrico al 10%. La formacin de precipitado al agregar el reactivo de gelatina, y la aparicin de colores o precipitados verdes, azules o negros e s prueba positiva de la presencia de taninos en la muestra. 6) Ensayo para Triterpenoides y/o esteroides Moler la muestra vegetal seca. Agregar un volumen suficiente de cloroformo o diclorometano y extraer por agitacin. Filtrar. Si el filtrado es turbio contiene humedad, secarlo agregando sulfato de sodio anhidro y filtrar. En un tubo de ensayo limpio y completamente seco, colocar 1 ml de filtrado orgnico. Aadir 1 ml de anhdrido actico. Por la pared del tubo y con mucha precaucin, dejar resbalar 1-2 gotas de cido sulfrico concentrado. La formacin de colores azules, violetas, rojos o verdes es prueba positiva de que la muestra contiene Esteroides y/o Triterpenoides. 7) Ensayo para Quinonas Ensayo con una fraccin : Colocar en un tubo de ensayo unos 5 ml de filtrado acuoso. Aadir 1 ml de perxido de hidrgeno al 20% y 1 ml de cido sulfrico al 50%. Calentar la mezcla en un bao de agua hirviendo durante 15 minutos. Enfriar. Aadir 5 ml de tolueno. Agitar sin emulsionar. Recuperar la fase tolunica. Trasvasar 2 ml fase tolunica a un tubo de ensayo. Aadirle 1 ml de una solucin de NaOH al 5% con amoniaco al 2%. Agitar sin emulsionar. Si la capa acuosa toma una coloracin rosada a roja intensa es prueba positiva de la presencia de quinonas en la mues tra.
Ensayo directo: Colocar 5 g de muestra fresca ( 1 g de muestra seca y molida), en un sistema de reflujo, agregar 25 ml de HCl 5%. Reflujar 5 minutos. Dejar enfriar y filtrar. Con el filtrado acuoso proceder como se describe para el ensayo con una fraccin acuosa. 8. Reconocimiento de Antocianinas En un erlenmeyer colocar unos 100 g. de muestra fresca finamente desmenuzada. Aadir unos 200 ml de agua. Calentar a ebullicin durante unos 5 minutos. Filtrar.
13
Ensayo En un tubo de ensayo colocar 2 ml de f iltrado. Aadir 1 ml de NaOH diluido. Observar el color formado. En otro tubo de ensayo colocar otros 2 ml de filtrado. Aadir unas 6 gotas de un cido mineral diluido. Observar el color formado. Las antocianinas se reconocen por producir diferentes color es a diferentes pH. 9. Reconociemiento de Cumarinas. En un tubo de ensayo grande colocar 1 g de material vegetal fresco y macerado y agregar cantidad suficiente de etanol comercial que cubra el material vegetal. Cubrir la boca del tubo de ensayo con un pa pel filtro blanco y sujetarlo con unas pinzas para tubo de ensayo o con una banda elstica. Agregarle unas gotas de NaOH diluido en el papel filtro que cubre la boca del tubo de ensayo. Calentar hasta ebullicin el tubo de ensayo por 5 minutos, enfriar y r etirar el papel filtro. Observar bajo luz ultravioleta a 365 nm la aparicin de una coloracin fluorescente que puede ser: verde, amarilla, roja en el papel filtro. Nota: El papel filtro normalmente se observa azul fluorescente bajo la luz ultravioleta de 365 nm.
Plantas con alcaloides:
Datura sp. (borrachero), hojas y flores. Catharantus roseus (cortejo), hojas. Hojas de tabaco, t. Plantas con flavonoides: Ptalos de rosas rojas y amarillas. Ptalos de lirio africano. Plantas con saponin as: Hojas de Agave sp.(penca sbila). Fruto de Solanum quitoense (lulo). Cscara de Dioscorea ssp. (ame). Plantas con taninos: Hojas de plantago (llantn). Hojas de guayaba T (Thea sinensis ), hojas. Uvas (Vitis vinifera ). Pltano o guineo (Musa ssp.). Agallas de alepo ( Querquis ssp. ). Corteza de casco de vaca ( Bahuinia picta ). Plantas con esteroides: Semillas de Glicine max (soya). Aceite de oliva (Olea europeae ). Plantas con cardiotnicos: Azuceno de la habana, hoj as. Plantas con antocianinas: Repollo morado.
14
Plantas con quinonas:
Hojas de guardaparque. Moras. Uvas sin hollejo. Ruibarbo (rizomas)
6. Reactivos y materiales necesarios por grupo 150 ml HCl al 5% 1 ml perxido de hidrgeno al 20% 50 ml Acetato de plomo al 4% con cido actico al 0.5% 2 ml Urea 10M gotas de FeCl 3 al 10% 2 ml de cido sulfrico al 50% 2 ml de solucin NaOH al 5% con amoniaco al 2% R. Dragendorff, Valser, Mayer y Reineckato de amonio. R. gelatina-sal R. Kedde solucione s A y B 200 ml etanol 50 ml diclorometano 5 ml benceno 2 ml anhdrido actico Acido sulfrico concentrado Acido clorhdrico concentrado 5 papeles de filtro limaduras de magnesio sulfato de sodio anhidro centrifuga 2000 RPM y 2 -4 tubos cuchillo.
15
Prctica 3 TCNICAS GENERALES DE AISLAMIENTO, SEPARACIN Y PURIFICACIN (CROMATOGRAFA EN CAPA FINA Y EN COLUMNA)
OBJETIVOS Seleccionar de una serie eluotrpica el eluente que mejor separe los carotenoides presentes en diferentes muestras vegetales. Con el mejor eluente, fraccionar cromatogrficamente el extracto de carotenoides, hasta aislar compuestos puros y caracterizarlos por mtodos de coloracin, cromatogrficos y espectrales. Identificar los carotenoides presentes en el material vegetal asignado para anlisis. BASE DEL MTODO La muestra aplicada en la fase estacionaria es adsorbida en la superficie del material por la accin de fuerzas electrostticas (fuerzas de Van der Waals, puentes de Hidrgeno, efectos inductivos, etc.) y para su posterior liberacin de acuerdo a la constante de afinidad de por los constituyentes de la muestra por la fase mvil. MARCO TERICO CROMATOGRAFA La cromatografa (chromo= color y graphie=escritura, escribir en colores) fue inventada el 1903 por el botnico ruso Mikhail Tswe tt. Ismailov y Scraiber utilizaron lminas de vidrio para colocar capas muy delgadas de almina y luego aplicaron extractos vegetales, dando as la primera forma de cromatografa de capa fina. Egon Stahl (1956) di el nombre de cromatografa de capa fina, estandariz los procedimientos, equipos y adsorbentes dando un auge a esta tcnica simple, econmica y eficiente. TERMINOLOGA Fase Estacionaria (Adsorbente) Es una de las dos fases que forman un sistema cromatogrfico. Puede ser un slido, un gel o un l quido. Si es un lquido, puede estar distribuido en un slido, el cual puede o no contribuir al proceso de separacin. El lquido puede tambin estar qumicamente unido al slido (Fase Ligada) o inmovilizado sobre l (Fase Inmovilizada). Los adsorbentes m s utilizados son
16
Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones) xido de Aluminio Almina (cida, neutra bsica) Tierra Silcea Kieselguhr Celulosa (Nativa o micro -cristalina) Poliamidas. Estos sorbentes varian en tamao de partcula, da metro del poro, homogeneidad y pureza. Fase Mvil (eluente) Es el fluido (solvente o mezcla de solventes) que se filtra a travs o a lo largo del lecho estacionario (fase estacionaria), en una direccin definida. Puede ser un lquido (Cromatografa Lquid a), un gas (Cromatografa de Gases) o un fluido supercrtico (Cromatografa con Fluido Supercrtico). Cuando se utiliza un lquido como fase mvil mediante una serie eluotrpica (Tabla 1) se escoge la mejor combinacin de solventes miscibles para una buena separacin cromatogrfica de una muestra en sus componentes. Tabla 1. Serie eluotrpica de solventes Hidrocarburos ligeros (ter de petrleo, hexano, heptano. etc.) Ciclohexano Tetracloruro de carbono Tricloroetileno Tolueno Benceno Diclorometano Cloroformo Eter etlico Acetato de etilo Acetona n-Propanol Etanol Metanol Agua Muestra Mezcla consistente en cierto nmero de componentes, cuya separacin se pretende en el lecho cromatogrfico al ser arrastrados o eluidos por la fase mvil.
17
Componentes de la Muestra Los constituyentes qumicamente puros de la muestra. Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria (es decir, no retardados), retenidos parcialmente (es decir, eluidos a tiempos diferentes) o retenidos permanentemente.
CLASIFICACIN DE LA CROMATOGRAFA Clasificacin de acuerdo a la forma del lecho cromatogrfico Cromatografa en Columna Cromatografa Plana Clasificacin de acuerdo al estado fsico de la fase mvil Cromatografa de Gases (GC) Cromatografa Lquida (LC) Cromatografa co n Fluido Supercrtico (SFC) Clasificacin de acuerdo al mecanismo de separacin Cromatografa de Adsorcin Cromatografa de Reparto Cromatografa de Intercambio Inico Cromatografa de Exclusin Cromatografa de Afinidad Tcnicas especiales Cromatografa con Fase Invertida Cromatografa con Fase Normal Anlisis Isocrtico Elusin con Gradiente Cromatografa Bidimensional CROMATOGRAFA EN COLUMNA (CC) Es una tcnica de separacin en la que el lecho estacionario est contenido dentro de un tubo de vidrio vertical. La muestra es aplicada lquida o slida (adsorbida por fase la estacionaria). Posteriormente se agrega el eluente por la parte superior del tubo cromatogrfico y se recogen volmenes definidos por el analista de eluente luego de ser elu do por el tubo cromatogrfico, separando una muestra en sus componentes como se ilustra en la figura 1:
18
Recolector de fracciones
Figura 1. Diagrama de una cromatografa en columna.
CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (CCF) Es la tcnica de separacin en la qu e la fase estacionaria est sobre un plano formando una capa de partculas slidas extendida sobre un soporte, tal como una placa de vidrio o aluminio ((Thin Layer Chromatography, TLC), la muestra es aplicada en puntos o en banda, para posteriormente ser e luda dentro de un tanque cromatogrfico como se ilustra en la figura 2.
Marca de fin
Marca de inicio
Muestra
Eluente
Figura 2. Diagrama de una cromatografa en capa fina
19
Si los componentes de la muestra (manchas) no son coloreados, se requiere de mtodos que nos permitan visualizarlos componente presentes. Este procedimiento tambin se conoce este como revelado de la placa. El revelado de las placas se puede realizar mediante dos mtodos: Mtodo qumico (por inmersin o rociado de reactivos coloreantes). Se obtienen derivados coloreados o fluo rescentes de los componentes de la muestra. Mtodo fsico (pticos). Generalmente se utiliza mediante la radiacin con luz UV a la placa cromatogrfica a 254nm y/o 365nm. La cromatografa en capa fina como mtodo cualitativo y cuantitativo, siempre requiere contar con un estndar de referencia para comparar su valor de factor de retardo (Rf) y el color de la mancha del estndar al ser revelada con agentes qumicos, con los datos experimentales obtenidos. El factor de retardo (Rf) es un valor relativo par a cada sustancia y depende de las condiciones cromatogrficas con que se haya trabajado (fase mvil, fase estacionaria, eluente y el tiempo de saturacin). Se define como el cociente entre la distancia recorrida por el centro de la mancha y la distancia re corrida simultneamente por la fase mvil como se ilustra en la figura 3.
c Distancia recorrida por la fase mvil (X) b a Destancia recorrida por cada muestra
Figura 3. Factor de retardo de una muestra. Rf para la mancha 1 = a / X Rf para la mancha 2 = b / X Rf para la mancha 3 = c / X Los valores de Rf siempre son menores o iguales a uno (Rf = 1).
20
CAROTENOIDES Los tetraterpenoides ms conocidos son los pigmentos liposolubles amarillos -rojos denominados carotenoides, los cuales se encuentran ampliamente distribuidos en el reino vegetal y en diversos tipos de tejidos. Se conocen al go ms de 400 carotenoides. A los pigmentos hidrocarbonados se les denomina CAROTENOS, y a los oxigenados XANTOFILAS. Se conocen tambin tetraterpenos incoloros como el fitoeno y el fitoflueno, pero han sido menos estudiados que los carotenoides. La nica diferencia estructural entre los tetraterpenoides coloreados e incoloros es el mayor nmero de enlaces dobles conjugados en los primeros. Los tetraterpenoides, a diferencia de otras clases de terpenoides, no poseen sistemas anulares complejos y son acclic os, mono- o biciclicos. Los miembros acclicos contienen bsicamente el siguiente esqueleto:
Debe notarse que la molcula es simtrica a cada lado de la lnea punteada y puede racionalizarse como la unin de dos radicales diterpnicos tipo fitilo. Las variaciones se introducen por enlaces dobles y grupos funcionales tales como hidroxilos, epxidos, carboxilos, etc. A medida que se aumenta el nmero de enlaces dobles se incrementa la posibilidad de isomerismo CIS-TRANS, y muchos de los problemas de la q umica de los carotenoides proviene de la dificultad para distinguir y separar ismeros geomtricos de este tipo. La mayora de los carotenoides nativos son todo trans, y al nombrarlos se asume por defecto que tienen la configuracin trans a menos que se c ite la geometra cis. La ciclizacin puede ser a uno o ambos lados de la cadena. Cuando solo hay ciclizacin en uno de los extremos se les denomina carotenoides del tipo IONONA:
21
Algunos pigmentos como la bixina y la crocetina tienen menos de 40 carbono s pero se clasifican como carotenoides porque las peculiaridades de su estructura sugieren que se derivan de la degradacin de carotenoides, en lugar de producirse a partir de unidades ms pequeas. Los apo -carotenoides son compuestos C -27 o C-30 derivados probablemente de la degradacin de Xantofilas. Hasta el momento no ha sido asignada ninguna funcin general a los carotenoides. Existen indicios de que son receptores de luz para el fototropismo. Como los pigmentos florales podran participar en la atracc in de insectos, pero principalmente se cree que funcionan como pigmentos de cloroplastos de las hojas. Hasta cierto grado la luz absorbida por los carotenoides puede transferirse a la ferredoxina o la clorofila, donde es usada para la fotosntesis. Tambi n se tienen evidencias de que los carotenoides protegen a la clorofila contra la fotodestruccin por luz de corta longitud de onda p. ej: Longitudes de onda cercanas a 400 nm donde tanto las clorofilas como los carotenoides absorben intensamente. Las plant as albinas carecen de carotenoides y clorofilas bajo condiciones normales de crecimiento, pero bajo luz dbil son capaces de acumular clorofila. En condiciones normales de luz la clorofila se destruye rpidamente porque los carotenoides no estn presentes para protegerla. El carotenoide ms ampliamente distribuido es el ? -caroteno, el cual constituye casi el 0.1% de las hojas verdes secas. La lutena es la xantofila ms importante de hojas y puede encontrarse en mayores concentraciones que el ? -caroteno. La mayora de carotenoides tienen la misma cadena central del ? -caroteno y difieren solamente en las porciones correspondientes a los dos anillos.
22
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL REACTIVOS Y MATERIALES NECESARIOS POR GRUPO 30g de muestra vegetal fresca triturada o rallada (Tomate de alio rojo, Pimentn verde -rojo, zanahor ia, Pimentn rojo, ahuyama, mango cscara roja, pasta de tomate, salsa de tomate, espinacas, etc.) Erlenmeyer 250 ml Slica gel para columna 1 columna de cromatografa n-hexano puro ( ter de petrleo) Acetato de etilo puro Metanol etanol para extraer (destilado) Algodn o gasa Papel filtro Sulfato de sodio anhidro 15g. Capilares
Tubos de ensayo limpios Lpiz de grafito Tanque para cromatografa Bao Mara Rotaevaporador Mortero con pistilo Licuadora Espectrofotmetro UV -Visible Etanol puro 50mL.
NOTA= Consultar los carotenoides presentes en el material vegetal asignado para esta prctica y su color antes de ir a la seccin de clase.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL OBJETIVOS Seleccionar de una serie eluotrpica , el eluente que mejor separe los carotenoides presentes en diferentes muestras vegetales. Con el mejor eluente, fraccionar cromatogrficamente el extracto de carotenoides, hasta aislar compuestos puros y caracterizarlos por mtodos de coloracin, cromatogrficos y espectrales. Conocer otros sist emas cromatogrficos para la separacin de carotenoides.
a. Deshidratacin En un erlenmeyer seco se colocan unos 30 g. de tejido fresco triturado finamente en un mortero. Se aade un volumen suficiente de etanol al 95% para que recubra la muestra. Se cal ienta a ebullicin sobre un bao mara durante 5 minutos. Se
