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ADN recombinante

No debe confundirse con recombinacin gentica.

Diagrama de ADN ligado. Esta secuencia pertenece a un gen de lahemoglobina humana.

El ADN recombinante, o ADN recombinado, es una molcula de ADN artificial formada de manera deliberada in vitro por la unin de secuencias de ADN provenientes de dos organismos de especies diferentes que normalmente no se encuentran juntos. Al introducirse este ADN recombinante en un organismo se produce una modificacin gentica que permite la adicin de un nuevo ADN al organismo conllevando a la modificacin de rasgos existentes o la expresin de nuevos rasgos. La produccin de unaprotena no presente en un organismo determinado y producidas a partir de ADN recombinante se llaman protenas recombinantes. El ADN recombinante es resultado del uso de diversas tcnicas que los bilogos moleculares utilizan para manipular las molculas de ADN y difiere de la recombinacin gentica que ocurre sin intervencin dentro de la clula. El proceso consiste en tomar una molcula de ADN de un organismo, sea un virus, planta o una bacteria y en el laboratorio manipularla y ponerla de nuevo dentro de otro organismo. Esto se puede hacer para estudiar la expresin de un gen, para producir protenas en el tratamiento de unaenfermedad gentica, vacunas o con fines econmicos y cientficos.1
Contenido
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1 Procedimiento 2 Aplicaciones 3 Produccin y terapia con protenas recombinantes

o o o o

3.1 Produccin en bacterias 3.2 Produccin en levaduras 3.3 Produccin en clulas de insecto 3.4 Produccin en clulas de mamfero

4 Referencias 5 Enlaces externos

[editar]Procedimiento
El proceso de produccin de un ADN recombinante comienza con la identificacin desde un organismo de una secuencia de ADN de inters con el fin de propagarlo en otro organismo que carece de la secuencia y, por ende, del producto protico de esa secuencia de ADN.2 As se pueden producir cantidades ilimitadas de la protena codificada por el susodicho gen. En trminos simples, el procedimiento consiste en:3

Localizacin de genes y sus funciones. Clonacin del ADN, y su posterior almacenamiento en genotecas. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) Utilizacin de vectores de expresin.

[editar]Aplicaciones
El vector que se utiliza contiene secuencias de ADN que al ser replicadas confieren resistencia a antibiticos especficos. Esta tcnica ha sido ampliamente utilizada en el campo de la medicina y ha permitido el desarrollo de importantes avances teraputicos como por ejemplo la produccin de insulina recombinante.2 Permite adems la posibilidad de utilizar plantas y alimentos transgnicos, as como microorganismos modificados genticamente para producir frmacos u otros productos de utilidad para el hombre, entre los que se pueden citar: la insulina humana, la hormona del crecimiento, interferones, la obtencin de nuevas vacunas o la clonacin de animales. El uso de ADN recombinantes puede tambin tener un impacto perjudicial que un uso inadecuado podra provocar en el ser humano y en el propio planeta. Con el uso de ADN recombinante se ha logrado obtener plantas transgnicas resistentes a insectos, hongos, bacterias y herbicidas, con mejores caractersticas de calidad durante poscosecha y con alto contenido nutricional.4 Tambin ha permitido la clonacin, expresin y produccin mediante esta tcnica de diversos antgenos, por ejemplo, la vacuna contra la hepatitis B5 y lavacuna contra el virus del papiloma humano.6

[editar]Produccin

y terapia con protenas recombinantes

Las protenas recombinantes son aquellas que se producen mediante la tcnica del ADN recombinante, es decir, expresando un gen de un organismo en otro organismo distinto. Para que estas protenas sean tiles desde el punto de vista teraputico tienen que conservar su actividad. Adems, se debe evitar que sean inmunognicas para el ser humano. Para ello es importante decidir para cada protena recombinante cual es el organismo de expresin ms adecuado.

[editar]Produccin

en bacterias

Estas protenas recombinantes han intentado expresarse en bacterias como E. coli, ya que son fciles de mantener, crecen rpido y se conoce bien su genoma. Sin embargo, el mayor problema que presenta la produccin en bacterias es que en ellas no existe glicosilacin proteica, por lo que algunas protenas producidas en bacterias pierden totalmente su funcin. An as se han logrado producir con xito algunas protenas recombinantes en bacterias. La primera protena recombinante que se produjo en E. coli fue la somatostatina, una hormona anti-crecimiento de 14 aminocidos. Sin embargo, aunque desde el punto de vista cientfico fue un xito, desde el punto de vista econmico fue un fracaso, ya que su utilidad estaba reducida a

personas con problemas de gigantismo y similares, que son poco comunes. Posteriormente se logr un gran xito en este campo mediante la produccin de insulina en bacterias. La insulina presenta la ventaja de no necesitar modificaciones postraduccionales, por lo que se evita este problema de su produccin en bacterias. Adems, la diabetes es una enfermedad muy frecuente en la sociedad, con unos 170 millones de diabticos. En EEUU el 6% de la poblacin (20 millones de habitantes) son diabticos y esta enfermedad es la 6 causa de muerte. Antes de esta produccin en bacterias, se usaba insulina porcina.

