Universidade Estadual de Campinas Instituto de Qumica Departamento de Qumica Analtica LAQQA LABORATRIO DE QUIMIOMETRIA EM QUMICA ANALTICA

Desenvolvimento de metodologias analticas multivariadas empregando espectroscopia Raman de baixa resoluo amplificada por superfcie

Tese de Doutorado

Aluno: Dirginis Bueno Montrazi Ribeiro Orientador: Prof. Dr. Ronei Jesus Poppi Co-orientador: Prof. Dr. Cesar Mello

Campinas SP, Set/2009

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DEDICATRIA

Dedico este trabalho aos meus tios Paulo Henrique e Tuca, minha noiva Samanta e a minha mezinha Esmerinda

AGRADECIMENTOS Agradeo a Deus por mais esta oportunidade e mais uma vitria conquistada. Agradeo a Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo pela concesso da bolsa para realizao deste trabalho. UNICAMP e UNIFRAN por fornecer toda a estrutura fsica e tecnolgica para realizao deste trabalho Agradeo ao meu orientador professor doutor Ronei Jesus Poppi pela pacincia e tambm pela excelente orientao ao longo deste trabalho. Agradeo tambm ao meu co-orientador professor doutor Cesar Mello pela brilhante participao neste trabalho. Agradeo aos alunos e ex alunos (Danilo, Guilherme, Werickson, Lus, Laura, Jlio, Trevisan, Patrcia, Paulo Henrique, Jez, Waldomiro, Renato, Gilmare, Alessandra) do grupo LAQQA pelo incentivo. Agradeo ao Biomdico, da Universidade de Franca (UNIFRAN), Marcos Aurlio Stoppa pelo fornecimento das amostras de plasma humano utilizadas neste trabalho. Agradeo aos meus familiares por todo apoio e incentivo ao longo desta caminhada. Agradeo tambm as pessoas que no foram citadas, mas que contriburam de alguma forma para realizao deste trabalho.

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RESUMO Nesta tese metodologias analticas foram desenvolvidas empregando espectroscopia Raman de baixa resoluo amplificada por superfcie (SERS) e calibrao multivariada baseada no mtodo dos mnimos quadrados parciais (PLS) para determinao dos pesticidas endosulfan e metamidofs (e misturas deles) em gua, e do hormnio tireoestimulante (TSH) em plasma. Para a construo dos modelos de calibrao dos pesticidas, um total de 70 e 30 amostras compuseram os conjuntos de calibrao e validao, respectivamente, sendo a diviso realizada pelo algoritmo de Kennard-Stone. J na construo dos modelos de calibrao para a determinao quantitativa dos pesticidas nas misturas, um total de 38 e 11 amostras foram utilizadas na calibrao e validao respectivamente. Para construo dos modelos de calibrao para quantificao de TSH, um total de 39 mostras foram utilizadas na calibrao e 14 amostras de plasma foram utilizadas na validao. As amostras tambm foram divididas pelo algoritmo de Kennard-Stone. Os modelos foram desenvolvidos utilizando diferentes tipos de pr-processamentos de sinais e comparados atravs dos erros de previso (RMSEP). Foram utilizados como pr-processamento, o filtro de transformada de Fourier, a correo de espalhamento multiplicativa, a

transformao padro normal de variao, a ortogonalizao de espectros pelo mtodo de Gram-Schmidt, a centralizao e autoescalamento dos dados. Os melhores modelos foram validados atravs da determinao de figuras de mrito. Foram avaliados a exatido, sensibilidade, sensibilidade analtica, seletividade, ajuste, razo sinal/rudo, limites de deteco e quantificao. A metodologia proposta mostrou-se rpida, de baixo custo e apresentou erros abaixo de 10 g/L para os pesticidas e abaixo de 0,8 UI/mL para TSH, podendo facilmente ser adaptada para o monitoramento de pesticidas em guas e tambm em anlises laboratoriais de rotina para determinao de TSH.

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ABSTRACT In this thesis analytical methodologies were developed employing low resolution surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) and multivariate calibration based on partial least squares method (PLS) for determination of the pesticides endosulfan and methamidophos (and mixtures of them) in water and the thyroid stimulating hormone (TSH) in plasma. For the pesticides calibration model development, a total of 70 and 30 samples composed the calibration and validation sets, respectively, using the Kennard-Stone algorithm for samples separation. In the model development for the mixture of pesticides, a total of 38 and 11 samples were used in the calibration and validation sets, respectively. For the model development in the TSH determination, 39 samples were used in the calibration set and 14 in the validation set. Also the Kennard-Stone algorithm was used to split the samples into the two data sets. The models were developed using different preprocessing methods and compared by using the prediction errors (RMSEP). The following pre-processing were tested: Fourier transform filter, multiplicative scatter correction, standard normal variate, spectra orthogonalization by Gram-Schmidt method, mean center and autoscaling. The best models were validated by figures of merit determination. It was assessed the accuracy, sensibility, analytical sensibility, selectivity, fit, signal/noise ratio, detection and quantification limits. The proposed methodology is fast, has low cost and presented prediction errors below to 10 g/L for the pesticides and below to 0.8 UI/mL for TSH. It may easily be adapted for the pesticides monitoring in waters and also for routine laboratory analysis in TSH determination.

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Sumrio Lista de Figuras ............................................................................................... xxvii Lista de Tabelas .................................................................................................. xxiii Prefcio ................................................................................................................... 1 Captulo 1 - A espectroscopia Raman e o Efeito da Amplificao por Superfcie (SERS) .................................................................................................. 7 1.1. Introduo ........................................................................................................ 9 1.2. Modelo ondulatrio do espalhamento Raman ................................................. 9 1.2.1. Origem do espectro Raman ....................................................................... 12 1.3. Espectroscopia Raman amplificada por superfcie ........................................ 14 1.3.1. O Mecanismo de amplificao eletromagntico ......................................... 15 1.3.1.1. A superfcie plana do metal ...................................................................... 16 1.3.2. O mecanismo qumico de intensificao .................................................... 20 1.3.2.1. Transferncia de carga............................................................................. 20 Captulo 2 Mtodos Quimiomtricos .............................................................. 23 2.1. Introduo ...................................................................................................... 25 2.2. Calibrao cultivariada ................................................................................... 25 2.3. Pr-processamento dos sinais analticos ....................................................... 27 2.3.1. Remoo do rudo experimental: O Filtro de transformada de Fourier ...... 28 2.3.2. Correo do espalhamento multiplicativo .................................................... 29 2.3.3. Transformao padro normal de variao ................................................. 30 2.3.4. Ortogonalizao dos espectros: o mtodo de Gram-Schmidt .................... 31 2.3.5. Dados centrados na mdia.......................................................................... 32 2.3.6. Normalizao dos espectros ....................................................................... 33 2.3.7. Compresso de dados: anlise de componentes principais........................ 34 2.4. Validao: figuras de mrito ........................................................................... 36 2.4.1. Exatido ...................................................................................................... 37 2.4.2. Preciso ...................................................................................................... 38 2.4.3. Sensibilidade ............................................................................................... 38 xiii

2.4.4. Sensibilidade Analtica ................................................................................ 39 2.4.5. Linearidade.................................................................................................. 40 2.4.6. Sinal analtico lquido................................................................................... 40 2.4.7. Razo sinal/rudo ........................................................................................ 42 2.4.8. Robustez ..................................................................................................... 43 2.4.9. Limite de deteco e quantificao ............................................................. 43 2.4.10. Seletividade ............................................................................................... 44 Captulo 3 Obteno do Efeito SERS ............................................................. 45 3.1. Instrumentao ............................................................................................... 47 3.2. Preparao da suspenso de nanopartculas de ouro ................................... 47 3.3. Caracterizao da suspenso de nanopartculas de ouro.............................. 48 Captulo 4 Determinao de Pesticidas em guas Utilizando o Efeito SERS .................................................................................................................... 57 4.1. Introduo ...................................................................................................... 59 4.1.1. Classificao dos pesticidas quanto toxidade .......................................... 61 4.2. Pesticida metamidofs ................................................................................... 62 4.3. Pesticida endosulfan ...................................................................................... 63 4.4. Mtodos convencionais de anlise ................................................................. 64 4.5. Atribuies das bandas vibracionais do espectro Raman do pesticida metamidofs .......................................................................................................... 64 4.6. Atribuies das bandas do espectro Raman do pesticida endosulfan .......... 66 4.7. Obteno dos espectros SERS dos pesticidas em soluo aquosa ............. 69 4.8. Modelos de calibrao multivariada para o pesticida metamidofs ............... 70 4.8.1. Modelo de calibrao utilizando a transformada de Fourier como prprocessamento ...................................................................................................... 73 4.8.2. Modelo de calibrao utilizando a correo de espalhamento xiv

multiplicativa como pr-processamento ................................................................ 75 4.8.3. Modelo de calibrao utilizando o mtodo de ortogonalizao de GramSchmidt como pr-processamento ............................................................................................... 77 4.8.4. Comparao dos modelos para o pesticida metamidofs ........................... 79 4.9. Modelos de Calibrao para o pesticida endosulfan ...................................... 80 4.9.1. Modelo de calibrao utilizando transformada de Fourier como prprocessamento ...................................................................................................... 82 4.9.2. Modelo de Calibrao utilizando a transformada padro normal de variao como pr-processamento ....................................................................... 84 4.9.3. Modelo de Calibrao utilizando correo de espalhamento multiplicativa como pr-processamento ................................................................ 85 4.9.4. Modelo de Calibrao utilizao ortogonalizao de Gram-Schmidt como pr-processamento ...................................................................................... 87 4.9.5. Comparao dos Modelos para o pesticida endosulfan .............................. 88 4.10. Modelos de calibrao multivariada para misturas dos pesticidas metamidofs e endosulfan .................................................................................... 89 4.11. Validao dos melhores modelos de Calibrao .......................................... 93 Captulo 5 Determinao de TSH em plasma sanguneo utilizando SERS .................................................................................................................. 103 5.1. Introduo .................................................................................................... 105 5.1.1. Hormnio Tireoestimulante (TSH) ............................................................. 106 5.2. Parte experimental ....................................................................................... 107 5.3. Resultados e discusso................................................................................ 110 Concluses.......................................................................................................... 117 Referncias Blibliogrficas .................................................................................. 121 xv

Lista de Figuras Figura 1.1. Esquema das transies vibracionais dos espalhamentos: Raman Stockes, Rayleigh e Raman Anti-Stockes................................................. 13 Figura 1.2. Vetores campo eltrico e magntico da luz incidente e refletida para s-polarizao e p-polarizao na superfcie do metal..................... 16 Figura 1.3. O processo de transferncia de carga ................................................ 21 Figura 2.1. Representao esquemtica da seqncia de operaes utilizada na aplicao do filtro de transformada de Fourier ................................... 29 Figura 2.2. Ortogonalizao de vetores para remoo da fluorescncia usando o mtodo de Gram-Schmidt .................................................................................. 32 Figura 2.3. Representao geomtrica da propriedade de ortogonalidade do sinal analtico lquido ........................................................................................ 41 Figura 3.1. Espectro de absoro no ultravioleta-visvel da suspenso de nanopartculas de ouro .................................................................................... 49 Figura 3.2. Espectro de absoro no ultravioleta-visvel da suspenso de nanopartculas de ouro contendo 1 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L ...................................................................................................... 50 Figura 3.3. Espectro de absoro da suspenso de nanopartculas de ouro contendo 2 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L ............................. 50 Figura 3.4. Espectro de absoro da suspenso de nanopartculas de ouro contendo 3 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L ............................. 51 Figura 3.5. Espectro de absoro da suspenso de nanopartculas de ouro contendo 4 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L ............................. 51 Figura 3.6. Espectro de absoro da suspenso de nanopartculas de ouro contendo 5 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L ............................. 52 xvii

Figura 3.7. Microscopia eletrnica de varredura da suspenso de nanopartculas de ouro contendo 5 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L ........................ 53 Figura 3.8. Microscopia eletrnica de varredura da suspenso de nanopartculas de ouro contendo 5 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L ........................ 53 Figura 3.9. Espectros Raman do cristal violeta ..................................................... 54 Figura 3.10. Espectros Raman dos cristais de violeta na presena de ouro coloidal .................................................................................................................. 55 Figura 4.1. Frmula estrutural do pesticida metamidofs ...................................... 62 Figura 4.2. Frmula estrutural do endosulfan ........................................................ 63 Figura 4.3. Espectro Raman do pesticida metamidofs puro ................................ 65 Figura 4.4. Estrutura molecular do pesticida metamidofs .................................... 66 Figura 4.5. Espectro Raman do pesticida puro endosulfan. .................................. 67 Figura 4.6. Estrutura molecular do pesticida endosulfan ....................................... 68 Figura 4.7. Espectros Raman SERS do metamidofs no prprocessados .......................................................................................................... 71 Figura 4.8. Modelo de calibrao para determinao de metamidofs ................. 73 Figura 4.9. Espectros SERS do pesticida metamidofs aps utilizao do filtro com transformada de Fourier ................................................................... 74 Figura 4.10. Modelo de calibrao para determinao de metamidofs com pr-processamento por filtro com transformada de Fourier .......................... 75 Figura 4.11. Espectros SERS do pesticida metamidofs com pr- processamento por MSC. ............................................................................................................... 76 Figura 4.12. Modelo de calibrao para determinao de metamidofs com pr-processamento por MSC......................................................................... 77 Figura 4.13. Espectros SERS de metamidofs pr-processado com ortogonalizao ..................................................................................................... 78 xviii

Figura 4.14. Modelo de calibrao para determinao de metamidofs com pr- processamento por ortogonalizao ...................................................... 79 Figura 4.15. Espectros Raman SERS de endosulfan no prprocessados .......................................................................................................... 81 Figura 4.16. Modelo de calibrao para determinao de endosulfan. () calibrao; () validao ...................................................................................... 82 Figura 4.17. Espectros SERS do pesticida endosulfan aps utilizao do filtro de transformada de Fourier ........................................................................................ 83 Figura 4.18. Modelo de calibrao para determinao do endosulfan com transformada de Fourier como pr-processamento. () calibrao; () validao ............................................................................................................... 84 Figura 4.19. Modelo de calibrao para determinao de endosulfan utilizando SNV como pr-processamento. () calibrao; () validao.............................. 85 Figura 4.20. Espectros Raman SERS de endosulfan pr-processados com MSC ...................................................................................................................... 86 Figura 4.21. Modelo de calibrao para determinao de endosulfan com prprocessamento por MSC. () calibrao; () validao ....................................... 86 Figura 4.22. Espectros Raman SERS de endosulfan pr-processados com ortogonalizao ..................................................................................................... 87 Figura 4.23. Modelo de calibrao para determinao de endosulfan com prprocessamento por ortogonalizao. () calibrao; () validao ...................... 88 Figura 4.24. Espectros Raman SERS das misturas de pesticidas endosulfan e metamidofs .......................................................................................................... 90 Figura 4.25. Valores de referncia contra os previstos pelo modelo para a quantificao do pesticida endosulfan na mistura. () calibrao; () validao ............................................................................................................... 91

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Figura 4.26. Valores de referncia contra os previstos pelo modelo para a quantificao do pesticida metamidofs na mistura. () calibrao; () validao ............................................................................................................... 92 Figura 4.27. Valores de referncia versus valores estimados pelo modelo PLS para o pesticida endosulfan. () amostras de calibrao, (*) amostras de validao ............................................................................................................... 95 Figura 4.28. Valores de referncia versus valores estimados pelo modelo PLS para o pesticida metamidofs. () amostras de calibrao, (*) amostras de validao ............................................................................................................... 95 Figura 4.29. Valores de referncia versus valores estimados pelo modelo PLS para o pesticida endosulfan na mistura. () amostras de calibrao, (*) amostras de validao .......................................................................................................... 96 Figura 4.30. Valores de referncia versus valores estimados pelo modelo PLS para o pesticida metamidofs na mistura. () amostras de calibrao, (*) amostras de validao .......................................................................................... 96 Figura 4.31. Escalar NAS contra as concentraes de referncia para o endosulfan ............................................................................................................. 97 Figura 4.32. Escalar NAS contra as concentraes de referncia para o metamidofs .......................................................................................................... 97 Figura 4.33. Escalar NAS contra as concentraes de referncia para o endosulfan na mistura ........................................................................................... 98 Figura 4.34. Escalar NAS contra as concentraes de referncia para o metamidofs na mistura ........................................................................................ 98 Figura 4.35. Grfico de erros absolutos contra os valores de referncia do modelo de calibrao para determinao do pesticida endosulfan ....................... 99 Figura 4.36. Grfico de erros absolutos contra os valores de referncia do modelo de calibrao para determinao do pesticida metamidofs .................. 100 xx

Figura 4.37. Grfico de erros absolutos contra os valores de referncia do modelo de calibrao para determinao do pesticida endosulfan na mistura ... 100 Figura 4.38. Grfico de erros absolutos contra os valores de referncia do modelo de calibrao para determinao do pesticida metamidofs na mistura 101 Figura 5.1. Espectros SERS de plasma sanguneo sem pr-processamento ..... 110 Figura 5.2. Espectros SERS de plasma sanguneo aps pr-processamento .... 111 Figura 5.3. Grfico usado para a escolha no nmero de variveis Latentes ....... 112 Figura 5.4. Valores de referncia contra previstos pelo modelo para determinao de TSH. () calibrao; () validao................................................................. 114 Figura 5.5. Escalar NAS contra as concentraes de Referncia, () amostras de calibrao, (*) amostras de validao ................................................................. 115 Figura 5.6. Grfico de erros absolutos contra as concentraes de referncia... 116

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Lista de Tabelas Tabela 4.1. Classificao toxicolgica de pesticidas ............................................. 61 Tabela 4.2. Atribuio das bandas Raman para o pesticida metamidofs ............ 66 Tabela 4.3. Atribuio das bandas Raman para o pesticida endosulfan ............... 68 Tabela 4.4. Solues preparadas das diferentes concentraes das misturas de pesticidas .............................................................................................................. 70 Tabela 4.5. Valores dos erros calculados pelos modelos de calibrao para quantificao de metamidofs ............................................................................... 79 Tabela 4.6. Valores de teste F para os diferentes modelos Desenvolvidos .......... 80 Tabela 4.7. Valores dos erros calculados pelos modelos de calibrao para quantificao de endosulfan .................................................................................. 89 Tabela 4.8. Valores dos erros calculados pelos modelos de calibrao para quantificao de endosulfan nas misturas ............................................................ 92 Tabela 4.9. Valores dos erros calculados pelos modelos de calibrao para quantificao de metamidofs nas misturas.......................................................... 93 Tabela 4.10. Figuras de Mrito para os modelos desenvolvidos........................... 93 Tabela 5.1. Concentraes obtidas pelo mtodo quimioluminescente ................ 109 Tabela 5.2. Resultados de figuras de mrito estimadas para o modelo PLS ......................................................................................................... 113

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PREFCIO

Os equipamentos utilizados para obteno dos espectros Raman podem ser divididos entre dispersivos e baseados em transformada de Fourier. Os equipamentos com transformada de Fourier utilizam lasers operando a 1064 nm que fazem com que pouca ou nenhuma fluorescncia seja observada nas medidas, porm a intensidade Raman pequena, o que compensada com a utilizao da vantagem das medidas multiplexadas. Esses equipamentos tm custos elevados, mas conseguem tima resoluo e relao sinal/rudo. Porm recentemente com o desenvolvimento dos lasers de diodo e detectores de matriz de diodo de carga acoplada (CCD), equipamentos portteis e de baixo custo tem surgido no mercado, o que pode tornar possvel o desenvolvimento de aplicaes com espectroscopia Raman mais simples e a um custo acessvel. A desvantagem desses equipamentos mais simples que normalmente lasers no visvel so utilizados, gerando espectros com fluorescncia e pouco resolvidos. Com a possibilidade do tratamento dos dados por mtodos

quimiomtricos, tem sido demonstrado, principalmente com a espectroscopia no infravermelho prximo, que a ausncia de resoluo e a presena de fortes interferncias espectrais no so fatores limitantes para o desenvolvimento de metodologias de anlise para determinaes quantitativas. Assim pode-se pensar em metodologias analticas com a unio da espectroscopia Raman de baixa resoluo e mtodos quimiomtricos. A espectroscopia Raman amplificada por superfcies (SERS do ingls, Surface Enhanced Raman Spectroscopy), desenvolvida na dcada de 70, realizada pela adsoro do analito em superfcies coloidais metlicas, propiciando a amplificao no efeito Raman. Dessa forma, pode-se com essa tcnica espectroscpica vibracional alcanar nveis de concentrao extremamente baixos, podendo assim ser utilizada em metodologias analticas para anlise de traos. Esta tese teve como objetivo utilizar tcnicas quimiomtricas de calibrao multivariada baseada em mnimos quadrados parciais (PLS do ingls, Partial Least Squares) para determinao de pesticidas em guas e tambm de 3

hormnio tireoestimulante (TSH do ingls, Thyroid Stimulating Hormone) em plasma utilizando a espectroscopia Raman de baixa resoluo amplificada por superfcie (SERS) como resposta instrumental. O recurso de amplificao do sinal Raman foi utilizado para que se possam fazer determinaes trao tanto para pesticidas (g/mL) quanto para TSH (UI/mL). O procedimento SERS para o monitoramento de guas superficiais prximas s indstrias e lavouras extremamente atraente, dada a simplicidade experimental dos mtodos envolvidos, a possibilidade de determinaes simultneas de pesticidas de um modo extremamente rpido, alm de ter a vantagem de fazer anlises in situ, vantagem que a tcnica cromatogrfica ainda no possui. Para a determinao de TSH, o procedimento SERS tambm extremamente atraente dada a simplicidade experimental dos mtodos envolvidos, os baixos limites de deteco possveis de serem alcanados, a rapidez do mtodo para se obter o resultado e, principalmente, a iseno de reagentes radioativos e no-radioativos nesta determinao. A presente tese foi divida em cinco captulos, sendo que o primeiro intitulado A Espectroscopia Raman e o Efeito da Amplificao por Superfcie apresenta a teoria da tcnica empregada para determinao dos pesticidas em guas e tambm do TSH em plasma. O segundo captulo intitulado Mtodos Quimiomtricos reporta a parte terica sobre os mtodos quimiomtricos (pr-processamento de sinais, mtodos de quantificao e validao) utilizados no desenvolvimento dos modelos de calibrao multivariada. O terceiro captulo intitulado Obteno do Efeito SERS explica como foram produzidos e otimizados os colides de ouro utilizados na amplificao do espalhamento Raman. O quarto captulo intitulado Determinao de Pesticidas em gua utilizando o Efeito SERS apresenta os modelos de calibrao multivariada e prprocessamentos de dados utilizados para quantificao dos pesticidas

Metamidofs e Endosulfan, assim como a mistura deles. A validao dos modelos 4

de calibrao multivariada proposta com base na determinao de figuras de mrito. O quinto captulo intitulado Determinao de TSH em Plasma Sanguneo utilizando SERS, aborda a metodologia desenvolvida, utilizando a espectroscopia Raman de Baixa Resoluo Amplificada por Superfcie para quantificao do hormnio tireoideano (TSH). Tambm nesse caso foi realizada a validao do modelo pela determinao das figuras de mrito. Finalmente a tese se encerra pelas Concluses e apresentao das Referncias Bibliogrficas utilizadas.

CAPTULO 1
A ESPECTROSCOPIA RAMAN E O EFEITO DA AMPLIFICAO POR SUPERFCIE

1.1. Introduo A espectroscopia Raman [1-4] ocupa hoje uma posio destacada dentre as tcnicas usadas na investigao da estrutura microscpica da matria. sabido que as tcnicas espectroscpicas de uma maneira geral, fornecem informaes detalhadas sobre os nveis de energia das espcies em estudo; particularmente no caso da espectroscopia vibracional, a grande vantagem reside na maior riqueza de detalhes proporcionada pelos nveis de energia vibracionais, frente aos nveis de energia eletrnicos: enquanto os espectros eletrnicos so constitudos por bandas largas usualmente sem estrutura, os vibracionais representam a impresso digital da molcula. Sem dvida, a espectroscopia Raman detm uma srie de vantagens sobre a espectroscopia de absoro no infravermelho (IV) sendo que as principais so a possibilidade de obteno de espectros de substncias em meio aquoso e a utilizao de recursos especiais, como o efeito Raman ressonante e o efeito de amplificao por superfcie, que aumentam sua sensibilidade. Mais ainda, trata-se de uma tcnica de investigao qualitativa e quantitativa, que combinada com o uso de fibras ticas, permite a monitorao remota de amostras; essa possibilidade vem sendo explorada, por exemplo, no estudo de matrizes biolgicas [5] na determinao de pesticidas [6] e em pesquisas biomdicas por permitir o estudo de tecidos [7] in vivo.

1.2. Modelo ondulatrio do espalhamento Raman

Os espectros Raman so obtidos irradiando-se uma amostra com uma fonte de laser potente de radiao monocromtica no visvel ou no infravermelho prximo. Durante a irradiao, o espectro da radiao espalhada medido em certo ngulo (geralmente 90 graus) com um espectrmetro apropriado. As intensidades das linhas Raman so, quando muito, 0,001% da intensidade da fonte; como conseqncia, sua deteco e medida so mais difceis do que em um espectro no infravermelho. 9

A causa bsica do espalhamento Raman a polarizao induzida na molcula pelo campo eltrico oscilante da radiao eletromagntica incidente. Este dipolo induzido espalha a radiao com ou sem alterao da energia vibracional da molcula. A polarizao P induzida na molcula depende da polarizabilidade desta molcula e do campo eltrico da radiao eletromagntica

incidente E, como apresentado na equao 1.1, abaixo.

(1.1)

A polarizabilidade dos eltrons de uma molcula depender da freqncia de vibrao molecular e, portanto podemos considerar como uma aproximao bastante razovel que o potencial que governa esta variao na polarizabilidade o mesmo que governa as vibraes moleculares, isto , o potencial do oscilador harmnico. Assim sendo, um feixe de radiao com freqncia ex incidindo sobre uma soluo de um analito tem o campo eltrico E dessa radiao descrito pela equao:

E 0 cos( 2ext t )

(1.2)

onde E0 a amplitude da onda. Quando o campo eltrico da radiao interage com uma nuvem eletrnica de uma ligao do analito induz-se um momento dipolar P na ligao que dado por:

E0 cos 2ext t

(1.3)

Para ser ativa no Raman, a polarizabilidade de uma ligao precisa variar em funo da distncia entre os ncleos, de acordo com a equao:

10

(r

req )

(1.4)

onde 0 a polarizabilidade da ligao na distncia internuclear de equilbrio req e a separao internuclear em qualquer instante r. A variao na separao internuclear se altera com a freqncia de vibrao e dada por:

req

rm cos( 2 t )

(1.5)

Onde rm a separao internuclear mxima relativa posio de equilbrio. Substituindo a equao 1.5 na 1.4 temos:
r mcos(2 t ) r

(1.6)

Podemos, ento, obter uma expresso para o momento dipolar induzido P substituindo a equao 1.6 na equao 1.3. Assim,
cos(2 t ) cos(2ext ) r

0E0 cos(2ext t ) E0 rm

(1.7)

A equao 1.7 pode ser rearranjada para:

cos 2 ext r cos 2 ext r

0 E0 cos(2ext t )

E0 rm 2

E0 rm 2

(1.8)

O primeiro termo da equao 1.8 contm somente o termo de freqncia de excitao ext e corresponde ao espalhamento inelstico, sem troca de energia com a molcula, tambm chamado de espalhamento Rayleigh e ocorre na mesma freqncia da radiao incidente e, portanto, no apresenta nenhuma informao sobre os nveis vibracionais da molcula em questo. J no segundo termo, aparecem as radiaes espalhadas com freqncia (ext 11
)

, chamado de

espalhamento Raman Stokes e (ext

) chamado de espalhamento Raman anti-

Stokes. Aqui a freqncia de excitao foi modulada pela freqncia vibracional da ligao. importante notar que o espalhamento Raman exige que a polarizabilidade de uma ligao varie em funo da distncia, isto ,

/ r na

equao 1.8 precisa ser maior que zero para que as linhas Raman apaream.

1.2.1. Origem do espectro Raman

Na espectroscopia Raman, a excitao espectral normalmente realizada por radiao de comprimento de onda resultante dos picos de absoro do analito. O diagrama de energia da Figura 1.1 mostra um quadro qualitativo das fontes de espalhamentos Rayleigh e Stokes [8]. A figura mostra a variao de energia na molcula quando ela interage com um fton da fonte. O processo mostrado no quantizado, assim, dependendo da freqncia da radiao da fonte, a energia de uma molcula pode assumir um nmero infinito de estados virtuais, entre o estado fundamental e o primeiro estado eletrnico excitado. Na transio mostrada esquerda tem-se a passagem do estado fundamental para um estado virtual, cuja energia dada por E=h0. Esse processo gera uma emisso Raman quando a molcula perde a energia decaindo para o primeiro nvel vibracional excitado (E=hv). Isso gera bandas Raman Stokes. Na transio do centro da figura, tem-se a variao de energia, pela absoro do fton, entre o estado fundamental e o estado virtual. Nesse caso, aps o decaimento, volta-se ao estado fundamental. Tem-se o espalhamento Rayleigh, sem perda de energia, e como conseqncia as colises so denominadas elsticas. Finalmente, a transio mostrada direita apresenta a passagem entre um primeiro nvel excitado vibracional e um estado virtual de maior energia. Aps o decaimento, tem-se a volta para o estado fundamental, com variao na energia. Isso gera as bandas Raman anti-Stokes

12

Estados Virtuais Virtuais E=h0

E=hv E=h0

Estado Fundamental

ib

Banda Rayleigh Banda Stockes Banda anti-Stockes

0 - v

0 + v

Figura 1.1. Esquema das transies vibracionais dos espalhamentos: Raman Stockes, Rayleigh e Raman Anti-Stockes.

Na espectroscopia Raman, tanto molculas diatmicas heteronucleares como molculas diatmicas homonucleares apresentam atividade, pois em ambos os casos ocorre variao na polarizabilidade durante a vibrao. Por exemplo, a polarizabilidade da ligao dupla carbono-carbono varia significativamente durante a vibrao molecular e, portanto seu espalhamento Raman forte, j na ligao dupla carbono-oxignio a variao da polarizabilidade no to intensa, pois esta ligao j possui um momento de dipolo permanente intenso. No infravermelho ocorre justamente o contrrio, a absoro da ligao dupla carbono-carbono fraca e a absoro da ligao dupla carbono-oxignio forte. Fatos como este levaram a generalizao equivocada de espcies ativas no infravermelho so inativas na espectroscopia Raman. No espectro Raman, h simetria em relao linha Rayleigh, uma banda do lado de freqncias mais baixas, as Stokes, e uma do lado das freqncias 13

mais altas, as anti-Stokes. Como a populao dos estados excitados segue a distribuio de Boltzmann, deve-se esperar que as bandas anti-Stokes tenham menor intensidade do que as linhas Stokes.

1.3. Espectroscopia Raman amplificada por superfcie

A espectroscopia Raman amplificada por superfcie (SERS - do ingls Surface Enhanced Raman Spectroscopy) desenvolvida na dcada de 70 [9] realizada pela adsoro do analito em superfcies coloidais metlicas ou em superfcies speras desse metal, propiciando a amplificao no efeito Raman [10]. No descobrimento do feito por Fleischmann, reportou-se um espectro muito intenso da piridina em uma superfcie spera de um eletrodo de prata. A intensidade do espectro foi inicialmente atribuda ao aumento no empacotamento molecular na superfcie do eletrodo. Pesquisas posteriores mostraram que este aumento isolado na densidade de empacotamento no poderia provocar o enorme aumento na intensidade do espectro Raman e em 1977 duas teorias independentes foram formuladas para descrever o fenmeno. Superfcie spera essencial para a obteno do efeito SERS. Neste contexto, aspereza significa que a superfcie deve ter regies com certa curvatura. Por exemplo, prata coloidal com um dimetro mdio de partculas de 40 nm considerada spera, embora cada partcula coloidal seja essencialmente lisa (microscopicamente spera). O efeito SERS tem sido assim explicado por duas teorias: A teoria eletromagntica, em que o campo eletromagntico do metal-superfcie amplificado pelo campo incidente devido gerao de plasmons superficiais; e a teoria qumica, que prope a interao qumica entre analito e substrato, atravs do arranjo das ligaes ou transferncia de carga, resultando no aumento da polarizabilidade das molculas do analito. A amplificao do espalhamento normalmente muito alta, da ordem de 10 6 ou mais, permitindo a obteno dos espectros Raman de substncias qumicas em um curto tempo de integrao e/ou sem a subtrao de backgrouds [11]. 14

No desenvolvimento da metodologia SERS, alguns fatores importantes devem ser levados em considerao na obteno do substrato ativo, como por exemplo: a efetividade na amplificao, a durabilidade e reprodutibilidade. Dentre os materiais, incluindo metais e semicondutores, os metais prata (Ag), ouro (Au) e cobre (Cu) so os mais usados para induzir a amplificao do espectro Raman por superfcie de amostras qumicas. A superfcie metal-substrato para ativar o SERS pode geralmente incluir as seguintes formas: sis-coloidais, eletrodos porosos e filmes metlicos. Uma vantagem dos sis coloidais metlicos est na sua simples preparao e manipulao. Porm, a variao da intensidade SERS com o tempo de vida do sol o maior fator limitante na aplicao do substrato em anlises. Eletrodos porosos podem ser usados para amplificar sinais Raman de uma ampla gama de analitos, mas a incluso do aparelho eletroqumico complica as medidas do sistema. A aplicao de filmes via sol-gel, possui o potencial para contornar estas desvantagens [12], porm ainda existem problemas prticos nessa implementao que dependem da estrutura e formao do sol-gel.

1.3.1. O mecanismo de amplificao eletromagntico (EM)

No mecanismo EM, h vrias propriedades que so de extrema importncia no efeito SERS. Estas propriedades, na superfcie, incluem a forma e tamanho (por exemplo, uma pequena irregularidade na forma das partculas metlicas, uniformidade no tamanho das nano partculas, partculas metlicas coloidais ou agregados fractais, etc.) e tambm a freqncia dependente da funo dieltrica na superfcie dos materiais [13]. A intensificao do campo eletromagntico na superfcie do metal primariamente causada pelo campo eltrico local na superfcie, campo este que responsvel pela excitao da radiao Raman e tambm pelo momento de dipolo induzido em molculas adsorvidas sobre a superfcie irregular do metal.

