Outros testes de sensibilidade a antifngicos

Dra. Mrcia Melhem

Seo de Micologia Instituto Adolfo Lutz

Mtodos para avaliar a resistncia a antifngicos Quando avaliar a resistncia a antifngicos Isolamento de um fungo Como realizar os testes Testes Problemas ainda existentes no mtodo de referncia... Fenmeno trailing ou arraste observado para azis e 5-fc Interpretao dos resultados de MIC (g/mL) Sensititre YeastOne Resultado SDD Comparao de mtodos Indicaes do teste de sensibilidade Espcies Critrios clnicos para indicao do teste de sensibilidade Consideraes finais

ndice

Mtodos para avaliar a resistncia a antifngicos

Difuso a partir de discos

Difuso a partir de fitas

Diluio em agar Diluio em meio lquido em tubos = macrodiluio em placas = microdiluio

Quando avaliar a resistncia a antifngicos?

Infeco ou colonizao? Critrios microbiolgicos e clnicos para indicao do teste de sensibilidade a antifngicos

Isolamento de um fungo

Levedura

Fungo Filamentoso (bolor)

Microbiota humana transiente ou permanente

MEIO AMBIENTE

MICROBIOTA

(pele, mucosas, TR, TGI, TU)

+ MEIO AMBIENTE

Microbiota transiente (pele, mucosas, TR) + MEIO AMBIENTE

AGENTE ETIOLGICO

Como realizar os testes?

Colnia pura

Plaqueamento

Cultura mista uma causa comum de erro!

Manuteno Freezer a -20 80c

Como realizar os testes? 1.Inculo

Suspenso de clulas do fungo

INCULO

Soluopadro= 106 ufc/mL

Comparao para ajuste de turbidez: espectrofotmetro ou visual

Como realizar os testes? 2. Condies

INCULO

ANTIFNGICO (s)

= Sensibilidade

CONDIES PARA O TESTE: temperatura, tempo e meio de cultura

Meio Slido (agar)

Meio Lquido (caldo)

Mtodo de Difuso por Discos

... tcnicas em agar

Vantagens Parmetros definidos para Candida e FZ (M44P) Fcil de realizar Similaridade com antibiograma Desvantagens Falta padronizao para outras drogas Resultado somente em 3 categorias que no indicam pequenas alteraes ou tendncia para No fornece a concentrao inibitria mnima (MIC), apenas correlaciona MIC com dimetro do halo

Mtodo de difuso por fitas

... tcnicas em agar

Vantagens: Resultado em CIM = MIC Facilidade de execuo Disponvel no comrcio

Desvantagens: Produto importado (custo) Trailling Leitura subjetiva Inculo varivel

Tcnicas em agar

Diluio em gar Diversas placas, cada uma contendo agar com diferentes concentraes de um AFG Inculo na superfcie (fungos de crescimento lento, dermatfitos, agentes de cromomicose) Observa-se a inibio do fungo na CIM (Vantagem sobre tcnica de disco) fungo 64 32 16 8 4
(g/mL)

0,5

Placa com agar e afg

Variante do teste em placa: Teste Rpido para leveduras frente a FZ

Agar com FZ (8g/mL) Colnias pequenas: sensveis Colnias grandes: resistentes

Mas, requer ainda melhor avaliao com cepas R

Testes em meio lquido

Em tubos = macrodiluio ou macromtodo Em placas de microtitulao = microdiluio ou micromtodo Mtodo de Referncia para leveduras (Candida spp e Cryptococcus neoformans) Doc. M27-A, 2002- NCCLS

Mtodo de Referncia para Fungos Filamentosos (Aspergillus, Fusarium, Rhizopus e Scedosporium) Doc. M38-P, 2002- NCCLS

Macromtodo

Srie de 10 tubos com vrias concentraes do antifngico + inculo do fungo

Aps 24 a 72 h observa-se os tubos em que houve inibio de crescimento

Entre esses tubos, o que contm a menor concentrao corresponde ao MIC

Micromtodo em placa

CONCENTRAES DECRESCENTES DO ANTIFNGICO

INCULOS

Controle de esterilidad e do meio

Inculos cepas ATCC Controle de crescimento dos inculos

MIC

Micromtodo em placa

Automatizao = resultados acurados Meio RPMI + 2% glicose em tampo MOPS = inerte Placas de microtitulao, 96 orifcios= economia de reagentes Placas contendo [FZ] de 0,12 at 64g/mL; [IZ] e[ AB] de 0,015 a 8g/mL= armazenadas e congeladas, prontas para uso Leitura da inibio: visual ou espectrofotomtrica com valor da d.o.impressa em fita = rastreabilidade de resultados Determinao do MIC: Para azis = desprezar crescimento residual devido ao trailing MIC concentrao que inibe 50% do crescimento, em relao ao controle positivo (coluna 12) Para AMB: concentrao que inibe 100% do crescimento

Micromtodo em placa

Vantagens: acurcia (procedimento e leitura)

Problemas ainda existentes no mtodo de referncia...

