BREVE REPASO SOBRE GENTICA Y SNTESIS DE PROTENAS

BREVE REPASO SOBRE GENTICA Y SNTESIS DE PROTENAS

BREVE REPASO SOBRE GENTICA Y SNTESIS DE PROTENAS

Generalidades de la Tecnologa del DNA Recombinante

El trmino DNA recombinante hace referencia a la creacin de nuevas combinaciones de segmentos o de molculas de DNA que no se encuentran juntas de manera natural. Aunque el proceso gentico de la recombinacin produce DNA recombinante, este trmino se reserva a las molculas de DNA producidas por la unin de segmentos que provienen de diferentes fuentes biolgicas. La tecnologa del DNA recombinante utiliza tcnicas que provienen de la bioqumica de los cidos nucleicos unidas a metodologas genricas desarrolladas originalmente para la investigacin de bacterias y de virus. La utilizacin del DNA recombinante es una herramienta poderosa para el aislamiento de poblaciones puras de secuencias especficas de DNA a partir de una poblacin de secuencias mezcladas.

Los procedimientos bsicos de la tecnologa del DNA recombinante incluyen de manera general los siguientes pasos:
Los fragmentos de DNA se generan utilizando unas enzimas denominadas endonucleasas de restriccin, que reconocen y cortan las molculas de DNA por secuencias especficas.

La piedra angular de la tecnologa del DNA recombinante es un tipo de enzimas denominadas endonucleasas de restriccin. Las enzimas de restriccin reconocen una secuencia especfica de nucletidos (denominada sitio de restriccin) de una molcula de DNA de doble cadena, y cortan el DNA por esa secuencia.

Hasta la fecha, se han aislado y caracterizado casi 200 tipos de enzimas de restriccin diferentes. Las enzimas de restriccin se denominan segn el organismo en el que se descubrieron, utilizando un sistema alfanumrico. La enzima EcoRI proviene de Escherichia coli; HindIII se descubri en Hemophilus influenzae.

Hay dos tipos de enzimas de restriccin:

Las enzimas de Tipo I cortan las dos cadenas del DNA en una posicin aleatoria a cierta distancia del sitio de restriccin. No se utilizan normalmente en la investigacin de DNA recombinante ya que el sitio de corte no es preciso.

Las enzimas de Tipo II reconocen una secuencia especfica y cortan las dos cadenas de la molcula de DNA con absoluta precisin dentro de la secuencia reconocida. Se usan ampliamente en investigacin de DNA recombinante puesto que cortan en sitios especficos. Las secuencias reconocidas por las enzimas de Tipo II son simtricas (palindrmicas), es decir, la secuencia de una de las cadenas leda en direccin 5 a 3' es la misma que la secuencia de la cadena complementaria leda tambin en direccin 5' a 3'.

La enzima de restriccin EcoRI reconoce y se une a la secuencia palindrmica GAATTC. El corte del DNA en este sitio produce colas de cadena sencilla complementarias. La colas de cadena sencilla resultantes pueden unirse con colas complementarias de otros fragmentos de DNA para formar molculas de DNA recombinante.

Para formar molculas de DNA recombinante, se corta DNA de distintas fuentes con EcoRI y se mezcla para que se unan formando molculas recombinantes. Despus se utiliza la enzima DNA ligasa para unirlos covalentemente en molculas de DNA recombinante.

Algunas enzimas de restriccin comunes, con sus sitios de reconocimiento y de corte, el patrn de corte y la fuente de origen.

Resumen enzimas de restriccin

Amplificacin del ADN o genes va PCR

La tcnica de PCR permite obtener, a partir de una sola molcula de ADN, millones de copias de un fragmento de ADN particular. La base de esta tcnica consiste en que la enzima polimerasa de ADN cumpla su funcin: sintetizar ADN a partir de un pequeo fragmento llamado cebador, y de los nucletidos (A, C, G y T). Las nuevas molculas de ADN sintetizadas en cada ciclo sirven de molde para ciclos siguientes. Por lo tanto, la PCR es una reaccin de amplificacin de fragmentos de ADN en forma exponencial y al final del ciclo 35-40 en el tubo de ensayos existen millones de copias del fragmento de inters.