23
filtra en caliente con un algodn, procurando que la masa semislida quede libre del solvente. b. Extraccin A la masa semislida se adiciona un volumen suficiente de diclorometano (tambin pued e usarse cloroformo) en una campana de extraccin y se remueve con una varilla de vidrio para que el solvente extraiga los carotenoides . Debe tenerse precaucin con el manejo de estos solventes pues son bastante voltiles y algunos son muy txicos. El extracto se filtra. El residuo slido se puede reextraer varias veces con el fin de obtener el mayor rendimiento posible. Los extractos filtrados se juntan, se trasvasan a un embudo de separacin y se aade si es necesario un volumen de solucin de NaCl satur ada. La fase orgnica se recupera, se seca con sulfato de sodio anhidro y se filtra. El filtrado con los carotenoides se concentra hasta un volumen aproximado de 5 ml, mediante aplicacin de calor suave (40 -50 C) y vaco. El extracto concentrado de carotenoides se tapa y se guarda para protegerlo de la luz, la humedad, el calor y el aire. c. Seleccin de otra fase mvil El extracto de carotenoides se a nalizar por CCF con la serie eluotrpica siguiente: n-Hexano n-Hexano/Acetato de Etilo 4:1 n-Hexano/Acetato de Etilo 2:1 n-Hexano/Acetato de Etilo 1:2 n-Hexano/Acetato de Etilo 1:4 Acetato de etilo
Utilizar como reveladores en su orden los siguientes, dibujando lo ms precisamente posible, y anotando en cada caso las observaciones como colores, fluorescencia, manchas : A simple vista Luz UV 254 nm Luz UV 366 nm Vapores de yodo
d. Fraccionamiento cromatogrfico y anlisis espectral Con el mejor eluente seleccionado previamente , proceder a realizar el fraccionamiento a escala mayor
24
del extracto por cromato grafa en columna CC cromatografa en capa preparativa CCP. Las fracciones coloreadas se recogen ( se raspan en el caso de la CCP), se enumeran y se les determina su espectro visible en el rango de 3 50 a 550 nm. Es importante tener en cuenta que para de terminar el espectro cada compuesto debe estar disuelto en hexano, y no tener residuos de otros solventes. La Tabla 2 muestra los Rf y los mximos de absorcin (en ter de petrleo) de varios carotenoides comunes. La figura 2 muestra el espectro visible d el licopeno obtenido de una muestra de tomate rojo.
25
Tabla 2. Valores Rf y mximos de absorcin de varios carotenoides CAROTENOIDE Rf SISTEMA 1 MXIM0S ABSORCIN (nm) 0.80 1 422, 444, 473 -Caroteno 0.74 1 425h, 451, 482 -Caroteno 0.41 1 437, 462, 494 -Caroteno 0.84 1 419, 444, 475 -Caroteno Licopeno 0.13 1 446, 472, 505 Lutena 0.35 2 420, 447, 477 Zeaxantina 0.24 2 423, 451, 483 Violaxantina 0.21 2 443, 472 Criptoxantina 0.75 2 425, 451, 483 Capsantina 0.16 2 ---------------Neoxantina 415, 437, 466 Rubixantina 432, 462, 494 Fucoxantina 425, 450, 478
Figura 2. Espectro Visible del Licopeno obtenido de tomate rojo
Sistema 1: Benceno/Eter de petrleo 9:1, Sistema 2: Diclorometano/Acetato de etilo 4:1
26
INFORME Debe incluir nombre vulgar y cientfico de la muestra analizada, parte de la planta analizada, familia vegetal, anlisis de los valores Rf y los espectros visible comparndolos con los reportados en la literatura. Informar cules carotenoides se logr identificar. Reactivos y materiales necesarios por grupo Muestra vegetal fresca triturada o rallada (Tomate de alio rojo, pimentn verde rojo, zanahoria, pimentn rojo, ahuyama, mango, pasta de tomate, salsa de tomate, etc.) Erlenmeyer 250 ml Slica gel para columna 1 columna de cromatografa N-hexano puro ( ter de petrleo) Acetato de etilo puro Etanol para deshidratar Algodn Papel filtro Sulfato de sodio anhidro 15 g. Capilares Tubos de ensayo limpios y secos reactivo de Carr Price Lpiz de grafito Frasco para cromatografa Rotavapor Mortero con pistilo Licuadora Espectrofotmetro UV -Vsible Bibliografa 1. Robinson T., "The Organic Constituents of Higher Plants", 5th. ed., Cordus Press, North Amherst MA U.S.A., 1983. Pp. 162 -5. 2. Harborne J.B., "Phytochemical Methods", Chapman & Hall, 1973, 119 -128 pp. 3. Stahl E., Thin layer Chromatog raphy, 1969. 1.Merck Co. Inc., Reactivos de coloracin para cromatografa en capa fina y en papel.
27
2. Dalmases, P., Bonet, J. J., Tcnicas de Cromatografa Lquido -Slido en Columna, Afinidad 111 -126 (1984).
Cromatograma CCF de un extracto de carotenoide s del pimentn (slica gel, n-hexano/acetato de etilo 4:1)
28
Prctica 4 RECONOCIMIENTO DE ADULTERACIONES Y/O FALSIFICACIONES (OBSERVACIN DE DROGAS PULVERIZADAS) El planteamiento sistemtico de la identificacin de drogas en polvo puede realizarse por var ios caminos; sin embargo, cuando se trata de drogas organizadas, todos los mtodos dependen del reconocimiento microscpico de los tipos celulares caractersticos, as como de los contenidos de las clulas. Cuando se trata de una mezcla de drogas es impres cindible una mayor experiencia y prctica. Cuando se ha realizado un tanteo de la identificacin, deben llevarse a cabo posteriores observaciones y ensayos qumicos confirmativos; la mayora de las drogas de farmacopea, poseen en la actualidad ensayos para su reconocimiento mediante cromatografa de capa fina (CCF). ENSAYOS PRELIMINARES: 1. ANOTAR EL COLOR. Blanco: gomas arbiga, tragacanto. Amarillo: regaliz, jengibre, escila. Marrn claro: Ipecacuana, nuez vomica, opio, hinojo, genciana, cilantro, cardamomo, lino. Castao canela: canela. Castao oscuro: clavo, sbila. Rojo: quina. Anaranjado: ruibarbo Verde: sen, digital, estramonio. 2. ANOTAR EL OLOR. Los siguientes son especialmente caractersticos: Jengibre, hinojo, ge nciana, opio, cilantro, cardamomo, canela, clavo, nuez moscada.
3. ANOTAR EL SABOR: Aromtico: Cilantro. cardamomo, canela, clavo. Aromtico y picante: Jengibre.
29
Amargo: cuasia, genciana, loes, quina, escila. Dulce: regaliz. Astringente: catec. 4. Mezclar una pequea cantidad de polvo con unas gotas de agua y abandonarlo un tiempo. Los extractos acuosos y jugos concentrados como el aloe se disuelven casi completamente, mientras se pone de manifiesto la naturaleza gomosa o mucilaginosa de drogas como l a goma arbiga, tragacanto y semillas de lino. 5. Mezclar una pequea cantidad de polvo con cido sulfrico diluido, si existe carbonato clcico (tiza) tiene lugar una efervescencia seguida de disolucin. 6. Comprimir una pequea cantidad de polvo entre pa pel de filtro. Una mancha oleosa, que se extiende pero que persiste cuando el papel es calentado en una estufa aparece cuando los polvos contienen aceite fijo (Ej.: lino, man, etc). El aceite esencial desaparece por calentamiento en estufa. (todos los aromticos) 7. Agitar una pequea cantidad de polvo en un tubo de ensayo lleno de agua hasta la mitad y si aparece espuma abundante sospechar la presencia de drogas saponinas como el clavo, nuez moscada; hervir suavemente y advertir el olor si hay desprendimi ento de aceite esencial. Filtrar y dividir en dos porciones que pueden ser ensayadas respecto a taninos y derivados antraquinnicos de la siguiente manera: a) Ensayo de taninos: Se agregan gotas de FeCl 3 muy diluido, se producen coloraciones que van desde el azul oscuro hasta el negro pasando por el verde oscuro. Tambin se puede realizar la prueba de la gelatina; en la que precipitan los taninos al agregar una solucin de gelatina al 1% que contenga 10% de cloruro sdico. Ausencia de taninos: pimienta, j engibre, cuasia, estrofanto. Presencia de taninos: borraja. salvia, ratania, canela, quina, clavo y ruibarbo. b) Ensayo de antraquinonas: Mediante la agitacin del extracto acuoso con HCl diluido, y calentamiento para producir la hidrlisis, las antraqui nonas liberadas se extraen con tolueno y dan un color rosa-rojo cuando la solucin se agita con amoniaco diluido. Positivo para: loes. ruibarbo, cscara sagrada, sen.
OBSERVACIN MICROSCPICA
30
Si los ensayos preliminares han demostrado que la droga se d isuelve en agua, deben realizarse ensayos con otros lquidos, como alcohol, aceite de oliva, hasta que se encuentre uno en el que la droga sea insoluble. En la mayora de los casos, sin embargo, puede adoptarse el siguiente procedimiento:
1. OBSERVACION DE ALMIDON Montar placa en agua, observar y dibujar cualquier grnulo que se observe y ensayar si se trata de almidn o no mediante adicin de agua de yodo. 2. OBSERVACIN DE TRICOMAS EPIDERMICOS Y OXALATO DE CALCIO Montar en hidrato de cloral (disuelve almidn, protenas, clorofila,, resinas, aceites esenciales y produce la expansin de clulas retradas), hervir suavemente hasta que clarifique y observar. Para estar seguro de que el oxalato clcico, no ha pasado inadvertido, debe utilizarse luz polariza da. OBSERVACIN DE LIGNINA Humedecer el polvo con una solucin alcohlica de floroglucina (1% en etanol del 90%) y dejarlo hasta que casi se seque. Aadir HCl concentrado, poner cubreobjetos y observar. Advirtase la presencia o ausencia de vasos lignific ados, fibras, parnquima, esclereidas, pelos. Si los vasos o fibras no se tien de rojizo, sospechar presencia de jengibre o ruibarbo. De los ensayos preliminares y de los tres montajes anteriores se obtendr una considerable informacin. El examen puede c ontinuarse mediante la aplicacin de otros ensayos microqumicos: Cloro yoduro de cinc (Reactivo de Schultze); ensayo para paredes de celulosa. Por lo general es conveniente desengrasar los polvos grasos, decolorar los fuertemente coloreados y preparar una fibra bruta cuando contienen mucho almidn. La aplicacin de los conocimientos de anatoma de los rganos vegetales en que se presentan las drogas har posible el reconocimiento. Esto deber ampliarse con la utilizacin de referencias o tablas de caracter es diagnsticos de drogas en polvo. La identidad de un polvo no ha de considerarse como establecida hasta que haya sido comparada con uno de reconocida autenticidad. TABLAS RECOMENDADAS: Wallis y Mirimanoff.
31
Jacksori Snowcson; Powered Vegetable Drugs. Londres: Thornes (1968) DROGA Alo CARACTERSTICAS Presencia: Montado en lactofenol, muestra fragmentos amarillentos o cristales aciculares. Parcialmente soluble en agua y completamente soluble en alcohol al 60%. Confirmar con ensayos qumicos. Ausencia: T ejido vegetal, almidn, Oxalato de Calcio. Presencia: Clulas epidrmicas isodiamtricas . colnquima, esclernquima lignificado, clulas pigmentadas poligonales con contenido pardo -rojizo, abundancia de aceite y granos de aleurona 3-18 microgramos. Ausencias almidn, vasos y sber
Lino
Presencia de Oxalato de Calcio y ausencia de almidn y pelos epidrmicos: clavo cilantro alcaravea escila cscara de naranja y limn. Presencia de pelos epidrmicos, ausencia de almidn y oxalato de calcio: nuez vmica hoja de digital catec lobelia azafrn Presencia de almidn, ausencia de oxalato de calcio y pelos epidrmicos. tragacanto nuez moscada jengibre valeriana Presencia de pelos y oxalato de calcio, ausencia de almidn. hojas de sen estramonio beleo ans hammamelis
32
manzanilla romana Presencia de oxalato de Calcio y almidn, ausencia de pelos epidrmicos. a) Deteccin de vasos lignificados con floroglucina y HCl si los hay. cuasia regaliz jalapa si no los hay ruibarbo cardamomo canela b) Presencia de esencias en c ardamomo y canela. En general: semillas de cardamomo cuasia ruibarbo regaliz rawolfia ipecacuana genciana canela cscara sagrada quina podofilo cerezo quilaya ratania jalapa
BIBLIOGRAFIA: 1. Evans, W. C. "Farmacognosia. Trease -Evans". 13a Ed. Interamerica na McGraw Hill, Madrid -Auckland-Bogot, 1991. 2. Gattuso, M.A.; Gattuso, SJ. "Manual de procedimiento para el anlisis de drogas de drogas en polvo", UNR Editora, Rosario, 1999. Cyted.
33
Anlisis microscpico de algunas drogas Observaciones: Las fotografas son tomadas a placas montadas con fluoroglucina/HCl, vistas con ocular 6.3X Solo para montar la placa de lino: presionar con el cubreobjetos hasta lograr que el material quede como una delgada capa La observacin de diferentes estructuras de una mis ma planta algunas veces requiere el montaje de varias placas.
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
Bibliografa Deyson, G. Caractres analytiques des poudres vgtales. Paris, CDU et SEDES runis, 1976 Evans, W. C. "Farmacognosia. Trease -Evans". 13a Ed. Interamericana McGraw Hill, Madrid -Auckland-Bogot, 1991. Gattuso, M.A.; Gattuso, SJ. "Manual de procedimiento para el anlisis de drogas de drogas en polvo", UNR Editora, Rosario, 1999. Cyted.
45
Prctica 4b CONTROL DE CALIDAD DE PLANTAS MEDICINALES ANALISIS MACRO Y MICROSCPICO DE MATERIAL VEGETAL OBJETIVO Identificar los diferentes marcadores taxonmicos descritos en las farmacopeas para el control de calidad de un material vegetal como materia prima para productos fitoteraputicos utilizando agentes qumicos de tincin. Identificar una muestra problema de material vegetal en polvo mediante sus caractersticas organolpticas, macro y microscpicas.
BASE DEL MTODO El anlisis histoqumica del material vegetal en polvo ayuda en el proceso de control de calidad, evi dencindose la presencia de material extrao (arena), adulteraciones o falsificaciones. Este anlisis es de apoyo a los dems anlisis farmacopicos. MARCO TERICO El material vegetal es clasificado de acuerdo a sus caractersticas sensoriales, macroscpicas y microscpicas. Un examen para determinar estas caractersticas es en primer paso establecer la identidad y el grado de pureza del material, para despus llevarse a cabo posteriores anlisis. Siempre que sea posible, patrones del material o muestras d e calidad farmacopeica debe de estar disponible como referencia. Una inspeccin visual provee una simple y rpida medida para identificar el material, pureza y, posiblemente, calidad. Si una muestra es encontrada ser significativamente diferente, en trmin os de color, consistencia, olor o textura, de las especificaciones, se considera una NO conformidad de los requerimientos. Sin embargo, los juicios deben ser cautelosos con relacin al olor y la textura, debido a las diferencias que existen entre personas o por la misma persona a diferentes tiempos. Siendo entonces esta una habilidad sensorial que se afina con la experiencia. La identificacin macroscpica de una planta medicinal est basada en la forma, tamao, color, caractersticas superficiales, textur a, caractersticas al quebrarla y apariencia superficial de un corte. Sin embargo, mientras esas cualidades son juzgadas subjetivamente y sustituciones o adulteraciones pueden ser muy
46
parecidas al material genuino, a menudo es necesario respaldarse en anl isis microscpicos y/o fisicoqumicos. La inspeccin microscpica del material vegetal es indispensable por la identificacin del material quebrado o en polvo; el material debe de ser tratado con reactivos qumicos. Un examen microscpico solo NUNCA prove e una completa identificacin. Solo cuando esta asociado con otros mtodos analticos que frecuentemente suplen invaluable evidencia. Si la comparacin con material de referencia revela algunas caractersticas no descritas en los requerimientos, estos pue den ser atribuidos a material extrao, antes que un constituyente normal. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL REACTIVOS Y MATERIALES NECESARIOS POR GRUPO 10g de muestra vegetal fresca o seca en polvo. 3 Porta objetos Tamiz malla #20. 3 Cubre objetos Reactivos de coloracin 1 microscpico por cada 3 gru pos A cada grupo de estudiante se le asignar una monografa farmacopica, la cul debern de analizar para el posterior desarrollo en el laboratorio de las tcnicas macro y microscpicas descritas. 1. Pruebas o rganolpticas: Anotar el color, olor y sabor de la muestra asignada. 2. Con base en la monografa asignada y el material vegetal entregado, encontrar todos los tejidos descritos dentro de la monografa siguiendo cuidadosamente el procedimiento descrito de coloracin o limpieza. Dibujar cada una de las caractersticas visualizadas al microscopio. 3. Comparar el material vegetal problema asignado con las monografas disponibles, visualizar los marcadores taxonmicos descritos y concluir. DETECCIN HISTOQU MICA DE TEJIDO VEGETAL Y SU CONTENIDO 1. Hidrato de cloral: Una solucin de hidrato de cloral (80 g de hidrato de cloral en 20 mL de agua) se utiliza como agente clarificante. Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos y agregar de 2 -8 gotas que impregnen todo el material
Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoqumica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff
47
vegetal y calentar suavemente. El hidrato de clorar disuelve contenido celular y sustancias extracelular (granos de almidn, granos de aleurona) y permite una mejor visualizacin de tejidos celulares como: pared celular, fibras, vasos, cristales de oxalato de calcio, tricomas, estomas y polen. 2. Glicerol: Se utiliza como medio para la visualizar material vegetal al microscopio y para prevenir el secado de soluciones acuosas o de hidrato de cloral. Se agregan 2 3 gotas a la muestra en el portaobjetos y se coloca el cubreobjetos. 3. Deteccin de concreciones de carbonato de calcio (cistolitos) y de cristales de oxalato de calcio: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos. Verter 2 3 gotas de cido clorhdr ico 2M, con la precaucin de que el reactivo est en ntimo contacto con todos los componentes del polvo. Colocar el cubreobjetos y observar inmediatamente al microscopio a 10x. La presencia de carbonato de calcio est indicada por la aparicin de burbujas . Los cristales de oxalato de calcio, que en general tardan ms tiempo en disolverse, no desprenden burbujas. 4. Deteccin de almidn: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos. Verter 2 3 gotas de Solucin de Lugol diluida (1:5) en agua . Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio a 10x y 40x. Los granos de almidn se colorean de azul -violceo intenso. (Esta reaccin en reversible al ser calentado el portaobjetos) 5. Deteccin de lpidos y aceites esenciales: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos. Verter 2 3 gotas de solucin de Sudan III (0.5 g Sudan III calentados a reflujo en etanol o isopropil alcohol) y dejar actuar durante 2 3 minutos. Escurrir el lquido y lavar bien con alcohol 70 %. Colocar el cubr eobjetos y observar al microscopio a 10x y 40x. Los lpidos aparecen como gotas de color rojo. 6. Deteccin de taninos: Colocar 2 a 3 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos. Verter 2 3 gotas de solucin de cloruro frrico al 5 %. Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio a 10x y 40x. La presencia de taninos se traduce en la aparicin de masas oscuras de color pardo, azul o negro. 7. Deteccin de celulosa: Colocar 2 a 3 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos. Verter 1 2 gotas de soluci n de cloruro de zinc yodado (Disolver 20 g de cloruro de zinc y 6.5 g de yoduro de potasio en 10.5 mL de agua), dejar reposar 2 minutos y agregar 1 gota de yodo (0.1 mol/L), dejar reposar 1 minuos, remover el exceso de reactivo con una tira de papel filtro y agregar 1 gota de H 2SO 4 60%. Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio, las paredes de celulosa se observan en colores desde el azul al violeta. 8. Deteccin de vasos lignificados (esclereidas, vasos, fibras, parenquima): Colocar 2 a 3 mg de la d roga en polvo sobre un portaobjetos y mezclarlos con un pequeo volumen de floroglucinol, dejar reposar hasta casi sequedad, agregar 1
48
gota de HCl 25%. Cubrir con un porta objeto y observar los vasos lignificados en colores desde el rosado hasta el color c ereza (rojo carmin). 9. Deteccin de suber: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos. Verter 2 3 gotas de solucin de Sudan III y dejar actuar durante 2 3 minutos o calentar suavemente. Los vasos suberizados o cuticulizados se observ al de color rojo al rojo-naranja. 10. Deteccin de granos de aleurona: Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos. Verter 2 3 gotas de solucin de yodo/etanol. Los granos de aleurona se observan amarillentos caf o caf. Agregar luego unas 2 3 gotas de trinitrofenol en etanol y los granos de tornarn amarillos. 11. Deteccin universal: Solucin A Diluir 20 mL de una solucin saturada de Sudan III en cido lctico con 30 mL de cido lctico. Solucin B Disolver 0.55 g de sulfato de anilin a en 35 mL de agua. Solucin C Disolver 0.55 g de yoduro de potasio y 0.05 g de yodo en 5 mL de agua y agregar 5 mL de etanol. Procedimiento Combinar la solucin A, solucin B y la Solucin C y agregar 2.5 mL de HCl con agitacin (No filtrar). Colocar 2 a 10 mg de la droga en polvo sobre un portaobjetos. Verter 2 3 gotas del reactivo y calentar suavemente. Cubrir con un porta objeto y observar los elementos lignificados de amarillo, sber de marrn, lpidos de color rojo y almidn de color azul -violeta. 12. Deteccin de estomas: Los estomas son unas aberturas que regulan la entrada y salida de gases. Estas aberturas estn rodeadas por clulas especializadas llamadas oclusivas que al cambiar de tamao y forma, modifican el dimetro de la abertura estomtic a y de este modo regulan el intercambio gaseoso.
49
Imagen tomada de: British pharmacopoeia, Appendix XI H. Stomata. 2003. 1- Anomocticos (irregulares): Los estomas estn rodeados por un nmero variado de clulas. 2 - Anisocticos (desiguales): Los est omas estn rodeados por tres clulas, de las cules una es marcadamente ms pequea que las otras. 3 - Diacticos (Atravesando): Los estomas estn incrustados entre dos clulas vecinas. 4 - Paracticos (Paralelos): Los estomas tienen paralelamente a ello s una o ms clulas vecinas. BIBLIOGRAFA 1. British Pharmacopoeia, 2003. 2. USP 27, NF 22. 2003. 3. Quality control methods for medicinal plant materials, WHO Geneva, 1998
50
Prctica 5 RECONOCIMIENTO CROMATOGRFICO DE PLANTAS MEDICINALES APROBADAS EN COLOMBIA
RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE AJENJO, Artemisia absinthium L., Asteraceae
Introduccin La droga la constituyen las hojas y flores. Las hojas contienen 0.3% de principios amargos (Absinthina y anabsinthina), mientras que las flores cont ienen un 0.15%.
Extraccin 1 g. de droga pulverizada se extrae durante 10 minutos con 10 ml de Metanol a 60C sobre un bao de agua. La mezcla se filtra y el filtrado se evapora hasta un volumen aprox. de 2 ml Fase estacionaria : Fase mvil: Revelador: Rf 0.3-0.4 Slica gel 60F -254 Cloroformo:Metanol 95:5 Liebermann-Burchard/UV 365 nm SUSTANCIA Absinthina COLOR amarillo ocre
RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DEL AJO, Allium sativum, Liliaceae Introduccin El bulbo o diente contiene cistena, cistina, sulfxido de metionina, cicloalina, alina (= Sulfxido de S -alilcistena), y deoxialina (=S -alil-cistena), junto con otros aminocidos azufrados y sulfxidos de cistena. Extraccin 25 g. de dientes frescos finamente desmenuzados se extraen en fro (con ayuda de hielo seco) con 2 porciones de 100 ml de metanol al 80%. Se purifica por cromatografa en columna, controlando las fracciones con Reactivo de Ninhidrina. Fase estacion aria: Fase mvil: Revelador: Slica gel 60 n-Butanol : n -Propanol : Acido actico glacial : Agua 30 : 10 : 10 : 10 Ninhidrina
51
Rf 0.5 0.7
SUSTANCIA Alicina Alina
COLOR Naranja Azul-violeta
RECONOCIMIENTO DE LA ALCACHOFA POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA Introduccin La droga la constituyen las hojas, las cuales contienen sesquiterpenlactonas como cinaropicrina, grossheimina y cinarina; cidos fenolcarboxilicos como 1,3 dicafeoilqunico, clorog nico y neoclorognico; y luteolina -7-O-glucsido, un flavonoide. Extraccin 1 g. de droga pulverizada se extrae durante 10 minutos con 10 ml de metanol sobre un bao de agua. La mezcla se filtra y se evapora hasta un volumen de aprox. 2 ml Fase estaciona ria: Fase mvil: Revelador: Slica gel 60F -254 Acetato de etilo:Acido frmico:Acido actico:Agua 100 : 11 : 11 : 27 Polietilnglicol para productos naturales/UV 365 nm
Rf 0.7 0.6 0.45 0.4
SIJSTANCIA Cinarina Luteolina-7-0-gluc. Acido clorognico Rutina
COLOR Azul fluorescente Amarillo Azul fluorescente Amarillo
52
RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE LA ALBAHACA, Ocimum basilicum , Lamiaceae Introduccin La droga la constituyen las hojas, las cuales contienen 0.1 -0.45% de aceite esencial. El aceite esencial contiene principalmente metilchavicol 55% y linalool. Extraccin a) Por arrastre con vapor de agua Mtodo oficial de la Farmacopea Europea III, pg. 62. b) Con Diclorometano 1 g. de droga pulverizada se extrae por agitacin durante 15 minutos con 10 ml de diclorometano. El filtrado obtenido se evapora a sequedad. El residuo se disuelve en 1 ml de Tolueno, y se aplican 50 -100 L. en la placa crom atogrfica. Fase estacionaria : Fase mvil: Revelador: Rf 0.3 0.9 Slica gel 60 Tolueno : Acetato de Etilo 93 : 7 Vainillina- Acido sulfrico SUSTANCIA Linalool Metilchavicol COLOR Azul intenso Rojo violeta
RECONOCIMIEN TO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE LA HIERBABUENA, Mentha viridis L., Lamiaceae Introduccin La droga la constituyen las hojas y ramas jvenes, las cuales contienen 1.2% de aceite esencial. El aceite contiene principalmente L -Carvona 42 -67%, mentol, ac etato de dihidrocarveol, alcohol dihidrocuminlico, pineno, limoneno y felandreno.
53
Extraccin 1) Destilacin por arrastre con vapor de agua Se utiliza el mtodo oficial de la Farmacopea Europea III pg. 62 con 50 g de muestra, 500 ml de agua, 2 horas d e destilacin a un flujo de 3 -3.5 ml /min. 2) Extraccin con diclorometano Como se describi para la albahaca Fase estacionaria : Fase mvil: Revelador: Rf 0.25 0.46 0.7 Slica gel 60 Tolueno : Acetato de Etilo 93 : 7 Vain illina-Acido sulfrico SUSTANCIA Alcohol dihidrocumnico Carvona Acetato de dehidrocarveol COLOR Azul intenso Rojo-Violeta Azul intenso
RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE HINOJO, Foeniculum vulgare , Apiaceae Introduccin La droga la constituyen los frutos, los cuales contienen 2 -7% de aceite esencial. El aceite esencial contiene principalmente anetol (50 -80% en la variedad dulce, 60 -80% en la variedad vulgare), metilchavicol, safrol, anisaldehdo y fenchona (0.4 -0.8% en la variedad dulce, 12 -22% en la variedad vulgare). Extraccin 1) Destilacin por arrastre con vapor de agua Segn el mtodo oficial de la Farmacopea Europea III, pg. 62, utilizando 10 g. de muestra, 200 ml de agua, 2 horas de destilacin a una rat a de 2-3 ml /min. 2) Extraccin con diclorometano Tal como se describi para la albahaca. Fase estacionaria : Slica gel 60 Fase mvil: Tolueno : Acetato de Etilo 93 : 7 Reveladores : 1.Vainillina -Acido sulfrico 2. PMA-Permanganato de potasio 3. Acido sulfrico concentrado
54
Rf 0.6 0.9
SUSTANCIA Fenchona Anetol
REVELADOR 3 1 2 3
COLOR Azul oscuro Rojo-Violeta Rojo-Pardo Azul oscuro
Nota: La fenchona no se detecta en estas condiciones para el ans, lo que permite diferenciar las dos plantas. RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE LA MALVA, Malva sylvestris , Malvaceae Introduccin La flor contiene la malvina, un pigmento que le confiere el color caracterstico. Extraccin 1 g. de droga pulverizada se extrae por agitacin durante 15 minutos con 6 ml de Metanol:Acido Clorhdrico (9 partes de metanol, 1 parte de cido al 25%). Se utilizan 25 l del filtrado para la cromatografa. Fase estacionaria : Fase mvil: Reveladores : Slica gel 60F -254 n -Butanol : Acido actico glacial : Agua 40 : 10 : 20 Ninguno
Rf 0.4
SUSTANCIA Malvina (=Malvidin -3,5-diglucsido
COLOR Violceo
RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE LA MANZANILLA MATRICARIA, Matricaria chamomilla , Asteraceae Introduccin La droga la constituyen las flores, las cuales contienen 0.5 -1.5% de aceite esencial. El aceite esencial a su vez contiene chamazuleno 0 -15%, bisabolol 10 -25%, bisabolol xidos A y B (ambos 10 -25%), polinas 1 -40%, farneseno 15%.
55
Extraccin a) Destilacin por arrastre con vapor de agua Segn mtodo oficial de la F. Eur. III pg. 62 con: 50 g de muestra, 500 ml de agua destilada de una solucin de cloruro de sodio al 1%, 4 horas de destilacin a 3 -4 ml/minuto. b) Extraccin con Dclorometano Tal como se ha descrito para la albahaca. Fase estacionaria : Fase mvil: Revelador: Rf 0.2 0.25 0.35 0.5-0.6 0.95 0.99 Slica gel 60 T olueno : Acetato de Etilo 93 : 7 Vainillina -Acido sulfrico SUSTANCIA Oxidos A y B de bisabolol Alcohol terpenoide Bisabolol Polinas Azuleno Farneseno COLOR Amarillo/Verde Violeta Violeta Pardo Rojo violeta Azul-Violeta
RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DEL ROMERO, Rosmarinus officinalis , Lamiaceae Introduccin Las hojas contienen 1 -2% de aceite esencial, el cual contiene principalmente 1,8 -cineol 15-30%, borneol 10-20%, acetato de bornilo, camfeno 5 -10%, alfa- y beta-pineno. Extraccin a) Destilacin por arrastre con vapor de agua Segn mtodo oficial de la Farm. Eur. III pg. 62. b) Extraccin con diclorometano Tal como se describi para la albahaca. Fase estacionaria : Fase mvil: Revelador: Slica gel 60 Tolueno : Acetato de Etilo 93 : 7 Vainillina -Acido sulfrico
56
Rf 0.25 0.45 0.7 0.99
SUSTANCIA Borneol Cineol Acetato de bornil o Alfa- y beta-pineno
COLOR Azul oscuro Azul intenso Azul intenso Violeta
RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE LA SABILA, Aloe vera, Liliaceae Introduccin La droga la constituye el jugo desecado de las hojas el cual contiene 14 -28% de principios antracnicos tal es como alona, aloesinas A y B, aloinsidos A y B, etc. Extraccin 0.5 g. de droga pulverizada se extraen con 5 ml de Metanol, calentando durante 5 minutos sobre un bao de agua. El filtrado se aplica directamente sobre la placa cromatogrfica. Fase estacionaria: Fase mvil: Slica gel 60F -254 Acetato de etilo : Metanol : Agua 100 : 13.5 : 10 1) Hidrxido de potasio/ UV 365 nm 2) Poiietilnglicol PN/UV 365 nm
Reveladores :
Rf 0.3 0.47 0.95 ---
SUSTANCIA Aloinsidos A y B Alona Alo-emodina Aloesinas A y B
REVELADOR 1y2 1y2 1 1
COLOR Amarillo Amarillo Rojo Azul fluorescente
57
RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE FLORES DE SAUCO, Sambucus nigra , Caprifoliaceae Introduccin La droga la constituyen las flores, las cuales contienen glicsidos de quercetina 1.5 -3% como hipersido, isoquercitrina y rutina. Extraccin 1 g. de droga pulverizada se extrae con 10 ml de metanol durante 5 minutos sobre un bao de agua a aproximadamente 60 C. El filtrado se utiliza para la cromatografa. Fase estacionaria : Fase mvil: Slica gel 60F -254 Acetato de etilo : Acido frmico : Acido actico : Agua 100 : 11 : 11 : 27 1) R. productos naturales/UV 365 nm 2) Polietilnglicol para productos naturales/UV 365 nm
Reveladores :
Rf 0.4 0.7 0.9
SUSTANCIA Rutina Isoquercitrina Acido cafeico
COLOR Amarillo Amarillo Azul fluorescente
RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE HOJAS DE TORONJIL, Melissa officinalis , Lamiaceae Introduccin Las hojas contienen 0.01 -0.25% de aceite esencial, el cual est constituido principalmente de Citronelal 39%, Citral 30%, citronelol, linal ool, geraniol y cariofileno. Extraccin a) Por arrastre con vapor de agua Segn el mtodo oficial de la Farmacopea Europea III pg. 62, con: 40 g. de muestra, 400 ml de agua, destilando a 2 -3 ml/min durante 2 horas.
58
b) Extraccin con Diclorometano Como se describi para la albahaca. Fase estacionaria : Slica gel 60 Fase mvil: Cloroformo Revelador: Anisaldehdo/Acido sulfrico Rf SUSTANCIA 0.7 Citronelal 0.45 0.25-0.4 Citral Geraniol, linalool y Citronelol
COLOR Azul intenso Azul violceo Azul violceo