[editar]Produccin

en levaduras

Al ser clulas eucariotas y por lo tanto ms similares a las humanas que las bacterias y ser muy fciles de emplear industrialmente, las levaduras constituyen otro grupo de organismos susceptibles de producir protenas recombinantes para uso humano. Sin embargo, aunque s presentan glicosilacin proteica, al contrario que las bacterias, esta es totalmente distinta a la humana, por lo que estas protenas presentan problemas, en muchos casos incluso inmunognicos.

[editar]Produccin

en clulas de insecto

Ms cercanas an a las clulas humanas que las levaduras son las de insecto, como las de Spodoptera frugiperda (una polilla parsito del maz y del algodn), que se cultivan fcilmente in Vitro, aunque el medio de cultivo es caro. Dicho medio, adems, no contiene suero, lo que hace ms fcil el procesado de la protena. Otra de las propuestas ha sido el uso no de clulas de insecto, sino de los insectos completos para la produccin de estas protenas. Para ello se infectan a los insectos con baculovirus modificados (que adems no infectan a los seres humanos) para que expresen la protena recombinante. Sin embargo, este sistema presenta exactamente el mismo problema que el de levaduras: que las clulas de insecto presentan glicosilacin, pero esta es totalmente distinta a la de mamferos.

[editar]Produccin

en clulas de mamfero

Al ser clulas ms parecidas a las humanas, el procesamiento que sufren las protenas recombinantes producidas en clulas de mamfero tambin es ms similar, por lo que se conserva su funcin (aunque puede haber ligeros cambios en el patrn de glicosilacin). Los inconvenientes de este mtodo es que el crecimiento celular es ms lento, tardando de 6 a 24 horas en duplicarse las clulas, que los cultivos pueden sufrir contaminacin de bacterias u hongos y que se puede contaminar el producto con virus que infecten a humanos. Para la produccin en mamferos se usan las clulas CHO, de ovario de ratn chino, que pre

CONTENIDOS ADN RECOMBINANTE O CLONACIN CELULAR

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La tcnica del ADN recombinante se utiliza en estudios sobre la regulacin de la expresin gnica, en la regulacin de la produccin comercial de sntesis de protenas como la Insulina o la hormona del crecimiento, en el desarrollo de organismo transgnicos y en la amplificacin del ADN, es decir, en obtener un gran nmero de copias de un gen determinado. En este ltimo caso, existe una tcnica mejor, denominada con las siglas PCR.

La tcnica consiste en introducir el gen seleccionado en el interior de un vector y ste, a su vez, dentro de una clula, denominada clula anfitriona. Aprovechando la maquinaria celular, el gen se expresa, sintetizndose as la protena codificada en el gen. Adems, al dividirse la clula, las nuevas clulas formadas contienen ese gen que tambin sintetizan esa protena. Se genera un grupo celular que contiene un genoma distinto. Las etapas en la produccin de ADN recombinante son las siguientes: 1. Preparacin de la secuencia del ADN para su clonacin 2. Preparacin de un vector de clonacin 3. Formacin del ADN recombinante 4. Introduccin del ADN recombinante en una clula anfitriona 5. Propagacin del cultivo 6. Deteccin y seleccin de clones recombinantes

1. Preparacin de la secuencia del ADN para su clonacin Es la parte esencial del proceso, ya que el ADN debe separarse y concentrarse. Partimos de clulas con ncleo, que deben ser lisadas (rotas). Las protenas estructurales, enzimas, ARN y restos moleculares deben separarse del ADN. El ADN obtenido se concentra y se fragmenta por accin de las enzimas de restriccin. Se asla el ADN que se desea clonar, por ejemplo, mediante cromatografa lquida o por centrifugacin. Si el ADN debe expresarse hay que aadir los segmentos reguladores de la expresin gnica.

