Relatrio das aulas prticas Thiago Marques Coelho

ndice Morfologia Bacteriana Colorao de Gram........................................2 Importncia da colorao de Gram...................................................2 Mtodo de colorao.........................................................................2 Fungos.................................................................................................4 Principais fungos observados no microscpio...................................5 Cultivo de Fungos e Bactrias..............................................................7 Ar atmosfrico...................................................................................7 gua..................................................................................................7 Solo...................................................................................................8 Homem.............................................................................................9 Contagem Cultivo de Fungos, Vrus e Bactrias...................................9 Resultados......................................................................................11 Determinantes ambientais.................................................................12 Coluna de Winogradsky......................................................................13 Colimetria...........................................................................................15

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Morfologia Bacteriana Colorao de Gram

A primeira aula prtica de laboratrio teve como objetivo a familiarizao dos alunos com a tcnica de colorao de Gram alm de treinar os alunos a distinguir as diferentes formas e arranjos das bactrias.

Importncia da colorao de Gram

Desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista holands Hans Cristian Gram, a colorao de Gram, rotineiramente utilizada em laboratrios de microbiologia, consiste em preparaes histolgicas para observao ao microscpio ptico, utilizada para corar diferencialmente microorganismos com base na composio qumica da sua parede celular sendo que a integridade desta tambm interfere na colorao. A tcnica de Gram permite dividir as bactrias em dois grandes grupos: Gram positivos(roxo) e Gram negativas(vermelho) alm de permitir o estudo da clula bacteriana quanto sua morfologia(cocos ou bacilos) e arranjo.

Fig

1.

Exemplo

bactrias

Gram

positivas(esquerda)

Gram

negativas(direita).

Mtodo de colorao
1. Sobre uma lmina de vidro, colocar uma gota dgua. Com a ala de platina tocar levemente na superfcie da colnia e emulsionar o material na gota dgua(caso o microrganismo seja fornecido em suspenso, colocar uma gota dessa lmina). Deixar secar.

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2. Passar o esfregao na chama do bico de Bunsen trs vezes a fim de fixar o material. 3. Cobrir o esfregao seco com violeta de genciana e deixar por um minuto. 4. Lavar com gua corrente. 5. Esgotar a lmina, cobrir com soluo de lugol e deixar por um minuto. 6. Esgotar a lmina e, mantendo a mesma inclinada, pingar gotas de lcool at que no se desprenda mais corante da preparao. 7. Lavar com gua corrente. 8. Cobrir a lmina com soluo de fucsina e deixar por trinta segundos. 9. Lavar a lmina e cobrir com papel filtro para a secagem da lmina. 10.Examinar ao microscpio com a objetiva de imerso. A fig. 2 Mostra o desenho e caracterizao dos organismos vistos em aula:

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Fig 2. Estrutura e caracterstica de diversas bactrias vistas em aula.

Fungos
Na aula prtica de fungos, os alunos observaram as colnias a olho nu e, com o auxilio do microscpio tico, observaram as estruturas das leveduras e bolores, formas microscpicas dos fungos.

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Fig 3. Exemplos de fungos vistos no laboratrio.

Principais fungos observados no microscpio

1. Rhizopus spp Bolor Pertencente subdiviso

zycomycotina Reproduo assexuada Bolor de aspecto algodonoso e

colorao cinza preto Hifas cenocticas(no septadas) Presena de rizides e

Fig 4. Rhizopus spp.

esporangiporos(condios internos) 2. Penicillium spp

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Bolor Pertencente subdiviso

Deuteromycotina Reproduo assexuada Aspecto esverdeada

Fig. 5. Penicillinum spp

aveludado

colorao

Hifas septadas e hialinas Condeos externos e esterigmas em forma de pincel.

3. Aspergillus spp Bolor Pertencente subdiviso

Deuteromycotina Reproduo assexuada Aspecto pulverulento e colorao

Fig. 6. Aspergillus spp.

esverdeada Hifas septadas e hialinas Condeos externos e presena de vescula.

4. Candida spp Levedura Pertencente subdiviso Deuteromycotina Reproduo assexuada (gemulao ou brotamento) Aspecto cremoso e opaco
Fig 7. Candida spp.

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Cultivo de Fungos e Bactrias

Nesta aula prtica foram realizados diversos cultivos de fungos e bactrias. Os meios naturais onde foram coletadas as amostras foram no ar atmosfrico, gua, solo e Homem.

Ar atmosfrico
Duas placas placas de gar Sabouraud + cloranfenicol(para cultivos de fungos) e gar nutriente(para cultivo de bactrias) foram expostas, durante 15 minutos, ao ar atmosfrico sobre um vaso de planta localizado no corredor dos laboratrios didticos do ICB. As amostras coletadas foram incubadas no laboratrio em

temperaturas aproximadamente constantes durantes 2 dias.

gua
Para a anlise da gua, foram coletadas amostras de gua presente no bebedouro, gua da rede pblica de abastecimento, lago do IB, e poa dgua na grama em frente ao prdio do ICB.

