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Objetivos de aprendizaje
Explica los procedimientos para el marcaje de fragmentos de DNA utilizando la tecnologa de PCR. Reconoce los tipos y caractersticas de sondas moleculares y los fundamentos del marcaje, asi como la importancia de su utilizacin. Conoce y explica generalidades de diferentes mtodos de marcaje.
Importancia. La capacidad de encontrar en un genoma las secuencias de DNA de interes mediante sondas especificas siendo usado principalmente en el campo de la medicina.
marcaje de oligonucleotidos de DNA, para ser Usados en la macarcion de sondas por la la tecnologa de PCR.
oligonucleotidos degenerados.
SE MARCAN USANDO LA ENZIMA TERMINAL DEOXINUCLEOTIDO TRANSFERASA (TdT) QUE AGREGA ISOTOPOS RADIACTIVOS DE P-32 EN EL EXTREMO 3
SE MARCAN USANDO LA ENZIMA POLINUCLEOTIDO CINASA QUE AGREGA UN SOLO FOSTATO DE P-32 EN EL EXTREMO 5 DE CADA CADENA DE DNA
RNAm
RT-PCR
Plantilla para PCR
cDNA
SONDAS.
RNA.
EXTRACCION DEL DNA PLASMIDICO RESTRICCION DEL INSERTO DESNATURALIZACION DEL DNA
Mtodo Indirecto.
Marcacin de SONDAS
NICK trasnlation.
ACTUAN DOS ENZIMAS: DNasa 1 Y DNApolimerasa 1 SE UTILIZA ADN DOBLE CADENA SE INTRODUCE LA MELLA AL AZAR MEDIANTE LAS DNAasas. PUEDEN HACERSE SONDAS NO RADIACTIVAS
NICK TRANSLATION.
Marcacin de SONDAS
RANDOM PRIMER SE UTILIZA UNA SECUENCIA DE OLIGONUCLEOTIDOS CONOCIDA. SE USA ADN SIMPLE CADENA (SE DESNATURALIZA POR CALOR). SE USA EL FRAGMENTO DE KLENOW PARA GENERAR UNA CADENA COMPLEMENTARIA
Bibliografia.
Biologia celular y molecular. Lodish, Berk, Zipursky, 4ta. Edicion, editorial panamericana.
Biologa molecular e Ingeniera Gentica. Luque, Jos ngel. ; Editorial Harcourt.