RECONOCIMIENTO POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE RAICES DE VALERIANA, Valeriana officinalis , Valerianaceae Introduccin La droga la constituyen las races o rizomas que contienen los valepotriatos como: valtrato, isovaltrato, IVDH_Valtrato, didrovaltrato y acevaltrato, cuya concentracin cambia de una variedad a otra. Adems contiene 0.25% de aceite esencial en los rizomas frescos, el cual contiene valerenal, valeranona y cido valernico. Extraccin 0.2 g. de droga pulverizada se extraen con 5 ml de diclorometano durante 5 minutos a unos 60 0C con agitacin ocasional. El residuo de la filtracin se lava con otros 2 ml de diclorometano. Los extractos combinados se evaporan a sequedad, y el residuo d e disuelve en 0.2 ml de acetato de etilo. Se aplican en la cromatoplaca 10 microlitros de esta solucin. Fase estacionaria : Fase mvil: Revelador: Rf 0.73 0.65 0.55 0.4 <0.4 Origen Slica gel 60 Tolueno : Acetato de etilo 75 : 25 HCl concentrado : Acido actico glacial 2:8 SUSTANCIA Valtrato/Isovaltrato Didrovaltrato Acevaltrato IVDH-Valtrato Valtrahidrinas Productos de degradacin COLOR Azul Pardo Azul Azul Azul
59
Prctica 6 ACEITES ES ENCIALES INTRODUCCIN El caracterstico olor, aroma, de ciertas plantas es debido al aceite esencial o voltil all presente y usado desde la antigedad como fuente natural de fragancias y perfumes. Actualmente los aceites esenciales son usado en la perfu mera, en la industria alimenticia o como fuente de materias primas. Algunos con propiedades adicionales son usados como carminativos, aromatizantes, anestsicos locales y ltimamente otros con propiedades antiemticas e insecticidas. Los aceites esencial es o esencias vegetales son mezclas de un numero variables de sustancias olorosas. En un aceite esencial pueden encontrarse hidrocarburos alicclicos y aromticos , as como sus derivados oxigenados, alcoholes, aldehdos, cetonas, steres, sustancias azuf radas y nitrogenadas. Los componentes mas frecuentes se derivan del cido mevalnico; se les cataloga como monoterpenos de 10 unidades de carbono y sesquiterpenoides con 15 unidades de carbono. Todos los aceites esenciales oficinales se extraen por destila cin, con excepcin del de limn y el de cade. La destilacin de las esencias por medio de agua o vapor se ha practicado durante mucho tiempo, pero las modernas plantas industriales poseen muchas ventajas sobre las antiguas destileras, en las que con frec uencia se produca la carbonizacin y descomposicin de la esencia. En la moderna destilera de aceites esenciales, la materia prima esta contenida en cestos o bandejas perforados. El destilador contiene agua en el fondo, la cual se calienta mediante ser pentines por los que circula vapor, o tambin haciendo pasar a su travs vapor de agua a presin. Algunas esencias como las de cayeput, alcaravea, trementina y de leo sndalo australiano, son rectificadas. Esta consiste, generalmente en una segunda desti lacin en corriente de vapor, que libera la esencia de resinas y otras impurezas. La luz y el oxigeno atmosfrico parecen ejercer un efecto adverso sobre la mayora de los aceites esenciales, por lo que deben de seguirse estrictamente las directrices ofici ales respecto del almacenamiento. Las esencias utilizadas en perfumera, se pueden extraer por arrastre con vapor, como se describi anteriormente. Pero algunos requieren de otro tipo de tratamiento, como son el enflorado, digestin en grasas calientes, m todos neumticos o por medio de disolventes. El rendimiento de esencia obtenido de una planta vara de unas cuantas milsimas por ciento del peso vegetal hasta 1 -3%. La composicin del aceite puede cambiar con la poca de la recoleccin, el lugar geogrfic o o pequeos cambios genticos. En gimnospermas y angiospermas es donde aparecen las principales especies que contienen aceites esenciales, distribuyndose entre unas 60 familias. Son particularmente ricas en esencias las pinceas, laurceas, mirtceas, l abiceas, umbelferas, rutceas, y compuestas.
60
2. Destilacion Por Arrastre Con Vapor De Aceites Esenciales OBJETIVO Separar los aceites esenciales de: Comino, clavos de olor. corteza de canela, ans, eucalipto, etc. y tratar de caracterizar sus const ituyentes, despus de aislarlos por cromatografa de columna y/o capa fina. PROCEDIMIENTO El mas antiguo y sencillo mtodo para obtener aceites esenciales es la destilacin por arrastre con vapor, a partir de material vegetal, lo ms fresco posible. Usand o matraces de 1 a 6 litros, en el laboratorio se pueden destilar por arrastre con vapor continuo 100 a 500 g. de planta fresca, con buena recuperacin de la esencia.
3 1
4 3 2 1
7 8 9 10 11 3 2
7 8 9
10
Fig. 1. Equipo para extraer aceites esenciales por arrastre con vapor En el matraz 1 co locar suficiente agua (mas o menos 1 litro por cada Kg de material vegetal) y unos ncleos de ebullicin; si se cuenta con un equipo generador de vapor, como una olla a presin la cual a travs del conducto de la vlvula se puede conducir el vapor hacia el compartimento donde se encuentra el material vegetal. En el compartimento 2 se ubica la muestra picada en pequeos trozos. El agua se somete a calentamiento, logrando as la generacin de vapor, que a medida que asciende y atraviesa el material vegetal v a extrayendo el aceite esencial. En el embudo de separacin 3, se recoge el destilado; este se puede recoger sobre una
61
solucin saturada de cloruro de sodio, con el fin de disminuir la formacin de la emulsin aceite en agua. Tambin es de utilidad el ad icionarle un poco de ter etlico o diclorometano al embudo, con el fin de observar mas fcilmente las dos fases y as favorecer la separacin. Nota: la unin entre el embudo de separacin y el condensador, debe permitir la liberacin de presin, de lo co ntrario el equipo puede romperse por exceso de presin. Una vez cese la destilacin, separe las dos fases. La fase etrea se seca con sulfato de sodio anhidro y se concentra a 40 -45C ( no es necesaria la presin reducida). Una vez el aceite este libre de solvente, pese y calcule el rendimiento con base en el material vegetal de partida. 2. Extraccin de aceites esenciales con solventes OBJETIVO Separar los aceites esenciales con solventes no polares y caracterizar sus componentes por mtodos espectrofo tomtricos. PROCEDIMIENTO Se extraen 30 g. de muestra seca y molida en un dispositivo Sohxlet con un volumen suficiente de ter de petrleo. Las fases etreas se juntan, se filtran, se secan con Na 2SO 4 anhidro, se filtran de nuevo y se evaporan a sequedad con calentamiento suave. El residuo de evaporacin debe tener el olor caracterstico de la muestra antes de extraerla. Este es el aceite esencial crudo (AEC) el cual se pesa para calcular su rendimiento.
62
ANLISIS CROMATOGRFICO Y AISLAMIENTO DE COMPONENTES PRINCIPALES EXTRACCIN. Se extraen 30 g. de muestra seca y molida en un dispositivo Sohxlet con un volumen suficiente de ter de petrleo. Las fases etreas se juntan, se filtran, se secan con Na 2SO 4 anhidro, se filtran de nuevo y se evaporan a seq uedad con calentamiento suave. El residuo de evaporacin debe tener el olor caracterstico de la muestra antes de extraerla. Este es el aceite esencial crudo (AEC) el cual se pesa para calcular su rendimiento.
ANLISIS POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA. El AEC se redisuelve en unos ml de ter de petrleo o cloroformo y se analiza por CCF con slica gel y c/u de los siguientes eluentes: a) Diclorometano b) Tolueno: acetato de etilo 93:7 Para revelar cada una de las cromatoplacas se utilizan los siguientes revelad ores: a) b) c) d) e) Luz ultravioleta (254 y 375 nm) Olfato Vapores de yodo 2,4- Dinitrofenilhidrazina (0.4 g. en 100 ml HCl 2 N) Vainillina/cido sulfrico
NOTA: De acuerdo con los resultados de este anlisis se escoge el sistema cromatogrfico en el cual el componente principal del aceite se observe bien separado de los dems componentes. FRACCIONAMIENTO POR CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA El AEC se aplica disuelto en un pequeo volumen del eluente escogido y se aplica a una placa cromatogrfica de slica gel. Se eluye con el eluente escogido. Los componentes mayoritarios pueden reconocerse por revelado con luz ultravioleta de 254 nm (compuestos con enlaces dobles conjugados), o cortando una tira lateral de la placa y revelndola con alguno de los revelado res c, d e, citados arriba. EXTRACCION DE LOS COMPONENTES POR CCF Los componentes mayoritarios se raspan con la ayuda de la lmpara UV el revelador, se extraen con una mezcla 1:1 de alcohol:cloroformo. Se filtra y se lleva a sequedad. El residuo debe ser el componente puro o con algunas impurezas. En el caso que se observe que el compuesto est muy impuro puede purificrsele por otra CCF preparativa.
63
ANALISIS DEL COMPONENTE PURO. a) Ensayos de coloracin. Si se obtiene una buena cantidad del compuest o puro se pueden realizar ensayos para fenoles, aldehdos y cetonas, alcoholes, etc. b) Anlisis Espectral. Al componente puro se le determinan los espectros infrarrojo, ultravioleta, etc.
64
PRACTICA 7. TECNICAS GENERALES DE EXTRACCIN Y VALORACION DE U NA DROGA a. Valoracin de alcaloides del tropano El trmino alcaloide (de lcali), fue propuesto por el farmacutico W. Meissner en 1819, se aplic a los compuestos de origen vegetal con propiedades alcalinas, este carcter bsico es debido a la presenci a de nitrgeno amnico en su estructura. No existe una definicin exacta para el termino alcaloide s, pero se pueden considerar como compuestos orgnicos de origen natural ( vegetal: familias Lauraceae, Ranunculaceae, Magnoliaceae, Annonaceae, Menispermacea e, Papaveraceae, Fumariaceae, Rutaceae, Apocynaceaae, Loganiaceae, Solanaceae , Rubiaceae; animal: ranas de la familia Mantellidae quienes presentan alcaloides txicos en piel ; bacteriano: la Pseudomona aeruginosa produce la Piocianina , hongos: el Psilocybe produce Psilocyna y Psilocybina, etc.), nitrogenados, derivados generalmente de aminocidos, mas o menos bsico, de distribucin restringida, con propiedades farmacolgicas importantes a dosis bajas (gran variedad de actividad sobre SNC y SNA) y que presentan gran diversidad estructural .
N N piridina N indolicidina
N quinolicidina O
N tetrahidro isoquinoleina
pirrolidina piperidina
N N tropano quinoleina
N imidazol indol
N O N
N N
N N purina
N O diterpnico N esteroidal
N espermidina
Figura 1. Algunos ejemplos de variabilidad estructural de los alcaloides Para su estudio, algunos autores dividen los alcaloides en cuatro clases (figura 2): 1. Alcaloides Verdaderos : los cuales cumple n estrictamente con las caractersticas de la definicin de alcaloide: tienen siempre un nitrgeno heterocclico, son de carcter bsico y existen en la naturaleza normalmente en estado de sal, biolgicamente son formados a partir de aminocidos.
65
2. Protoalcaloides: son aminas simples con nitrgeno extracclico, de carcter bsico y que son productos del metabolismo de los aminocidos. 3. Pseudoalcaloides : presentan todas las caractersticas de la definicin de alcaloide pero no son derivados de aminocidos. 4. Alcaloides imperfectos : se derivan de bases pricas y no precipitan con los reactivos especficos para alcaloides. No son alcaloides los aminocidos, las betalanas, los pptidos, los amino azcares, las vitaminas nitrogenadas, las porfirinas, algunas bases c omo la tiamina ampliamente distribuida en los seres vivos y los alkil aminas de bajo peso molecular. Los alcaloides se han clasificado en funcin de su estructura (heterocclica y no heterocclica), actualmente existen varias formas de clasificarlos 1,6 segn sus propiedades farmacolgicas, distribucin botnica de acuerdo a su origen biosinttico .
Acetil CoA Malonil CoA Proteinas
N2 Aminoacidos Aminocidos Aminocidos modificados
Mevalonato
Policetidos
- CO2 Alcaloides Imperfectos No cclicas Aminas Cclicas
NH3
Protoalcaloides
Isoprenoides Aminados
Policetidos Aminados
Alcaloides Verdaderos
Pseudoalcaloides
figura 2. Aspectos biogenticos para la clasificacin de los alcaloides
EL NITROGENO es necesario para la construccin de amino cidos que posteriormente se convertirn en protenas, y de nucleotidos que harn parte de los cidos nucleicos, en las plantas l a funcin de los alcaloides no es aun clara, se ha sugerido que estas sustancias pueden actuar en los v egetales como:
66
Fuente de almacenamiento del nitrgeno sobrante Productos de desecho del nitrgeno sobrante Protectores por su sabor amargo evitan el ataque de insectos, los alcaloides generalmente se localizan en los tejidos perifricos de los rganos de la planta (recubrimiento de las semillas, corteza del tallo, raz o fruto, epidermis de la hoja) . Rreguladores del crecimiento se ha demostrado que los alcaloides derivados de la putrescina se incrementan notablemente en algunas plantas cuando se encuentran en suelos deficientes de potasio 2,3, no obstante la prdida de alcaloides en el vstago de plantas que normalmente los acumulan en las partes areas, ( Nicotiana y Daturas) no ha impedido el desarrollo, lo cual sugiere que los alcaloides no son esenciales para los vegetales.
Los alcaloides se reconocen en el laboratorio por su capacidad de combinarse con el yodo o los metales pesados (bismuto, mercurio, tunsgteno) cuando se encuentran en forma de sal en extractos cidos formando precipitados; en la prctica, se utilizan los siguientes reactivos para su deteccin: yodo-yoduro de potasio (Reactivo de Wagner), mercurio tetrayoduro de potasio (reactivo de Mayer), tetrayodo bismuto de potasio (reactivo de Dragendorff), solucin de cido pcrico (reactivo de Hager), cido slico tngtico (reactivo de Bertrand), p-dimetilamino benzaldehido (reactivo de Ehrlich); reaccin de Vitali-Morin (para alcaloides en estado base). La extraccin y aislamiento se fundamentan en la diferencia de solubilidad que presentan los alcaloides segn se encuentren en forma de sal (sales de cidos orgnicos y combinaciones con otras sustancias solubles en solvente polares: agua, soluciones cidas e hidroalcoholicas ) de base (solubles en solventes orgnicos no polares: diclorometano, acetato de etilo ), generalmente son incoloros, pero las conjugaciones en la molcula producen coloraciones que van desde el amarillo hasta el rojo , adems la mayora son slidos a temperatura ambiente, pero hay excepciones (la nicotina que es lquida).
+ H X
.. R 3N
Alcaloide base
+ R 3 NH X
Alcaloide sal
La extraccin puede realizarse mediante mtodos generales como : 1. Extraccin en medio alcalino : en donde una solucin alcalina desplaza los alcaloides de sus combinaciones salinas y las bases liberadas son solubilizadas en un solvente orgnico medianamente polar 2. Extraccin en medio cido : Extraccin de los alcaloides en forma de sales con agua acidulada, alcohol o solucin hidroalcohlica acidulada, seguido de una alcalinizacin y extraccin de los alcaloides base con un solvente orgnico no
67
miscible (alcaloides y compuestos nitrogenados. Universidad de Antioquia, G. J. Arango 2000)
68
EXTRACCIN DE ALCALOIDES EN MEDIO ALCALINO (FIGURA 3)
DROGA SECA Y DESENGRASADA 1. Alcalinizacin 2. Extraccin con solvente orgnico apolar
Marco libre de alcaloides Mayer (-)
Solucin de alcaloides bases (+ impurezas)
extraccin con cido diluido
Solucin cida (alcaloides sales) 1. Alcalinizacin 2. Extraccin solvente org. no polar
Solucin orgnica (libre de alcaloides)
Fase acuosa alcalina
Fase orgnica (alcaloides bases)
deshidratacin evaporacin en vaco
Alcaloides Totales (AT)
MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA Y FITOQUMICA 2008
69
DROGA EN POLVO, SECA Y DESENGRASADA 1. Maceracin en alcohol al 70% 2. Concentracin del macerado
Solucin acuosa (alcaloides sales) 1. Alcalinizacin 2. Ext. con solvente organico medianamente apolar
Fase acuosa (alcalina) Ext. con sol. cida dil.
Fase orgnica (alcaloides bases)
Fase acuosa (Alcaloides sales) 1. alcalinizacin 2. extraccin con solvente organico inmisible
Fase orgnica (impurezas)
Fase acuosa alcalina (impurezas)
Fase orgnica (alcaloides bases) evaporacin
Alcaloides totales