15

1.3.1.1. A superfcie plana do metal

Para entender facilmente a interao da luz incidente com uma superfcie, devemos analisar o esquema desta interao conforme mostrado na figura 1.2.

s-polarizao

p-polarizao

Figura 1.2. Vetores campo eltrico e magntico da luz incidente e refletida para spolarizao e p-polarizao na superfcie do metal.

Os vetores campo eltrico e campo magntico correspondem as denotaes Ki, Ei, Bi e Kr, Er, Br respectivamente. Os vetores obedecem independentemente a regra da mo direita para a luz incidente e refletida. Para uma superfcie plana tem-se [14-16]:

surf Es
surf E p,y

i Es 1 rs
i E p,y 1 rp cos

(1.9) (1.10) (1.11)

surf E p,z

surf E p,z 1 rp sen

onde os ndices s e p indicam as direes de p- e s-polarizao, y e z denotam as componentes do campo (E) paralelo aos eixos y, z (ver figura 1.2). O sobrescrito surf simboliza as componentes primrias do campo na superfcie, rs e rp 16

correspondem aos coeficientes de Fresnel na reflexo da luz. O sinal positivo ou negativo que compe os coeficientes de Fresnel uma conseqncia no deslocamento da fase pelo 0 () para a onda refletida. O comportamento da refletividade facilmente descrito usando as expresses para os coeficientes de Fresnel rp e rs para irradiao da luz numa superfcie metlica da soluo em anlise em funo da funo dieltrica da superfcie metlica [14] dada por:

rs

cos cos
cos cos

sen

1 2

sen2
sen2 sen2

1 2

(1.12)

1 2 1 2

rp

(1.13)

em que representa o ngulo incidente. Note que a funo dieltrica,

(,K)

depende da freqncia e do vetor onda K da luz incidente. Porm nos negligenciamos a correlao de (,K) com K. As componentes de espalhamento do campo ptico na superfcie do metal so dadas, de acordo com a polarizao conforme equao 1.14,

E s'
' Ep

1 rs' px
'

1 rp' py cos

1 rp' pz sen

'

(1.14)

Em que os primeiros representam a luz espalhada. As quantias polarizadas p x , p y e pz so dadas por:

px py pz

xx E xy yx E x zxE x

xy E y YY E y zy E y
17

xzEz yzEz zzEz

(1.15)

onde representa a polarizabilidade. Substituindo a equao 1.15 em 1.13, obtemos as intensidades Raman para superfcie[14-16], conforme as equaes 1.16, 1.17, 1.18 e 1.19.

Is

4 csc xx 1 rs 1 rs'

(1.16)

I ps

4 csc xy 1 r p 1 rs' cos

yz 1 r p 1 rs' sen

(1.17)

I ps

4 csc yx 1 rs 1 rp' cos

'

zx 1 rs 1 rp' sen

(1.18)

I ps

4 csc

yy 1 rp cos zy 1 r p cos

yz 1 r p sen

1 r p' cos
'

'

zz 1 r p 1 rp' sen

(1.19)

Atravs das equaes descritas acima, certos aspectos da intensidade do espalhamento Raman, podem ser deduzidos para molculas adsorvidas na superfcie. Se ignorarmos o efeito do tensor polarizabilidade, a intensidade do espalhamento Raman pode ser determinada por dois fatores: pelos ngulos da radiao incidente e espalhada, e pela funo dieltrica da freqncia dependente
. ngulos incidentes entre 60 e 65 [17] so sugeridos para intensificar o

campo ptico local da superfcie, sendo assim um dos principais processos na intensificao mxima do espalhamento Raman. A dependncia da funo dieltrica na freqncia da radiao incidente () ser discutida detalhadamente no pargrafo seguinte. Assumindo o modelo do oscilador harmnico e omitindo a interao do eltron com o campo magntico do campo ptico, a funo dieltrica da freqncia dependente pode ser escrita da seguinte forma [18-20]:

18

2 p 1 2 i

(1.20)

em que o coeficiente amortecimento introduzido para permitir a perda de energia eletromagntica no interior do metal, e p a freqncia do plasmon, que depende do nmero e propriedades de eltrons livres em qualquer sistema.

2 p

4Ne 2 m0

(1.21)

Na equao 1.21, N, e e m representam respectivamente a densidade numrica, a carga e a massa dos eltrons livres do sistema. Esta formulao pode ser usada para discutir o campo eltrico local da superfcie e tambm o espalhamento Raman atravs de uma superfcie. Mudando-se o comprimento de onda da radiao incidente para o vermelho, a funo dieltrica pode ter um sinal negativo dando um extenso valor absoluto. Neste caso, rs tende a -1, enquanto r p aproxima-se de 1. Como resultado, a componente tangencial do campo na superfcie aproximadamente zero. Este valor da componente relativo ao cancelamento do campo incidente e do campo refletido [15]. Por essa razo, para espectroscopia de absoro no infravermelho, somente o dipolo induzido normal na superfcie contribui na intensidade. Quando a freqncia da radiao incidente est prxima freqncia do plasmon p, ocorre a ressonncia entre as freqncias do plasmon e da radiao incidente. Neste caso, se omitirmos a parte imaginria da funo dieltrica, o ser muito pequeno, por exemplo, rs tende a 1, enquanto r p tende a -1. Como resultado, h um aumento na componente campo s-polarizao e a componente p-polarizao ao longo da direo y. Em contraste, a componente p do campo normal da superfcie maciamente atenuada. 19

Para espectroscopia Raman, as radiaes nas regies do visvel e ultravioleta prximo so freqentemente usadas como fonte de excitao. Portanto, a funo dieltrica no muito pequena e assim, a componente tangencial do campo local da superfcie no ser zero. Por essa razo, baseado na teoria EM, a intensificao mxima do campo local numa superfcie plana no mais do que dois, conduzindo para um fator mxima intensificao de 16 na intensidade do espalhamento Raman [13].

1.3.2. O Mecanismo Qumico de Intensificao

Esse modelo baseado no princpio que uma molcula adsorvida pode, sob condies especficas, interagir com a superfcie do metal de maneira que provoque um enorme aumento na polarizabilidade molecular, [21]. H alguns fatores que influenciam e contribuem no mecanismo qumico. Dentre eles podemos citar a interao da ligao qumica entre molculas adsorvidas e tomos que constituem a superfcie metlica, a orientao e cobertura das molculas e a estrutura da superfcie metlica. Porm, estes fatores que influenciam a intensidade SERS dependem do mecanismo de transferncia de carga envolvido.

1.3.2.1. Transferncia de Carga

No modelo de transferncia de carga, os ftons incidentes excitam um eltron da superfcie metlica para a molcula adsorvida, gerando uma molcula excitada negativamente carregada. A geometria molecular dessa molcula excitada diferente das espcies neutras. Esta transferncia de carga induz uma relaxao nuclear dentro da molcula excitada, que resulta no retorno do eltron para a superfcie do metal, o aparecimento de uma molcula neutra excitada e a emisso de um fton numa freqncia deslocada (Raman).

20

No espalhamento Raman, transferncia de carga um processo de excitao virtual em que o estado de transferncia de carga pode estar parcialmente em ressonncia com a radiao de excitao. Este processo gera uma grande contribuio na seo cruzada do espalhamento Raman do complexo molcula-metal. Este assumido e provavelmente o caso de vrios sistemas experimentais, que normalmente uma fraca interao envolvida no sistema substrato-molcula. Neste nvel de energia molecular ocorre um entrelaamento com a banda de conduo do metal [22]. Geralmente, o processo de transferncia de carga envolve os quatro passos seguintes [23] (1) um fton aniquilado, ento um eltron excitado de um doador (2) O eltron excitado transferido para uma molcula adsorvida ou para o prprio substrato metlico; (3) o eltron excitado volta para o doador a partir do recebedor e ao mesmo tempo um fton Raman emitido (4), o complexo metal e molcula adsorvente esto localizados em nveis vibracionais excitados como mostrado na Figura 1.3.

Figura 1.3. (a) O eltron excitado no interior do metal. (b) O eltron intramolecular excitado pela luz incidente. (c) O eltron da superfcie do metal excitado para a molcula adsorvida. (d) O eltron intramolecular excitado para um orbital vazio do metal da superfcie.

21

CAPTULO 2
MTODOS QUIMIOMTRICOS

23

2.1. Introduo

A quimiometria [24] pode ser definida como uma rea da qumica que usa mtodos matemticos, estatsticos e de lgica formal para planejar ou selecionar procedimentos timos de medidas e experimentos e extrai o mximo da informao qumica relevante, com a anlise dos dados. O termo quimiometria foi utilizado pela primeira vez por qumicos, nos anos setenta, formalizando uma rea de estudo de aplicao de mtodos matemticos s cincias qumicas. O primeiro qumico a utilizar esta expresso talvez tenha sido S. Wold (Umea University Sucia), que trabalhava em mtodos de reconhecimento de padres. A quimiometria divide-se em algumas reas principais, muito pesquisadas e aplicadas atualmente como: processamento de sinais analticos, planejamento e otimizao de experimentos, reconhecimento de padres e classificao de dados [25] calibrao multivariada [26], monitoramento e modelagem de processos multivariados [27] e mtodos de inteligncia artificial [28]. A construo de modelos de regresso a partir de dados de primeira ordem, ou seja, dados que podem ser representados atravs de um vetor para cada amostra, tem sido a principal linha de pesquisa da quimiometria aplicada qumica analtica. A construo desses modelos denominada de calibrao multivariada.

2.2. Calibrao multivariada

A calibrao multivariada [29] pode ser definida como uma srie de operaes que estabelecem, sob condies especficas, uma relao entre medidas instrumentais e valores para uma propriedade de interesse

correspondente. Um modelo de calibrao, na verdade, uma funo matemtica (f) que relaciona dois grupos de variveis, uma delas denominada independente (X) e a outra denominada dependente (Y): 25

Y f (X) Xb

(2.1)

Esta etapa representa a calibrao e por isso o conjunto de dados empregado para essa finalidade chamado conjunto de calibrao. Os parmetros do modelo so denominados de coeficiente de regresso (b) determinados matematicamente a partir de dados experimentais. Aps construo do modelo, este deve ser validado. Nesta etapa, as variveis independentes obtidas para outro conjunto de amostras, so utilizadas em conjunto com os coeficientes de regresso para que sejam calculados os valores previstos para a varivel dependente. No conjunto de validao utilizam-se amostras cujas variveis dependentes sejam conhecidas para que seja possvel estabelecer uma comparao entre os valores previstos, calculados na etapa de validao, e os valores conhecidos previamente atravs de metodologia padro, o que permitir a avaliao sobre o desempenho do modelo de calibrao proposto. O mtodo de calibrao multivariada mais utilizado e considerado como padro dentro da rea, o mtodo dos mnimos quadrados parciais (PLS, do ingls Partial Least Squares) [30]. A base do PLS decompor a matriz (X) das variveis independentes e a matriz (Y) das variveis dependentes, em um produto de duas matrizes menores mais uma matriz de erro, como segue:

TP E

(2.2) (2.3)

UQ F

em que as matrizes T e U so chamadas de matrizes dos escores; P e Q matrizes dos loadings; E e F as matrizes de erro de X e Y respectivamente. Esta decomposio muito til nos casos em que a matriz X mal condicionada, ou ainda, quando o nmero de amostras menor que o nmero de variveis 26

independentes visto que podemos utilizar uma matriz T de dimenso inferior a da matriz X sem perda de informao til, eliminando rudo e colinearidade dos dados. Efetuando a decomposio anterior, o prximo passo ajustar uma relao linear, quando possvel, entre U eT, como segue:

bT

(2.4)

em que b o coeficiente do ajuste, usualmente obtido com algoritmo NIPALS. Finalmente, podemos substituir U na equao 2.3, e obter:

bTQ

(2.5)

e portanto, podemos obter os escores da matriz Y a partir dos escores da matriz X e vice-versa. Terminada e etapa de calibrao pode-se fazer previses para amostras desconhecidas. Para tanto basta obter os escores da matriz X, o qual pode ser transformado em concentrao, atravs da equao 2.5.

2.3. Pr-processamento dos sinais analticos

Outra etapa importante no desenvolvimento de um modelo de calibrao a etapa de pr-processamento. Muitas vezes os dados a serem modelados so expressos em grandezas diferentes, apresentam muitos rudos, interferentes fsicos que possam prejudicar o desempenho do modelo. Assim tratamentos so realizados nos dados antes do desenvolvimento do modelo de calibrao.

27

2.3.1. Remoo do rudo experimental: o filtro de transformada de Fourier

A idia bsica deste tipo de filtro aplicar-se a transformada de Fourier direta, dada pela Equao 2.6, para que se obtenha o sinal analtico representado no domnio das freqncias w , ou melhor, aplicamos a transformada de Fourier direta para obter o espectro de freqncias F(w), do sinal analtico[31].

Fw

1 2

ei

(2.6)

Na Equao 2.6,

representa o domnio original do sinal analtico e f representa os comprimentos de onda, para

o sinal analtico. Para espectros, cromatogramas, ou fiagramas,

representa a varivel tempo e assim por diante.

Uma vez obtido o espectro de freqncias do sinal analtico, devemos cortar as freqncias altas, visto serem estas freqncias, na grande maioria dos casos, relacionadas ao rudo instrumental. Finalmente aplicamos a transformada de Fourier inversa, dada pela Equao 2.7 e recuperamos o sinal analtico inicial, livre de rudo.

1 2

Fwe

i w

dw

(2.7)

A seqncia de operaes utilizada no processo de remoo de rudo, atravs da transformada de Fourier, pode ser facilmente entendida se observarmos a Figura 2.1.

28

Sinal Analtico com rudo

Transformada de Fourier direta

F w

1 2

ei w d

Espectro de frequncias do sinal analtico, com as frequncias do rudo

Corte das frequncias relativas ao rudo instrumental

f
Sinal Analtico sem rudo

1 2

F we

i w

dw

Transformada de Fourier inversa

Espectro de frequncias do sinal analtico, sem as frequncias do rudo

Figura 2.1. Representao esquemtica da seqncia de operaes utilizada na aplicao do filtro de transformada de Fourier.

2.3.2. Correo do espalhamento multiplicativo

O mtodo de correo de espalhamento multiplicativo (MSC - do ingls, Multiple Scatering Correction) [32] comumente aplicado em espectroscopia para a correo de linha base, proveniente principalmente da no homogeneidade da distribuio de partculas na matriz. Este mtodo assume que os comprimentos de onda da luz espalhada possuem uma dependncia distinta entre a luz espalhada e a absorvida pelos constituintes da amostra. Portanto teoricamente, possvel separar estes dois sinais. Este mtodo tenta remover o efeito do espalhamento pela linearizao de cada espectro por um espectro ideal. Para efeito de clculo, considera-se que o espectro ideal o espectro mdio do conjunto de dados para o qual deseja realizar a correo da linha base. Em seguida, utiliza-se uma regresso linear para calcular o coeficiente angular e linear do grfico entre o espectro ideal e o espectro que vai ser corrigido. O espectro corrigido calculado subtraindo cada 29

ponto do espectro pelo valor do coeficiente linear e dividindo este valor pelo coeficiente angular. A tcnica muito simples e pode ser facilmente entendida se acompanharmos a seqncia de operaes abaixo [33]. Matematicamente, e resumindo, a correo feita da seguinte forma:

1. A partir do conjunto total de espectros , calcula-se o espectro mdio x ; 2. Faz-se a regresso linear para cada um dos k espectros ( x ik ) do conjunto total de espectros, contra o espectro mdio, sobre todos os i comprimentos de onda:

xik
3. Correo final:

uk

xi

(2.8)

corrigido ik

no x ik

corrigido

uk
(2.9)

2.3.3. Transformao padro normal de variao

Normalmente, os espectros Raman apresentam problemas de linha base, inclinaes e algumas vezes curvaturas, devido principalmente ao espalhamento de luz. O espalhamento fortemente dependente do comprimento de onda da luz, do tamanho das partculas, do ndice de refrao etc. Para minimizar este efeito, necessrio o uso de tcnicas como a transformao padro de variao (SNV do ingls Standard Normal Variate) [34]. Esta tcnica aplicada para corrigir os efeitos do espalhamento multiplicativo e o tamanho da partcula, de maneira anloga correo de espalhamento multiplicativo (MSC). 30

Apesar do MSC e SNV terem a mesma finalidade, ou seja, corrigir a linha base espectral, estas duas tcnicas so bem diferentes. O SNV no necessita de um espectro ideal, ou seja, de um espectro mdio para fazer a correo dos espectros. A correo realizada pela normalizao de cada espectro para o seu prprio desvio padro, conforme ilustrado pelas equaes 2.10 e 2.11a seguir:

Mdia do espectro

xi
j

xi 1 p

(2.10)

Espectro corrigido

X i SVN

Xi
p

xi xi
2

(2.11)

Xi
j 1

p 1

em que X representa uma matriz com n espectros e p comprimentos de onda,

x i a mdia do vetor contendo o espectro i da matriz X .

2.3.4. Ortogonalizao dos espectros: o mtodo de Gram-Schmidt

Dados dois vetores linearmente independentes no espao n-dimensional

R n pode-se obter um vetor ortogonal a qualquer um deles. Por exemplo, suponha

que um espectro qualquer (obtido em qualquer regio do espectro eletromagntico) seja um dos vetores, aqui chamado de u, e o outro vetor o espectro dos interferentes, isto , aquilo se deseja eliminar do espectro u, por exemplo, espectro do solvente e cubeta, fluorescncia da matriz, rudo do branco, ou seja, tudo que no for correlacionado a medida de interesse, aqui chamado de v. Sabendo-se o que se deseja eliminar (v) o prximo passo projetar o espectro 31

u na direo do espectro v. Assim, dentro de certo limite numrico computacional, a contribuio de v em u, como representado na Figura 2.2 [35].