Los fragmentos producidos mediante la digestin con enzimas de restriccin se unen a otras molculas de DNA que sirven de vectores. Despus de unirse a un vector o vehculo de clonacin, un segmento de DNA puede llegar a entrar en una clula husped y replicarse o clonarse. Los vectores son, esencialmente, molculas de DNA transportadoras. Para servir de vector, una molcula de DNA debe tener unas determinadas caractersticas: 1. Debe poder replicarse independientemente junto con el segmento de DNA que transporta.
2. Debe contener algunos sitios de corte para enzimas de restriccin, presentes slo una vez en el vector. Estos sitios de restriccin se cortan con una enzima de restriccin y se utilizan para insertar segmentos de DNA cortados con la misma enzima. 3. Debe tener algn marcador de seleccin (normalmente genes de resistencia a antibiticos o genes de enzimas que la clula husped no tiene) para poder distinguir las clulas husped que transportan el vector de las que no lo contienen.

Actualmente se utilizan CUATRO tipos principales de vectores naturales: los plsmidos, los bacterifagos, los csmidos y algunas bacterias
PLASMIDOS Los plsmidos son molculas de DNA de doble cadena extracromosmicas de origen natural que tienen un origen de replicacin (ori+) y que se replican autnomamente en las clulas bacterianas. Para poder utilizarlos en ingeniera gentica, se han modificado o diseado muchos plsmidos de manera que contengan un nmero limitado de sitios de restriccin y genes de resistencia a antibiticos especficos. El vector pBR322 fue uno de los primeros plsmidos diseados que se utiliz en DNA recombinante. Este plsmido tiene un origen de replicacin (ori+), dos genes de seleccin (resistencia a los antibiticos ampicilina y tetraciclina), y algunos sitios de restriccin nicos.

Clula bacteriana

Bacterifagos lambda (fago )

Pasos en la clonacin utilizando el fago lambda como vector. Se extrae el DNA de una preparacin de fago lambda y se elimina el grupo central de genes por tratamiento con una enzima de restriccin. El DNA a clonar se corta con la misma enzima y se liga entre los brazos del cromosoma de lambda. Luego se empaqueta el cromosoma recombinante dentro de las protenas del fago para formar un virus recombinante. Este virus puede infectar clulas bacterianas y replicar su cromosoma, incluido el inserto de DNA.

Los csmidos

Los csmidos son vectores hbridos construidos utilizando partes del cromosoma del fago lambda y de DNA plasmdico. Los csmidos contienen la secuencia cos del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del DNA del fago dentro de su cubierta proteica, y secuencias plasmdicas de replicacin y de genes de resistencia a antibiticos, que permiten identificar las clulas husped que los contienen. El DNA de los csmidos que contiene insertos de DNA se empaqueta en la cpside proteica de lambda para formar partculas fgicas infectivas. Una vez el csmido entra en la clula husped, se replica como un plsmido.

Agrobacterium tumefaciens como vector natural

La introduccin de este material exgeno se realiza aprovechando la existencia de una bacteria patgena, Agrobacterium tumefaciens, que tiene la capacidad de transferir parte de su material gentico a las plantas.

VECTORES ARTIFICIALES

BIOBALISTICA

ELECTROPORACION

La molcula de DNA recombinante, formada por un vector que lleva un segmento de DNA insertado, se transfiere a una clula husped. Dentro de esta clula, la molcula de DNA recombinante se replica, produciendo docenas de copias idnticas conocidas como clones.

APLICACIONES DE LA TECNOLOGIA DE DNA RECOMBINANTE EN EL AREA ALIMENTARIA

ALIMENTOS TRANSGENICOS

Un organismo modificado genticamente (abreviado OMG, OGM o GMO, este ltimo del ingls Genetically Modified Organism) es aquel cuyo material gentico es manipulado en laboratorios donde ha sido diseado o alterado deliberadamente con el fin de otorgarle alguna caracterstica especfica.

Los alimentos transgnicos son aquellos alimentos producidos a partir de plantas o animales obtenidos por manipulacin gentica. Por ahora y en general, se trata de alimentos producidos de plantas transgnicas, es decir con genes aadidos o modificados.

