You are on page 1of 45

ADN Recombinante

ADN recombinante
Definicin Clonacin Vectores Biblioteca genmica y complementaria Identificacin y secuenciacin de AND clonado Marcadores PCR Aplicacin de la tcnica ADN recombinante

ADN
Definicin:

ACIDOS NUCLEICOS
Polmeros lineales de un monmero llamado NUCLETIDO

Nuclesido
Acido fosfrico Base nitrogenada
Purina ADENINA y GUANINA Pirimidinas CITOSINA TIMINA(ADN) URACILO(ARN)

Pentosa
D-ribosa 2-desoxi-D-ribosa

ARN ADN

GENOMA VEGETAL

ADN GEN GENOMA


Nuclear
Cromosomas Mayor parte de la informacin gentica

Molcula que contiene la informacin gentica Unidad funcional del ADN ADN total de un organismo

Mitocondrial
Circular Regiones no codificantes

Cloroplstico
Circular (120-160 kPB)
Codifica 120-140 genes

Bases moleculares de la vida


GENOTIPO
Transcripcin Traduccin

ADN

ARNm

Protenas

FENOTIPO

ADN recombinante
Definicin: cualquier molcula de ADN formada de la unin de fragmentos de ADN de fuentes diferentes. Generalmente se cortan las molculas de ADN con enzimas de restriccin y se unen con ADN ligasa

Enzimas de restriccin
Cualquier enzima que reconoce y corta una secuencia especfica corta, sitio de restriccin, en una molcula de ADN de doble cadena
EcoRI 5' 3'

G A A T T C C T T A A G

3' 5'

5' 3'

G C T T A A

A A T T C G

3' 5'

Enzima ADN Ligasa


Enzima que cataliza la formacin de enlaces fosfodiester en direccin 3'5' entre el extremo 3'-hidroxil de una cadena simple de cido nucleico con el extremo 5'-fosfato de otra cadena simple, para formar una secuencia continua
OH
5'

A A T T C ATP

3'

ADN Ligasa AMP + PPi


5'

A A T T C

3'

Clonacin
Clon: una poblacin de clulas idnticas o de molculas de ADN descendientes de un mismo progenitor Pasos: Insercin de un fragmento de ADN dentro de la molcula de ADN del vector (Enzimas) Introduccin de la molcula recombinante dentro de una clula husped para su replicacin (choque de calor o electroporacin) Seleccin de clulas transformadas (medio + antibitico)

VECTORES
Plsmidos: molculas circulares de ADN extracromosmico con auto replicacin (Origen de replicacin, gen de resistencia a antibiticos, regin de insercin de ADN forneo) (20kb) Fagos: virus que infecta bacteria, se replica como virus ltico (25 kb) Cosmidos: insercin de secuencia COS del fago dentro de plsmidos de Escherichia coli. (45 kb) BAC:(Cromosoma artificial de bacteria) (300kb) YAC: (Cromosoma artificial de levadura) (1000 kb)

Biblioteca genmica
Conjunto de molculas de ADN clonadas que contienen fragmentos de todo el ADN genmico

Biblioteca c-ADN
Conjunto de clones provenientes de m-ARN producidos por un tipo de clulas, el nmero de clones debe ser suficientemente grande para incluir la secuencia de cada uno de los m-ARN expresados en ese tejido Transcriptasa reversa: m-ARNc-ADNADN-cdclonacin Columnas de oligos d-T (eucariotes)

Identificacin y secuenciacin de ADN clonado


'

Identificacin del ADN clonado


Hibridizacin ADN-ADN (Southern blot) ADN-ARN (Northern blot)
'

Expresin de la protena codificada Actividad bioqumica Anticuerpos especficos (Western blot)

Identificacin del ADN clonado


Hibridizacin
ADN o ARN

Enzimas de restriccin

Sonda marcada
Solucin alcalina

+ Electroforesis gel

Transferencia

Membrana

Autoradiograma

Identificacin del ADN clonado


Hibridizacin
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

'

1, 9: Muestra 57-v (control positivo 1:10) 2, 10: H2O (control negativo) 3, 11: Muestra 103-v (Lara) 4, 12: Muestra 117-v (Zulia) 5, 13: Muestra 261-v (Aragua) 6, 14: Muestra 297-v (Gurico) 7, 15: Muestra 307-v (Gurico) 8: Marcador molecular 100 pb