10 y 8 u

b.u

4 Vetor ortogonal que procuramos 2 u' 0 x -2 -b.u -4 v

-6

-8

-10 -10

-8

-6

-4

-2

10

Figura 2.2. Ortogonalizao de vetores para remoo da fluorescncia usando o mtodo de Gram-Schmidt.

Subtraindo o vetor u (espectro u) do espectro u, tem-se o espectro u sem a contribuio do espectro v dos interferentes. Isto o que realizado pelo mtodo de Gram-Schmidt.

2.3.5. Dados centrados na mdia

A centralizao na mdia [36] consiste em fazer com que para cada varivel seus valores tenham mdia zero. Para centrar os dados na mdia, obtmse para cada coluna o valor mdio e, em seguida, subtrai-se este valor de cada varivel dessa mesma coluna. Desta forma, ocorre a mudana do sistema de

32

coordenadas para o centro dos dados. A equao 2.12 utilizada para centrar os dados na mdia.

x i , j cm

xi , j

xj

(2.12)

em que, x i , j cm corresponde ao valor centrado na mdia para a varivel j na amostra i ; x i , j o valor da varivel j na amostra i e x j a mdia das amostras na coluna calculada pela equao 2.13 .

xj

1 n

xi , j
i 1

(2.13)

onde n representa o nmero de amostras.

2.3.6. Normalizao dos espectros

A normalizao [37] usada principalmente para remover variao sistemtica, geralmente associada com tamanho da amostra. Na normalizao, dividem-se cada uma das variveis de uma dada amostra i por um fator de normalizao, ou seja, pela norma da amostra i, representada por resultado que todas as amostras estaro numa mesma escala.

xi . O

xij ( norm )
As normais utilizadas so:

xij xi

1 2,..., J ,

(2.14)

xi

max x ij
1 j J

norma sup, ou l

xi

1 j 1

x ij
33

norma l1

xi

2 j 1

2 x ij

norma Euclidiana ou norma l 2

Normalizao pela norma sup: a resposta mxima de cada uma das amostras se torna igual a 1. Normalizao pela norma l1: a rea sob cada um dos espectros unitria. Normalizao pela norma l2: cada espectro ter comprimento igual a 1. 2.3.7. Compresso de dados: anlise de componentes principais Os instrumentos analticos nos permitem medir simultaneamente, de modo rpido e eficiente uma enorme quantidade de dados de um sistema qumico. Com o avano e a chegada de computadores em laboratrios, e com o interfaceamento entre instrumentos e computadores, aliados a poderosas ferramentas matemticas deram ao qumico analtico uma grande habilidade em transformar dados em informaes teis, pois nem sempre o aumento no nmero de dados aumenta as informaes sobre o sistema de interesse, uma vez que nem todos os dados possuem informaes relevantes sobre o sistema. Assim, necessria a utilizao de mtodos matemticos que nos permitem a compresso deste conjunto de dados obtidos do sistema em questo, em um conjunto de dados ainda muito menor, mas que possua as mesmas informaes realmente teis, para a anlise e modelamento do sistema. Existe uma srie de mtodos destinados compresso de dados, entretanto, o mais usado o mtodo fundamentado na anlise dos componentes principais (PCA do ingls, Principal Component Analysis) [38]. A idia bsica da anlise de componentes principais achar combinaes lineares entre as variveis independentes, de modo a reduzir a sua dimenso em um conjunto muito menor de dados, que ainda contenha as principais informaes sobre o sistema em questo. Na anlise de componentes principais, a matriz das variveis independentes (os espectros) decomposta em uma soma de matrizes 34

menores, que no podem mais ser reduzidas, mais uma matriz de erros, como se segue:

t1pT 1

t 2pT 2

t kpT k

(2.15)

em que E uma matriz de erros t i e p iT so os escores e loadings, respectivamente, da matriz das variveis independentes [39]. Um conjunto de espectros pode ser matematicamente interpretado na forma de matrizes. Estes espectros, isto , a matriz chamada de espao vetorial

R m . Para que esta matriz seja comprimida, devemos achar o subespao vetorial
R n , em que n
m . Este subespao, ou seja, esta nova base, onde a matriz ser

projetada so os autovetores ou componentes principais. Para se obter os autovalores, devem-se achar primeiramente os autovetores da matriz, pois para cada autovalor obtido h um autovetor correspondente. O maior autovalor corresponde ao maior autovetor, o qual captura a maior parte da varincia na matriz, o segundo maior autovalor, corresponde ao segundo maior autovetor, que captura o resduo da varincia a qual no faz parte da varincia do primeiro autovetor. Esta varincia capturada acumulativa, no entanto vale lembrar que devemos pegar os autovetores responsveis por 95% da varincia na matriz dos espectros, sendo que devemos levar em considerao 5% para erros aleatrios [40]. Quando se projeta a matriz dos espectros nessa nova base, ou seja, nos autovetores, (esta projeo nada mais que uma multiplicao) obtm-se a matriz reduzida chamada escores e os loadings que significam as regies de maior importncia (de maior peso) dos escores.

35

2.4. Validao: figuras de mrito

O bom desempenho de qualquer tcnica analtica depende crucialmente de dois parmetros: a qualidade das medidas instrumentais e a confiabilidade estatstica dos clculos envolvidos no seu processamento. Uma forma de assegurar a aplicabilidade e o alcance de um mtodo durante as operaes de rotina de um laboratrio estabelecendo os limites destes parmetros por meio da estimativa das figuras de mrito, numa etapa conhecida como validao [41]. A validao um processo de averiguao da performance de um mtodo, com o intuito de avaliar se este apresenta uma performance adequada para as condies nas quais ser aplicado. O processo de validao deve ser realizado sempre que um procedimento analtico proposto ou desenvolvido. A validao de um mtodo estabelece, por estudos sistemticos realizados em laboratrio, que o mtodo atende ao seu propsito e s normas impostas por rgos de fiscalizao nacionais e internacionais [42]. A validao pode ser atestada atravs da determinao de parmetros conhecidos como figuras de mrito, que, dependendo de onde o mtodo ser aplicado, do seu propsito e ou do rgo de fiscalizao a que estar sujeito, o nmero de figuras de mrito ou nvel que deve ser atingido em cada uma delas, pode variar [43]. As figuras de mrito so, portanto, os indicadores quantitativos do escopo e do bom desempenho das tcnicas, e so descritas na literatura especializada como [44]: - Exatido - Preciso - Sensibilidade - Seletividade - Linearidade - Razo sinal/rudo - Limite de deteco - Limite de quantificao 36

- Robustez A maneira pelas quais essas figuras de mrito devem ser determinadas estabelecida pelos rgos de fiscalizao e encontra-se descrita em normas especficas, guias de validao e trabalhos cientficos. Entretanto, a maioria dos guias, normas e trabalhos cientficos, ainda so referentes calibrao univariada e so poucos os trabalhos cientficos que realizam a determinao de figuras de mrito para validao de modelos de calibrao multivariada [45]. No Brasil, os dois rgos que regulamentam a validao de mtodos analticos so a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA) [46] e o Instituto Nacional de Metrologia, Normalizao e Qualidade Instrumental (INMETRO).

2.4.1. Exatido

Este parmetro se reflete proximidade entre os valores de referncia e os valores encontrados pelo modelo de calibrao, e relaciona-se com o erro absoluto de uma medida [47]. Em quimiometria este parmetro geralmente expressado como a raiz quadrada do erro quadrtico mdio de previso (RMSEP do ingls root mean square error of prediction) [48] conforme descrito na equao 2.16:

RMSEP

(yi

y i )2 N

(2.16)

em que N representa o nmero de amostras utilizadas na previso, y i e yi representam os valores de referncia e os valores preditos pelo modelo de calibrao.

37

2.4.2. Preciso

O termo preciso fornece a disperso dos valores medidos em torno de um valor mdio [49], e seu valor numrico estimado pelo desvio padro relativo, ou DPR, para anlises de amostras contendo a mesma quantidade das espcies de interesse. O DPR ainda conhecido como CV (coeficiente de variao), ou ainda pela sigla RSD proveniente do ingls Relative Standard Deviation e seu clculo realizado como descrito na equao 2.17, em que s o desvio padro descrito na equao 2.18 e x o valor mdio do nmero total de medidas N descrito na equao 2.19:

RSD
N

100 s x

(2.17)

( xi s
i 1

x )2

N 1
N

(2.18)

xi x
i 1

(2.19)

Em que xi representa cada uma das medidas individuais. 2.4.3. Sensibilidade

Este parmetro a frao do sinal analtico que devido ao aumento da concentrao de um analito em particular em unidade de concentrao. A sensibilidade definida como o inverso da norma do vetor coeficientes de regresso (bk) do modelo de calibrao [50].

SEN

1 bk
38

(2.20)

em que bk o vetor dos coeficientes de regresso estimados pelo PLS. Quando o NAS [51] determinado, o vetor de sensibilidade lquida s nas para k cada amostra do conjunto de calibrao pode ser determinado a partir do vetor
A,k x nas como:

snas k

x nas A,k y

(2.21)

Em que, o vetor de sensibilidades s nas deve ser igual para todas as amostras de k
A,k calibrao, x nas o vetor de sinal analtico lquido para a espcie k, y o vetor

que contm os valores de referncia. O escalar SN, pode ser determinado por:

SEN

snas k

(2.22)

2.4.4. Sensibilidade Analtica A sensibilidade analtica () no abordada em normas ou guias de validao. No entanto, esse parmetro apresenta a sensibilidade do mtodo em termos da unidade de concentrao que utilizada, sendo definida como a razo entre a sensibilidade e o desvio padro do sinal de referncia (x) [52] :

SEN x

(2.23)

em que, SN obtido atravs das equaes (88) ou (90) e x o desvio padro do sinal de referncia estimado atravs do desvio padro do valor de NAS para os espectros do sinal de referncia. 39

O inverso desse parmetro, ou seja, (-1), permite estabelecer a menor diferena de concentrao entre amostras, que pode ser distinguida pelo mtodo.

2.4.5. Linearidade

Em modelos de calibrao multivariada uma medida quantitativa da linearidade no corresponde a uma tarefa simples, ou mesmo possvel. Qualitativamente, grficos de resduos e dos escores contra a concentrao, os quais devem ter comportamento aleatrio e linear, respectivamente, podem indicar se os dados seguem ou no o comportamento linear [53].

2.4.6. Sinal analtico lquido

A validao de modelos de calibrao multivariada pode ser feita com base no clculo de parmetros que assegurem que o modelo apresenta performance adequada e dentro dos objetivos desejados. Em calibrao multivariada o conceito de Sinal Analtico Lquido [54] (NAS - do ingls Net Analyte Signal), exerce uma importante funo na determinao de figuras de mrito. O mtodo para o clculo do NAS para modelos multivariados de calibrao inversa foi proposto por Lorber [55]. O NAS definido, para uma propriedade de interesse k, como sendo a parte do sinal analtico que ortogonal s contribuies de possveis interferentes presentes na amostra. Sua propriedade de ortogonalidade pode ser observada pela representao geomtrica da Figura 2.3:

40

Figura 2.3. Representao geomtrica da propriedade de ortogonalidade do NAS.

No clculo do NAS, primeiramente a matriz X reconstruda com A

variveis latentes gerando a matriz X A (decomposta em escores e loadings), em

seguida determinada a matriz X A, k , que a matriz que contm a informao de

todas as espcies presentes na amostra exceto da espcie de interesse k, descrito na equao 2.24:

X A,

[I y A,k y A,k ]X A

(2.24)

em que y A o vetor de concentraes da espcie de interesse k estimado com A

variveis latentes, X A o vetor de respostas instrumentais de uma amostra

estimado com A variveis latentes e

o ndice + sobrescrito indica a

k

pseudoinversa da matriz em questo. Isso faz com que a matriz X A,

fique livre

de qualquer contribuio da espcie k. O vetor NAS ento obtido como:

X nas A,k

[I XT , k ( XT k ) ]X A A A,

(2.25)

Uma vez que X nas livre de interferentes, possvel substitu-lo por uma A,k

representao escalar sem perda de informao. Assim temos:

41

 nas

X nas A,k

(2.26)

em que || || representa a norma Euclidiana do vetor X nas . A,k

Com a possibilidade de calcular um valor escalar livre de interferentes, a partir de um vetor contendo contribuies de constituintes desconhecidos, torna-se possvel a construo de uma nova forma de calibrao multivariada, em que o modelo pode ser representado em uma forma univariada. Primeiro o clculo do NAS feito para as i amostras de calibrao, em seguida o coeficiente de

regresso determinado por mnimos quadrados entre o vetor nas e o vetor de

concentraes y:

bnas

(nasTnas) 1nasT y

(2.27)

E o modelo de regresso pode, ento, ser representado por:

bnas nas

(2.28)

Se os dados foram centrados na mdia, antes da determinao do coeficiente de

regresso bnas , o vetor nas precisa ser corrigido de forma a evitar um erro de sinal
que introduzido pelo uso da norma Euclidiana. Esta correo pode ser feita pela multiplicao de cada elemento do vetor nas pelo seu sinal correspondente no vetor ( y
y ) , onde y a mdia do vetor y que contm os valores de referncia.

2.4.7. Razo sinal/rudo

Em calibrao univariada, a razo sinal/rudo, S/N k,i [56] , representa o quanto do sinal do analito maior do que o rudo instrumental. No caso da

42

calibrao multivariada, esta razo indica o quanto da intensidade do NAS da espcie de interesse est acima do desvio padro do sinal de referncia:

S / Nk ,i

nask ,i x

(2.29)

em que, nsk,i o valor escalar do sinal analtico lquido para a amostra i e x o desvio padro do sinal de referncia.

2.4.8. Robustez

Em processos industriais, ou mesmo em anlises de bancada, existem diversas variveis instrumentais ou ambientais, que no so possveis de se controlar. Alguns exemplos so a umidade, temperatura, pequenas variaes na quantidade dos componentes para a formao de um produto na indstria, entre outros. Para tanto, um mtodo analtico robusto no deve ser sensvel a esses tipos de variaes, pois isto acarretaria na introduo de erros que podem ser significativos ao resultado. A robustez [57] em calibrao multivariada, consiste em testar a performance do modelo de calibrao multivariada frente a alguns tipos de variaes e averiguar se estas so ou no significativas.

2.4.9. Limite de deteco e quantificao

O limite de deteco (LD) e o limite de quantificao (LQ) [58] de um procedimento analtico expressam respectivamente, as menores quantidades da espcie de interesse que podem ser detectadas e determinadas

quantitativamente. Para um conjunto de dados que apresenta comportamento homoscedstico (varincia constante ao longo da faixa de trabalho, erros com previso no correlacionados e que seguem uma distribuio normal), os LD e LQ na calibrao multivariada podem ser calculados por:

43

LD

3x bk

3x

1 SEN
1 SEN

(2.30)

LQ 10x bk

10x

(2.31)

em que, x o desvio padro do sinal de referncia, bk o vetor dos coeficientes de regresso do modelo PLS para a espcie k, SN corresponde ao valor de sensibilidade obtido atravs das equaes 2.20 ou 2.22.

2.4.10. Seletividade

Seletividade [59] a medida do grau de sobreposio entre o sinal da espcie de interesse e os interferentes presentes na amostra e indica a parte do sinal que perdida por essa sobreposio. Para modelos de calibrao multivariada esse parmetro definido como:
nas i xi

SEL

(2.32)

Em que nas i o escalar NAS estimado para amostra i e xi o vetor de dados

originais. O valor de seletividade estimado a partir da expresso 2.32 informa quanto do sinal original usado na calibrao por no ser ortogonal propriedade de interesse. Dessa forma, a seletividade calculada a partir dessa equao no se refere ao sentido geralmente empregado para o termo em qumica analtica, com modelos univariados, e sim a uma forma de estimar quanto do sinal perdido por ortogonalidade.

44

CAPTULO 3
OBTENO DO EFEITO SERS

45

Nesta tese, o efeito SERS foi obtido pela deposio do analito em ouro coloidal. Apesar da literatura reportar a possibilidade da utilizao de prata, ou mesmo cobre, no foi possvel obter resultados quantitativos em colides desses metais. Tambm foi avaliada a possibilidade de obter o efeito em sol-gel de ouro, mas tambm no foi observada amplificao significativa do sinal Raman neste caso. A seguir sero apresentados o procedimento experimental e a

caracterizao da suspenso de nanopartculas de ouro e espectros do efeito SERS.

3.1. Instrumentao

Os espectros Raman foram obtidos num espectrmetro Raman de baixa resoluo (Raman System,Inc) com LASER diodo, laser operando no

infravermelho prximo (785 nm) e detector do tipo CCD de 2048 elementos e interface grfica desenvolvida em ambiente MATLABTM. Espectros de deslocamento Raman foram obtidos na faixa de 700 a 2.000 cm -1, com tempo de integrao de 60 segundos.

