TEMA 7: INTRODUCCIN A LA TRANSCRIPCIN.

Hiptesis de la molcula puente

El DNA se encuentra confinado en el ncleo y debe ser importado hacia los ribosomas para la sntesis de protenas, se requiere una molcula puente. El primer candidato para ser esta molcula puente fue el RNA.

Por aquel entonces se conocan menos tipos de RNA, por lo que realizaron experimentos de pulso de 30 y caza inmediata para averiguar qu tipo de RNA cumpla con las condiciones necesarias para ser la molcula puente. Se obtuvo un patrn de absorbancia a 260 nm. RNA 4S RNA soluble RNA 16S desconocido RNA 23S RNA ribosmico Entre los dos RNA conocidos, el mejor candidato era el rRNA: porque se encontraba en los ribosomas por su tamao (el RNA soluble era demasiado pequeo para llevar la secuencia de una protena)

Se postul por tanto la hiptesis: 1 gen 1 ribosoma 1 protena Cada ribosoma llevara la impronta de una protena concreta, es decir, estara especializado en la sntesis de una sola protena.

Argumentos en contra Escasa variabilidad de los rRNA: Proporcin rRNA:

Proporcin DNA:

Si los rRNA fueran los portadores del mensaje debera haber una correspondencia de la variabilidad del rRNA con el DNA, sin embargo no se produce esta similaridad. 1961 Jacob y Monod Analizando los genes de la codificacin de protenas en E. coli, observaron que las bacterias eran capaces de cambiar rpidamente la expresin de los genes. o Si cambiaban los componentes del medio, se sintetizaban protenas diferentes. Esto demostraba que la molcula puente deba ser una molcula que cambiara muy rpidamente y que, por lo tanto, fuera muy inestables. o Resultaba contradictorio con la idea del rRNA como molcula puente, ya que ste era muy estable

Demostracin de la existencia del mRNA

Jacob, Brenner y Meselson Utilizaron el DNA del fago T4 e infectaron una bacteria para conseguir la sntesis de protenas del fago T4. Tras la introduccin del DNA, podan seguirse dos posibles caminos: DNA T4 ribosomas T4 (llevan especificidad en su rRNA) Protenas fago T4 DNAT4 mol. puente inestable lectura de la mol. en los ribosomas de E. coli (no llevan especificidad de secuencia, son fabricas de prot. sean cuales sean) Protenas fago T4

1 Experimento Demostraron que introducir istopos pesados conllevaba la formacin de ribosomas pesados. Introdujeron DNA del fago T4 en E. colis previamente cultivadas en presencia de (istopos pesados no radiactivos). Se produjo la sntesis de ribosomas pesados:
13

Cy

15

A representa las dos subunidades separadas (30S y 50S) B representa el ribosoma completo (70S)

Si el DNA del fago T4 lo introducan en una E. coli cultivada en un medio normal, la representacin mostraba un desplazamiento a una menor sedimentacin.

Sin istopos pesados

Este experimento demostraba que los ribosomas pertenecan a la E. coli (que era la que haba sido cultivada en el medio con istopos pesados) y no eran los del fago T4 creados a partir del DNA introducido. La molcula puente por lo tanto no era el rRNA, sino que era una molcula que era leda por los ribosomas de la bacteria.

2 Experimento En este segundo experimento cultivaron E. coli con los mismos istopos pesados durante varias generaciones, asegurando as que todas las molculas de DNA de E. coli fueran pesadas (y que por lo tanto todo lo sintetizado por la bacteria sea pesado). Introdujeron a tiempo 0: DNA del fago T4 Una gran cantidad de isotopos ligeros, 14N y 12C (por lo que si el rRNA del fago T4 fuera la molcula puente, cualquier ribosoma nuevo que se formara sera ligero)

Un pulso de Uridina 14C, radiactiva (se incorpora al DNA que se est sintetizando)

