Fitoqumica para Biologa 2009-II I.

- Fitoqumica- Introduccin Fitoqumica Es la ciencia que estudia el aislamiento, estructura, qumica, metabolismo, distribucin natural y funcin biolgica de las sustancias orgnicas que elaboran y acumulan las plantas. Farmacognosia conocimiento de las drogas. Estudia la ocurrencia y aislamiento de sustancias vegetales o animales que pueden utilizarse como medicamentos. Etnofarmacognosia La farmacognosia de cada cultura o cada pueblo.En Per existen varios centros geogrficos con medicina tradicional propia,por ejemplo la medicina tradicional del sur andino del Per, la del Per septentrional ( sierra norte) , la del nororiente peruano. Por consiguiente existen varias etnofarmacognosias.

Figura 1.- Este hombre de Desaguadero (3843 msnm)-Puno est comercializando plantas medicinales. En la mano tiene Chuquiraga jussieui (Asteraceae) Kiswara que se utiliza en afecciones renales y prostticas.

Taxonoma vegetal Ciencia que delimita, describe y nombra cualquier grupo de plantas que considera representa una unidad distinta. Una unidad taxonmica: taxn Los rangos o categoras que deben siempre utilizarse para construir la clasificacin jerrquica de las plantas es:

Rango Reino Divisin Subdivisin Clase Familia Gnero Especie

Ejemplo Vegetal Espermatofita (plantas con semilla) Angiosperma (semilla encapsulada) Rosales Rosaceae Margyricarpus Margyricarpus pinnatus (Lam.)Kuntze

La posicin de los productos secundarios en el metabolismo Metabolismo: conjunto altamente integrado de reacciones qumicas en los organismos vivos. Catabolismo: degradacin de molculas grandes en pequeas, generalmente para obtener energa. Anabolismo: construccin de macrobiomolculas (biosntesis).

Metabolismo primario Estudia el agua, aminocidos, azcares,lpidos, polisacridos, protenas, enzimas , cidos nucleicos. Son estructuras y reacciones comunes a todos los organismos. Los estudia la bioqumica. Metabolismo secundario Estudia estructuras y reacciones que frecuentemente difieren de especie a especie y que pueden considerarse como una expresin de la individualidad qumica del organismo. Los principales metabolitos secundarios son: Sustancias fenlicas

Terpenos Alcaloides Tambin los animales ejercen metabolismo secundario, por ejemplo: Toxinas Ferohormonas

Figura 2.- Los insectos tienen un lenguaje que se basa en la emisin y deteccin de sustancias qumicas (ferohormonas).Coleptero verde sobre Z innia peruviana (Asteraceae), en Huayllabamba-Cusco.

Motivos para estudiar qumicamente las plantas 1.- Por su utilidad prctica:

Tropaoelum majus mastuerzo, por su contenido de glucosinolatos/isotiocianatos sirve como insecticida, antibiotico, antiviral, antitumoral:
S Glc N O SO 3
-

mirosinasa

NCS

glucosinolato

isotiocianato

Figura 3.- El mastuerzo texao es oriundo del Per, antiguamente sus flores y hojas se utilizaban para ensaladas. Se sabe contiene vitamina C cunto? : no esmuy dificil averiguralo

2.- Para conocer el curso de la evolucin: las especies no evolucionan en aislamiento los dinosaurios se extinguieron porque no pudieron detectar el sabor de los alcaloides txicos presentes en las primeras plantas con flores 4

Evolucin de los compuestos fenlicos:

Edad (millones de aos) 500 400 370 120

Taxn Algas verdes psilophyta helechos angiospermas

Tipo de fenoles cidos cinnmicos,chalconas,flavanonas,flavonas Hidroxiflavonas, alcoholes cinnamlicos, ligninas Flavonoles, catequinas (proantocianidinas) Antocianidinas, auronas, isoflavonas

3.- Interacciones planta animal: Las sesquiterpenlactonas como la parthenina y la tenulina que se obtienen de ciertas asterceas tienen fuerte actividad antinutritivas sobre insectos en concentraciones muy menores a las que existen en el tejido vegetal.
H3C HO CH2 OH CH3 H3C O O

CH3 O

O O

CH3

parthenina
4.- Taxonoma vegetal:

tenulina

En las asterceas , la subtribu Barnadesiinae de la tribu Mutisieae no presentan 5metilcoumarinas, mientras que las otras tribus de Mutisieae si las tienen, por consiguiente se excluye a Barnadesiinae de la tribu Mutisieae: Antes la tribu Mutisieae tena las siguientes subtribus: Barnadesiinae Gochnatiinae Mutisiinae Nassauviinae

Ahora, Barnadesiinae a pasado a ser la tribu Barnadesieae.