3.2. Preparao da suspenso de nanopartculas de ouro

Para preparao dos substratos ativos, foram usados os seguintes reagentes: cido Tetracloroaurico (Sigma-Aldrich, Co.), Citrato de Sdio (Merck, Co.) gua deionizada Milli-Q, Cloreto de Sdio (Merck, Co.). A suspenso de nanopartculas de ouro foi preparada de acordo com a metodologia proposta por Lee-Meisel [60]. Foram adicionados 20 mL de uma soluo de cido tetracloroaurico 1mmol/L em um erlenmeyer de 50 mL, envolto por papel alumnio. Esta soluo foi aquecida at ebulio, onde em seguida, sob agitao vigorosa, foram adicionados 2 mL de uma soluo de citrato de sdio a 1%. O ouro (Au3+) gradualmente se reduz a (Au0) na presena do citrato de sdio. Neste ponto pode47

se perceber a formao de nanopartculas comprovada pela cor vermelha bem intensa da suspenso. Aps mudana de cor da suspenso, o aquecimento e agitao foram paralisados. Aps o resfriamento da suspenso de nanopartculas de ouro, foram adicionadas soluo 5 mL de cloreto de sdio 0,1 mol/L, cujo papel foi aglutinar as partculas de ouro para potencializar ainda mais a intensificao do sinal Raman.

3.3. Caracterizao da suspenso de nanopartculas de ouro

A suspenso de nanopartculas de ouro, preparada conforme relatada na parte experimental foi caracterizada pela espectrofotometria eletrnica de absoro no ultravioleta-visvel e tambm pela microscopia eletrnica de varredura. Alguns testes foram realizados para escolher a melhor soluo coloidal a ser utilizada nos experimentos. Dentre eles, foram-se adicionando 1 mL de cloreto de sdio 0,1 mol/L e obtendo-se os espectros UV/vis. para se ter uma idia do tamanho e distribuio das nanopartculas de ouro. Sabe-se que quanto mais o plasmon de absoro das partculas de ouro deslocado para a regio do vermelho, maiores so as partculas [61]. O objetivo, no entanto, aumentar os tamanhos das nanopartculas, com a adio da soluo de cloreto de sdio, fazendo com que seus plasmons de absoro se desloquem para a regio do vermelho para que possam entrar em ressonncia com a freqncia do laser do espectrmetro Raman e com isso intensificar o espalhamento Raman. Na figura 3.1 apresentado o espectro de absoro no UV-Vis da soluo de ouro coloidal. Nota-se que a absoro do plasmon superficial d origem a uma banda larga, com o mximo de absoro em torno de 527 nm. No caso deste substrato SERS ativo, teramos intensificao do campo eltrico para radiaes de comprimento de onda dentro da banda de absoro do plasmon (~370 e 600 nm). O mximo de absoro no espectro UV-VIS de solues coloidais est relacionado ao tamanho mdio das partculas, enquanto que a largura da banda de absoro relaciona-se disperso das partculas [62]. 48

O laser do espectrmetro Raman, utilizado para obteno das medidas, possui comprimento de onda de 785 nm e para que o efeito SERS tenha um mximo de intensificao, soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L foi adicionada suspenso com a finalidade de aumentar o tamanho das nanopartculas. medida que estas nanopartculas aumentam de tamanho, a banda de seus plasmons de absoro desloca-se para a regio do infravermelho prximo, fazendo com que o campo eltrico das nanopartculas entre em ressonncia com o campo eltrico do laser incidente aumentando significativamente o

espalhamento Raman. Nota-se, na figura 3.2, um deslocamento no plasmon de absoro para 700 nm aps adio de 1 mL de soluo de cloreto de sdio. As figuras 3.3, 3.4, 3.5 e 3.6 apresentam os respectivos deslocamentos de 725, 735, 740 e 745 nm.

0,80 0,75 0,70 0,65 0,60 0,55 0,50 527

Absorbncia

0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 450 500 550 600 650

Comprimento de onda (nm)

Figura 3.1. Espectro de absoro no ultravioleta-visvel da suspenso de nanopartculas de ouro.

49

0,70 0,65 0,60 0,55 0,50 0,45

700

Absorbncia

0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 550 600 650 700 750 800 850

Comprimento de onda (nm)

Figura 3.2. Espectro de absoro no ultravioleta-visvel da suspenso de nanopartculas de ouro contendo 1 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L.
0,70 0,65 0,60 0,55 0,50 0,45

725

Absorbncia

0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 550 600 650 700 750 800 850 900

Comprimento de onda (nm)

Figura 3.3. Espectro de absoro da suspenso de nanopartculas de ouro contendo 2 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L. 50

0,60 0,55 0,50 0,45 0,40

735

Absorbncia

0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000

Comprimento de onda (nm)

Figura 3.4. Espectro de absoro da suspenso de nanopartculas de ouro contendo 3 mL soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L.
0,60 0,55 0,50 0,45 0,40

740

Absorbncia

0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000

Comprimento de onda (nm)

Figura 3.5. Espectro de absoro da suspenso de nanopartculas de ouro contendo 4 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L. 51

0,50 0,45 0,40 0,35

745

Absorbncia

0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 550

600

650

700

750

800

850

900

950

1000

Comprimento de onda (nm)

Figura 3.6. Espectro de absoro da suspenso de nanopartculas de ouro contendo 5 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L.

Pode-se observar, pelos espectros apresentados, que a suspenso de nanopartculas de ouro que propiciar as melhores medidas ser a soluo contendo 5 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L. Tambm foram obtidas micrografias eletrnicas de varredura da referida suspenso, a fim de caracterizar o tamanho e homogeneidade das partculas de ouro da soluo coloidal. Foi utilizado um Microscpio Eletrnico de Varredura MEV Jeol JMS 6360-Lv com microssonda de Raios-X. A figura 3.7 mostra uma micrografia eletrnica de varredura onde as partculas brilhantes correspondem ao ouro metlico. Aumentando a resoluo da imagem (MEV), proveniente da figura 3.7, observamos na figura 3.8 a distribuio das partculas de ouro com formato esfrico uniforme, com tamanho mdio de 400 nm.

52

Figura 3.7. Microscopia eletrnica de varredura (MEV) da soluo de ouro coloidal contendo 5 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L.

Figura 3.8. Microscopia eletrnica de varredura (MEV) da soluo de ouro coloidal contendo 5 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol.L/L.

53

Para verificar o efeito SERS, primeiramente foram obtidos espectros Raman de solues de violeta genciana nas concentraes 1x10-3, 1x10-4 e 1x10-5 mol/L. Para isso, foram adicionados em uma cubeta de quartzo, 1 mL da suspenso de nanopartculas de ouro e 1 mL das solues de violeta genciana nas concentraes descritas acima e obtidos os espectros. Para comparao foram obtidos os espectros Raman sem o efeito SERS. A figura 3.9 mostra os espectros Raman das solues de violeta genciana, onde se pode observar que no h uma distino entre os espectros, apresentando apenas rudo. Na figura 3.10 so apresentados os espectros de duas solues de violeta genciana, onde aps processamento para eliminao da fluorescncia e normalizao dos espectros, nota-se claramente o efeito SERS com grande amplificao do espalhamento Raman.

Deslocamento Raman (cm-1)

Figura 3.9. Espectros Raman de violeta genciana.

54

Deslocamento Raman (cm-1)

Figura 3.10. Espectros Raman de violeta genciana na presena de ouro coloidal.

55

CAPTULO 4
DETERMINAO DE PESTICIDAS EM GUA UTILIZANDO O EFEITO SERS

57

4.1. Introduo

Pesticida um termo usado para uma substncia ou misturas de substncias, sintticas ou naturais, que servem para controlar a proliferao de insetos, fungos, bactrias, ervas daninhas, roedores e outras pestes [63]. Com a crescente necessidade de fornecer alimentos populao torna-se indispensvel o controle das doenas, pragas e plantas invasoras, com a utilizao de pesticidas que se destaca entre as principais formas de controle, visando assegurar maior produtividade. Os primeiros grupos utilizados como pesticidas, foram substncias txicas de origem natural, tais como o piretro e a nicotina, alguns elementos inorgnicos como o mercrio e enxofre, alm da cal e alguns sais de arsnio [63]. Aps a segunda guerra mundial, o nmero de substncias novas e o uso extensivo dessas na agricultura aumentaram enormemente. O BHC e o DDT surgiram como uns dos mais importantes produtos qumicos, sendo usados em larga escala nas lavouras para combater insetos. Com o aumento do plantio de monoculturas, ocorreu o aparecimento de vrias pragas, as quais so combatidas pelo uso de pesticidas. Como resultado, diversos problemas ambientais surgem a cada momento, muitos deles praticamente irreversveis e de extrema relevncia. Como exemplo, pode-se citar as conseqncias ambientais da expanso do uso de produtos qumicos orgnicos sintticos, com nfase naquelas substncias cuja toxicidade chega a afetar a sade humana, especialmente no que diz respeito ao cncer e aos defeitos congnitos, assim como o bem-estar de organismos inferiores [64]. O impacto das atividades agrcolas modernas sobre a qualidade da gua subterrnea tornou-se conhecido na dcada de 70. Em particular, demonstrou-se a existncia de altas taxas de lixiviao de nitratos e outros ons mveis em muitos slos submetidos ao plantio contnuo. Com a contaminao das guas por pesticidas, e com o crescimento geomtrico da populao, o suprimento de gua potvel e de boa qualidade nas reas mais desenvolvidas torna-se cada vez mais difcil e de maior custo. A gua potvel e a no contaminao dos alimentos s 59

pode ser assegurada atravs de programas de monitoramento ambiental, que podero minimizar o risco de poluio [65]. Estudos desenvolvidos em vrias regies do mundo tm mostrado que a porcentagem dos produtos utilizados na agricultura que atingem os ambientes aquticos geralmente baixa. Entretanto, como foi citado no pargrafo anterior, os pesticidas com grande mobilidade no meio ambiente tm sido detectados, no s em guas subterrneas, mas tambm em guas superficiais. A concentrao da maioria dos pesticidas em gua baixa em parte devido ao fato de serem geralmente pouco solveis em gua e em parte devido ao fato da sua diluio. Isto, no entanto, no exclui a possibilidade de que concentraes muito altas venham a ocorrer atravs da eroso dos solos, pelo descarte, lavagem de tanques e embalagens, ou mesmo depois de chuvas torrenciais, especialmente quando as reas ao redor de um pequeno crrego tenham sido recentemente tratadas com altas doses de pesticidas. Todavia, mesmo em concentraes baixas, os pesticidas representam riscos para algumas espcies de organismos aquticos que podem concentrar estes produtos por at 1000 vezes. Devemos ressaltar que a preocupao com a contaminao de ambientes aquticos aumenta, principalmente, quando a gua usada para o consumo humano. Em conseqncia de sua toxicidade, a Agncia de Proteo Ambiental (EPA do ingls, Environmental Protection Agency) dos Estados Unidos e a Unio Europia (EU do ingls, European Union) incluram os pesticidas em suas listas de prioridades. A Unio Europia estabeleceu em sua diretriz a Concentrao Mxima Admissvel (CMA) de um pesticida individual na gua potvel de 0,1 g/L, sem, no entanto, ultrapassar 0,5 g/L quando se considera a soma total de todos os pesticidas. Limites semelhantes so adotados por outros pases, como Estados Unidos e Canad [66].

60

4.1.1. Classificao dos pesticidas quanto toxidade

Os pesticidas esto divididos em quatro classes toxicolgicas para o ser humano, conforme apresentado na tabela 4.1.

Tabela 4.1. Classificao toxicolgica de Pesticidas Classe I Classe II Classe III Classe IV Rtulo Vermelho Rtulo Amarelo Rtulo Azul Rtulo Verde Extremamente Txico Altamente Txico Mediamente Txico PoucoTxico

Devido grande diversidade de produtos existentes (somente no Brasil so cerca de 300 princpios ativos em 2 mil formulaes comerciais diferentes), os pesticidas podem ser classificados de acordo com sua funo, como por exemplo, inseticidas, herbicidas, fungicidas, algicidas, dentre outros, e tambm com de acordo com seu poder txico. Esta segunda classificao fundamental para o conhecimento da toxicidade aguda de um determinado pesticida. Os pesticidas podem ser classificados quanto afinidade (aficida, ovicida, larvicida, raticida, formicida, acaricida, inseticida entre outros) e quanto ao modo de ao (ingesto, contato, microbiano e fumegante) sendo possvel o enquadramento em mais de uma classe. Quanto origem, a diviso envolve os compostos inorgnicos (compostos de mercrio, brio, enxofre e cobre), os pesticidas de origem vegetal, bacteriana e fngica (piretrinos, antibiticos e fitocidas), e os pesticidas orgnicos. Os pesticidas orgnicos, que apresentam tomos de carbono em sua estrutura, constituem o maior grupo de produtos com alta atividade fisiolgica. As principais classes desses compostos so os organoclorados (OCs),

organofosforados (OPs) e Carbamatos [64]. Vamos nos ater neste trabalho em dois pesticidas dos mais

comercializados nos Brasil. O endosulfan que compem a classe dos organoclorados e o metamidofs que compem a classe dos organofosforados. 61

4.2. Pesticida Metamidofs

O pesticida de ingrediente ativo ou nome comum metamidofs, com nome qumico 0,S-dimetil fosforamidotioato de frmula molecular C2H8NO2PS e frmula estrutural apresentada na figura 4.1 comercializado no Brasil h vrios anos segundo alguns diferentes nomes comerciais, entre eles: Tamaron BR (Bayer), Hamidop 600 (Arysta), Metamidofos Fersol 600 (Fersol), Metafos (Milenia), Metasip (Sipcam Agro), Dinafos (Cheminova) [67]. um pesticida acaricida organofosforado sistmico, formulado como concentrado solvel ou soluo aquosa no concentrada, que contm 600 g do ingrediente ativo metamidofs por litro do produto comercial. Est autorizado pela ANVISA (Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria), do Ministrio da Sade apenas para uso em pulverizao foliar nas culturas de algodo, amendoim, batata, feijo, soja, tomate e trigo, via trator, piv central ou aplicao area, evitando-se, assim, maior contato de aplicadores em exposio ocupacional. Na cultura do tomate, seu uso est autorizado somente para tomate rasteiro, com fins industriais (massa de tomate, etc.), sendo seu uso proibido para tomate de mesa [67].

Figura 4.1. Frmula estrutural do pesticida metamidofs

As formulaes de metamidofs foram todas enquadradas pela ANVISA nas Classes toxicolgicas I ou II. Do ponto de vista de sua ao txica, como qualquer outro organofosforado, tambm o metamidofs um ster inibidor da enzima acetilcolinesterase (uma enzima vital para o funcionamento do sistema 62

nervoso), sendo este seu modo de ao, tanto nos insetos pragas, objetos do controle, bem como, assim, tambm nos demais animais (mamferos inclusive). Desse modo, em humanos, quando a exposio demasiadamente elevada (aplicadores mal protegidos, sem o uso de equipamentos de proteo individual, aplicaes sem observao de critrios tcnicos) pode causar neuropatias, causando sndrome colinrgica, que se reflete em acmulo do neurotransmissor acetilcolina nas terminaes nervosas (salivao, sudorese, lacrimejamento, paralisia muscular, dificuldades respiratrias, asfixia, etc., e, eventualmente bito). Do ponto de vista de riscos ao meio ambiente, por ser um ster solvel em gua e razoalvemente polar, o metamidofs degradado com certa facilidade e rapidez, especialmente atravs da hidrlise da ligao ster. Assim, seu uso pode e deve causar ao meio ambiente apenas um efeito adverso localizado, se usado de modo correto e adequado.

4.3. Pesticida Endosulfan

Este pesticida consiste na mistura de dois estereoismeros como ingredientes ativos, sendo 70% -endosulfan e 30% de -endosulfan de

nomenclatura qumica 6,7,8,9,10,10 - hexacloro-1,5, 5a, 6, 9, 9a- hexahidro- 6, 9, metano-2,4,3-benzodioxatiepin-3-xido de frmula molecular C9H6Cl6O3S e frmula molecular apresentada na figura 4.2. Ele um inseticida largamente empregado na cultura de soja, devido sua ao eficaz no combate s pragas, no havendo produto substituto de igual eficincia [68].

Figura 4.2. Frmula estrutural do endosulfan

63

Foi introduzido no mercado em 1957 com o nome comercial Thiodan e possui registro para a aplicao em soja por meio da Portaria n 95/85 do Ministrio da Agricultura, tendo como Limite Mximo de Resduos (LMRs) de Pesticida de 1,0 mg/kg para esta cultura [68].

4.4. Mtodos convencionais de anlise

Em geral, os mtodos usados na anlise de pesticidas em guas, exigem que se efetue previamente a extrao e pr-concentrao destes compostos para posterior anlise por cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC do ingls, High Performance Liquid Chromatography). Os mtodos oficiais utilizam tcnicas analticas de extrao lquido-lquido (LLE do ingls Liquid-Liquid Extaction ) e extrao por fase slida (SPE do ingls, Solid Phase Extraction). A LLE envolve grandes quantidades de solventes caros e txicos, e elevados tempos de anlise; j a SPE, embora apresente uma srie de vantagens em relao LLE, tem como desvantagens entupimento da coluna de separao, falta de reprodutibilidade e a no reutilizao dos cartuchos [69-71]. Por este motivo, h a necessidade de se desenvolver novos mtodos analticos que permitam rpidas determinaes in situ de pesticidas, para monitoramento contnuo de ambientes aquticos extensos, onde se faz o uso rotineiro destes pesticidas. 4.5. Atribuies das bandas vibracionais do espectro Raman do pesticida Metamidofs

A figura 4.3 mostra o espectro Raman do pesticida metamidofs puro obtido atravs de um espectrmetro Raman de baixa resoluo (Raman System,Inc) com LASER diodo, laser operando no infravermelho prximo (785 nm) e detector do tipo CCD de 2048 elementos.