Fenmeno trailing ou arraste observado para azis e 5-fc

AB
100%

16 g/ml 8

0.5

0.25

0,12

0,06

C+

de inibio (NCCLS) 90%

CIM

(EUCAST)

Azis 80%

64 g/ml 32

16

0,5

0,25

C+

Inibio

(MACRO)
50% de inibio (MICRO)

CIM

E ainda...

Mtodo tem baixa sensibilidade p/ identificar cepas resistentes anfotericina B - AMB. No vivel para laboratrio de anlises clnicas (complexidade e custo). Algumas espcies de leveduras no crescem bem nas condies de incubao (T , t, meio de cultura?) Outros mtodos denominados NCCLS-like : Europa: comit da ESCMID = EUCAST (modificaes na microdiluio: adio de glicose ao meio de cultura, suspenso mais concentrada do fungo, leitura antecipada, agitao das placas, etc...).

Interpretao dos resultados de MIC (g/mL)

S
Afg

SDD

FZ IZ
AMB S = sensvel;

<8 < 0,25

<2 R = resistente;

16 - 32 0,25-0,5
-

> 64
NCCLS 2002

>1
>2

SDD = sensibilidade dependente da dose: 100 mg/dia= 6-7 ug/mL de soro FZ 400 mg/dia= 20 ug/mL de soro 800 mg/mL=50-60 ug/mL de soro

Sensititre YeastOne

Indicador Alamar Blue (oxidao-reduo) 2 cepas/placa x IZ, FZ, 5FC Pelcula selante. Incubao 35C/24h 48h

Crescimento: negativo inibio parcial ( trailing) positivo

Resultado SDD

Concentraes sricas de FCZ

Dose diria de FZ (mg/dia) 100 400 800

Concentrao sangunea (g/mL) 6 20-30 40-60

Comparao de mtodos
[Ramani & ChatuRverdi JCM 2003;41]

17 laboratrios de Nova York, USA

5 cepas ATCC Correlao boa:

AMB = 85 % FZ = 74 %

E-test (3/17)

Microdiluio (14/17)

Maiores erros: Apenas 1/17 indicou C.krusei FZ Nenhum indicou C.lusitaniae AMB

Comparao de mtodos

235 cepas de Candida glabrata

E-test com azul de metileno
Difuso por discos FZ = 91-96% Microdiluio VZ = 93-95%
Pfaller et al., 2003

726 cepas de Candida sp

E-test Microdiluio

Caspofungina = alta correlao, exceo C.lusitaniae

Pfaller et al., 2002

Comparao de mtodos

102 cepas Candida spp e Saccharomyces cerevisiae

E-test

Microdiluio

Correlao E test x NCCLS VZ = 100% Correlao E test x NCCLS Caspofungina = 89%

Chryssanthou, E & Cuenca-Estrella JCM 2002;40

Indicaes do teste de sensibilidade

Critrio microbiolgico: depende da identificao da espcie

Aps a identificao da espcie....

1.

Espcie reconhecidamente, resistente aos azis ou anfotericina B Espcie sensvel

2.

Espcies: 3 tipos

INTRNSECA: todos os membros so Ex.: fungos filamentosos e levedura Candida krusei frente ao fluconazol (FZ)
H indicao do teste de sensibilidade ao FZ ? no E para outros azis? sim

Espcies

NATURAL: alguns membros so Ex.: Candida glabrata ao FZ C.lusitaniae, Aspergillus, Rhizopus anfot.B (AMB)

H indicao do teste de sensibilidade ? sim

Espcies

ADQUIRIDA: aps exposio droga, alguns membros, ou todos, tornamse

Ex.: C.glabrata,C.albicans,C.parapsilosis, C.tropicalis e outras espcies a FZ, itraconazol e cetoconazol

H indicao do teste de sensibilidade ? sim

Candida glabrata

Desenvolve de modo muito rpido, poucas horas de exposio ao FZ.

No se recomenda tratar infeces caudadas por C.glabrata com FZ.

Espcies reconhecidamente, sensveis

Avaliao da sensibilidade in vitro no precisa ser feita de rotina, para a orientao teraputica. A identificao da espcie, em regra, suficiente para manter ou re-orientar tratamento.

Critrios clnicos para indicao do teste de sensibilidade

Paciente com histria de profilaxia com azl.

Caso de falha teraputica.

Caso com infeco por espcie com perfil de sensibilidade desconhecido ou pouco estudado.

Consideraes finais

1.

Testes em agar podem ser teis para triagem de cepas resistentes, desde que, realizadas dentro de um protocolo rgido, com cepas-padres e monitorados por um laboratrio de referncia (mtodo NCCLS ou NCCLS-like). Os mtodos de referncia no so aplicveis a todas as espcies de fungos. No existe um mtodo com boa sensibilidade para identificar cepas AMB .

2.

3.

4.

A aplicao clnica de testes de sensibilidade a antifngicos limitada.