Identificacin del ADN clonado


Hibridizacin

'

Identificacin del ADN clonado


Hibridizacin ADN-ADN (Southern blot) ADN-ARN (Northern blot)
'

Expresin de la protena codificada Actividad bioquimica Anticuerpos especificos (Western blot)

Secuenciacin del ADN clonado


Secuenciacin (Fred Sanger)
Sntesis de ADN (cs) usando didesoxinucleotidos (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), dNTPs, ADN polimerasa I y un cebador marcado. Una reaccin/ddNTP Gel secuencia

3-OH en cadena normal de ADN permite la extensin

Desoxiribosa

Una cadena de ADN que termine en un didesoxinucleotido no puede extenderse porque se requiere un 3-OH para la polimerizacion Didesoxiribosa

Secuenciacin del ADN clonado


Secuenciacin (Fred Sanger)
Sntesis de ADN (cs) usando didesoxinucleotidos (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), dNTPs, ADN polimerasa I y un cebador marcado. Una reaccin/ddNTP Gel secuencia

Secuenciacin del ADN clonado


Secuenciador automtico Deteccin con fluorescencia

Secuenciacin del ADN clonado


Deteccin con fluorescencia

Marcadores
Morfolgicos Citolgicos Bioqumicos

Moleculares

PCR
Reaccin en cadena de la polimerasa (Polymerase chain reaccion)
Pasos: Desnaturalizacin Hibridizacin de ADN complementario Extensin

PCR

Reactivos: Cebadores o Primers Taq polimerasa (Thermus aquaticus) Cl2Mg Desoxirribonucleotidos ADN patrn (Template)

Aplicaciones de la tcnica del ADN recombinante


Diagnstico Anlisis de mutaciones Sntesis de genes Expresin de genes de eucariticos en bacteria Organismos transgnicos

Generacin de plantas transgnicas

La estrategia transgnica es ms selectiva No existen barreras reproductivas

Posibilidades de la transformacin gentica

Transferencia de genes (caracteres) entre organismos no relacionados genticamente Introducir nuevos caracteres de herencia simple
Introducir copias adicionales de un gen existente
Diferentes niveles de expresin En distintos tejidos u rganos Patrones de regulacin diferentes

Suprimir la expresin de un gen

CULTIVOS TRANSGNICOS
PRESENTE
Resistentes a herbicidas Resistentes a insectos

Soya Maz Cnola

Algodn Papa Maz

Otros

Plantas tolerantes a herbicidas Soya Roundup Ready (RRS)

Ingrediente activo glifosato.


Soya infectada por malezas

Soya transgnica

Cultivos Bt resistentes a insectos


Barrenador europeo del maz
Gusano del copo del algodn

Plagas controladas por el maz y algodn Bt


Contiene una protena especfica de Bacillus thuringiensis

Manipulacin gentica de la maduracin del fruto


Tomate FlavrSavr (Calgene), Zeneca..

Plantas transgnicas de tomate

Demostr el potencial de la biotecnologa para manipular caractersticas especficas de los cultivos.

Manipulacin del contenido nutricional Tolerancia a la sal Resistencia a enfermedades


Tomate transformado con un gen que confiere resistencia al virus del mosaico del tabaco
Produce plantas ms resistentes y productivas

CULTIVOS TRANSGNICOS
FUTURO

Mejora en propiedades nutricionales


Maz, soja, cnola, etc

Mejora desde el punto de vista industrial


Aceites, almidn

Mejora produccin Mayor tolerancia a estreses

Plantas para produccin de vacunas, etc

Principales cultivos
Maz Patata Papa Soya Tomate Algodn Colza Tabaco Meln Remolacha Trigo Arroz Otros

10

15

20

25

30

35

40

45

Porcentaje sobre el total

Caractersticas agronmicas
Tolerancia a herbicidas Resistencia a insectos Calidad de productos Resistencia a virus Resistencia a hongos Propiedades agronmicas Otras Genes marcadores Resistencia a bacterias

10

15

20

25

30

Porcentaje sobre el total

Controversia sobre cultivos transgnicos

Propaganda de compaas Propaganda de grupos en contra Opinin de los cientficos

You might also like