64

1000

405 320

613

800

Intensidade (u.a)

515 665
600

795
400

732

880 1010 1220

200

0 0 500 1000 1500

-1

2000

Deslocamento Raman (cm )

Figura 4.3. Espectro Raman do pesticida metamidofs puro.

Os 45 modos vibracionais possveis do metamidofs foram calculados teoricamente, cuja geometria otimizada encontra-se apresentada na Figura 4.4, atravs do programa GAMESS (do ingls - General Atomic and Molecular Electronic Structure System) verso 22 de fevereiro de 2006 (R5), com clculo DST (do ingls - Density Functional Theory), com funcional B3LYP e base de Dunning cc-pVDZ [72,73]. Pode-se observar atravs da tabela 4.2, que mostra as freqncias tericas e experimentais, que a diferena bastante pequena entre eles, indicando que o espectro Raman obtido realmente da espcie a ser analisada. Assim, com base nos modos vibracionais tericos foi realizada a atribuio das bandas espectrais Raman.

65

Figura 4.4. Estrutura molecular do pesticida metamidofs.

Tabela 4.2. Atribuio das bandas Raman para o pesticida metamidofs. Frequncia Terica (cm-1) 315 408 523 601 687 742 780 865 998 1194 Frequncia experimental (cm-1) 320 405 515 613 665 732 795 880 1010 1220 Atrribuio Deformao P-O Estiramento P-S Estiramento P-S Estiramento P-S Deformao axial C-S Estiramento P-O Estiramento P-O Deformao P-N Deformao P-O-C Estiramento P=O

4.6. Atribuies das bandas do espectro Raman do pesticida Endosulfan

A figura 4.5 mostra o espectro Raman do pesticida endosulfan puro obtido atravs de um espectrmetro Raman de baixa resoluo (Raman System,Inc) com LASER diodo, laser operando no infravermelho prximo (785 nm) e detector do tipo CCD de 2048 elementos. 66

3500

365
3000

410 465 635 845

660

2500

560

Intensidade (u.a)

2000

1500

995

1150 1220

1000

1360

500

0 0 500 1000 1500

-1

2000

2500

Deslocamento Raman (cm )

Figura 4.5. Espectro Raman do pesticida puro endosulfan

A tabela 4.3 apresenta os valores calculados, os experimentais e as atribuies das bandas do espectro Raman. Podemos observar que a diferena entre os valores tericos e espectrais muito pequena, mostrando assim grande concordncia entre as freqncias experimentais e calculadas teoricamente. Devido a essa mnima diferena os modos vibracionais tericos foram utilizados para atribuio das bandas espectrais Raman do endosulfan.

67

Figura 4.6. Estrutura molecular do pesticida endosulfan

Tabela 4.3. Atribuio das bandas Raman para o pesticida endosulfan. Frequncia Terica (cm-1) 371 418 440 555 640 656 857 992 1148 1226 1370 Freqncia experimental (cm-1) 365 410 465 560 635 660 845 995 1150 1220 1360 Atribuio Estiramento C-Cl Estiramento C-Cl Deformaes no esqueleto Deformaes no esqueleto Deformaes no esqueleto Deformaes no esqueleto Estiramento C-H Estiramento C-H Estiramento SO3 Estiramento S=O Deformao CH

68

4.7. Obteno dos espectros SERS dos pesticidas em soluo aquosa Aps etapa de otimizao do SERS, passou-se ento a utilizar este substrato para se obter espectros SERS de pesticidas metamidofs, endosulfan e tambm de suas misturas em gua. Os espectros Raman foram obtidos num espectrmetro Raman de baixa resoluo (Raman System,Inc) com LASER diodo, laser operando no

infravermelho prximo (785 nm) e detector do tipo CCD de 2048 elementos e interface grfica desenvolvida em ambiente MATLABTM [74]. Espectros de deslocamento Raman foram obtidos na faixa de 700 a 2.000 cm -1, com tempo de integrao de 60 segundos. Os espectros SERS foram obtidos utilizando cubeta de quartzo, usando solues aquosas padro de pesticida metamidofs em concentraes variando de 10 g/L a 59,5 g/L. No total foram preparadas 100 solues do pesticida na faixa de concentrao descrita. Foram adicionados em cubeta, 1,0 mL de soluo coloidal de ouro, 0,2 mL das solues padro nas concentraes descritas acima e obtidos os espectros SERS. Os espectros SERS de endosulfan foram obtidos seguindo os mesmos passos de obteno dos espectros SERS de metamidofs. Os espectros SERS das misturas de endosulfan e metamidofs foram obtidos vertendo em cubeta de quartzo j contendo 1,0 mL de soluo coloidal de ouro, 0,2 mL das solues padro das misturas. Estas misturas foram preparadas em propores diversas de concentraes de cada pesticida totalizando 49 solues aquosas padro cujas concentraes esto indicadas na tabela 4.4.

69

Tabela 4.4. Solues preparadas das diferentes concentraes das misturas de pesticidas.
Soluo (N) Endosulfan (g/L) Metamidofs (g/L) Soluo (N) Endosulfan (g/L) Metamidofs (g/L) Soluo (N) Endosulfan (g/L) Metamidofs (g/L) Soluo (N) Endosulfan (g/L) Metamidofs (g/L) 1 25 25 15 35 25 29 45 25 43 55 25 2 25 30 16 35 30 30 45 30 44 55 30 3 25 35 17 35 35 31 45 35 45 55 35 4 25 40 18 35 40 32 45 40 46 55 40 5 25 45 19 35 45 33 45 45 47 55 45 6 25 50 20 35 50 34 45 50 48 55 50 7 25 55 21 35 55 35 45 55 49 55 55 8 30 25 22 40 25 36 50 25 9 30 30 23 40 30 37 50 30 10 30 35 24 40 35 38 50 35 11 30 40 25 40 40 39 50 40 12 30 45 26 40 45 40 50 45 13 30 50 27 40 50 41 50 50 14 30 55 28 40 55 42 50 55

4.8. Modelos de calibrao multivariada para o pesticida Metamidofs A figura 4.7 mostra os espectros SERS do pesticida metamidofs nas concentraes variando de 10 a 59,5 g/L, utilizando o espectrmetro Raman de baixa resoluo (Raman System,Inc) com LASER diodo, laser operando no infravermelho prximo (785 nm) e detector do tipo CCD de 2048 elementos.

70

Figura 4.7. Espectros Raman SERS do metamidofs no pr-processados

Os espectros SERS de metamidofs, no pr-processados referentes figura 4.7, foram obtidos com a finalidade de construir o modelo de calibrao multivariada para determinao quantitativa do pesticida metamidofs, usando tcnicas quimiomtricas de calibrao multivariada baseadas no mtodo dos mnimos quadrados parcias (PLS). O modelo, a priori, foi construdo com os dados no pr-processados para posterior comparao com modelos cujos dados foram pr-processados. Foram utilizados os seguintes pr-processamentos para avaliar, atravs do RMSEC (raiz quadrada do erro quadrtico mdio de calibrao) e RMSEP (raiz quadrada do erro quadrtico mdio de previso) o desempenho dos seguintes pr-processamentos: transformada de Fourier (FT do ingls, Fourier Transformation), correo multiplicativa do espalhamento (MSC), ortogonalizao de espectros pelo mtodo de Gram-schmidt (GS), transformao padro normal de variao (SNV) e dados centrados na mdia. Em todos os modelos desenvolvidos foram usadas 70 amostras na calibrao e 30 amostras na previso. Essa separao foi baseada no algoritmo de Kennard-Stone [75]. 71

O mtodo de validao cruzada foi usado para a escolha do nmero timo de variveis latentes, isto , o menor nmero de variveis latentes que conseguem capturar a maior varincia dos dados para construir o modelo de calibrao para quantificao de metamidofs. A validao cruzada um procedimento onde uma das amostras do conjunto de calibrao retirada e o modelo desenvolvido com os restantes, usando diferentes nmeros de variveis latentes. Aps isso, realizada a previso da amostra que foi retirada. Todo processo repetido at que todas as amostras de calibrao tenham sido previstas. No final calculada a raiz quadrada do erro quadrtico mdio de validao cruzada (RMSECV do ingls, Root Mean Square Error of Cross Validation) para cada nmero de variveis latentes utilizadas. Pela anlise dos valores de RMSECV para diferentes nmeros de variveis latentes no modelo, observou-se que a partir de 10 variveis latentes no existia mais variao aprecivel no erro. Assim esse nmero foi escolhido para os clculos, capturando 99,26 % e 96,20 % da varincia dos dados independentes (espectros do pesticida) e dependentes (concentraes de metamidofs), respectivamente. Os resultados obtidos para o dados apenas centrados na mdia apresentaram valores da raiz quadrada do erro mdio quadrtico de calibrao (RMSEC do ingls, Root Mean Square Error of Calibration) e da raiz quadrada do erro mdio quadrtico de previso (RMSEP do ingls, Root Mean Square Error of Prediction) de 2,50 g/L e 3,30 g/L respectivamente. A figura 4.8 ilustra o grfico dos valores previstos contra os valores de referncia para quantificao do pesticida metamidofs utilizando as amostras de validao.

72

Valores Previstos (g/L)

Valores de Referncia (g/L) Figura 4.8. Modelo de calibrao para determinao de metamidofs

4.8.1. Modelo de calibrao utilizando a transformada de Fourier como prprocessamento

Os espectros SERS das solues aquosas do pesticida metamidofs foram pr-processados aplicando a Transformada de Fourier (ver figura 4.9). Foi utilizado esse processamento para verificar se com a diminuio dos rudos, inerentes medida direta do espalhamento Raman, os resultados de previso do modelo de calibrao ficassem melhores. Verifica-se nessa figura uma certa diminuio do rudo espectral, pela eliminao de altas freqncias do espectro. Em seguida, os dados foram centrados na mdia e foi utilizado o mtodo de validao cruzada para escolher o nmero de variveis latentes. Os valores de RMSEC e RMSEP foram calculados para possvel avaliao do desempenho do modelo.

73

Figura 4.9. Espectros SERS do pesticida metamidofs aps utilizao do filtro com transformada de Fourier.

Para o modelo foram utilizadas 10 variveis latentes as quais capturaram 99,96 % e 96,20 % da varincia dos dados, como mostrado na tabela 10, e que explicaram o menor RMSECV (raiz quadrada do erro quadrtico mdio de validao cruzada). Os valores de RMSEC e RMSEP calculados pelo modelo foram de 2,79 g/L e 3,36 g/L respectivamente. A figura 4.10 mostra o grfico dos valores previstos contra os valores de referncia para quantificao do pesticida metamidofs utilizando as amostras de validao. Analisando-se os resultados, nota-se que os valores de previso so at piores que os anteriormente apresentados. Uma possvel explicao para isso que a utilizao do filtro acabou por eliminar informaes espectrais importantes para o desenvolvimento do modelo de calibrao.

74

Valores de Referncia (g/L) Figura 4.10. Modelo de calibrao para determinao de metamidofs com prprocessamento por filtro com transformada de Fourier.

4.8.2. Modelo de calibrao utilizando MSC como pr-processamento O terceiro modelo de calibrao foi construdo utilizando a correo de espalhamento multiplicativo. Os espectros aps esta correo esto apresentados na figura 4.11. Este pr-processamento foi aplicado para verificar o efeito de uma correo de espalhamento sobre os resultados de previso.

Valores Previstos (g/L)

75

Figura 4.11. Espectros SERS do pesticida metamidofs com pr-processamento por MSC.

Aps a correo de espalhamento, os dados foram centrados na mdia, e em seguida, foi utilizado o mtodo de validao cruzada para escolher o nmero de variveis latentes a ser empregado no modelo. Neste modelo foram utilizadas 10 variveis latentes as quais capturaram 99,96 % e 96,20 % da varincia dos dados das variveis independentes e dependentes, respectivamente. Os valores de RMSEC e RMSEP calculados pelo modelo foram de 2,79 g/L e 2,08 g/L respectivamente. A figura 4.12. ilustra o grfico dos valores previstos contra os valores de referncia para quantificao do pesticida metamidofs utilizando as amostras de validao.

76

Valores Previstos (g/L)

Valores de Referncia (g/L) Figura 4.12. Modelo de calibrao para determinao de metamidofs com prprocessamento por MSC.

Pode-se observar nesse caso que as previses foram melhores s demais j apresentadas, uma vez que os pontos da figura 4.12. praticamente esto sob a reta verificando que os valores previstos so muito prximos aos esperados. Alm disso, menores valores de RMSEP foram obtidos, confirmando a superioridade do modelo desenvolvido.

4.8.3. Modelo de calibrao utilizando o mtodo de ortogonalizao de GramSchmidt como pr-processamento

O quarto modelo de calibrao foi construdo utilizando os espectros SERS do pesticida metamidofs pr-processados utilizando o mtodo de GramSchmidt. Nesse caso, os espectros foram ortogonalizados em relao ao espectro SERS do branco (gua). Dessa forma, pretende-se eliminar a contribuio de 77

efeitos que no esto correlacionados com a amostra, uma vez que estes foram eliminados. A figura 4.13. apresenta o espectro aps a ortogonalizao, onde se percebe que grande parte do efeito no relacionado ao Raman foi eliminado.

Figura 4.13. Espectros Raman SERS de metamidofs pr-processado com ortogonalizao.

O mtodo de validao cruzada tambm foi utilizado neste modelo para a escolha do nmero timo de variveis latentes. Foram utilizadas 10 variveis latentes, as quais capturaram 99,99 % e 99,50 % da varincia dos dados das matrizes das variveis independentes e dependentes, respectivamente. Os valores de RMSEC e RMSEP calculados pelo modelo, com os dados centrados na mdia, foram de 2,55 g/L e 2,73 g/L respectivamente. A figura 4.14. ilustra o grfico dos valores previstos contra os valores de referncia para quantificao do pesticida metamidofs utilizando as amostras de validao. Nesse caso, os valores de previso para as amostras 29 e 30 no esto adequados, contudo para as demais os resultados esto satisfatrios, com erros similares aos obtidos anteriormente. Assim a remoo da informao ortogonal aos dados no propiciou uma melhora significativa nos resultados de previso. 78

Valores Previstos (g/L)

Valores de Referncia (g/L)

Figura 4.14. Modelo de calibrao para determinao de metamidofs com prprocessamento por ortogonalizao.

4.8.4. Comparao dos modelos para o pesticida Metamidofs

Tambm pr-processamento por SNV foi aplicado, mas os resultados foram bastante piores que os apresentados anteriormente e por isso os dados no esto apresentados. Para um resumo geral dos resultados obtidos a tabela 4.5 apresenta os resultados de RMSEP.

Tabela 4.5. Valores dos erros calculados pelos modelos de calibrao para quantificao de metamidofs. Modelos Desenvolvidos Tipos de prRMSEP (g/L) processamentos 1 Modelo CM 3,30 2 Modelo FT 3,36 3 Modelo MSC 2,08 4 Modelo GS 2,73 5 Modelo SNV 4,15 79

Pelos resultados apresentados na tabela 4.5, nota-se claramente que os melhores pr-processamento so o MSC e GS. Para uma avaliao mais confivel desses resultados um teste F pode ser aplicado para verificar se existe diferena significativa entre os resultados num certo grau de certeza. A tabela 4.6 apresenta os valores de F calculados como a relao entre os quadrados dos RMSEPs.

Tabela 4.6. Valores de teste F para os diferentes modelos desenvolvidos. FT CM FT MSC GS 1,19 MSC 2,52 2,61 GS 1,46 1,52 1,72 SNV 1,51 1,53 3,98 2,31

Tomando-se o valor de F tabelado com 30,30 graus de liberdade e confiana de 95%, tem-se 1,84. Assim pode-se concluir que o pr-processamento com MSC produz melhores resultados que CM, FT e SNV, enquanto que o prprocessamento com GS produz melhores resultados que SNV. Observando os valores dos erros de previso, podemos concluir que a correo de espalhamento multiplicativo o pr-processamento mais adequado para construir modelos de calibrao para quantificao de metamidofs.

4.9. Modelos de calibrao para o pesticida Endosulfan A figura 4.15. mostra os espectros Raman SERS de endosulfan, obtidos atravs de um espectrmetro Raman de baixa resoluo (Raman System,Inc) com LASER diodo, laser operando no infravermelho prximo (785 nm) e detector do tipo CCD de 2048 elementos.

80

Figura 4.15. Espectros Raman SERS de endosulfan no pr-processados.

Assim como para o Metamidofs, foram desenvolvidos modelos de calibrao multivariada para determinao do endosulfan em gua. Tambm os mesmos pr-processamentos foram testados e comparados para avaliao da possibilidade da quantificao utilizando o SERS. O primeiro modelo de calibrao para o pesticida endosulfan foi construdo com os dados centrados na mdia. O mtodo de validao cruzada tambm foi utilizado para a escolha do nmero timo de variveis latentes, isto , o menor nmero de variveis latentes que conseguem capturar a maior varincia dos dados para construir o modelo. Nesse caso, foram escolhidas 10 variveis latentes, as quais capturaram respectivamente, 99,75 % e 94,48 % da varincia das varveis independentes e dependentes. Os valores de RMSEC e RMSEP calculados pelo modelo foram de 3,34 g/L e 3,27 g/L respectivamente. A figura 4.16. ilustra os valores de referncia contra os valores previstos pelo PLS.