VALORACION DE ALCALOIDES DEL TROPANO (Flores y hojas de Datura sp.) La hioscina (escopolamina) y la hiosciamina son los alcaloides principales de las especies de Datura (Solanaceae), pertenecen al grupo de los alcaloides tropn icos de
70
conocida actividad farmacolgica, estos alcaloides se encuentran en algunos gneros de la familia Solanceas : Atropa, Datura, Duboisia, Hyoscyamus, Mandragora, Scopolia, etc. Adems se encuentran en otros gneros de familias como el Erythroxylum (Erythroxylaceae).
CH 3
CH3 N
N O
CH3 N
COOMe OH O C 6 H5
O
O O Ph
Ph
OH
OH
L-Hiosciamina : Atropina Ester del acido trpico con la tropina
ACITIVIDAD BIOLOGICA La Atropina ( l(-)-hiosciamina) se encuentra en Atropa belladona , Datura stramonium y la escopolamina ( l(-)hioscina) en Hyosciamus n iger, los ismeros l(-) de ambos alcaloides son 100 veces mas potente s que los ismeros d (+). Se absorben bien en el intestino y a travs de la conjuntiva alcanzando el sistema nervioso central en un lapso de tiempo entre 30 60 minutos, en donde provocan bloqueo competitivo reversible de las acciones de los colinomim ticos (acetilcolina y anlogos) en los receptores muscarnicos (farmacologa bsica y clnica de B. G. Katzung 1999) Efecto en los organos Sistema Nervioso Central: Estimulan o deprimen dependiendo de la dosis empleada, a dosis txicas estimulan con ap aricin de irritabilidad inquietud, desorientacin, alucinaciones y delirio, si la dosis incrementa el esta de intoxicacin pro gresa hacia la depresin profunda, coma, parlisi s respiratoria depresin cadiovascular y eventualmente la muerte . Gastrointesti nales: reducen la secrecin salival . Cardiovasculares: producen boqueo colin rgico en el ndulo sinusal el cu al genera taquicardia y cuya intensidad depende la dosis . Efectos oculares : bloquea la accin parasimptic a en las fibras circulares del iris y el msculo ciliar produciendo midriasis (pupila dilatada) y cicloplej a (desenfoque para visin lejana e incremento de la presin intraocular) ( Fundamento s de farmacologa en teraputica C.A. Isaza 1992).
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Extraccin de alcalo ides por el mtodo cido . En un erlenmeyer de 250 ml se colocan 10 g de material vegetal seco y molido con suficiente cantidad de etanol del 95% (v/v) que cubra la muestra (aproximadamente 100 ml), se macera a temperatura ambiente por 24 horas, tambin pu ede realizarse un
71
reflujo durante 2 horas si no se dispone del tiempo para la maceracin a temperatura ambiente. El extracto etan lico se filtra, el residuo slido se lava con 3 porciones de etanol de 10-15 ml y se descarta, la reunin de los filtrados se concentra a un pequeo volumen o se evapora a sequedad, luego se le adicionan 15 ml de H 2SO 4 0.5 N y 10 ml de agua destilada. La fase acuosa cida se extrae con tres porciones de 10 ml de hexano para desengrasar, la fase orgnica hex nica se descarta y las acuosas cidas se alcalinizan con NH 4OH al 25% hasta obtener un pH entre 10 y 11, posteriormente se extraen con tres porciones de 10 ml de diclorometano. Los extractos dicloromet nicos reunidos son secados sobre sulfato de sodio anhidro y llevados a seque dad en rotaevaporador, el residuo alcalo dico se redisuelve en 3 5 gotas de etanol y 5.0 ml de H 2SO 4 0.02N (medidos exactamente con pipeta volumtrica), se adicionan 15 ml de agua destilada y 2 -3 gotas del indicador rojo de metilo (viraje de pH entre 4. 2 - 6.3). Esta solucin cida (color rosa) es valorada por retroceso, por adicin de una solucin de NaOH 0.01 N desde una bureta hasta que el color de la solucin cambie a amarillo.
72
DIAGRAMA DE FLUJO VALORACIN DE ALCALOIDES DEL TROPANO Base del mtodo: extraccin de alcaloides en medio cido
Material vegetal Seco y Molido (10 g) Extraer ETOH al 95 % (100 ml) por 24 horas a 25 C reflujo de 2h Filtrar, Lavar con ETOH (porciones de 10 ml)
FILTRADO
RESIDUO SOLIDO
Concentrar, Adicionar 15 ml H2SO4 0.5 N y 10 ml H2O Filtrar si es necesario Extraer con 15 ml Hexano (3 porciones)
DESECHAR
FASE ORGANICA (hexano)
FASE ACUOSA
DESECHAR
Alcalinizar con NH4OH 25% (pH: 10 -11) Extraer con 15 ml CH2Cl2 (3 porciones)
FASE ACUOSA
FASE ORGANICA (CH2Cl2) inferior
DESECHAR
Filtrar sobre Na2SO4 LLevar a sequedad en RVP balon pequeo Redisolver en gotas de ETOH y 5.0 ml H2SO4 0.02 N
Agregar 15 ml H2O Agregar 2 - 3 gotas Indicador Rojo de Metilo (pH: 4.2 - 6.3)
Retrovaloracin: Sln NaOH 0.01 N Punto final: cambio a color amarillo
Nota: 1. Si al agregar el indicador rojo de metilo no se observa cambio de color a rojo y la solucin permanece de color amarillo, debe agregarse mayor cantidad de cido ya que los alcaloides de la mues tra han consumido todo el cido agregado, y es necesario establecer el medio cido para proceder con la retrovaloracin. 2. Segn el libro Farmacognosia de Trease and Evans 13 edicin, Editorial Interamericana Mc Graw -Hill 1991 pgina 606, el Estramonio pu ede contener entre 0.2 y 0.45% de alcaloides siendo los principales la hiosciamina y la hioscina (escopolamina), la droga BP contiene no menos de 0.25% de alcaloide.
73
Clculos
Tener en cuenta que: 1. Asumir el punto final de la titulacin como el punto d e equivalencia para tomar el volumen de base utilizada en el proceso de neutralizacin. 2. Calcular el volumen de Volumen de H 2SO 4 0.02N neutralizado por el alcaloide base 3. El H 2SO 4 es un cido diprtico, entonces por cada meq de cido reaccionan 2 equivalentes de base NaOH. 4. Cada 1 ml. de cido o de base 0.01 N es equivalente a 2.892 mg. del alcaloide calculado como L - hiosciamina. PM = 289.2 g/n En el punto de equivalencia: 1 Meq de Acido = 2 Meq de base N H2SO4 x V H2SO4 = 2 (N NaOH x V NaOH) V H2SO4 libre (exceso) = 2 (N NaOH x V NaOH ) N H2SO4 V H2SO4 que reacciona con el alcaloide base = 5.0 ml - V H2SO4 libre (exceso) % Alcaloides en la muestra = 2 (5.0 ml - ((V NaOH x N
NaOH )/
H2SO4 ))
x 2.892 mg/ml x 100
Peso de muestra (mg)
Datos: N H2SO4 = 0.02 N NaOH = 0.01 V H2SO4 = 5.0 ml V NaOH = ?
b. Cuantificacin de rutina en flores de saco y en partes areas de pensamiento Introduccin La rutina es un glicsido flavonoide que se encuentra ampl iamente distribuido en plantas y productos fitofarmacuticos. Esta amplia distribucin, junto con la facilidad en su deteccin a nivel de laboratorio mediante la cromatografa en capa fina (CCF) y la espectroscopia Ultravioleta (UV), la hacen un indicador adecuado para el
74
reconocimiento y el control de calidad de productos fitofarmacuticos terminados o sus materias primas vegetales correspondientes. Procedimiento Preparar una solucin estndar de rutina en metanol de concentracin 100 ppm Tomar 1.2 ml de solucin completar a 10 ml y determinar el espectro UV entre 200 y 400 nm. Seleccionar la longitud de onda de trabajo. Para obtener la curva de calibracin, tomar alcuotas de la solucin estndar y llevar a 10 ml segn la tabla siguiente. Leer absorbanc ias de cada solucin a la longitud de onda de trabajo. Realizar una curva de Absorbancia vs. Concentracin en ppm. Alcuota (ml) 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 Volumen final (ml) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 Absorbancia a 360 nm Concentracin de rutina (ppm)
La grfica muestra una curva de calibracin obtenida experimentalmente con alcuotas tomadas a partir de una solucin estndar de rutina de concentracin aproximada a 100 ppm.
Curva de calibracin de estndar de rutina
0,9
0,8
Absorbancia a 360 nm
0,7
0,6
0,5
y = 0,0352x + 0,037 R2 = 0,9906
0,4
0,3
0,2
0,1
0 0 5 10 15 20 25
Concentracin en metanol (ppm)
75
2. Extraccin de la droga 1 g de droga seca y en polvo (pesar con balanza de precisin 1 diezmilsima de gramo), se extrae con 10 ml de metanol, con agitacin, calentamiento en bao de agua a 60 C, durante 10 minutos. Filtrar, lavar el filtrado dos veces con 10 ml de metanol (preferiblemente cali ente), evaporar a sequedad y pesar el extracto obtenido. 3. Separacin mediante CCF Redisolver el extracto en 2 ml de metanol caliente y sembrar una banda en una cromatoplaca de slica gel GF -254 (20x10 cm, 1 mm espesor de capa), colocando al lado una apl icacin del estndar de rutina disuelto en metanol. Evaporar a sequedad el resto de extracto y pesar para determinar por diferencia el peso de extracto sembrado en CCF. Desarrollar en la mezcla Acetato de etilo/Acido frmico/Acido actico/Agua 100:11:11:2.7. La rutina se observa con un rf aproximado de 0.3, de color amarillo. Retirar la placa luego de desarrollar, dejarla secar en un extractor de vapores y analizarla con una lmpara UV a 254 nm. Demarcar la banda correspondiente a la rutina en la muestra, raspar y extraer con metanol caliente 3 veces (porciones de 5 a 10 ml). Los filtrados se concentran a sequedad y se redisuelven en 3 ml de metanol, medidos con exactitud. Ayudarse con una pipeta Pasteur para evitar prdidas.
4. Lectura espectrofotomtri ca y cuantificacin Leer absorbancia a 360 nm y determinar concentracin mediante interpolacin con la curva de calibracin. Determinar el porcentaje de rutina en la muestra y comparar con lo reportado para muestras autnticas.
c. Cuantificacin de r utina en un jarabe de saco Introduccin La rutina es un glicsido flavonoide que se encuentra ampliamente distribuido en plantas y productos fitofarmacuticos. Esta amplia distribucin, junto con la facilidad en su deteccin a nivel de laboratorio median te la cromatografa en capa fina (CCF) y la espectroscopia Ultravioleta (UV), la hacen un indicador adecuado para el reconocimiento y el control de calidad de productos fitofarmacuticos terminados o sus materias primas vegetales correspondientes. En este caso se propone un mtodo de cuantificacin en un jarabe.
76
Procedimiento Preparar una solucin estndar de rutina en metanol de concentracin 100 ppm Tomar 1.2 ml de solucin completar a 10 ml y determinar el espectro UV entre 200 y 400 nm. Seleccionar la longitud de onda de trabajo. Para obtener la curva de calibracin, tomar alcuotas de la solucin estndar y llevar a 10 ml segn la tabla siguiente. Leer absorbancias de cada solucin a la longitud de onda de trabajo. Realizar una curva de Absorbancia v s. Concentracin en ppm. Alcuota (ml) 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 Volumen final (ml) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 Absorbancia a 360 nm Concentracin de rutina (ppm)
2. Extraccin de la droga A partir de la informacin dada en la etiqueta por el fab ricante tomar un volumen equivalente a 1 g de droga seca y en polvo (medir exactamente con material volumtrico). Evaporar a sequedad con ayuda de vaco y calentando a 60C. El residuo se extrae con 10 ml de metanol, con agitacin, calentamiento en bao de agua a 60C, durante 10 minutos. Filtrar, lavar el filtrado dos veces con 10 ml de metanol (preferiblemente caliente), evaporar a sequedad y pesar el residuo obtenido. 3. Separacin mediante CCF Redisolver el residuo en 2 ml de metanol caliente y sembrar una banda en una cromatoplaca de slica gel GF -254 (20x10 cm, 1 mm espesor de capa), colocando al lado una aplicacin del estndar de rutina disuelto en metanol. Desarrollar en la mezcla Acetato de etilo/Acido frmico/Acido actico/Agua 100:11:11:2.7. La rutina se observa con un rf aproximado de 0.3, de color amarillo. Retirar la placa luego de desarrollar, dejarla secar en un extractor de vapores y analizarla con una lmpara UV a 254 nm. Demarcar la banda correspondiente a la rutina en la muestra, raspa r y extraer con metanol caliente 3 veces (porciones de 5 a 10 ml). Los filtrados se concentran a sequedad y se redisuelven en 3 ml de metanol, medidos con exactitud.
77
4. Lectura espectrofotomtrica y cuantificacin Leer absorbancia a 360 nm y determinar concentracin mediante interpolacin con la curva de calibracin.
Figura 1. Espectro UV de rutina en metanol
d. Cuantificacin de anetol en semillas de ans e hinojo Introduccin El anetol es un fenilpropano que se encuentra distribuido en varia s plantas aromticas. Esta amplia distribucin, junto con la facilidad en su deteccin a nivel de laboratorio mediante la cromatografa en capa fina (CCF) y la espectroscopia Ultravioleta (UV), la hacen un indicador adecuado para el reconocimiento y el con trol de calidad de productos fitofarmacuticos terminados o sus materias primas vegetales correspondientes. Procedimiento Preparar una solucin estndar de anetol en metanol de concentracin 100 ppm Tomar 1.2 ml de solucin completar a 10 ml y determinar el espectro UV entre 200 y 400 nm. Seleccionar la longitud de onda de trabajo. Para obtener la curva de calibracin, tomar alcuotas de la solucin estndar y llevar a 10 ml segn la tabla siguiente. Leer absorbancias de cada solucin a la longitud de onda de trabajo. Las absorbancias deben estar en el rango de 0.3 a
78
0.8, si no es as se debern preparar diluciones calculando absorbancias de 0.3, 0.4, 0.5, 0.6 y 0.7. Realizar una curva de Absorbancia vs. Concentracin en ppm. Alcuota (ml) Volumen final (ml) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 Absorbancia a 360 nm Concentracin de rutina (ppm)
2. Extraccin de la droga 1 g de droga seca y en polvo (pesar con balanza de precisin 1 diezmilsima de gramo), se extrae con 10 ml de diclorometano, con agitacin, durante 15 minutos. Filtrar, lavar el filtrado dos veces con 10 ml de diclorometano, evaporar a sequedad y pesar el extracto obtenido.
3. Separacin mediante CCF Redisolver el extracto en 1 ml de tolueno y sembrar una banda en una cromatoplaca de slica gel GF -254 (20x10 cm, 1 mm espesor de capa), colocando al lado una aplicacin del estndar de anetol disuelto en tolueno diclorometano. Evaporar a sequedad el resto de extracto no sembrado y pesar. Por diferencia determinar el peso de ext racto sembrado. Desarrollar en la mezcla Tolueno/Acetato de etilo 93:7. Retirar la placa luego de desarrollar, dejarla secar en un extractor de vapores y analizarla con una lmpara UV a 254 nm. El anetol se observa a un Rf aproximado de 0.95. Demarcar la banda correspondiente al anetol en la muestra, raspar y extraer con diclorometano 3 veces (porciones de 5 a 10 ml). Los filtrados se concentran a sequedad y se redisuelven en 3 ml de metanol, medidos con exactitud. 4. Lectura espectrofotomtrica y cuanti ficacin Leer absorbancia a 260 nm y determinar concentracin mediante interpolacin con la curva de calibracin. Determinar el porcentaje de anetol en la muestra y comparar con lo reportado para muestras autnticas.
79
Figura 2. Espectro UV de anetol en metanol
80
Prctica 8 MARCHA FITOQUMICA OBJETIVO Efectuar el estudio qumico sistemtico de las plantas con el fin de detectar varias clases de sustancias vegetales presentes en ellas como son los alcaloides, los flavonoides, las quinonas, las sapon inas, los taninos, los compuestos fenlicos, los triterpenoides, los esteroides, los cardiotnicos y las leucoantocianidinas , las que con mayor frecuencia se ha comprobado estn relacionadas con actividades biolgicas especficas, o se utilizan como materi as primas para el desarrollo de productos farmacuticos comerciales . Para propsitos de la presentacin de los resultados se deben utilizar las siguientes convenciones: Resultado Negativo Dudoso Positivo Francamente positivo No determinado Asignacin +/+ ++ ND
81
MUESTRA SECA Y PULVERIZADA (50 g)
FRACCIN A (AA, CF, TA, FL, TE, QU, CA, AL, LE) H2O HCl diluido Ensayar FL, LE, CF, AA, TA
INSOLUBLES (FRACCIN B)
SOLUBLES Alcalinizar, Particin con CHCl 3 CH 2Cl 2
FASE CHCl 3 (FRACCIN C)
FASE ACUOSA BSICA 1. Salado ("Salti ng out") 2. Particin con CHCl 3
Ensayar CA, TE
Ensayar AL (en medio cido)
FASE CHCl 3 (FRACCIN D)
FASE ACUOSA (FRACCIN E)
Ensayar FL, LE, CA, TE, AL
Ensayar AL, FL, CF, TA
82
CONVENCIONES
AA = AMINOACIDOS CF..= COMPUESTOS FENOLICOS TA = TANINOS FL = FLAVONOIDES TE = TRITERPENOIDES Y/O EST EROIDES QU = QUINONAS CA = CARDIOTONICOS AL = ALCALOIDES LE = LEUCOANTOCIANINAS
83
OBTENCIN Y ANLISIS DE LA FACCIN A