Fig. 8. Procedimento de semeao da placa de petri com a gua do abastecimento pblico.

Com exceo da amostra de gua na poa da grama, as amostras foram coletadas em tubos de 20 mL previamente esterilizados, levados ao 7

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laboratrio e as placas de Petri foram ser abertas prximas ao bico de Bunsen para evitar contaminao com germes do ar, ento, com o auxlio da ala de Drigalski, as placas foram semeadas e fechadas. Para a semeadura do material da poa na grama, foi utilizado swabs e esfregados na placa de petri em forma de zigue-zague. As incubaes foram realizadas em placas de gar Sabouraud + cloranfenicol (para cultivos de fungos) e gar nutriente(para cultivo de bactrias).

Fig. 9. Poa na grama onde foi feita coleta.

Solo
Duas placas de petri de gar Sabouraud + cloranfenicol(para cultivos de fungos) e gar nutriente(para cultivo de bactrias) foram utilizadas para a incubao dos microrganismos presentes no amostra de solo coletada no jardim do ICB. O procedimento foi o seguinte: 1. Adicionar 9 mL de gua estril em 1 g de amostra do solo; 2. Misturar bem a suspenso; 3. Deixar em repouso por 10 minutos;

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4. Semear 0,1 mL do sobrenadante nas placas de petri; 5. Espalhar, com a ala de Drigalski, o material semeado; 6. Incubar as placas.

Homem
Na incubao de microrganismos presentes em amostras de fossas nasais e peles e mos foram realizados os seguintes procedimentos: 1. Umedecer 2 swabs em soluo salina e esfregar na superfcie do material a ser estudado; 2. Passar os swabs na superfcie das placas de agar Sabouraud e agar nutriente; 3. Incubar as placas a 37C por 24-48 horas para bactrias e a 25C por 3 5 dias para fungos;

Contagem Cultivo de Fungos, Vrus e Bactrias

Aps 2 dias de incubao dos fungos e bactrias, foi realizado uma anlise observacional das placas de petri a fim de determinar grosseiramente a diversidade e riqueza dos microrganismos presentes em relao s demais placas com os diversos materiais analisados.

Fig. 10. Placas de petri incubadas com material da gua do lago do IB, poa na grama do ICB, bebedouro e rede pblica de abastecimento.

Alm

disso,

foram

preparadas

diversas

lminas

para

serem

analisadas com microscpio tico em lente de imerso. A escolha das

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colnias a serem observadas em microscpio foi determinada pela predominncia das mesmas nas placas de petri.

Fig. 11 e 12. Lminas preparadas(esquerda) e exemplo de bactria observada em aula(direita).

Para preparar as lminas, foi utilizada a tcnica de Gram que teve o seguinte procedimento: 1. Sobre uma lmina de vidro, colocar uma gota de gua. Com o fio de um material inerte tocar levemente na superfcie da colnia e emulsionar o material na gota de gua. Deixar secar. 2. Passar o esfregao na chama do bico de Bunsen trs vezes a fim de fixar o material. 3. Cobrir o esfregao seco com violeta genciana e deixar por 1 minuto. 4. Esgotar a lmina e cobrir com soluo de lugol e deixar 1 minuto. 5. Esgotar a lmina e, mantendo a mesma inclinada, pingar gotas de lcool at que no se desprenda mais corante da preparao. 6. Lavar com gua corrente. 7. Cobrir a lmina com soluo de fucsina e deixar por 30 segundos. 8. Lavar a lmina e cobrir com papel de filtro. 9. Examinar ao microscpio com a objetiva de imerso.

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Fig 13 e 14. Lminas cobertas com Lugol(esquerda) e o fio de material inerte sendo flambado.

Resultados
Abaixo esto os resultados de todas as colnias de bactrias observadas:
Quadro 2. Descrio macroscpica e microscpica das colnias analisadas.

Amostra Lago do ICB Poa na grama 1 Bebedouro Poa na grama 2

Descrio macroscpica Grades colnias; Borda no visvel; Branca. Grandes colnias; Borda no visvel; Branca. Mdia e pequenas colnias; Borda visvel; Amarelo clara. Pequenas colnias Borda visvel; Roxa.

Descrio microscpica

Gram Stereptobacilos

Gram + Streptobacilos

Gram + streptobacilos

Gram stafilococus

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Determinantes ambientais
Nesta aula prtica, foram testados o crescimento da Escherichia coli(bactria), vbrio(bactria), levedura(fungo) e aspergillius(fungo) em diferentes meios e presena de bacterifagos em uma amostra com diluies decimais. Os meios de crescimento onde os microrganismos foram submetidos foram: Sal nas concentraes 0; 2,5%; 5%; 10%; 20%; 30%. Glicose nas concentraes 0; 10%; 20%; 40%; 60%.
Quadro 3. Concentrao dos microrgansimos em diferentes meios salinos.

Sal
Vibrio E. coli Levedura Aspegilli us

0 + +++ ++++ ++

2,5% ++ ++ +++ +++

5% ++ ++ ++

10% + +

20% -

30% -

Quadro 4. Concentrao dos microrgansimos em diferentes meios glicados.

