Captulo 4

Control del crecimiento microbiano Medios de cultivo

Algunos conceptos bsicos...

Esterilizacin: eliminacin o muerte de microorganismos que contiene un objeto o sustancia. todos los

Bactericida: Agentes que destruyen y matan a las bacterias Bacteriosttico: Agentes que inhiben el crecimiento de las bacterias Desinfectante: agente que elimina la carga microbiana total en superficies inanimadas tales como mesadas de trabajo Antisptico: agente que controla y reduce la presencia de microorganismos potencialmente patgenos sobre piel y/o mucosas

Esterilizacin

Criterio de muerte para un microorganismo

Perdida irreversible de su capacidad de reproduccin

Cintica de Muerte de un Microorganismo

La muerte de microorganismos como consecuencia de un tratamiento a altas temperaturas sigue una cintica exponencial.

N ufc

dN dt

= - KN

tiempo

VALOR D : Tiempo de reduccin decimal

Se define el valor D como el tiempo necesario para que el nmero de supervivientes caiga al 10% del valor inicial (o, lo que es lo mismo, para que el logaritmo del nmero de supervivientes se reduzca en una unidad).

El tiempo (D) vara para cada temperatura (de ah el subndice t) de forma que a mayores temperaturas el valor de D es menor, es diferente para distintos 5 microorganismos, distintos entornos y diferentes condiciones fisiolgicas.

Efecto de la Temperatura

log n m.o. viables

100 10
70 C

50 C A que temperatura es menor el valor de D? 60 C

tiempo
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D es un parmetro de la sensibilidad de un Microorganismo determinado al efecto de la temperatura

log n MO viables

100 10

B C

Cul es el microorganismo ms sensible al tratamiento?

tiempo
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Efecto de la carga inicial (No)

8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 20 40 Tiempo (min) 60 80

log N sobrevivientes

Agentes Fsicos
CALOR

RADIACIONES

FILTRACIN
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Calor
Calor hmedo
Ambos pueden ser utilizados en procesos de esterilizacin

Calor seco

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Calor hmedo
PROCESOS

Esterilizacin: Vapor saturado a presiones mayores que la atmosfrica Tindalizacin (fraccionada por vapor) Pasteurizacin UHT
MECANISMOS DE ACCIN Desnaturalizacin de protenas Destruccin de cidos nucleicos

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Pasteurizacin
LHT (low temperature holding) 30 minutos a 62.8C HTST (high temperature short time) 15 segundos a 71.6C Solo destruye patgenos (Coxiella burnetti, Mycobacterium
Louis Pasteur

tuberculosis, etc.) y reduce flora de deterioro.

NO ES UN PROCESO DE ESTERILIZACIN Usos: leche, lcteos, jugos de fruta
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UHT (Ultra high temperature)

140C-150C durante pocos segundos

Proceso continuo Necesita envasado asptico Si es un proceso de esterilizacin

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Tindalizacin
100 C 30 min, 3 das sucesivos Proceso discontinuo con perodos de incubacin intercalados Usos: esterilizacin de productos de baja resistencia trmica, cuando no existe otra opcin

John Tyndall 14

Vapor saturado a presiones mayores que la atmosfrica

Condiciones: Vapor saturado a temperaturas mayores de 100C (PRECAUCIN: eliminacin total del aire) Equipo: Autoclave
Alcance: Se puede conseguir esterilizacin

Usos: Esterilizacin de materiales y productos termoestables (salvo productos oleosos y polvos). Descontaminacin de desechos biolgicos.
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Autoclave

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Autoclave
Condiciones : 121 C durante 15-20 minutos, con cargas iniciales bajas 121 C durante 30 minutos, con cargas iniciales altas Indicadores: Fsicos: Temperatura y/o presin Qumicos Indicador biolgico: Geobacillus stearotermophilus (D121C = 5 minutos) Tamao del inculo: 106 esporas

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Perfil de temperatura de un proceso de esterilizacin por calor hmedo

Temperatura C

120

110
100

3
Tiempo (min.)

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Etapa de calentamiento Etapa de Etapa de enfriamiento mantenimiento

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Calor Seco
Mecanismo de accin: Procesos de oxidacin Controles de proceso de esterilizacin Indicadores fsicos y qumicos Indicador biolgico esporas de Bacillus subtilis var. niger (D160C = 0.3 a 1.8 min, Z=20C, tamao del inculo: 105 esporas)

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Calor Seco
Aire caliente: Equipo: Hornos elctricos Alcance: Se consigue esterilizacin (170 C, 90 minutos o 160 C, 120 minutos) Usos: a) Esterilizacin de: Materiales resistentes al calor Sustancias no miscibles en agua (inyectables oleosos, siliconas, vaselina lquida) Polvos b) Despirogenizacin (250 C 45 minutos o 180 C 4 h, o 650 C 1 min)