A tiempo = 5 min, obtuvieron los ribosomas se lleva a cabo una centrifugacin de los mismos no se detecta presencia de ribosomas ligeros, el perfil corresponde a los ribosomas pesados Al aadir la radiactividad se observa que sta no tiene perfil tipo ribosomas de neosntesis. o la radiactividad se asociaba a los ribosomas pesados de E. coli (B), que son los que sintetizan las protenas

radiactividad

Por lo tanto, no se forman ribosomas nuevos pero si se sintetiza un tipo de RNA que se asocia a los ribosomas ya existentes de E.coli. nuevo tipo de RNA (mRNA) que acta como molcula puente

Watson Realizaba simultneamente experimentos de obtencin de RNA total o radiactivo en bacteria E. coli sin fago. Consistan en experimentos de pulso corto y caza inmediata: aada uridina radiactiva durante 30 segundos e inmediatamente obtena los resultados (pulso de 30 segundos y caza inmediata). la radiactividad se incorporaba en un producto (RNA) de tamao intermedio entre el 16S y el 4S. o Este RNA no se observa en el perfil total de RNA porque es muy inestable (vida media 2-3 min) no representa ms del 5% de la bacteria en un momento determinado, el porcentaje aumenta siendo el RNA mayoritario, pero se degrada muy rpidamente por lo que no se aprecia

RNA desconocido (mRNA)

Estos experimentos se publicaron al mismo tiempo y ambos demostraban la existencia de un nuevo RNA que actuaba como molcula puente, el RNA mensajero.

Conforme los experimentos de pulso y caza son ms largos, la curva que se obtiene se parece ms al perfil de RNA total. - cuanto mayor tiempo, los nucletidos radiactivos se incorporan a RNA estables

Caractersticas mRNA
Tamao La molcula de mRNA puede tener un tamao de 500 a 10000 nucletidos. Algunos experimentos similares de pulso y caza encontraban RNA de 100S (muy grande) hnRNA (no maduro) (RNA nuclear heterogneo). o el mRNA en su inicio presenta intrones y protenas asociadas, tras la maduracin queda un tamao similar al anterior 500 -10000 N

Carcter monofibrilar El mRNA es una molcula de simple cadena donde hay muy escasos lugares de apareamiento (A-U y C-G). Sin embargo, el DNA es una molcula dplex, por lo tanto: El mRNA es copia de la misma cadena siempre o de cualquier de las 2? Dos opciones:

o o

Slo se transcribe una cadena siempre se formarn en una direccin Se transcriben las dos cadenas hay dos direcciones de copia

Experimentos de S. Spiegelman con el virus 174 Hibrid virus de simple cadena positiva (SS+) y virus de cadena dplex (RF).

Sin embarg slo se copiaba la cadena negativa del DNA dplex Transcripcin en una de las dos cadenas. En otros virus ocurra de la misma forma, sin embargo en bacterias la transcripcin se demostr se transcriben ambas cadenas en direcciones opuestas. Se transcribe la cadena codificable, y dependiendo del gen ser una u otra.

En muchos casos, la mayor parte de la protenas est codificada en la hebra superior, W, que es por convenio la hebra transcrita de izquierda a derecha, pero algunas protenas estn codificadas en la hebra inferior, C, que es transcrita en direccin opuesta. La transcripcin se realiza sobre la hebra molde complementaria. El mRNA obtenido ser idntico en secuencia (con U en lugar de T) a la hebra codificante o no molde.

La transcripcin por tanto comprende la sntesis de una cadena de RNA que representa a una cadena del DNA dplex. Cuando se dice que representa, lo que se quiere decir es que el RNA tiene una secuencia idntica a una de las cadenas del DNA (excepto que en lugar de T hay U), la cual se denomina cadena codificadora. Es complementaria a la otra cadena, la cual es la molde para su sntesis. Cuando se escribe una secuencia de DNA siempre hay que escribir la codificante e indicar en la direccin en la que se codifica 5 3.