DROGA O MUESTRA (50 g) SECA Y PULVERIZADA 1. Macerar con etanol 70%, 24 horas 2. Reflujar 1 hora 3. Filtrar caliente
Residuo, lavarlo con alcohol
FILTRADO (FRACCIN A) 1 ml 40 ml Ensayar AA Llevar a sequedad FRACCIN A RESIDUAL
RESIDUO
FILTRADO Redisolver en 20 ml de agua caliente y filtrar
DESECHAR RESIDUO 10 ml (caliente)
FILTRADO ACUOSO 10 ml Filtrar en fro
DESECHAR
Ensayar FL y LE
RESIDUO
FILTRADO ACUOSO
* NOTA: Para llevar a sequedad utilice

calentamiento con temp eratura no mayor de 50 C. DESECHAR Ensayar CF y TA
84
ANLISIS DE LAS FRACCIONES A RESIDUAL Y B

FRACCIN A RESIDUAL Llevar a sequedad Aadir 30 ml de HCl 5%. Calentar a 60 C durante 15 minutos. Filtrar en caliente.
RESIDUO INSO LUBLE
FILTRADO ACUOSO ACIDO I
Lavar con 20 ml de HCl 5% y filtrar
RESIDUO
FILTRADO
Disolver con 30 ml de cloroformo o diclorometano Deshidratar con Na 2SO 4 anhidro y filtrar
FILTRADO (FRACCIN B) Ensayar TE, CA, QU, FL.
RESIDUO DESECHAR
85
OBTENCIN Y ANLISIS DE LA FACCIN C