El primer producto vegetal transgnico que se comercializ fueron los tomates MacGregor que haban sido modificados para bloquear la sntesis de pectinasas, enzimas que intervienen en la maduracin, y de este modo evita la podredumbre por sobremaduracin.

Mejorado la resistencia a los insectos. Mejorado su rendimiento. Mejorado el aroma. Disminuido el contenido en cafena.

Resistentes a las heladas

Con mejor composicin de cidos grasos

ALGODN RESISTENTE A HERBICIDAS

ALIMENTOS TRANSGENICOS EN EL MERCADO

Los alimentos transgnicos que se encuentran en el mercado varan considerablemente segn la regin y la normativa vigente en cada pas. La lista de variedades autorizadas, sobre todo en Estados Unidos, se alarga cada da, tanto en lo que se refiere a los genes como a las especies. En Europa, la lista es ms restringida: slo incluye el maz, la soya, el tomate y la colza.

Otro producto importante es la soja transgnica. En este caso, lo que se ha hecho es introducir un gen que la hace resistente a un herbicida, el glifosato, conocido por su nombre comercial de Roundup (Monsanto) o Faena en Mxico..

El maz transgnico se ha obtenido para que sea resistente a un insecto, el barrenador del tallo del maz, y a un herbicida, el glufosinato. Por lo que respecta al herbicida, vale lo dicho para la soya. En cuanto a la resistencia contra el insecto, se obtiene insertando en el maz el gen de una protena insecticida de una bacteria (Bacillus thuringiensis). Esta protena insecticida es perfectamente inocua, y su utilizacin est autorizada incluso en la llamada "agricultura ecolgica u orgnica.

INGENIERIA METABOLICA
Es el mejoramiento directo de la formacin de un producto o de propiedades celulares a travs de la modificacin de una reaccin bioqumica especfica o la introduccin de nueva/s con la utilizacin de la tecnologa de ADN recombinante

FACTORES RELEVANTES EN INGENIERA METABOLICA

Conocimiento de las rutas metablicas involucradas Regulacin de las enzimas implicadas Disponibilidad de sustratos y afinidades enzimticas Efectos fisiolgicos

Estrategias para modificar el metabolismo mediante manipulacin gentica

1) Producir ms cantidad del producto deseado Aumentar el flujo de la ruta biosinttica Inhibir el catabolismo del producto Aumentar el nmero de clulas productoras

2) Producir menor cantidad del producto deseado Reducir el flujo de la ruta biosinttica Aumentar el catabolismo
3) Expresin de nuevos componentes Completar rutas metablicas a partir de precursores por insercin de genes Crear nuevas rutas metablicas mediante insercin de genes

Las tcnicas disponibles permiten prolongar (4,5), ramificar (6,7) y bloquear (8) rutas metablicas. El flujo metablico puede tambin incrementarse por expresin constitutiva de enzimas calves (1) o por neutralizacin de los mecanismos de retroalimentacin por acumulacin de producto (2*)

Aspartato
Mensajes de <<feedback>> Aspartato cinosa

Aspartato semialdehido
Homoserina deshidrogenasa

cido dihidropicolinico

Homoserina

Lisina

Metionina

Treonina

RESUMEN
Las tcnicas de ingeniera gentica que se usan consisten en aislar segmentos del ADN (material gentico) para introducirlos en el genoma (material hereditario) de otro, ya sea utilizando como vector otro ser vivo capaz de inocular fragmentos de ADN (Agrobacterium tumefaciens, un virus, etc.), ya sea bombardeando las clulas con micropartculas recubiertas del ADN que se pretenda introducir, u otros mtodos fsicos como descargas elctricas que permitan penetrar los fragmentos de ADN hasta el interior del ncleo, a travs de las membranas celulares. Los alimentos transgnicos son aquellos alimentos producidos a partir de plantas, microorganismos o animales obtenidos por manipulacin gentica. La ingeniera metablica es una aplicacin de la ingeniera gentica en la cual podemos manipular el metabolismo celular para producir o sobreproducir algn metabolito de nuestro particular inters. Hasta el momento no se han publicado resultados concluyentes que indiquen que los organismos transgnicos y los alimentos elaborados a travs de estos no sean inocuos.