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 Incineracin:
Destruccin de material contaminado

Flameado :
Desinfeccin

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Resistencia a calor
RESISTENCIA Priones Endosporas bacterianas Mycobacteria Virus sin envoltura lipdica Hongos Bacterias Virus con envoltura lipdica

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Esterilizacin por filtracin

La esterilizacin por filtracin se logra por el paso de un lquido o un gas a travs de un material capaz de retener los microorganismos presentes. La esterilizacin por filtracin se emplea para materiales sensibles al calor, tales como ciertos medios de cultivo, azcares, soluciones de antibiticos y otros medicamentos, etc.

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Esterilizacin por filtracin

Embudo

Filtro de membrana Plataforma de vidrio Base Tapn de goma

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Esterilizacin por filtracin

Medio no estril

Grampa de sujecin

Vaco

Medio estril
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FILTRACIN DE AIRE
Filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air) Remocin de hasta el 99.97% de partculas mayores de 0.3 micrones de dimetro Se usan en cabinas o habitaciones de flujo laminar CONTROL Retencin Mnima de un 99.97% de partculas generadas mediante ensayo DOP(di-octil-nftalato) en caliente con un dimetro de 0.3 micrones.

SE USAN PARA Lograr ambientes con nmero de partculas controlado: FLUJOS LAMINARES AREAS DE TRABAJO
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Cabinas de Flujo Laminar Vertical

Salida de aire

Entrada de aire

Protege la muestra, el operador y el medio ambiente

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Esterilizacin por radiaciones

Baja energa

Actividad antimicrobiana

Alta energa

Dos tipos: Radiaciones ionizantes Radiaciones no ionizantes

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Radiaciones Ionizantes
Caractersticas: Alta energa, baja longitud de onda Gran poder de penetracin Ionizan tomos y molculas No requieren altas temperaturas Tipos: Rayos gamma Rayos catdicos (electrones acelerados) Partculas beta
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Mecanismos de accin:
Formacin de radicales libres Dao al ADN, ARN

Resistencia:
Priones

Deinococcus radiodurans Enterococcus faecium

Esporas bacterianas Virus Hongos Bacterias (en gral)

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Desventajas: Equipo especial, personal entrenado No todos los materiales resisten el tratamiento Reacciones no deseadas en alimentos

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Radiaciones no Ionizantes
Caractersticas: Baja energa, sin poder ionizante Sin poder penetrante Mxima eficiencia biocida a 260nm Mecanismos de accin: Sitio blanco ADN Formacin de dmeros de timina Usos: Desinfeccin de superficies Desinfeccin de aire y agua

NO SE UTILIZAN PARA ESTERILIZAR SINO PARA:

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ESTERILIZACIN POR RADIACION UV

Luz ultravioleta
La radiacin ultravioleta producida artificialmente en el espectro de 250 nm ha sido utilizada por su actividad germicida esterilizante por ms de 30 aos. La accin de los rayos ultravioleta se debe a la produccin de ozono que logra la asepsia, ya que este gas conserva su accin inhibidora hasta una dilucin de 1 x 40.000. Los aminocidos aromticos de las protenas y las bases puricas y primidinicas, en particular la timina del DNA, son los principales compuesto blancos afectados por la accin bactericida de la accin ultravioleta. Evitando la replicacin de las tiras del DNA o causando recombinaciones que terminan en mutaciones mortales.

Dmeros de timina

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Procesos de esterilizacin
Agente Calor hmedo Condiciones 121C 15 min. (o equivalente) Usos Material termoestable Penetrable por vapor

Calor seco

160C 2 horas 180C 1 hora

Material termoestable No penetrable por vapor

Radiaciones ionizantes

25KGy 45KGy

Material termosensible Resistente al tratamiento

Filtracin

0.22 micras de poro

Material filtrable
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Control de Esterilizacin

Controles del proceso Indicadores: Fsicos Qumicos Biolgicos

Post-proceso: TEST DE ESTERILIDAD !!!

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Controles del proceso

Indicador fsico Ej: Temperatura, presin

Indicador qumico

Cambio de color

Indicador biolgico

Microorganismo resistente

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Agentes qumicos de esterilizacin y control del crecimiento

Antispticos Alcoholes Iodo rgano-Mercuriales

Colorantes
Desinfectantes y/o Esterilizantes Cloro y Compuestos clorados Aldehdos Oxido de Etileno Compuestos Fenlicos
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Alcoholes
Lesionan la membrana celular de los microorganismos y desnaturalizan protenas. Desorganizan la estructura fosfolipdica de la membrana. No destruyen esporas y tienen una accin germicida lenta. Los alcoholes de cadena corta tienen un efecto nocivo mayor que los de cadena larga. Se utilizan en concentraciones del 50 al 70%. Los ms utilizados son el etanol e isoproplico.

Iodo
Es un agente oxidante que modifica grupos funcionales de protenas y cidos nucleicos. Inactiva protenas y enzimas por oxidacin de los grupos -SH a S-S, pudiendo atacar tambin grupos amino, indoles, etc. Se utiliza como desinfectante de la piel (tintura de iodo: yodo molecular 2% y yoduro de sodio 2% en alcohol), aunque es irritante. Es efectivo contra esporas en una concentracin de 1600 ppm de iodo libre
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Perxido de Hidrgeno
Es un antisptico dbil, con capacidad oxidante y formadora de radicales libres. Actualmente, el perxido de hidrgeno gaseoso se est utilizando como desinfectante de superficies o decontaminante de gabinetes biolgicos debido a que no posee las propiedades txicas y cancerigenas del xido de etileno y formaldehdo.

rgano-Mercuriales
Estos tipos de compuestos se combinan con los grupos -SH de las protenas, inactivando enzimas. Dentro de los mercuriales orgnicos se encuentran el metafen y el mertiolate.

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Colorantes
Los derivados del trifenilmetano (violeta de genciana, verde de malaquita y verde brillante) bloquean la conversin del cido UDP-acetilmurmico en UDPacetilmuramil-pptido.

R = HSO4- Verde Brillante R = Cl- Verde de Malaquita

Violeta de Genciana
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Cloro y sus derivados

El cloro, los hipocloritos y las cloraminas son desinfectantes que actan sobre protenas y cidos nucleicos de los microorganismos. Oxidan grupos -SH, y atacan grupos aminos, indoles y al hidroxifenol de la tirosina.

El producto clorado ms utilizado en desinfeccin es el hipoclorito de sodio (agua lavandina), que es activo sobre todas las bacterias, incluyendo esporas, y adems es efectivo en un amplio rango de temperaturas.
La actividad bactericida del hipoclorito de sodio se debe al cido hipocloroso (HClO) y al Cl2 que se forman cuando el hipoclorito es diluido en agua.

El hipoclorito de sodio se comercializa en soluciones concentradas (50-100 g/l de Cloro activo) y Generalmente, se utilizan soluciones con una concentracin del 0.1-0.5% de Cloro activo. Su actividad est influida por la presencia de materia orgnica
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Aldehdos
Son agentes alquilantes que actan sobre protenas, lo que provoca modificacin irreversible de enzimas e inhibicin de la actividad enzimtica. Se utilizan como desinfectantes y esterilizantes. Destruyen esporas. El glutaraldehdo es el nico esterilizante efectivo en fro. El formaldehdo como gas se utiliza para descontaminar edificios, ambientes, etc. El formaldehdo gaseoso se obtiene por calentamiento del paraformaldehdo tiene la desventaja de ser muy irritante y perder actividad en ambientes refrigerados.

Glutaraldehido

Paraformaldehido

Formaldehido

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Oxido de Etileno
Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrgenos lbiles como los que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc. Es utilizado en la esterilizacin gaseosa, generalmente en la industria farmacutica. Sirve para esterilizar material termosensibles como el descartable y plstico, equipos electrnicos, bombas cardiorrespiratorias, etc. Es muy peligroso

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Compuestos Fenlicos
Son desinfectantes que provocan lesiones en la membrana citoplasmtica porque desordenan la disposicin de las protenas y fosfolpidos. El fenol no es usado a menudo como desinfectante por su olor desagradable, por ser muy irritante y por el resido que queda luego de tratar las superficies.

Los derivados del fenol ms utilizados son el hexaclorofeno (compuesto difenlico) y los cresoles (alquil fenoles). Estos son muy efectivos a bajas concentraciones contra formas vegetativas de bacterias. No son efectivos contra esporas.

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Medios de cultivo
Son sustancias nutritivas preparadas en el laboratorio para el crecimiento de microorganismos

Medios de cultivo Crecimiento

Nutrientes

agua fuente de energa fuentes de C, N, otros elementos micronutrientes, factores de crecimiento

temperatura

Condiciones de cultivo

pH
luz aireacin actividad de agua potencial redox

Los medios de cultivo por su aspecto fsico se dividen en:

Medios lquidos (caldos)

Medios slidos

Propiedades del agar

Son pocos los microbios que lo degradan Funde aproximadamente a la temperatura de ebullicin del agua Permanece en estado lquido hasta una temperatura aproximada de 40 C Se mantiene fluido en baos de agua a unos 50 C El agar solidificado se puede incubar hasta temperaturas cercanas a los 100 C (importante para bacterias termfilas)

Los medios con agar se emplean:

En tubos de ensayo En placas de Petri

Cuando el agar solidifica en tubos:

Inclinado: para disponer de una superficie mayor de crecimiento (agar inclinado)
Vertical: se denomina agar para siembra en puncin

Preparacin de medios de cultivo

Hay que aadir al medio una fuente de: Energa Carbono Nitrgeno Azufre Fsforo Factores necesarios para el crecimiento

Clasificacin de los medios de cultivo

Por su estado fsico: lquidos o slidos

Por su composicin qumica: qumicamente definidos o complejos Por su funcin: selectivos, electivos, diferenciales, de enriquecimiento

Medios qumicamente definidos

Es aqul del que se conoce la composicin qumica exacta

Factores orgnicos de crecimiento

Los microorganismos que necesitan muchos factores de crecimiento se denominan exigentes. Ejemplo: Lactobacillus Escherichia coli es una bacteria menos exigente. Utiliza medios ms sencillos pues tiene una mayor capacidad de sntesis de compuestos biolgicos

Medio qumicamente definido para el cultivo de una bacteria quimioauttrofa capaz de usar iones amonio como fuente de energa

Componente

Concentracin (gramos/ litro)

Sulfato amnico SO4(NH4)2 Bicarbonato sdico CO3HNa Fosfato disdico PO4HNa2 Fosfato monopotsico PO4H2K Sulfato magnsico SO4Mg.7H2O Cloruro frrico Cl3Fe.6H2O Cloruro clcico CL2Ca.2H2O Agua

0,5 0,5 13,5 0,7 0,1 0,014 0,18 1 litro

Medios complejos

La mayora de las bacterias hetertrofas y los hongos se cultivan en medios complejos cuya composicin qumica exacta vara

Los medios complejos estn formados por nutrientes como: Extractos de levadura Extractos de carne Extractos de vegetales Digeridos de protenas de carne Digeridos de protenas vegetales

En los medios complejos las protenas cubren las necesidades de:

Energa Carbono Nitrgeno Azufre

Las protenas son molculas grandes y relativamente insolubles Pero una digestin parcial con cidos o enzimas las reduce a mezclas de cadenas ms corta de aminocidos: peptonas.
Estos pequeos fragmentos solubles pueden ser digeridos por las bacterias.

En los extractos de carne o levadura se encuentran:

Vitaminas Nitrgeno orgnico Compuestos de carbono Factores orgnicos de crecimiento

Composicin del agar nutritivo

Componente
Extracto de carne Peptona bacteriolgica Cloruro de sodio (opcional)

Concentracin (gramos/litro)
3 5 5

Medios para cultivos anaerbicos

Las bacterias anaerobias mueren en presencia de oxgeno. Para su cultivo se utilizan medios adecuados denominados medios reductores

Estos medios contienen

Ingredientes como el tioglicolato sdico, que se combina con el oxgeno disuelto en el medio y lo eliminan

Medios selectivos y diferenciales

Medios selectivos: se utilizan para inhibir el crecimiento de bacterias no deseadas
Medios diferenciales: se utilizan para identificar bacterias con capacidades diferentes en su crecimiento

Medio electivo

Los medios electivos carecen de alguna fuente nutricional

Medios de enriquecimiento
Proporcionan nutrientes y condiciones ambientales favorables para el desarrollo de un microorganismo determinado pero no son adecuados para el crecimiento de otros. Se trata tambin de medios selectivos pero diseados para detectar un nmero pequeo del microorganismo buscado. Ejemplos: Caldo Rappaport-Vassiliadis, caldo lactosa-bilis (2 %)-verde brillante.

Medios de preenriquecimiento

Se utilizan para favorecer el crecimiento de microorganismos injuriados. Ejemplos: Agua peptona-fosfato y caldo nutritivo.

Agar MacConkey
Cantidad (g/l) Peptona de gelatina Peptona de casena Lactosa Sales biliares Cloruro sdico Rojo neutro Cristal violeta Agar 17 1.5 10 1.5 5 0.03 0.001 13.5

Caldo MacConkey
Cantidad (g/l) Peptona de gelatina Peptona de casena Lactosa Sales biliares Cloruro sdico Rojo neutro Cristal violeta 17 1.5 10 1.5 5 0.03 0.001

Agar de Baird-Parker
Triptona Piruvato de sodio Glicina Extracto de carne Cloruro de litio Extracto de levadura Agar Yema de huevo Telurito de potasio