FILTRADO ACUOSO ACIDO I
Alcalinizar con gotas de NH 4OH conc. (pH 10 -11)
Particin con 2x15 ml de cloroformo (o diclorometano)
FASE orgnica
FASE ACUOSA BSICA
Lavar c on 10 ml de H 2O
FASE orgnica
FASE ACUOSA
Deshidratar con Na 2SO 4 anhidro y filtrar
RESIDUO 5 ml DESECHAR
FILTRADO (FRACCIN C) Resto
Llevar a sequedad Redisolver en 10 ml de HCl 5% con calor y filtrar Ensayar CA y TE. FILTRADO Ensayar AL. RESIDUO DESECHAR
86
OBTENCIN Y ANLISIS DE LAS FRACCIONES D Y E

FASE ACUOSA BSICA
Hacer particin con 2x15 ml de CHCl 3 CH 2Cl 2
FASE orgnica Lavar con 20 ml de solucin semisaturada de NaCl
FASE ACUOSA (FRACCIN E)
FASE orgnica
FASE ACUOSA
Neutralizar con HCl y ensayar FL, LE, AL (en medio cido), CF (pH ligeramente cido) y TA (pH neutro).
Deshidratar con Na 2SO 4 anhidro y filtrar Redisolver D1 en 4 ml de etanol y ensayar FL, CA, LE.
FILTRADO (FRACCIN D)
RESIDUO DESECHAR
Repartir en tres porciones iguales de 5 ml c/u: D1, D2 y D3. L levar a sequedad.
Redisolver D2 en 1 ml de CHCl 3 y ensayar TE.
Redisolver D3 en 5 ml de HCl 1% y ensayar AL. FIN
87
88
ENSAYOS SOBRE LAS FRACCIONES A -E
1.
ENSAYO DE SHINODA (O DE LA CIANIDINA) PARA FLAVONOIDES Y OTRAS SUSTANCIAS CON EL NUCLEO -BENZOPIRONA.
Precaucin 1: Antes de realizar el ensayo, si se trata de muestras que contienen demasiadas clorofilas, estas se deben eliminar precipitndolas co n acetato de plomo en solucin. Precaucin 2: Si la muestra est en solucin clorofrmica o diclorometnica, se debe evaporar para eliminar el solvente y redisolverla en 1 ml de alcohol. Precaucin 3: Realizar la prueba en la campana de extraccin de gas es y sujetando el tubo de ensayo con una pinza. Ensayo: Tomar 1 ml de solucin en un tubo de ensayo limpio. Aadir algunas li maduras de Mg. sujetar el tubo con una pinza. Aadir cuidadosamente por la pared del tubo, unas gotas de HCl concentrado (37%). La aparicin de coloraciones naranja a violeta es prueba positiva para la presencia de flavonoides. Para fines de comparacin realizar la prueba con 0.5 ml de una solucin patrn de morina. 2. ENSAYO DE ROSENHEIM (PARA LEUCOANTOCIANIDINAS): Ensayo: Tomar 1.0 ml de solucin acuosa en un tubo de ensayo limpio. Aadir 0.5 ml de HCl concentrado. Mezclar. Calentar durante 10 minutos a 100 0C y enfriar. Pasar a un tubo de ensayo de 10 x 75 mm. Aadir 0.4 ml de alcohol amlico y agi tar. Dejar separar las fases. La prueba se considera positiva si aparece coloracin en la fase amlica que vaya desde el carmes oscuro al rosado dbil.
3. ENSAYO DEL FeCl 3 (PARA COMPUESTOS CON HIDROXILOS FENOLICOS): Ensayo: Tomar 1.0 ml de solucin acuosa o alcohlica en un tubo d e ensayo limpio. Aadir 1 gota de FeCl 3 al 1% acuoso o alcohlico. Mezclar. La aparicin de coloraciones violeta, verdes, azules u oscuras se considera prueba positiva. Para fines de comparacin realizar la prueba con 0.5 ml de solucin pa trn de cido tnico.
89
4.
ENSAYO DE LA GELATINA -SAL (PARA TANINOS):
Ensayo: Tomar 1.0 ml de solucin acuosa neutra en un tubo de ensayo limpio. Aa dir 1.0 ml de solucin de gelatina -sal. La formacin de un precipitado se considera prueba positiva. Centrifugar si es ne cesario para observar el precipitado. Precaucin: Algunas otras sustancias tambin producen precipitados con este reactivo, para eliminar tales interferencias, es recomendable uti lizar el procedimiento de Sanabria, Pg. 73.
5.
ENSAYO DE LIEBERMANN -BURCHARD (PARA TRITERPENOIDES Y/O ESTEROIDES CON GRUPOS DIENO CONJUGADOS REALES O POTENCIALES):
Precaucin 1: El ensayo se realiza con muestras disueltas en cloroformo Diclorometano nicamente. Precaucin 2: Al adicionar el cido sulfrico hacerlo en la ca mpana de extraccin. La reaccin libera calor, utilizar pinza para tubo de ensayo. Si la solucin el tubo de ensayo no estn completamente secos puede haber salpicaduras. Ensayo: Tomar 0.5 ml de solucin clorofrmica anhidra en un tubo de ensayo limpio y seco. Aadir 0.5 ml de Anhdrido actico. Aadir cuidadosamente por la pared del tubo, una gota de Acido sulfrico concentrado. Observar y anotar los cambios de coloracin. Se considera positiva la prue ba cuando aparecen coloraciones violeta, verde o az ul. 6. ENSAYO DE BORNTRANGER (PARA NAFTO - Y ANTRAQUINONAS)
Precaucin: Realizar esta prueba en la campana de extraccin ya que el benceno y el tolueno son sustancias muy txicas. Ensayo: Tomar 3 ml de solucin clorofrmica y llevarlos a sequedad. Rediso lver en 5 ml de alcohol: H 20 (1:7). Aadir 1 ml de agua oxigenada de 20 vol menes, 1 ml de cido sulfrico al 50% y calentar la mezcla en un bao de agua hirviendo durante 10 -15 minutos. Dejar enfriar y extraer en un embu do de separacin con 5 ml de benc eno tolueno. Retirar 2 ml de la fase orgnica y agitarla en otro tubo con 1.0 ml de solucin de NaOH al 5% en NH 4OH al 2%. La prueba se considera positiva cuando aparecen coloraciones que van del rosado al rojo intenso en la ca pa alcalina.
90
7. ENSAYO DE KEDDE (PARA CARDIOTONICOS) Precaucin: La formacin del color violceo no dura sino algunos pocos segundos. Ensayo: Tomar 1 ml de la fase orgnica. Llevar a sequedad. Redisolver en 1 ml de alcohol. Aadir 0.5 ml de reactivo de Kedde recin prepa rado (Mezcla de partes iguales de las soluciones A y B). Se considera positiva la prueba si aparece una coloracin prpura o violcea. Como referencia se puede compa rar con el color producido con 1 ml de KOH al 5% en alcohol. 8. ENSAYOS PARA ALCALOIDES Precaucin 1: Todos los ensayos deben hacerse siempre con la muestra disuelta o redisuelta en HCl 5% acuoso. Precaucin 2: La solucin acuosa cida debe estar libre de turbiedades y precipitados antes de hacer los ensayos para alcaloides. Precaucin 3: Luego de realizados los ensayos, se deben desechar las muestras en un frasco dispuesto para ello en el laboratorio, esto con el fin de no contaminar el ambiente con metales pesados. Ensayos: Tomar 0.5 ml de solucin acuosa cida en 4 tubos de ensayo limpios. Aadir a cada tubo 1 gota de los reactivos de Dragendorff, Mayer, Valser y Reineckato de amonio. Se considera prueba positiva cuando aparecen preci pitados en por lo menos 3 tubos. Para fines de comparacin realizar el ensayo con 0.5 ml de una solucin p atrn de sulfato de quinina.
9. ENSAYO DE NINHIDRINA (PARA AMINOACIDOS). Ensayo: Colocar 1 gota de solucin, en una tirilla de papel filtro. Secar. Aadir 1 gota de reactivo de ninhidrina (Solucin al 0.002% en alcohol). Calentar sobre una plancha de calentamiento a 105 0C. El desarrollo de coloraciones violeta, azul o rosada se considera prueba positiva.
91
BIBLIOGRAFA CONSULTADA
1.
SANABRIA G. Antonio: Anlisis Fitoqumico Preliminar, Departamen to Farmacia, Universidad Nacional, Bogot, 198 3.
de
2.
ARANGO A. Gabriel J. QUIJANO T. Jairo: Marcha Fitoqumica Semicuantitativa, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Antioquia, Medelln.
3.
DOMINGUEZ X.A., Mtodos de Investigacin Fitoqumica, Ed. Limusa, Mxico, 1979.
92
PAUTAS PARA LA ELABORACIN DEL INFORME DE LABORATORIO El informe de laboratorio incluir el desarrollo y presentacin de cada uno de los siguientes puntos: TITULO El titulo debe describir en forma somera el alcance del expe rimento realizado procurando q ue no sea excesivamente largo y detallado como tampoco que sea muy corto y demasiado general. Cuando un experimento se trabaje con una determinada especie vegetal o animal, el titulo debe incluir el nombre cientfico de la misma, de acuerdo con las normas universales estableci das; adems el nombre vulgar, y la familia a la cual pertenece la muestra. En este caso, tambin debe incluirse el nombre de la parte de la especie analizada (por ejemplo: raz, fruto, hojas, partes areas, etc.). Por otro lado, el titulo debe incluir los nombres de las prin cipales tcnicas de laboratorio empleadas (ejemplo Purificacin por cromatografa en columna de . . ., ... identificacin por espectroscopia ultravioleta de . . . , etc.) . Un modelo de ttulo es: Aislamiento y caracterizacin del componente principal del aceite esencial de hojas de ajenjo, Artemisia absinthium , Compositae, mediante cromatografa en capa fina y tcnicas espectrales En este ttulo se reconocen las siguientes partes: Los logros alcanza dos: Aislamiento y caracterizacin de una sustancia. La parte de la planta analizada : Las hojas El nombre comn de la planta : El ajenjo El nombre cientfico de la planta : Artemisia absinthium ( en itlicas) La familia vegetal : Compositae (en ingls), Compuestas (en espaol) La tcnica de aislamiento : Cromatografa en capa fina . La tcnica de caracterizacin : Mtodos espectrales .
DATOS En esta parte del informe deben incluirse todas las medicio nes y observaciones realizadas en el laboratorio y que permiten hacer un anlisis e interpretacin de los fenmenos observados. Por ejemplo, los dibujos de las cromatoplacas obtenidas en un anlisis por cromatografa en capa fina con sus manchas y colores correspondientes ; los valores de absorbancia o transmitancia de un pigmento carotenoide al analizarlo por espectroscopia ultravioleta, los espectros
93
infrarrojo o ultravioleta determinados; los resultados de reacciones coloreadas para reconocer algn metabolito secun dario, etc. ANALISIS DE RESULTADO S En este tem se incluir la forma como se interpretaron los resultados obtenidos por comparacin con datos obtenidos con patrones o reportados en la literatura cientfica, citando como una nota al pi la referencia bibliogrfica correspondiente. Al citarse un dato u observacin de los reportados en la li teratura, debe siempre citarse la correspondiente referencia, la cual debe aparecer en el tem Bibliografa, y en el texto debe sealarse dicha referencia, por ejemplo: ANALISIS DE RESULTADOS La sustancia aislada mostr un mximo de absorcin en su es pectro ultravioleta en 206 nm, lo cual esta de acuerdo con lo reportado por Silverstein (1978) para sustancias con enlaces dobles aislados.... .... De acuerdo con este anlisis la sustancia mas pro bable es el B caroteno, ya que se necesitara determinarle por lo menos el correspondiente espectro de masas para confirmar este hecho.... CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES En este tem se debe incluir solamente aquellos hechos demos trados en la observacin experimental de cada prctica, y las sugerencias que se considere de inters sobre las conclusio nes obtenidas. Las conclusiones no deben ir reseadas bibliogrficamente, puesto que son inherentes a la interpretacin que d el es tudiante al experimen to realizado. Por ejemplo unas conclusiones pueden ser: ...el principal componente del aceite de clavo el eugenol. De acuerdo con los sistemas utilizados en la prctica el mejor sistema eluente para separar por cromatografa en capa fina los caroteno ides de la zanahoria (Daucus caraota ) es la mezcla diclorometano/ter de petrleo 50:50.... Las conclusiones no deben incluir eventos tales como cortes de energa, falta de recursos, dao de aparatos, excusas m dicas, etc.
94
BIBLIOGRAFIA Este tem debe relacionar en el orden alfabtico (por apelli dos del primer autor) solamente aquellos documentos, libros, revistas, folletos, comunicaciones personales, etc. que sean inherentes al informe, es decir los que efectivamente fueron consultados por el es tudiante para la elaboracin del informe. Por otro lado, si el estudiante encuentra un mismo dato re portado en varias fuentes bibliogrficas, debe reportar solo aquella que considere ms conveniente de acuerdo con su criterio. Por ejemplo, si encontr en el libro A que el fruto del tomate maduro contiene licopeno, y en otro libro B encontr que el mismo contiene -caroteno (pigmento amarillo) y licopeno (pigmento rojo) junto con otros pigmentos carotenoides... etc. , debe reportar solo el libro que le informe ms sobre lo reali zado en la prctica, es decir el B, en este caso. Si no es posible discernir entre uno y otro, siempre debe reportarse el ms reciente en su publicacin. Para propsitos de presentar las referencias bibliogrficas en cada informe s e deben tomar los siguientes modelos:
Para libros: Autor(es); Ttulo, volumen, Editor o Editorial, Nmero de edicin, ciudad, ao, paginas consultadas.
Ejemplo: HARBORNE J.B.: PHYTOCHEMICAL METHODS, Chapman and Hall Ltd., New York, 1973, pp 119 120.
Para revistas: Autor(es); ttulo del artculo (en minsculas), nombre de la revista (en may4sculas), volumen, nmero, paginas consultadas, (ao).
Por ejemplo el siguiente modelo:
95
Garg V.K., Nes W.R.; Codisterol and other 5-Sterols in the see ds of Cucurbita maxima PHYTOCHEMISTRY 23 (12), 2925 2929 (1974).
Para documentos publicados en Universidades: Autor(es), ttulo, Facultad o Departamento, Universi dad, ciudad, ao, pginas consultadas. Por ejemplo: Martnez M. A.; Manual de practi cas para el laborato rio de Fitoqumica, Facultad de Qumica Farmacutica, Universidad de Antioquia, Medelln, 1988, pp. 1518. Para referencias bibliogrficas de Internet: Se deben citar solamente pginas web de entidades acadmicas y cientficas reconocidas, acompaadas de la primera pgina impresa con la correspondiente direccin http y la fecha de consulta. No se aceptan como referencias bibliogrficas las comunicaciones personales, excepto las impresas enviadas por correo electrnico. Nota: Cuando se reporten referencias bibliogrficas incompletas que se compruebe que no son consistentes con lo escrito en el informe, este se calificar sobre una base del 70% de la calificacin mxima.
Evaluacin: Prctica 1: Informe al profesor, 5% Prctica 2: Informe 7%, quiz 3% Prctica 3: Informe 7% y quiz 3% Prctica 4: Informe 7%, quiz 3% Prctica 5: Informe 7%, quiz 3% Prctica 6: Informe, 10% Prctica 7: Informe, 10% Prctica 8: Informe 7% y quiz 3% Prctica especial: Anteproyecto 5%, Pster 20%.
96
Bibliografa 1. Domnguez, X. A., Mtodos de Investigacin Fitoqumica, Edit. Limusa, Mexico, 1973. 2. Wagner, H., Bladt, S., Zgainski, E. M., Plant Drug Analysis. A Thin Layer Chromatography Atlas, Springer -Verlag, Berlin -Heidelberg -New York-Tokyo, 1984. 3. Evans, W. C., Farmacognosia Trease -Evans, 13 edic., Interamericana McGraw -Hill, Madrid-Auckland-Bogot, 1991. 4. Harborne, J. B., Phytochemical Methods. A Guide to Modern Techniques of Plant Analysis, Chapman & Hall, London -Weinheim-New York, 1998. 5. Gattuso, M. A., Ga ttuso, S. J., Manual de Procedimientos para el Anlisis de Drogas en Polvo, UNR Editora, Cyted, Rosario (Argentina), 1999. 6. Ramrez, S., Fonnegra, R., Plantas Medicinales Aprobadas en Colombia, Universidad de Antioquia, Medelln, 1999. 7. http://matematicas.udea.edu.co/~carlopez/laboratorio/pagelab.html 8. http://farmacia.udea.edu.co/~ff 9. http://matematicas.udea.edu.co/~carlopez 10. Stahl, E., Thin Layer Chromatography 11. Martnez, A., Farmacognosia y Fitoqumica Experimental, Universidad de Antioquia, Medelln, 1991. 12. Revistas especializadas: Phytochemistry, Planta Medica, Journal of Natur al Products, Journal of Food and Agricultural Chemistry, etc. 13. Bases de datos: Napralert 14. Repblica de Colombia, Ministerio de Salud, Decreto ley N 677, Ley del medicamento de 1994. 15. Quality Control Methods for Medicinal Plant Materials, World Health Org anization, Geneva, 1998. 16. Sharapin, N., Fundamentos de Tecnologa de Productos Fitoterapeticos, Roberto Pinzn ed., Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnologa para el Desarrollo, Cyted, Santaf de Bogot D. C., 2000. 17. CD Farmacognosia y Fitoqumica, versin 2.0, Alejandro Martnez , Universidad de Antioquia, Medelln, 200 5.