81

Valores Previstos (g/L)

Valores de Referncia (g/L)

Figura 4.16. Modelo de calibrao para determinao de endosulfan. () calibrao; () validao.

4.9.1. Modelo de calibrao utilizando transformada de Fourier como prprocessamento

Para construo do segundo modelo de calibrao, os espectros Raman SERS de endosulfan foram pr-processados aplicando a Transformada de Fourier, na tentativa de eliminao de rudos espectrais. Os espectros filtrados esto apresentados na figura 4.17.

82

Figura 4.17. Espectros SERS do pesticida endosulfan aps utilizao do filtro de transformada de Fourier.

Para o modelo foram utilizadas 10 variveis latentes as quais capturaram 99,78 % e 92,71 % das varveis independentes e dependentes respectivamente. Os valores obtidos para RMSEC e RMSEP foram de 3,83 g/L e 3,56 g/L, respectivamente, com os dados centrados na mdia. Nesse caso, como para o pesticida anterior, a utilizao do filtro no proporcionou melhora nos resultados, apresentando at valores superiores de erros. A figura 4.18. ilustra os valores de referncia contra os valores previstos pelo PLS

83

Valores Previstos (g/L)

Valores de Referncia (g/L)

Figura 4.18. Modelo de calibrao para determinao do endosulfan com transformada de Fourier como pr-processamento. () calibrao; () validao.

4.9.2. Modelo de calibrao utilizando SNV como pr-processamento

Aps utilizao da transformada de Fourier, os dados foram prprocessados aplicando a transformao padro normal de variao, e em seguida, centrados na mdia para possibilitar melhor desempenho do modelo para quantificao de endosulfan. Para desenvolvimento do modelo de calibrao foi utilizado o mtodo de validao cruzada para a escolha do nmero timo de variveis latentes. Foram utilizadas 10 variveis latentes e os valores de e RMSEC e RMSEP calculados pelo modelo foram de respectivamente. A figura 4.19. ilustra o modelo de calibrao desenvolvido para quantificao do pesticida endosulfan. Para o pr-processamento SNV, possvel observar uma melhora significativa dos valores de previso em relao aos anteriormente mostrados. 3,05 g/L e 2,83 g/L

84

Valores Previstos (g/L)

Valores de Referncia (g/L)

Figura 4.19. Modelo de calibrao para determinao de endosulfan utilizando SNV como pr-processamento. () calibrao; () validao.

4.9.3. Modelo de calibrao utilizando MSC como pr-processamento

A figura 4.20. mostra os espectros j pr-processados aos quais foram aplicados a correo multiplicativa do espalhamento com a finalidade de corrigir as linhas base espectrais. O quarto modelo de calibrao foi construdo aps o prprocessamento. O RMSEP do modelo foi comparado com os demais RMSEPS dos modelos anteriores, para possvel avaliao no desempenho dos modelos de calibrao desenvolvidos. Para esse modelo tambm foi utilizado o mtodo de validao cruzada para a escolha do nmero timo de variveis latentes. Foram utilizadas 10 variveis latentes as quais capturaram 97,64 % de X e 96,74 % de Y da varincia dos dados. Os valores dos erros de RMSEC e RMSEP calculados pelo modelo foram de 2,50 g/L e 2,48 g/L, respectivamente. A figura 4.21. ilustra o modelo de calibrao desenvolvido para quantificao do pesticida endosulfan.

85

Figura 4.20. Espectros Raman SERS de endosulfan pr-processados com MSC.

Valores Previstos (g/L)

Valores de Referncia (g/L)

Figura 4.21. Modelo de calibrao para determinao de endosulfan com prprocessamento por MSC. () calibrao; () validao.

86

Tambm nesse caso, utilizando o MSC nota-se uma sensvel melhora nos resultados como para o SNV. A melhora com esses dois pr-processamentos pode ser explicada pelo fato de que eles corrigem parte do grande sinal da fluorescncia que encobre os picos Raman do endosulfan.

4.9.4. Modelo de calibrao utilizao ortogonalizao de Gram-Schmidt como pr-processamento

Os espectros SERS ortogonalizados esto apresentados na figura 4.22. Foram utilizadas 10 variveis latentes as quais capturaram 97,01 % e 95,73 % da varincia dos dados independentes e dependentes, respectivamente. Os valores dos erros de RMSEC e RMSEP calculados pelo modelo foram de 3,34 g/L e 3.02 g/L, respectivamente. A figura 4.23. ilustra o modelo de calibrao desenvolvido para quantificao do pesticida endosulfan.

2000 1500 1000 500 0 -500 -1000 -1500 -2000 -2500

Intensidade (u. a.)

500

1000 1500 2000 Deslocamento Raman (cm-1)

2500

3000

Figura 4.22. Espectros Raman SERS de endosulfan pr-processados com ortogonalizao.

87

Valores Previstos (g/L)

Valores de Referncia (g/L)

Figura 4.23. Modelo de calibrao para determinao de endosulfan com prprocessamento por ortogonalizao. () calibrao; () validao.

4.9.5. Comparao dos modelos para o pesticida Endosulfan

Os resultados obtidos para os diferentes modelos esto apresentados na tabela 4.7. Nesse caso nota-se que as diferenas entre os vrios prprocessamentos no so muito grandes, destacando-se apenas que a utilizao do MSC produz resultados com erros menores. Porm realizando-se um teste F para comparao dos RMSEPs com 95% de confiana, no so observadas diferenas significativas entre os modelos desenvolvidos.

88

Tabela 4.7. Valores dos erros calculados pelos modelos de calibrao para quantificao de endosulfan Modelos Desenvolvidos Tipos de prRMSEP (g/L) processamentos 1 Modelo CM 3,27 2 Modelo FT 3,56 3 Modelo SNV 2,83 4 Modelo MSC 2,48 5 Modelo GS 3,02

4.10. Modelos de calibrao multivariada para misturas dos pesticidas Metamidofs e Endosulfan

Os espectros Raman SERS da mistura de pesticidas esto apresentados na figura 4.24. Todos os modelos de calibrao foram desenvolvidos atravs do mtodo dos mnimos quadrados parciais com algoritmo SMPLS, sendo que foram desenvolvidos modelos independentes para cada pesticida. Foram usadas 38 amostras na calibrao e 10 amostras na previso. As variveis independentes e dependentes foram centradas na mdia, e em seguida, o mtodo de validao cruzada foi utilizado para obter o nmero timo de variveis latentes para construo do modelo. Tambm os mesmos prprocessamentos j apresentados anteriormente foram testados e comparados para avaliao da possibilidade da quantificao dos pesticidas em misturas utilizando o SERS. Nesse caso, os modelos para o pesticida endosulfan necessitaram de 11 variveis latentes, que capturaram mais de 95% da informao dos dados em todos os casos. J para o pesticida metamidofs somente por volta de 70% da informao dos dados para as variveis dependentes puderam capturados pelo modelo.

89

Figura 4.24. Espectros Raman SERS das misturas de pesticidas endosulfan e metamidofs.

A figura 4.25. ilustra o grfico dos valores de referncia versus os valores previstos pelo modelo de calibrao desenvolvido para o pesticida endosulfan com os dados centrados na mdia, onde se pode observar a excelente concordncia entre os valores de referncia e calculados pelo modelo.

90

Valores Previstos (g/L)

Valores de Referncia (g/L)

Figura 4.25. Valores de referncia contra os previstos pelo modelo para a quantificao do pesticida endosulfan na mistura. () calibrao; () validao.

A figura 4.26. ilustra os valores medidos contra os valores previstos pelo modelo para o pesticida metamidofs com dados pr-processados por MSC. Pode-se verificar que os resultados apresentados so bem piores que para o endosulfan. S pelo fato do modelo de calibrao multivariada com o PLS conseguir descrever apenas 72,01% da varincia nos dados das variveis dependentes, indica que est sendo difcil o desenvolvimento da relao entre os espectros e a concentrao do metamidofs. Pode-se verificar grande disperso entre as amostras de calibrao indicando algum problema com os dados. Apesar das medidas terem sido refeitas, no foi possvel desenvolver modelos com melhor poder de previso que os apresentados. Uma possvel explicao para isto que pode estar ocorrendo algum tipo de interao entre os pesticidas e o substrato ativo que faz com que a relao deixe de ser linear. No se pode esquecer que o PLS baseia-se nas relaes lineares entre as variveis independentes (X) e variveis dependentes (Y). Esses

91

resultados so bastante diferentes dos apresentados anteriormente para metamidofs puro, endosulfan puro e endosulfan na mistura.

Valores Previstos (g/L)

Valores de Referncia (g/L)

Figura 4.26. Valores de referncia contra os previstos pelo modelo para a quantificao do pesticida metamidofs na mistura. () calibrao; () validao. As tabelas 4.8 e 4.9 mostram os valores dos erros para as determinaes de endosulfan e metamidofs na mistura para os diversos pr-processamentos realizados. Nota-se claramente que as previses para o endosulfan so bastante superiores que para o metamidofs. Aplicando um teste F para comparao dos RMSEPs, verifica-se que no nvel de confiana de 95%, no existe diferena significativa entre os modelos.

Tabela 4.8. Valores dos erros calculados pelos modelos de calibrao para quantificao de endosulfan nas misturas Modelos Desenvolvidos Tipos de prRMSEP (g/L) processamentos 1 Modelo CM 1,80 2 Modelo FT 1,88 3 Modelo SNV 2,13 4 Modelo MSC 2,19 5 Modelo GS 1,59 92

Tabela 4.9. Valores dos erros calculados pelos modelos de calibrao para quantificao de metamidofs nas misturas Modelos Desenvolvidos Tipos de prRMSEP (g/L) processamentos 1 Modelo CM 3,31 2 Modelo FT 3,25 3 Modelo SNV 3,27 4 Modelo MSC 2,91 5 Modelo GS 3,85 4.11. Validao dos melhores modelos de Calibrao Foram estimadas as figuras de mrito para os modelos desenvolvidos na determinao dos pesticidas. Foram escolhidos os modelos que apresentaram o menor valor de RMSEP para esses clculos, apesar de que para a maioria dos casos, no houve diferena significativa entre os diferentes pr-processamentos testados. A tabela 4.10 apresenta as figuras de mrito calculadas.

Tabela 4.10. Figuras de Mrito para os modelos desenvolvidos.

Figuras de Mrito Endosulfan Metamidofs Endosulfan Na Mistura RMSEC Exatido
*

Metamidofs Na Mistura 5,85 2,91 14,54 0,02 0,0013 0,73 11,00 0,72 0,095 -39,00 0,73 1420,30 884,25 0,23 0,69

2,94 2,48 8,00 0,13 0,0061 0,95 1,60

2,87 2,08 7,76 0,13 0,0042 0,97 1,10 0,97 0,042 -36,00 0,97 782,09 316,60 0,43 1,29

0,86 1,80 3,51 0,29 0,0189 1,00 0,19 0,99 0,093 -40,00 0,99 335,67 224,97 0,94 2,85

RMSEP
**
*

Sensibilidade Analtica

Inverso da Sensibilidade Analtica

Seletividade Inclinao Ajuste Intercepto Coef. Corr. (r ) Inclinao Ajuste NAS

Razo Sinal/Rudo
2

0,95 0,044 -34,00

Intercepto Coef. Corr. (r ) Mx. Mn.

* * -1 2

0,83 658,61 338,38 0,50 1,34

Limite Deteco

Limite Quantificao

(*)Resultados em g/L , (**) (g/L)

93

O ajuste dos modelos construdos foi avaliado com base nos grficos dos valores para os parmetros estimados pelos modelos PLS contra os valores de referncia. Outra maneira de avaliar o ajuste de modelos de calibrao multivariada atravs dos grficos dos valores escalares do sinal analtico lquido (NAS), determinado pela norma do vetor de sinal analtico lquido em funo do valor de referncia para cada parmetro. Esta ltima refere-se representao pseudo-univariada dos modelos de calibrao multivariada. A inclinao, o intercepto e o coeficiente de correlao para os modelos so mostrados na Tabela 4.10. Pelos ajustes nota-se que somente para a determinao do metamidofs na mistura a correlao no est acima de 0,95, indicando que este modelo no est ajustado de maneira correta. As Figuras 4.27., 4.28., 4.29. e 4.30. mostram os grficos dos valores de referncia contra os valores estimados. Nesse caso, o modelo linear parece se ajustar bem aos dados, porm o modelo para o metamidofs na mistura tem um pior ajuste. Essa falta de ajuste pode ser em decorrncia da no interao das molculas de metamidofs com as partculas de ouro coloidal que produzem o efeito SERS. As figuras 4.31., 4.32., 4.33. e 4.34. mostram os grficos do escalar NAS contra a concentrao, respectivamente, dos modelos de calibrao para o endosulfan, metamidofs, endosulfan na mistura e metamidofs na mistura. Podese observar que para o NAS, novamente o ajuste para o pesticida metamidofs na mistura no adequado.

94

Figura 4.27. Valores de referncia versus valores estimados pelo modelo PLS para o pesticida endosulfan. () amostras de calibrao, (*) amostras de validao

Figura 4.28. Valores de referncia versus valores estimados pelo modelo PLS para o pesticida metamidofs. () amostras de calibrao, (*) amostras de validao 95

Figura 4.29. Valores de referncia versus valores estimados pelo modelo PLS para o pesticida endosulfan na mistura. () amostras de calibrao, (*) amostras de validao.

Figura 4.30. Valores de referncia versus valores estimados pelo modelo PLS para o pesticida metamidofs na mistura. () amostras de calibrao, (*) amostras de validao. 96

Valores de Referncia g/L

Sinal Analtico Lquido Figura 4.31. Escalar NAS contra as concentraes de referncia para o endosulfan.

Valores de Referncia g/L

Sinal Analtico Lquido Figura 4.32. Escalar NAS contra as concentraes de referncia para o metamidofs. 97

Valores de Referncia g/L

Sinal Analtico Lquido Figura 4.33. Escalar NAS contra as concentraes de referncia para o endosulfan na mistura.

Valores de Referncia g/L

Sinal Analtico Lquido Figura 4.34. Escalar NAS contra as concentraes de referncia para o metamidofs na mistura. 98

As Figuras 4.35., 4.36., 4.37. e 4.38. representam os resduos da calibrao validao para as amostras de endosulfan, metamidofs, endosulfan na mistura e metamidofs na mistura, respectivamente. Qualitativamente, estes grficos podem indicar se os dados seguem ou no um comportamento linear. A distribuio aleatria desses resduos um indicativo de comportamento linear. A distribuio dos erros para endosulfan, metamidofs e endosulfan na mistura apresenta um comportamento aleatrio, no entanto, para o metamidofs na mistura observa-se uma certa tendncia.

Figura 4.35. Grfico de erros absolutos contra os valores de referncia do modelo de calibrao para determinao do pesticida endosulfan.

99

Figura 4.36. Grfico de erros absolutos contra os valores de referncia do modelo de calibrao para determinao do pesticida metamidofs.

Erros Absolutos

Concentraes de Referncia (g/L)

Figura 4.37. Grfico de erros absolutos contra os valores de referncia do modelo de calibrao para determinao do pesticida endosulfan na mistura.

100

Erros Absolutos

Concentraes de Referncia (g/L)

Figura 4.38. Grfico de erros absolutos contra os valores de referncia do modelo de calibrao para determinao do pesticida metamidofs na mistura.