La transcripcin se inicia en el nucletido +1 Upstream (flujo ascendente): secuencia en direccin opuesta a la trasncripcin o Los nucletidos de esta secuencia estn numerados negativamente, siendo -1 el que precede al inicio de la transcripcin (+1) Downstream (flujo descendente): secuencia en direccin a la de la transcripcin. o Los nucletidos de esta secuencia estn numerados positivamente, siendo +2 el que le sigue al inicio de la transcripcin (+1).

Convencionalmente, las secuencias se escriben de tal manera que la transcripcin proceda de la izquierda (en flujo ascendente) a derecha (en flujo descendente). Esto corresponde a la estructura del RNAm en la direccin habitual 53.

La secuencia de DNA a menudo se escribe para mostrar slo a la cadena codificadora, la cual tiene la misma secuencia que el RNA. Morfologa: regiones del mRNA En procariotas

El primer nucletido siempre es un 5 trifosfato El inicio de la transcripcin se produce en el triplete AUG La transcripcin se para cuando llega al triplete STOP (UAG, UGA, UAA) El mRNA procariota es policistrnico: tiene ms de una regin codificante y por lo tanto pueden codificar varias cadenas polipeptdicas. o cistrn regin codificante formada por agrupacin de varios codones Las protenas que se codifican en un mismo cistrn suelen estar asociadas, su colocalizacin asegura que se transcriban a la vez o regin intercistrnica regin no codificante Secuencia Shine-Dalgamo (sitio de unin al ribosoma). o en posicin -7 upstream desde el codn de inicio o sec.: AGGAGG o se encarga de atraer y posicionar la subunidad pequea del ribosoma (ya que RNA 16S posee una secuencia complementaria) y sta se encarga de atraer la subunidad grande. Esta secuencia es complementaria de una secuencia ubicada cerca del extremo 3 de uno de los componentes del RNA del ribosoma, el rRNA 16S. El sitio de unin al ribosoma se aparea con este componente de rRNA, lo que alinea el ribosoma con el comienzo del marco de lectura abierto (ORF). permite la lectura por parte del ribosoma o Si los cistrones consecutivos no estn muy separados, el 2 cistrn no presenta secuencia Shine-Dalgamo, ya que el ribosoma no se suelta (esto es debido al carcter policistrnico) o Si los cistrones estn separados por mas de 20 30 pb s que presentan la secuencia Shine-Dalgamo el ribosoma se separa y se vuelve a unir.

Regin lder precede al codn de inicio o en el lder puede haber algn triplete de inicio (AUG) pero no es funcional ya que es previa a la secuencia Shine-Dalgamo. ORF (Open Readin Fragme) o regiones situadas entre un codn de inicio funcional y un codn de paro Regin codificante, que se transcribe y se traduce. o Secuencia de codones no superpuestos contiguos que se conoce como marco abierto de lectura (ORF). Trailer o Situada detrs del ltimo cistrn o incluye la secuencia de terminacin disocia la RNA pol 5-UAG-3, 5-UGA-3, 5-UAA-3.

En eucariotas

Los mRNA de las clulas eucariotas maduran mediante distintos procesos: adicin de una serie de seales prdida de intrones (disminuye longitud) Adicin de CAP o casquete 5 o Ocurre inmediatamente despus de que se sintetice el extremo 5. Tras ser sintetizado al RNA transcrito se le aade una guanina en el extremo terminal 5 que permitir iniciar el proceso de metilacin. El nucletido de guanina de la caperuza 5 est conectada al extremo del mRNA a travs de tres grupos fosfato. o El casquete es el resultado de sucesivos eventos de metilacin. o Se distinguen diversos tipos de CAP segn los procesos de metilacin CAP 0: casquete que posee un nico grupo metilo en la posicin 7 de la guanina terminal.