Figura 4.- El llaulli-Barnadesia horrida(Asteraceae). Tiene su cancin:

El amor es una planta llaullillay Que crece dentro del pecho llaullillay Luego,luego se marchita llaullillay Bajo la sombra de un mal pago llaullillay

Biosntesis de metabolitos secundarios

Figura 5.- Este es un esquema biosinttico para el cido rosmarnico , el cido cafeoilshikimico y el cido clorognico, que son compuestos fenlicos antioxidantes presentes en muchas familias de plantas. El cido rosmarnico es particularmente notable en la tribu Mentheae, subfamilia Nepetoideae de la familia Lamiaceae. (Phytochemistry 70,1663(2009)).

Para qu le sirven a la planta los metabolitos secundarios? Como adaptacin a los factores ambientales: 1) Factores climticos: temperatura, intensidad luminosa, duracin del da, la humedad. 2) Factores edficos: naturaleza del suelo, pueden existir metales pesados txicos o existir deficiencia de nutrientes. 3) Contaminantes artificiales. Gases industriales, pesticidas. 4) Animales: contra herbvoros o simbiosis con insectos polinizantes. 5) Competencia con otras plantas. Veamos algunos ejemplos: Adaptacin a las heladas(<0C), los insectos sintetizan glicerina (anlogo al etilenglicol en los radiadores de auto). Para este efecto las plantas sintetizan alcoholes polihidroxilados como el sorbitol y el manitol. Adaptacin a la sequa, las plantas que crecen en sitios de baja pluviosidad (desiertos, altiplanos), a menudo resisten la sequa, se llaman xerofitas.Los cactus generan cutculas cereas y espinas en vez de hojas para minimizar la prdida de agua por transpiracin. Como ejemplo de una sustancia que hace que la planta conserve agua cerrando los estomas (orificios en las epidermis de hojas y tallos), tenemos al cido abcsico:
H3C CH3 CH3 O

OH OH O

Adaptacin al selenio, el selenio es altamente txico para todos los organismos vivos. Sin embargo, hay plantas que se adaptan al selenio que si son comidas por animales, estos mueren.Una de estas plantas es Astragalus garbancillo (Fabaceae) Juska: asimilan incluso 5000 ppm de Se . El trebol con 5 ppm y los animales con 1ppm de Se muestran y signos de toxicidad.Cmo es entonces que esta planta ha sido capaz de absorver tanto Se sin perjudicarse?

La respuesta es por sntesis de aminocidos seleniados:

OH O O NH2 SH OH S NH2 CH3

cistena
OH

metionina
NH2 O SeH CH3 Se OH

O NH2

selenio-cistena

selenio-metionina

Estos aminocidos no hacen protenas y pasan a las vacuolas

Figura 5.- Astragalus garbancillo (Fabaceae). Planta muy txica para el ganado por su alto contenido de selenio.

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Para detoxificacin: Los fenoles son altamente txicos para plantas y microorganismos, de manera que se glucosilan y as van a las vacuolas o se metabolizan hasta CO2.
OH OGlc OGlcOGlc OGlcOGlcOGlc

OH

OH

OH

OH

hidroquinona
Como proteccin contra herbvoros: La defensa de la planta se basa en factores tanto fsicos como qumicos. Factores fsicos: espinas por ejemplo. Factores qumicos: existen 1180 plantas txicas para insectos (un solo autor). Entre las sustancias responsables de este efecto, tenemos: Aminocidos no proteicos. Glicsidos cianogenticos. Alcaloides (senecionina por ejemplo). Pptidos (amanitina). Protenas (fitohemaglutinina para escarabajos, mariposas). los herbvoros han fracasado en su ataque sobre las plantas, pues aun dominan el paisaje.