2. Preparacin de un vector de clonacin El vector es el portador de la secuencia de ADN que se desea clonar. Un vector debe presentar las siguientes caractersticas: Una pequea secuencia de ADN fcil de aislar, como, por ejemplo, un plsmido. Contener distintos puntos de ataque aenzimas de restriccin y que sean conocidos. Poder ser incluido en la clula anfitriona con facilidad. Replicarse de forma independiente al ADN de la clula anfitriona. Poseer un gen marcador con el que puedan identificarse y seleccionar las clulas clonadas. Un ejemplo de marcador puede ser la resistencia a un antibitico.

Las etapas del proceso consisten en: 1. Cortar el vector conenzimas de restriccin, las mismas enzimas que se utilizaron para cortar el ADN que se quiere insertar. 2. Unir el vector y el ADN que se va a clonar mediante los llamadosextremos cohesivos, o pegajosos, o escalonados. Una vez que el ADN ha sido introducido en el vector se denomina ADN inserto, o simplemente, inserto. Los tipos de vectores que se utilizan suelen ser plsmidos, virus como el fago , cromosomas creados de forma artificial y quimeras.

3. Formacin del ADN recombinante

En esta etapa se produce la unin covalente del vector y el ADN inserto mediante una ligasa. As se realiza el sellado de la

llamada Mella, Muesca o Nick.

4. Introduccin del ADN recombinante en la clula anfitriona

Para la clonacin (replicacin del ADN recombinante) se necesita la maquinaria celular. Por ello, hay que introducir el ADN recombinante en una clula anfitriona. Los tipos de clulas anfitrionas son:

Clulas bacterianas: son las ms utilizadas, ya que tienen una alta velocidad de replicacin, un bajo coste de mantenimiento de las colonias y son fcilmente manipulables. Clulas eucariotas: aunque las clulas eucariotas son, en general, difciles de mantener se usan levaduras y clulas tumorales: o Levaduras: se utilizan en procesos relacionados con la investigacin de la expresin y la regulacin gnic y la sntesis de protenas eucariotas. o Clulas tumorales: apropiadas en procesos de clonacin, ya que la velocidad de replicacin es muy alta y se mantienen los caracteres sin producirse cambios, pues son muy estables.

Los mtodos para la introduccin del ADN recombinante facilitan la entrada de grandes fragmentos de ADN, puesto que la membrana celular es selectiva y no permitira la penetracin de grandes molculas.

Si deseas aprender ms sobre los mtodos utilizados para la introduccin del ADN recombinate, pulsa sobre el siguiente enlace de ampliacin. Ampliacin sobre los mtodos de introduccin de ADN recombinante Cuando hayas estudiado la pgina de ampliacin de contenidos puedes repasar con ayuda de la actividad 4!

Actividad 4

5. Propagacin del cultivo Se induce la divisin de clulas anfitrionas, de forma que se producen tambin copias de ADN recombinante y, por ello, la clonacin. Primero se efecta una siembra en placas Petri con agar como medio de cultivo. Se dejan crecer las colonias. Cada una de ellas ser seleccionada y transferida a distintos medios lquidos, donde seguir aumentando el nmero de individuos de la colonia.

6. Deteccin y seleccin de los clones recombinantes En los procesos de clonacin se utiliza un gran nmero de clulas. Al final del proceso se hace necesario separar las clulas que contienen ADN recombinante de las que no lo contienen.

La deteccin y la seleccin de colonias se realiza en los medios de cultivo. En los procesos de clonacin se obtienen clula anfitrionas que no han incluido el vector, clulas recombinantes, es decir, que han incluido el vector con el ADN para recombinar, y clulas anfitrionas con vector que no lleva el ADN inserto. Los mtodos para detectar y seleccionar son:

Mtodo de hibridacin: se utiliza una sonda marcada que hibrida con el ADN recombinante o con el ARN mensajero que se transcribe a partir de l. Mtodo inmunolgico: se detecta la protena codificada en el ADN recombinante mediante anticuerpos especficos. Mtodos genticos: que, a su vez, pueden ser: o Insercin del vector y el ADN recombinante en un gen de la clula anfitriona que queda desactivado. Por ejemplo, si la colonia no produce enzima lactasa, es que el ADN recombinante se encuentra dentro del ADN bacteriano en ese gen. o Vector con genes de resistencia a un antibitico: en el medio se agrega el antibitico y slo crecer aquella colonia que sea resistente a l, por tanto, que porte el ADN. o Colonias con defectos nutricionales: se utilizan clulas anfitrionas mutantes que no puedan sintetizar, por ejemplo, un aminocido. Para que la colonia sobreviva, el aminocido debe ser aadido al medio de cultivo Empleando un vector que lleve el gen correcto para la sntesis de dicho aminocido, haciendo crecer las colonias celulares en medios carentes de l slo crecern las bacterias que lleven el ADN inserto.

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