Esta primera metilacin ocurre en todas las clulas eucariotas CAP1: casquete que posee dos grupos metilos El segundo metilo se agrega en posicin 2-O de la penltima base del transcrito En una pequea minora de eucariotas superiores, a la segunda base se agrega otro grupo metilo, pero slo cuando la posicin es ocupada por adenina (adicin del grupo metilo en la posicin N6) CAP2: consecuencia de una tercera metilacin Se produce una metilacin de la ribosa de la tercera base en la posicin 2-O Adicin de cola poliA Se adhiere al RNA despus de la transcripcin y la adicin est catalizada por la enzima poli(A) polimerasa, que agrega ~200 residuos de A al extremo 3-OH libre del mRNA. o Cuando el DNA est transcribindose por la RNA pol, sta llega a una secuencia de terminacin que es reconocida y cortada. Pero se pueden seguir aadiendo residuos de A (poliadeninacin), al generarse un 3-OH libre.

Eliminacin de intrones por Splicing Se escinden los intrones y los exones se empalman para obtener una nica secuencia codificante.

Tras la maduracin se obtiene un mRNA monocistrnico, con sus distintas partes: CAP o permite la unin de la subunidad pequea del ribosoma Regin lder o no suelen tener secuencias funcionales o los ribosomas avanzan hasta encontrar el triplete AUG Secuencia Kozak o formada por algunos nucletidos upstream del AUG ACCAUGG o Si se mutan estos nucletidos, disminuye la funcionalidad del mensajero o Se sita justo en el inicio de la traduccin pero no es el encargado de reclutar al ribosoma. Trailer Cola poli A

Estabilidad Procariotas Nada ms se transcribe la secuencia Shine-Dalgamo, se une la subunidad pequea de los ribosomas, que atrae a la grande. A medida que se transcribe, se traduce. Transcripcin simultneos. y traduccin son procesos

Si el gen es muy largo, mientras la RNA pol sigue transcribindolo, algunas endonucleasas (RNasa E) pueden empezar a degradar el mRNA por su extremo 5. los fragmentos de mRNA (endonucletidos) que han quedado libres son degradados por la exonucleasas PF 3 5 para liberar nucletidos sueltos.

En las bacterias la transcripcin y la traduccin estn ntimamente relacionadas. La primera empieza cuando la enzima RNA polimerasa se una al DNA y posteriormente se desplaza formando una copia de una cadena. Tan pronto se inicia la transcripcin, los ribosomas se adhieren al extremo 5 del mRNA y comien comienza la traduccin incluso antes de que el resto del mensaje se haya sintetizado. Los mRNA mensajeros presentan una gran inestabilidad, son creados y degradados muy rpidamente. Tiempo de vida medio: o mRNA cortos: 1 -15 min o mRNA largos: 5min. mx Procesividad muy rpida permite cambiar rpidamente segn el entorno renovando sus protenas o un mismo gen puede estar siendo transcripto por 15 RNA pol puede generar en un minuto 15 mRNA o estos 15 mRNA pueden ser traducido por 10 -30 ribosomas cada uno producen gran cantidad de protenas en muy poco tiempo

Eucariotas La estabilidad del mRNA eucaritico depende de su estructura y su secuencia. Las modificaciones de los extremos 5 y 3 del mRNA tienen funciones importantes en la prevencin del ataque de las exonucleasas o el CAP evita que las exonucleasas 5 3 ataquen el extremo 5

o la cola poli (A) evita que las exonucleasas 3 5 ataquen el extremo 3 Los elementos especficos de la secuencia del mRNA pueden estabilizarlo o desestabilizarlo En la regin codificadora, las mutaciones que crean codones terminacin activan un sistema de vigilancia que degarada al mRNA

La transcripcin se inicia y una vez se sintetiza el 5 se aade el CAP. El proceso contina hasta la secuencia de corte y poliadeninacin se forma cola poli(A) El mRNA madura es transportado al citoplasma, donde los ribosomas lo traducen. El proceso puede durar ms de cuatro horas, es mucho ms lento que el de procariotas. los eucariotas no requieren adaptarse a cambios bruscos en el entorno mRNA ms estables o Ejemplo: Eritrocitos siguen produciendo hemoglobina aunque pierdan el ncleo

La regulacin de la vida media del mRNA (estabilizacin) permite regular la sntesis de protenas Tiempo de vida ms largo, ms cantidad de protenas

Comparacin mRNA: procariota/eucariota