Competencia entre plantas: Las plantas superiores compiten entre s por agua, luz y nutrientes del ecosistema.En el curso de esta lucha han desarrollado varios medios de defensa contra sus vecinos, si esta es de naturaleza qumica, se llama alelopata. Alelopata: interacciones bioqumicas entre todo tipo de plantas (beneficiosas y perjudiciales): por ejemplo, las raices del nogal (Juglans regia) ejercen la siguiente reaccin qumica:

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OH

OH

hidrlisis, oxidacin

OH

OH

OH

OH

juglona, txico

De esta manera,no pueden crecer tomates hasta una distancia de 16 metros alrededor del rbol. Mtodos de separacin y purificacin de metabolitos secundarios La purificacin de metabolitos secundarios a partir de las plantas es de por s todo un arteciencia.Es el primer paso para estudiar a estas sustancias. Extraccin Los metabolitos secundarios se pueden extraer con disolventes de diferente polaridad : Hexano Benceno Eter etlico Cloroformo Acetato de etilo Acetona Etanol Metanol Agua polaridad creciente

La extraccin de un vegetal molido con un disolvente lquido se denomina lixiviacin o extraccin (l)-(l). De esta manera los solutos de una matriz orgnica slida (la planta) son transferidos hacia el disolvente. Como lo semejante disuelve lo semejante, de acuerdo al solvente que se emplee, se extraer un determinado tipo de sustancias en funcin a su polaridad.

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En la prctica esto se logra macerando la planta con disolvente fro o con disolvente caliente. Si el tejido vegetal es duro, como raices o cortezas puede decoccionarse (hervir) la planta en un determinado solvente. Es prctica comn extraer la planta secuencialmente con solventes de polaridad creciente, por ejemplo, primero con hexano o ter de petrleo, luego con cloroformo y finalmente con metanol. Purificacin de extractos Reparto (l)-(l) Cromatografa Cristalizacin-recristalizacin Reparto (l)-(l) El reparto (l)-(l) o extraccin (l)-(l) se puede definir como la transferencia de una sustancia X de una fase lquida A, a otra fase lquida inmiscible B. Para una temperatura dada, est dada por la ecuacin de Nerst:

KT = CaguaX/CsolventeX

Donde C significa concentracin. En el laboratorio se realiza esta operacin utilizando una pera de decantacin:

La operacin implica dispersar ambos lquidos inmiscibles para que suceda la transferencia de X. Esperar a que las fases se separen (coalescencia) por gravedad, y con la ayuda de la llave de paso, transferir el extracto, de la solucin extraida. Generalmente la operacin se repite varias veces sobre una misma solucin. Sistemas lquidos inmiscibles usuales: 13

Agua-ter de petrleo o hexano Agua-ter etlico Agua-cloroformo Agua-acetato de etilo Agua-n-butanol

Solubilidad mutua: Un litro de ter etlico disuelve 30 ml de agua Un litro de agua disuelve 100 ml de ter etlico

Casi todos los pares inmiscibles presentan el fenmeno de solubilidad mutua.

Desecacin de la fase orgnica: como el extracto orgnico est saturado de agua, antes de concentar el extracto por destilacin, hay que privarle del agua solubilizada, esto se logra empleando un desecante inerte como el sulfato de sodio o el sulfato de magnesio.

Ejercicios:

1.-La solubilidad de un alcaloide a 25C es de 0-16 g /100 mL de agua y 26.3 g 7100mL de dietil ter. Calcular el alcaloide extraido de un litro de solucin acuosa que contena 1.6 g de alcaloide al agitarla, a) una vez con 20 ml de ter b) dos veces con 10 mL de eter ,nuevos cada vez.

Solucin: Entonces KT = Cagua/Cter = 0.16/100/26.3/100= 6.08 x 10-3 Luego: 14

a) 6.08 x 10-3 = 1.6-x/1000/x720, despejando X=1.23 g de alcaloide extrados.

b) 6.08 x 10-3 = 1.6-x/1000/x/10, despejando x=0.995 g extrados en la primera extraccin.

En la segunda extraccin: 6.08 x 10-3 = 0.605-y/y/10, despejando Y = 0.38 g extrados en la segunda extraccin. Luego, las dos extracciones han extrado 1.38 g de alcaloide. Por consiguiente es mejor extraer con varias porciones de volmenes pequeos que una sola extraccin con un volumen grande.