Os indicadores de exatido, mostrados na Tabela 4.10, apresentam um nvel aceitvel de disperso e uma boa concordncia entre si, menos para o metamidofs na mistura. A sensibilidade e sensibilidade analtica apresentaram timos resultados para o modelo endosulfan e bons resultados para os demais modelos (metamidofs, endosulfan na mistura e metamidofs na mistura) considerando-se a faixa de concentraes utilizadas e tambm pela tcnica empregada neste trabalho. Os valores para o inverso da sensibilidade analtica, apresentados na Tabela 4.10, podem ser interpretados de forma mais clara, por apresentarem uma correlao com a concentrao utilizada. Este valor mais simples e informativo para comparaes e julgamento de um mtodo analtico, pois permite estabelecer a menor diferena de concentrao entre amostras que pode ser distinguida pelo mtodo. Segundo esses valores, por exemplo, o modelo capaz de fazer a distino entre amostras com diferena de concentrao da ordem de 0,13 g/L de endosulfan e metamidofs em guas. 101

Os valores de seletividade que so mostrados na Tabela 4.10 representam a frao mdia do sinal do espectro da amostra que usado na modelagem, por no ser ortogonal em relao propriedade de interesse. Logo, esses valores no se referem seletividade no seu significado fsico, que em geral empregado em Qumica Analtica. Eles indicam que menos que 1% em mdia do sinal est relacionado ao nvel do analito. Os valores para a razo sinal/rudo apresentados na Tabela 4.10 mostram o quanto o escalar nas est acima do desvio padro da flutuao do sinal instrumental da referncia. Os valores mnimos para a razo sinal/rudo apresentados quantitativas. Os limites de deteco e quantificao para os modelos construdos mostraram resultados coerentes com as quantidades medidas para todos os parmetros. Assim possvel realizar quantificaes para os pesticidas em gua com concentraes acima de 1,34 e 1,29 g/L para endosulfan e metamidofs, respectivamente. na tabela, so os limites aceitveis para determinaes

102

CAPTULO 5
DETERMINAO DE TSH EM PLASMA SANGUNEO UTILIZANDO SERS

103

5.1. Introduo

Os hormnios tireoideanos (HT) [76] so fundamentais para o crescimento e desenvolvimento de vrios rgos e tecidos de animais vertebrados. Embora essa ao j ocorra no estgio embrionrio, alguns desses rgos e tecidos ainda apresentam-se imaturos aps nascimento e tm um padro de desenvolvimento temporal especfico, o qual depende de um suporte adequado de triiodotironina (T3), o principal hormnio tireoideano. Dele tambm depende o crescimento, diferenciao e a regulao da atividade e metabolismo desses mesmos rgos e tecidos na fase adulta, razo pelas quais os hormnios tireoideanos so considerados essenciais para a manuteno da qualidade de vida do ser humano. A fonte de HT a glndula tireide, que secreta predominantemente o hormnio tiroxina (T4) da qual deriva, por desiodao, a maior parte do T3 circulante. do T3, hormnio que apresenta atividade biolgica no mnimo 5 vezes maior que a do T4, que depende a atividade de, praticamente, todos os tecidos do organismo, j que todos eles expressam receptores de HT [76]. Em linhas gerais, a funo tireoideana regulada pelo hormnio liberador de tireotropina (TRH) produzido no hipotlamo que, por meio do sistema porta hipotlamo-hipofisrio, se dirige adeno-hipfise, ligando em receptores especficos no tireotrofo e induzindo a sntese e secreo de hormnio tirotrpico (TSH). Este, por sua vez, interage com receptores presentes na membrana da clula folicular tireoideana induzindo a expresso de protenas envolvidas na biossntese de HT, aumentando a atividade da clula tireoideana e estimulando a secreo hormonal [76]. necessrio que a fisiologia da tireide esteja normal, para bons resultados reprodutivos, haja vista que, na mulher, o hipotireoidismo reportado como causa de falha na ovulao e aumento na taxa de abortamento [77]. Na dcada de 60 surgiram vrios estudos que demonstraram alteraes nas dosagens dos hormnios tireoideanos em patologias no tireoideanas. Desde ento, outros trabalhos foram publicados descrevendo doenas sistmicas graves, 105

agudas ou crnicas, acompanhadas ou no por desnutrio e caquexia, nas quais o perfeito entendimento da funo tireoideana no era simples, pois havia alteraes dos nveis hormonais do sangue, independente da presena de patologia endcrina [78].

5.1.1. Hormnio Tireoestimulante (TSH)

O hormnio tireoestimulante (TSH), tambm conhecido como tireotropina, uma glicoprotena produzida pelos tireotrofos da adeno-hipfise. formado por duas subunidades, alfa e beta, unidas por ligao no-covalente. A subunidade alfa comum a outras glicoprotenas, como o hormnio folculoestimulante (FSH), o hormnio luteinizante (LH) e a gonadotropina corinica humana (hCG). J a subunidade beta do TSH especfica, conferindo especificidade biolgica e imunolgica [79]. A secreo de TSH pela hipfise modulada por hormnios tireideos com mecanismo clssico de retrorregulao (feedback negativo). Dados recentes da literatura indicam quem o T3 produzido internamente, dentro do tirotrofocito, por desalogenao de T4, o agente que bloqueia a secreo de TSH em condies fisiolgicas [79]. O hipotlamo atua tanto estimulando a secreo de TSH, atravs do hormnio liberador de tireotropina (TRH). A concentrao srica de hormnios tireoidianos tambm causa influncia na secreo de TSH, atravs de feedback negativo exercido sobre o eixo hipotlaomo-hipofisrio. A somatostatina, um hormnio hipotalmico inibitrio, atua atravs do aumento do efeito inibitriodo hormnio tireoidiano sobre os tireotrofos. Ocorre ainda um controle neural, sendo que a dopamina responsvel por inibir fisiologicamente a secreo de TSH. A principal funo da tireotropina ligar-se receptores de alta afinidade na glndula tireide, estimulando a captao do iodo, a hormonognese e a liberao de T3 e T4 [79]. Desta forma, quando a funo hipotlamo-hipofisria est intacta, pequenas alteraes nas concentraes dos hormnios tireoideanos livres 106

resultam em grandes alteraes nas concentraes sricas de TSH, tornando o TSH o melhor indicador de alteraes discretas da produo tireoideana. A secreo do TSH pulstil e possui um ritmo circadiano com os pulsos de secreo ocorrendo entre 22hs e 4hs da madrugada, sendo seus nveis mdios entre cerca de 1,3 e 1,4mU/L, com limites inferiores entre 0,3 e 0,5mU/L e limites superiores entre 3,9 e 5,5mU/L (4,5). Variaes na concentrao srica de TSH podem ser atribudas a esta secreo pulstil e a liberao noturna do TSH [76]. Existem algumas tcnicas para avaliao dos nveis destes hormnios, sendo que as mais usadas so: as tcnicas de radioimunoensaio [80] e a quimiluminescncia [81]. Estas tcnicas so rpidas, exatas e apresentam baixos limites de deteco, porm a periculosidade da tcnica de radioimunoensaio, devido radioatividade dos reagentes envolvidos, o alto custo dos aparelhos, do conjunto de reagentes utilizados, bem como a utilizao de mo-de-obra especializada, inviabilizam o uso destes mtodos de anlise. A perspectiva de utilizao da espectroscopia Raman de baixa resoluo amplificada por superfcie (SERS), para determinao do hormnio tireoideano TSH extremamente atraente dada simplicidade experimental dos mtodos envolvidos, os baixos limites de deteco possveis de serem alcanados e principalmente a iseno de reagentes radioativos e no-radioatios. Contudo, as sobreposies de bandas espectrais, efeitos de fluorescncia do analito, conferem ao sistema caractersticas que podem dificultar a determinao do hormnio em questo. Uma alternativa bastante vivel para se determinar o TSH sem as caractersticas que dificultem sua determinao a aplicao de tcnicas quimiomtricas de calibrao multivariada baseadas no mtodo dos mnimos quadrados parcias (PLS).

5.2. Parte Experimental

Para desenvolver o modelo de calibrao por mnimos quadrados parciais, foram obtidas 53 amostras de sangue animal. As amostras foram 107

centrifugadas e todo soro foi coletado para quantificao do TSH. Foram utilizados 0,5 mL de soro de cada amostra sendo que desses, 0,25 mL foram usados para se determinar a concentrao do TSH pelo mtodo de referncia e os outros 0,25 mL foram utilizados para obteno dos espectros SERS de plasma. Anlises por quimioluminescncia foram realizadas como mtodo de referncia para quantificao de TSH. Utilizou-se o Kit ADVIA Centaur (Bayer Corporation). O princpio do teste um ensaio imunolgico tipo sanduche de dois stios que usa quantidades constantes de dois anticorpos com medida por quimioluminescente direta. Os resultados do ensaio so usualmente calibrados contra uma preparao de referncia de TSH (ex.: a Second International Reference Preparation [2nd IRP] 80/558 da OMS) e so expressos em miliunidades internacionais de atividade biolgica por litro de soro -mUI/L- (ou UI/ml). A tabela 5.1 mostra os resultados obtidos pelo mtodo de referncia, ou seja, pelo mtodo da quimioluminescncia. A sensibilidade analtica foi de 0,01 UI/mL. Os espectros Raman foram obtidos utilizando cubeta de quartzo, com tempo de integrao de 60 segundos. Foram adicionados na cubeta, 1,0 mL de soluo coloidal de ouro, 0,25 mL de plasma sanguneo e obtidos os espectros, a fim de observar a intensificao do sinal Raman (SERS).

108

Tabela 5.1. Concentraes obtidas pelo mtodo quimioluminescente

Plasma Sanguneo Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Amostra 5 Amostra 6 Amostra 7 Amostra 8 Amostra 9 Amostra 10 Amostra 11 Amostra 12 Amostra 13 Amostra 14 Amostra 15 Amostra 16 Amostra 17 Amostra 18 Amostra 19 Amostra 20 Amostra 21 Amostra 22 Amostra 23 Amostra 24 Amostra 25 Amostra 26 Amostra 27 Amostra 28 Amostra 29 Amostra 30 Amostra 31 Amostra 32 Amostra 33 Amostra 34 Amostra 35 Amostra 36 Amostra 37 Amostra 38 Amostra 39 Amostra 40 Amostra 41 Amostra 42 Amostra 43 Amostra 44 Amostra 45 Amostra 46 Amostra 47 Amostra 48 Amostra 49 Amostra 50 Amostra 51 Amostra 52 Amostra 53 Concentrao de TSH (UI/mL) 1,10 3,30 0,80 3,20 2,30 1,90 1,20 3,30 4,30 1,10 1,10 3,00 2,20 2,20 1,00 1,00 4,80 1,80 0,90 2,60 0,80 1,90 5,00 2,10 2,80 1,50 3,10 3,60 0,12 1,10 0,50 2,60 1,70 3,70 7,60 2,20 5,20 2,70 3,50 3,00 2,90 2,30 1,00 3,50 2,10 2,70 2,60 3,40 2,50 4,00 2,60 1,90 1,90

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5.3. Resultados e Discusso

A figura 5.1 mostra os espectros SERS de plasma sanguneo obtidos atravs de um espectrmetro Raman de baixa resoluo (Raman System,Inc) com LASER diodo, laser operando no infravermelho prximo (785 nm) e detector do tipo CCD de 2048 elementos.

Deslocamento Raman (cm-1)

Figura 5.1. Espectros SERS de plasma sanguneo sem pr-processamento.

Foram usadas 39 amostras na calibrao e 14 amostras na previso, sendo que alguns pr-processamentos foram realizados antes da construo do modelo. Os menores RMSEC (raiz quadrado do erro mdio de calibrao) e RMSEP (raiz quadrada do erro mdio de previso) foram obtidos com os dados escalados e tambm com o MSC. A figura 5.2 apresenta os espectros aps o prprocessamento.

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Deslocamento Raman (cm-1)

Figura 5.2. Espectros SERS de plasma sanguneo aps pr-processamento

O mtodo de validao cruzada foi usado para a escolha do nmero timo de variveis latentes, isto , o menor nmero de variveis latentes que conseguem capturar a maior varincia dos dados para construir o modelo de calibrao para quantificao do TSH, conforme ilustra a figura 5.3. Nessa figura pode-se observar que aps a utilizao de 7 variveis latentes no existe mais uma diminuio do RMSEP de validao cruzada. O modelo de calibrao para o TSH foi desenvolvido utilizando 7 variveis latentes capturando 97,34 % da varincia de X (variveis independentes) e 86,03% da varincia de Y (variveis dependentes). Os valores obtidos dos erros foram: RMSEC de 0,03 UI/mL e RMSEP de 0,04 UI/mL.

111

Figura 5.3. Grfico usado para a escolha no nmero de variveis Latentes

O resultado do clculo das figuras de mrito apresentado na Tabela 5.2. O modelo linear parece se ajustar bem aos dados. As Figuras 5.4, 5.5 e 5.6 mostram o grfico dos valores de referncia contra os valores estimados, o grfico do escalar NAS contra a concentrao e o grfico dos resduos respectivamente. Esses grficos demonstram o bom ajuste do modelo linear e a apresentao do modelo PLS na sua forma pseudo-univariada, assim como os erros com comportamentos aleatrios que tendem a confirmar o bom ajuste do modelo de calibrao PLS.

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Tabela 5.2. Resultados de figuras de mrito estimadas para o modelo PLS. Figuras de Mrito Exatido* RMSEC RMSEP Sensibilidade** Inverso da Sensibilidade Analtica* Razo Sinal-Rudo Mx. Min. Seletividade Inclinao Ajuste (Referncia x Estimado) Intercepto Coef. Corr. Inclinao Ajuste NAS Intercepto Coef. Corr. LD* LQ* 0,41 1,24 0,06 0,70 0,1 0,97 0,51 2,4 0,97 3,00 0,12 9,80x103 8,38x103 0,03 0,04

(*)Resultados em UI/mL de TSH em plasma sanguneo, (**)UI/mL de TSH -1

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Valores Previstos UI/mL

Valores de Referncia UI/mL

Figura 5.4. Valores de referncia contra previstos pelo modelo para determinao de TSH. () calibrao; () validao.

Os indicadores de exatido (RMSEC e RMSEP) mostram que os valores das concentraes de TSH estimados pelo modelo de calibrao, apresentam boa concordncia entre si e tambm com os valores obtidos pelo mtodo de referncia. Bons resultados foram encontrados para a sensibilidade e sensibilidade analtica dentro da faixa de concentrao estudada. O parmetro sensibilidade analtica bem simples e mais informativo para comparar e avaliar a sensibilidade do mtodo analtico de interesse, pois o inverso da sensibilidade (sensibilidade analtica) pode ser interpretado de forma mais clara, por sua relao direta com a concentrao. Com este parmetro possvel estabelecer o mnimo da diferena entre os valores de concentraes que podem ser medidas dentro da faixa de concentrao utilizada na construo do modelo de calibrao. Com base neste resultado, para TSH possvel distinguir diferenas entre as amostras com 114

diferena de concentrao da ordem de 0,12 UI/mL. No entanto, este valor uma estimativa otimista que considera o rudo espectral representando a maior fonte de erro e no leva em conta a falta de ajuste do modelo.

Valores de Referncia UI/mL

Sinal Analtico Lquido

Figura 5.5. Escalar NAS contra as concentraes de Referncia, () amostras de calibrao, (*) amostras de validao.

Os resultados de relao sinal/rudo apresentados na tabela 5.2, mostram o quanto o escalar NAS est acima do desvio padro da flutuao do sinal instrumental. Os resultados obtidos comprovam que o sinal est muito acima do rudo experimental, apesar de ser uma medida direta do espalhamento. Uma possvel explicao para esses resultados que a estimativa do rudo instrumental (x) no representa a totalidade do conjunto de dados. Segundo os resultados, a menor razo observada foi 8,38x103, que representa um limite mnimo aceitvel para determinaes quantitativas. Este resultado sugere que a estimativa LD e LQ apresentados na Tabela 52 podem ser valores otimistas.

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Os valores de seletividade que so mostrados na Tabela 5.2 representam a frao mdia do sinal do espectro da amostra que utilizado, por no ser ortogonal em relao propriedade de interesse. Logo, esses valores no se referem seletividade no seu significado fsico, que em geral empregado em Qumica Analtica. Eles indicam que apenas 6% do sinal utilizado durante o clculo do NAS. Os limites de deteco e quantificao encontrados sugerem que apenas concentraes acima de 1,24 UI/mL podem ser quantificadas, o que para as medidas efetuadas suficiente para indicar problemas com altas quantidades de TSH, uma vez que valores de referncia normais para TSH so de 0,50 a 3,50 UI/mL.

Erros Absolutos

Valores de Referncia UI/mL

Figura 5.6. Grfico de erros absolutos contra as concentraes de referncia.

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CONCLUSES

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Determinaes de pesticidas e TSH foram realizadas por modelos de calibrao multivariada baseados em espectroscopia Raman de baixa resoluo com amplificao do sinal por superfcie. Assim pode-se utilizar um equipamento que tem um custo mais acessvel para o desenvolvimento de uma metodologia que pode realizar a deteco de espcies em baixas concentraes. O problema inerente desses equipamentos que a baixa resoluo espectral pode ser contornado com a utilizao de mtodos quimiomtricos de calibrao multivariada. Colides de ouro foram empregados para a obteno dos espectros SERS, sendo que no foi possvel realizar determinaes quantitativas com prata coloidal ou por sol-gel. Os modelos foram construdos e validados usando amostras

representativas cujos resultados foram bastante aceitveis. Os erros de previso foram baixos levando em considerao a tcnica e a faixa das concentraes utilizadas na construo dos modelos de calibrao multivariada. Os modelos mostraram alta capacidade no parmetro sensibilidade podendo assim diferenciar amostras com baixa diferena de concentrao. Os resultados referentes exatido (RMSEC e RMSEP) e outras figuras de mrito, indicam que os modelos desenvolvidos para se determinar pesticidas e tambm TSH atravs da espectroscopia Raman amplificada por superfcie, podem ser usados como mtodos alternativos para monitoramento ambiental e tambm como mtodo alternativo para exames de rotinas laboratoriais. O procedimento desenvolvido para a determinao de traos de pesticidas extremamente atraente dada a simplicidade experimental dos mtodos envolvidos, a possibilidade de determinaes simultneas de pesticidas de um modo extremamente rpido, alm de ter a vantagem de fazer anlises in situ, vantagem que a tcnica cromatogrfica ainda no possui. Para a determinao de TSH o procedimento SERS tambm extremamente atraente dada simplicidade experimental dos mtodos envolvidos, os baixos limites de deteco possveis de serem alcanados, a rapidez do

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mtodo para se obter o resultado e principalmente a iseno de reagentes radioativos e no-radioatios para determinao de TSH. Contudo se desejarmos utilizar, com bastante eficincia, a espectroscopia Raman Amplificada por Superfcie (SERS) para determinao de pesticidas e TSH, devemos inevitavelmente utilizar tcnicas de pr-processamentos para tratar os espectros, caso contrrio, os erros de calibrao e previso sero elevados.

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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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