INVESTIGAR: - TECNICAS PARA LA TINCION EN HONGOS -PROCEDIMIENTOS DE LA TINCION DE GRAM - FUNCION DEL COLORANTE SOLUCION

Tincin de Gram

Se realiza para la identificacin de hongos. Suelen ser Gram+ y la nica consideracin a tener en cuenta es que el cristal violeta hay que mantenerlo por ms tiempo. Otras tcnicas histolgicas o tinciones: Plata Metalamina; Hematoxilina; Tincin Wright. EXAMEN DIRECTO Y CULTIVO Las muestras a partir de las cuales se realizan son:

Exudados ticos Secreciones respiratorias Biopsias Cepillados esofgicos Escamas Pelos y uas

NO EXAMEN DIRECTO PERO S CULTIVO

Exudado balanoprepuciales Exudado bucal-lingual

IDENTIFICACIN DE HONGOS MICELIALES La identificacin se hace en base a su morfologa, que puede ser macroscpica y microscpica y que vara en funcin del medio de cultivo, tiempo y temperatura de incubacin. La velocidad de crecimiento vara segn el hongo: Hongos miceliales: No dermatfilos! crecen rpido 3-5 das Dermatfilos! 1-3 semanas CARACTERSTICAS MACROSCPICAS

Textura de la colonia (mirar fotocopia 1):

o o o o

Algodonosa: micelio denso y largo Glabra: consistencia crea. No micelio areo Aterciopelada: micelio areo corto Pulverulenta: gran cantidad de esporas y conidias

Coloracin

CARACTERSTICAS MICROSCPICAS TCNICA CON PAPEL DE CELO CON AZUL

Cogemos un trozo de celo tocamos suavemente la parte superior del hongo del que queremos observar sus caractersticas microscpicas y lo colocamos sobre un porta al que anteriormente habamos aadido una gota de colorante azul algodn de lactofenol. Observamos al microscopio con el objetivo de 40x o 100x. CULTIVO O MICROCULTIVO EN PORTA

No se alteran las estructuras fngicas. Se utiliza un medio Saboraud que se vierte sobre una placa de petri (capa delgada). Una vez solidificado cortamos cuadrados con un bistur estril de 1-3 cm y los colocamos en una porta estril o flameada. La porta estar colocada en una placa de petri estril, sobre un soporte. En el fondo

de la placa aadiremos unas gotas de agua para evitar la desecacin durante la incubacin. Inoculamos o bien las esquinas, o bien los bordes del agar con el hongo a estudiar. Tomamos la muestra con un asa estril humedecida con agua. Sellamos las placas con parafilm y llevamos a incubar. EXAMEN DE FRAGMENTOS DE COLONIAS AL MICROSCOPIO

Mediante esta tcnica se rompen los conidios y las esporas. Consiste en cortar con el asa un fragmento de la colonia en el borde (asa en forma de cua) y depositarlo sobre una porta con una gota de azul de lactofenol. Si se ha incluido agar, calentar suavemente para fundirlo y aplastar el cubre. TCNICA PARA CONFIRMAR EL DIMORFISMO

Consiste en incubar la misma muestra a 25C, temperatura a la que crecen los hongos miceliales, y a 37C temperatura a la que crecen las levaduras (tejidos o medios especiales). Las especies ms importantes dimrficas son: Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidiodes imitis. Penicillium marneffei, Slorothrix schenckii. Para la confirmacin es necesario convertir la fase filamentosa en levaduriforme. Para ello incubamos parte de la colonia micelial en una placa de Agar Sangre (3-4 fragmentos). Sellamos e incubamos a 37C. Examinamos peridicamente el crecimiento buscando levaduras. Si crece colonia micelial repetimos la siembra hasta conseguir fase levaduriforme. MEDIOS DIFERENCIALES

Resistencia a Cicloheximida Actidiona:

o o

Dermatofitos y hongos dimrficas ! resistentes a 30C Zigomicetos, algunas levaduras, mayora de agentes micetomas! inhibidos

Agar Maz (patata, arroz): permite la esporulacin de hongos Desdoblamiento de urea: permite identificar especies de Trichophyton incubando a 25C / 7

PROCEDIMIENTO DE LA TINCIN DE GRAM

1. OBJETIVOS Y FUNDAMENTOS TEORICOS En el estudio de la ciencia que nos ocupa, la microbiologa, es fundamental la observacin de los microorganismos. Esta observacin se hace necesaria para su clasificacin e identificacin. Para ello se usa el microscopio tanto ptico como electrnico, y en sus diversas variantes (microscopio de rayos UV, electrnico de barrido, de contraste de fase, de campo oscuro). Nosotros abordaremos nicamente el microscopio ptico compuesto de dos lentes (condensador y objetivo). Un microscopio suele tener cuatro objetivos, pero en microbiologa se usa preferentemente el objetivo de inmersin, aunque para visualizar una preparacin siempre se recomienda empezar por el objetivo de x10 y una vez localizada la muestra ir subiendo poco a poco el nivel de aumentos. Al microscopio ptico hay dos formas de ver las preparaciones: Preparaciones en fresco con el objetivo seco. Tiene el inconveniente de que las preparaciones son muy difciles de ver debido al poco contraste del medio que les rodea. Preparaciones fijadas y teidas con el objetivo de inmersin. Se matan las bacterias, pero son ms visibles y su contraste es superior y de mayor calidad.

Entre los tipos de preparaciones del segundo tipo, hay un mtodo de tincin que se usa universalmente para distinguir a las bacterias en dos grandes grupos: se trata de la Tincin de Gram. Es una tincin diferencial que basa su distincin en la estructura diferente de la pared bacteriana de las bacteria Gram + (pared ms gruesa, y una sola capa de peptidoglucano) y de las Gram- (pared ms delgada y dividida en dos partes). El procedimiento y sustancias usadas son: Colorante bsico Cristal Violeta o Violeta de Genciana: Es el primer colorante que se echa sobre el frotis previamente preparado. Es un colorante selectivo que tie a todos los microorganismos. Se deja actuar durante un minuto y se lava con agua a continuacin. Lugol: Producto compuesto de yodo y yoduro potsico. Es un mordiente, que intensifica al Cristal Violeta haciendo que precipite. Se deja actuar un minuto y se lava con alcohol, el tiempo justo para que no se arrastre el colorante del todo. Alcohol 96: El alcohol retira el colorante de las Gram- debido a su diferente estructura de la pared celular (tamao de los poros). Safranina: Colorante bsico diferenciador. Tie a las bacterias Gram-. Se deja actuar treinta segundos y se lava con agua.

Como puede verse una vez finalizada la tincin las bacterias Gram- estarn teidas de un color rosceo, y las Gram+ de un color violeta. Esto sirve para diferenciarlas claramente al microscopio ptico.

FUNCION DEL COLORANTE: La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo.