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BIOQUIMICA APLICADA
CINETICA ENZIMATICA
Estudia la velocidad de las reacciones catalizadas enzimticamente Los principios generales de las reacciones qumicas se aplican tambin a las reacciones enzimticas
1. Concentracin de Enzima
En presencia de exceso de sustrato, la actividad es proporcional a la concentracin enzimtica
2. Concentracin de sustrato
Las reacciones enzimticas se saturan con el sustrato
Efecto autosaturante
Efecto autosaturante
Efecto autosaturante
Esto significa que a mayor cantidad de sustrato, mayor nmero de centros catalticos estarn ocupados, lo que incrementar la eficiencia de la reaccin, hasta el momento en que todos los sitios posibles estn ocupados. En ese momento se habr alcanzado el punto de saturacin de la enzima y, aunque se aada ms sustrato, no aumentar ms la eficiencia
3. Efecto del pH
La actividad enzimtica pasa por un mximo (pH ptimo). El pH ptimo de las enzimas varia ampliamente; para la pepsina, del estmago, es de 1,5, la arginasa tiene un pH ptimo de 9,7. La gran mayora de enzimas tienen un ptimo alrededor del pH fisiolgico de, ~7.0
3. Efecto del pH
Explicacin: El sitio activo de la enzima esta frecuentemente compuesto de grupos ionizables que deben estar en la forma inica para tener actividad, unir los sustratos o catalizar la reaccin. Una enzima que se someta a valores extremos de pH, se desnaturaliza.
En el efecto de la temperatura hay dos componentes: 1. Aceleracin de la reaccin segn la ecuacin de Arrhenius. (dentro del margen de actividad) k = A exp (-Ea/RT) Al aumentar la temperatura, la velocidad de reaccin aumenta y, para casi todas las enzimas, un incremento de 10C duplica e incluso triplica la velocidad de reaccin.
2. Desnaturalizacin trmica de la protena. Para muchas enzimas la regin de inactivacin trmica est muy prxima de la temperatura ptima.
4. Temperatura
CINETICA ENZIMATICA
Cintica de reacciones con un slo substrato
Michaelis y Menten propusieron un modelo para relacionar la velocidad de reaccin con la concentracin de substrato. Suponiendo la existencia de un solo complejo central, el esquema de reaccin sera:
Velocidad de reaccin
VS
concentracin
La ecuacin de MichaelisMenten describe como vara la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas de acuerdo a la concentracin de sustrato:
Parmetros enzimticos
1. Km (constante de Michaelis-Menten para cada enzima) = concentracin de S a la que la V es 1/2 Vmax. 2. Vmax = velocidad mxima terica = la velocidad cuando todos los centros activos estn ocupados con sustrato (nunca alcanzada en la realidad)
Unidades
Caractersticas de Km:
Es una medida de la afinidad del enzima por el S. Cuanto menor es Km, mayor es la afinidad del enzima por el S. Una Km pequea, refleja una gran afinidad por el sustrato, ya que bajas concentraciones de sustrato son suficientes para saturar al 50% de la enzima es decir, para alcanzar Vmax. Una Km grande, refleja una baja afinidad de la enzima por su sustrato, ya que son necesarias grandes concentraciones de sustrato para saturar el 50% de la enzima.
Km de algunas enzimas
ENZIMA Catalasa SUSTRATO H2O2 Km (mM) 25.0
Hexoquinasa
ATP
D-Glucosa D-Fructosa
0.4
0.05 1.5 9.0 108.0 2.5 4.0 5.0
Vmax
Vmax es una constante Vmax es la velocidad mxima terica de la reaccin pero, en realidad, nunca se alcanza Para alcanzar la velocidad mxima se requiere que [S] >> [E] y que TODAS las molculas de enzima estn unidas al sustrato. Vmax se alcanza asintticamente a medida que la concentracin de sustrato aumenta
Ploteo de Eadie-Hostee
El ploteo se realiza vi/ vi/[S], con ese fin se multiplica ambos miembros de la inversa de la ecuacin M-M por vi.Vmax obtenindose: Vmax (vi) = KmVmax(vi) + Vmax(vi)[S] vi Vmax[S] Vmax [S] Vmax = Km.vi + vi [S] Ordenando: vi = Vmax - Km.vi [S] Esta es una ecuacin de lnea recta de la forma Y = a bX. Pendiente= Km, Ordenada en el origen= Vmax.
[S] V
a Vm
Km V max
[S]
Ploteo Eisentahl-Cornish
Vmax = vi + vi.Km
[S]
V
V max
[S]
Km
Actividad enzimtica
Actividad enzimtica = cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por min = una forma comn de expresar la velocidad Actividad especfica = unidades por mg de protena total de la preparacin enzimtica. Unidad ms moderna: kat = nmoles de producto / seg
IRREVERSIBLES.
Inhibicin permanente Unin irreversible por medio de enlaces covalentes. Modificaciones qumicas de los grupos catalticos. Modificada la enzima, est siempre inhibida. Ejm: efecto del mercurio, plomo, gases neurotxicos y compuestos arsenicales. In cianuro, CN-: Se fija con gran afinidad a la sexta posicin de coordinacin del Fe hemnico del complejo citocromo oxidasa. Penicilinas: Inhiben enzimas sernicas que participan en la formacin de la pared bacteriana
INHIBIDORES
REVERSIBLES. La unin del inhibidor y la enzima es reversible. Al quitar el inhibidor del medio, se recupera la actividad. Se unen a la enzima por el mismo tipo de interacciones que se producen entre las enzimas y los sustratos.
hay inhibidores:
COMPETITIVOS, NO COMPETITIVOS, y ACOMPETITIVOS.
Agentes nerviosos
Los agentes nerviosos son esteres del cido fosfrico, con los OH sustituidos por otros radicales. Inhiben la acetilcolinesterasa
Plaguisidas organfosforados
Organofosforados: malathion Carbamatos: como el carbaril (Sevin). Organofosforados: Esteres de fosfato con O sustituidos con S u otros radicales. Con enlace P-C fosfonato, Con enlace P-N fosforamido, Con enlace P-S fosfotiolato Inhiben la acetilcolinesterasa
Neurotransmisin intoxicacin
Circuito elctrico de transmisin de seal entre una sensacin (nervio sensitivo) y un movimiento muscular (nervio motor).
Acetilcolina --- colina + acetato Enzima: acetilcolinesterasa Un inhibidor de la acetilcolinesterasa, inhibidor de la colinesterasa o anticolinesterasa es un compuesto qumico que inhibe a la enzima colinesterasa impidiendo que se destruya la acetilcolina liberada, produciendo como consecuencia un aumento en la concentracin y en la duracin de los efectos del neurotransmisor.
Los venenos inhiben la acetilcolinesterasa Reaccionan con la enzima de manera similar a la acetilcolina. La reactivacin de la enzima dura menos tiempo con los carbamatos, que con los organofosforados. De ah que, los carbamatos se consideran inhibidores reversibles porque en poco tiempo dejan la enzima libre, mientras que a los organofosforados se les llama inhibidores irreversibles porque el proceso de reactivacin, tarda mucho mas tiempo, y la enzima pierda propiedades catalizadoras
Armas qumicas
El Gas sarn. Es un lquido incoloro e inoloro usado como arma qumica debido a su extrema potencia como agente nervioso. Fue clasificado como arma de destruccin masiva en la resolucin 687 de la ONU. La produccin y almacenamiento de gas sarn fue declarada ilegal en la Convencin sobre Armas Qumicas de 1993. Fue desarrollado como pesticida en 1939 en Alemania. Puede convertirse en vapor (gas) y propagarse al ambiente.
Inhibidores competitivos
Los inhibidores competitivos tienen gran parecido estructural con el sustrato natural. Compiten con el sustrato por ocupar el sitio activo de la enzima. Esta unin es reversible y aumentando la concentracin de sustrato aumentamos el nmero de molculas de enzima libre. Sulfas (inhibe pasos metablicos en bacterias
Inhibicin competitiva
Malonato succnico
Sulfas microbianas
Infecciones
Inhibidor competitivo
Competitiva
Inhibicin No Competitiva
El inhibidor se combina con la enzima o con el complejo ES, interfiriendo con la formacin de producto. El valor de Km no vara Ejm. Yodoacetato. Se une a SH de cisteina y modifica el centro activo
No competitiva
V = Vmax. S . .1. Kmax+S (1+I/Ki)
Km se mantiene
Inhibicin acompetitiva
El inhibidor se une solo al complejo ES para dar un complejo inactivo. La Km se mantiene y la Vmax disminuye.
Aplicaciones
Muchos medicamentos son inhibidores enzimticos. La validez de un inhibidor enzimtico medicinal suele venir determinada por su especificidad (su carencia de unirse a otras protenas) y su potencia (su constante de disociacin, la cual indica la concentracin necesaria para inhibir a una enzima). Una alta especificidad y potencia asegura que el medicamento va a tener pocos efectos secundarios y por tanto una baja toxicidad.
a)Se libera un producto a partir de un primer complejo binario antes de la unin con el segundo substrato. b)Todos los substratos se unen a la enzima antes de la catlisis (en caso de dos substratos se denomina mecanismo de formacin de complejo ternario)
a.- Reacciones mediante formacin de un complejo ternario. En este caso, el complejo ternario puede formarse independientemente del orden de unin de los substratos (aleatorio), o bien nicamente en un orden determinado (mecanismo ordenado). Mecanismo aleatorio. Los substratos A y B forman un complejo con la enzima. Cualquiera de ambos puede combinarse con el otro substrato para formar el complejo ternario EAB, que conduce a los productos X e Y y a regenerar la enzima:
b.- Reacciones enzimticas sin formacin de un complejo ternario. El mecanismo se denomina ping-pong, formndose un complejo de la enzima con un substrato (EA), que libera el producto X, quedando como EA' (por ejemplo, un acil-enzima) que es atacado por el segundo substrato (por ejemplo, transfirindose el grupo acilo).