Separacioncromatograficamanual 2008

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Separacioncromatograficamanual 2008

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

1

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA DEPARTAMENTO DE FARMACIA

MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA Y FITOQUMICA 200 8

Medelln, Mayo de 2008

PRACTICA No. 6 PRACTICA No. 7

PRACTICA No. 8 PRACTICA No. 9

Reconocimiento de Flavonoides: (+)-Catequina

Flavan 3,4-diol Leucopelargonidin

Reconocimiento de Esteroides y/o Triterpenoides:

pH < 3 Catin cianina

pH 8.5 Base cianina

pH > 11 Anin cianina

Plantas con alcaloides:

Plantas con quinonas:

Hojas de guardaparque. Moras. Uvas sin hollejo. Ruibarbo (rizomas)

Figura 1. Diagrama de una cromatografa en columna.

Figura 2. Diagrama de una cromatografa en capa fina

Figura 2. Espectro Visible del Licopeno obtenido de tomate rojo

Sistema 1: Benceno/Eter de petrleo 9:1, Sistema 2: Diclorometano/Acetato de etilo 4:1

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoqumica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoqumica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoqumica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoqumica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff

Prctica 5 RECONOCIMIENTO CROMATOGRFICO DE PLANTAS MEDICINALES APROBADAS EN COLOMBIA

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoqumica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff

SUSTANCIA Alicina Alina

COLOR Naranja Azul-violeta

Rf 0.7 0.6 0.45 0.4

SIJSTANCIA Cinarina Luteolina-7-0-gluc. Acido clorognico Rutina

COLOR Azul fluorescente Amarillo Azul fluorescente Amarillo

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoqumica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoqumica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoqumica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff

SUSTANCIA Fenchona Anetol

COLOR Azul oscuro Rojo-Violeta Rojo-Pardo Azul oscuro

SUSTANCIA Malvina (=Malvidin -3,5-diglucsido

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoqumica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoqumica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff

Rf 0.25 0.45 0.7 0.99

SUSTANCIA Borneol Cineol Acetato de bornil o Alfa- y beta-pineno

COLOR Azul oscuro Azul intenso Azul intenso Violeta

Rf 0.3 0.47 0.95 ---

SUSTANCIA Aloinsidos A y B Alona Alo-emodina Aloesinas A y B

REVELADOR 1y2 1y2 1 1

COLOR Amarillo Amarillo Rojo Azul fluorescente

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoqumica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff

Rf 0.4 0.7 0.9

SUSTANCIA Rutina Isoquercitrina Acido cafeico

COLOR Amarillo Amarillo Azul fluorescente

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoqumica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff

COLOR Azul intenso Azul violceo Azul violceo

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoqumica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoqumica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoqumica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoqumica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoqumica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoqumica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoqumica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff

N2 Aminoacidos Aminocidos Aminocidos modificados

- CO2 Alcaloides Imperfectos No cclicas Aminas Cclicas

figura 2. Aspectos biogenticos para la clasificacin de los alcaloides

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoqumica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff

Manual de Laboratorio de Far macognosia y Fitoqumica 20 08, http://farmacia .udea.edu.co/~ff