2.-El coeficiente de distribucin a 25C del cido lctico entre agua y cloroformo, CCHCl3/Cagua, expresado en mol/L , tiene por valor 0.0203. Cunto cido lctico ser extrado, al agitar con 100 mL de agua otros 100 mL de una disolucin 0.8 M de dicho cido en cloroformo?

KT = , CCHCl3/Cagua, = 0.0203; KT = 0.08-x/100/x/100 = 0.0203, despejando x= 0.072 moles

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Cromatografa

La cromatografa es un mtodo para resolver mezclas de solutos que estn disueltos en un solvente comn por distribucin entre dos fases: la fase estacionaria (sorbente) y la fase movil.

Equipo bsico para cromatografa en columna:

Figura 6.- En la cromatografa de columna clsica el tamao de las partculas de gel de slice es de 200-700m,el solvente eluye la columna simplemente por gravedad, mientras que en la cromatografa flash es de 40-63 m y por eso se requiere aplicar presin de aire ,para eluir,usar una bomba de aceite o puede incluso ser una bombita de acuario.

Eluir: Obligar el paso de un lquido atravs de la columna cromatogrfica, producindose la separacin de los solutos que saldrn por el fondo de la columna.

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Figura 7.- En la cromatografa lquida por vaco el tamao de las partculas de gel de slice es de 40 m. La elucin se provoca ejerciendo vaco.

En la columna clsica, la longitud de la columna es 10 a 20 veces el dimtero de la columna. Cumplir con: 1.- Llenado uniforme de la columna . 2.- Aplicacin de la muestra. 3.- Se eluye con porciones de eluyente de polaridad creciente,luego como cada soluto de la mezcla tiene una particular tendencia a irse con el solvente / tendencia a retenerse el sorbente; se separan y salen por el fondo recogindose en los matraces.

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Formato de trabajo: Muestra: extracto de acetato de etilo de Eclipta prostrata Sorbente : 30 g de SiGel de 0.2 a 0.7 mm de dimetro de partcula Dimensiones de la columna: 1.5 x 17 cm Lquido adsorbido : CHCl3 N fraccin 1 2 3 4 5 Eluyente CHCl3:Me2CO (mL) 10 0 9 1 8 2 7 3 6 4 Volumen (mL) 10 10 10 10 10 Peso matraz (g) 9.000 9.000 9.000 9.000 9.000 Peso matraz+residuo 9.031 9.095 9.131 9.222 9.123 Peso residuo (mg) 31 95 131 222 123

Anlisis de las fracciones de cromatografa de columna por cromatografa en capa delgada

Figura 8.- En una cromatoplaca de SiGelG se aplica la muestra (la fraccin) ha analizar y se desarrolla con el eluyente , el nmero de zonas observadas nos dice sobre la pureza o complejidad del material analizado. 18

Principales tipos de metabolitos secundarios

Tipo

N estructuras (1980)

Distribucin

Actividad fisiolgica

Compuestos nitrogenados: Alcaloides Aminas Aminocidos no proteicos Glicsidos cianogenticos glucosinolatos 5500 100 400 30 75 Amplia en Angiospermas Amplia en Angiospermas Semillas de leguminosas espordicos Crucferas y otras 10 familias Txicos y amargos Repelentes Txicos Venenosos agrios

Terpenoides: Monoterpenos sesquiterpenlactonas diterpenos saponinas limonoides cucurbitacinas Cardenlidos 1000 600 1000 500 100 50 150 Amplia En Asterceas Amplia en latex y resinas Ms de 70 familias Rutceas,meliceas y simarubceas Cucurbitceas Asclepidceas, apocinceas y escrofuraliaceas universales Olor agradable Txicos y amargos Algunos txicos Hemolizan las clulas de la sangre Amargos Txicos y amargos Txicos

carotenoides

350

color

Fenoles: Simples flavonoides quinonas 200 1000 500 universales universales Amplia en Rhmnaceae Antimicrobianos Color color

Otros: poliacetilenos 650 Amplia en asterceas y umbelferas Txicos.

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Figura 9.- El 2003 Michael Wink muestra el nmero de estructuras conocidas, fijarse por ejemplo, que en 1980 se reportan 5500 alcaloides mientras que para el 2003 ya se conocen 12000!. (Phytochemistry 64, 3-19(2003)).

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