Ello impide: La utilizacin innecesaria del primer sustrato La acumulacin del producto final Se evita la acumulacin de intermedios (al ser la mayora R. Reversibles)
RUTA
ENZIMA
INHIBIDOR
Presentan una cintica sigmoidal, indicativa de efectos cooperativos en la unin del sustrato. Su actividad est regulada por otras molculas efectoras. Pueden mantener las concentraciones de sus sustratos en valores bastante constantes: Existe una concentracin crtica de sustrato ([S]c) por debajo de la cul la enzima es prcticamente inactiva
Enzimas alostericas
Ejemplos de cintica.
1. En una reaccin enzimtica que transcurre con una concentracin de enzimas de 0,015g/l, se obtienen los siguientes datos: [S] (g/l) 20 15 10 6.5 5.0 4.0 3.3 2.5 v(g/l-min)1.14 1.01 0.87 0.7 0.59 0.5 0.44 0.35 Deduzca el modelo que representa la cintica del proceso.
1.2
0.8
0.6
0.4
0.2
0 0 5 10 15 20 25
10
6.5 5.0 4.0 3.3 2.5
0.87
0.70 0.59 0.50 0.44 0.35
0.10
0.15 0.20 0.25 0.30 0.40
1.149
1.428 1.695 2.000 2.273 2.857
Grafica Linewaber-Burk
1/v
3.0000
2.5000
2.0000
1.5000
1.0000
0.5000
0.0000 0.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
0.300
0.350
0.400
0.450
Segn Linewaber-Burk
Interaccin.= 1/vmax=0.614 vmax = 1.628 g/l-min. Pendiente: Km/vmax. = 5.387 Km = 8.776 g/l El modelo ser. V = Vmax.S/(Km+S) V = 1.628S/(8.776+S) Comprobar por Eadie-Hostfee
Liberalizacin de Eadie-Hostfee
V = Vmax Km.V/S
v/S
0.160
0.140
0.120
0.100
0.080
0.060
0.040
0.020
INMOVILIZACION DE ENZIMAS
Se entiende por enzima inmovilizada (EI) aquella asociada a una matriz no esencial para su actividad.
Operacin continua
El biocatalizador se confina a una regin determinada a travs de la cual se pasa la solucin del substrato, que sale como un producto, libre de catalizador.
Reutilizacin
Mtodos de Inmovilizacin
Retencin
fsica
Atrapamiento o
inclusin
Inmovilizacin
qumica
Adsorcin
Unin covalente
Entrecruzamiento
Soportes de inmovilizacin
Inmovilizacin de enzimas
Enzimas: Aplicaciones
Industrias Lcteas
La lactasa es el enzima que consigue romper la lactosa, que es el azcar que contiene la leche Mucha gente es intolerante a la lactosa Existen en el mercado leches que vienen con lactasa
Industria Panadera
La mas comnmente utilizada es la lipoxidasa, que conjuntamente con el blanqueante, le da a la masa un carcter mas manejable Esta contenida en la harina de soja y de otras leguminosas.
Para aumentar la accin de la levadura se aade amilasa, en forma de harina de malta Se usan para ello tambin algunos mohos que contienen la enzima La harina de malta, tiene un inconveniente, y es que cambia el color del pan
Industria Cervecera
El proceso fundamental es la rotura del almidn Los azucares simples formados son fermentados por las levaduras Esto se lleva a cabo con las amilasas, provenientes de la malta. A veces se aaden otros almidones como de arroz o patata para aprovechar al mximo la actividad de las enzimas
Fabricacin de Zumos
Las peptinas provocan que los zumos sean demasiado viscosos y turbios. Esto se elimina con enzimas, contenidos en el propio zumo o que se pueden aadir En el proceso, como subproducto tenemos metanol, que aparece en muy baja concentracin
Tipos de pectinasas
Detergentes
Estos llevan enzimas que ayudan a limpiar Las proteasas facilitan la eliminacin de manchas de origen proteico Las lipasas eliminan las manchas de grasa y otros compuestos orgnicos Estos detergentes que llevan enzimas se denominan detergentes biolgicos
Medicina y Farmacia
El uso de enzimas en el sector mdico y farmacutico es potencialmente inmensa, pero su utilizacin es mnima Se usan slo si se tiene una seguridad absoluta de su eficacia. Alrededor de 150 enfermedades metablicas se han atribuido a defectos enzimticos. En teora, y una vez conocido el defecto, debera ser posible administrar la enzima ausente al paciente y aliviar o eliminar los sntomas de la alteracin. Los intentos para tratar las enfermedades metablicas hereditarias mediante la administracin de enzimas tienen xito parcial. El principal problema es que la enzima incorporada al organismo tiende a acumularse en el hgado y el bazo.