Glicose
Vibrio E. coli Levedura Aspegilli us

0 + ++ +++ +

10% ++ ++ ++ ++++

20% + + ++++

40% ++

60% +++

Obs: a quantidade de + indica a intensidade de sucesso do organismo em relao ao meio e o indica a no ocorrncia desse microrganismo. 12

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Fig. 15 e 16. Tubos de ensaios contendo meios com diferentes concentraes de salina(esquerda) e glicadas(direita).

Para a contagem dos bacterifagos foram preparadas previamente diferentes diluies da amostra a ser analisada e colocadas em placa petri com agar trplice em banho maria. Agita-se imediatamente aps a adio do nutriente e, ento, o meio incubado por 2 dias. Aps o perodo de incubao, conta-se a quantidade de UFP(unidade formadora de placa) na placa e sabendo-se a diluio realizada, determinase a quantidade de UFP.

Fig 17. Pontos transparentes indicando o nmero de UFP na placa de petri.

Coluna de Winogradsky
A coluna de Winogradsky um vaso, preferencialmente na forma de tubo, utilizado para cultura de diversos tipos de microrganismos. Este dispositivo foi inventado em 1880 pelo russo Sergei Nikolaievich Winogradsky (1856-1953), microbiologista, ecologista e cientista do solo.

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O aparelho , simplesmente, uma coluna feita de material

transparente, preenchida por gua e lama como alguma fonte de carbono como pedaos de papis ou casca de ovos, e alguma fonte de sulfato, como por exemplo, a gipsita. A coluna preparada vedada e exposta a alguma fonte de radiao luminosa(luz preferencialmente) solar por

alguns meses e, ento, obtm-se um gradiente de ambiente aerbico e anaerbico e de concentrao de sulfetos. A causa e conseqncia desses dois gradientes promove um crescimento de diferentes grupos de microrganismos em
Fig. 18. C olunas de Winogradsky de sete semanas de idade preparadas com diferentes fontes de carbono e sulfeto.

diferentes segmentos da

coluna (oxignica, anoxignica, etc) como clostridium(bactrias Gram positivas anaerbias), desulfovibrio(bactrias Gram negativas redutoras de sulfetos), clorobium(bactrias fotolitotrficas oxidantes de sulfetos), beggiatoa (proteobactrias quimiolitotrficas oxidantes de sulfetos). Na observao feita em aula, foram coletadas e preparado laminas de vrias amostras de material de trs colunas de Winogradsky expostas a diferentes radiaes luminosas, origens da lama e tempo de incubao afim de observar e, quando possvel, identificar os microrganismos presentes nas regies das colunas amostradas.

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Fig 19. Trs colunas de Winogradsky observadas em aula.

Todas as colunas continham basicamente os mesmos grupos de organismos com destaque para os seguintes grupos identificados:
Quadro 5. Descrio dos organismos identificados na coluna de Winogradsky.

Colimetria
A aula prtica de colimetria teve como objetivo determinar a concentrao de coliformes totais e Escherichia coli a partir de diluies Regio Microrganismo
Anabaena sp.

Observao
Alga Bactria prpura no associada ao sulfeto

Superfcie

Rhodopseudomonas acidophila

Rhizoclonuim sp.

Alga

Meio

Clorofexus aurantiacus Pelodictyon clathratiforme Desulfuromonas acetoxidans

Bactrias verdes redutoras de sulfato Bactria verde redutora de sulfato Bactria Incolor redutora de sulfato

Fundo
Thiovulum

decimais de uma amostra de gua do Rio Pirajussara.

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Fig. 20. Imagem do Rio Pirajussara onde foi coletada a amostra.

O procedimento da contagem foi feita da seguinte maneira: 1) A amostra inoculada em caldo lauril sulfato de sdio positivo e incubado, o qual inibe a microbiota acompanhante e, ao mesmo tempo um meio de enriquecimento para bactrias do grupo dos coliformes. Bactrias deste grupo causam turvao no meio. 2) A quantificao coliformes fecais foi realizada atravs de um mtodo de aproximao, denominado Nmero Mais Provvel (NMP), sendo o resultado expresso em NMP por 100 mL. A leitura do NMP consiste em anotar os tubos turvos e a quantidade de tubos verde-azulados fluorescentes quando radiamos luz UV. De posse destas anotaes, os valores so comparados com a tabela do NMP.

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Fig. 21. Procedimento em aula de preparao de diferentes diluies da amostra.

Fig.

22

23.

Visualizao

de

tubos

positivos

para

coliformes

totais(esquerda) e E. coli. O quadro abaixo mostra os resultados para coliformes totais e E. coli.
Concentrao da Amostra Concentrao de E.coli em 100ml

10-3 Coliformes Totais E. coli Coliformes Totais E. coli 5 5 5 5

10-4 5 4 5 3

10-5 4 0 4 2 1600 * 10-4 130 * 10-4 1600 * 10-4 140 * 10-4

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Coliformes Totais E. coli

5 5

5 4

4 0

1600 * 10-4 110 * 10-4

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