Impacto de las estrategias de

aireacin en la cintica de cultivo

fed-batch en el reactor en
miniatura 24
Profesora: Estrella Asp
Alumno: Nicols Gonzlez Silva
Reactores Bioqumicos
Dpto. Ingeniera Qumica
Facultad de Ingeniera
Introduccin
Productos biofarmacuticos estn teniendo un
inters comercial considerable

Los ms exitosos productos de este ndole han sido
los anticuerpos monoclonales (catalizadores,
diagnsticos, tratamientos)

El incremento de la demanda de estos productos
ha impulsado a la industria para aumentar la
capacidad de produccin y mejorar los procesos de
cultivo

La aceptacin del mercado de estos productos se
ve obstaculizada por los altos precios de venta

Presin
del
estado
Precios
de
venta
Incentivo
industrial
(fabricacin
viable)
Desarrollo y
eficiencia de
sus
bioprocesos
Escala piloto
(escala reducida)
Modelos
Biorreactores a
gran escala
En general la escala piloto son biorreactores STR de 0,5 10 L ,
utilizados para el cultivo celular

Existe la necesidad de que estos sean mas eficientes, de alto
rendimiento y que sean ms pequeos


Biorreactor 24

nica placa base agitadora (0-800 rpm)
Contiene una placa de 24 pozos pre-
esterilizados (3-7 mL)
Puertos individuales de inyeccin de gas
Control de pH, DO y T
Disponible diseos placa PERC y REG


Caracterizacin del biorreactor 24
Diseos de placa del biorreactor 24
PERC
Gas burbujeado asciende por un
tubo central ms alto que la
superficie del lquido

Proporciona aireacin superficial
REG
Gas se burbujea directamente en
la base de cada pozo

Proporciona aireacin creando
una fase de gas dispersa
Temas abordados en la investigacin
Hidrodinmica de la fase lquida y tiempos de
mezclado
Determinacin k
L
a

y rea interfacial gas-lquido
Estudios de evaporacin
Realizacin de un rendimiento consistente
Cinticas de cultivo celular fed-batch en placas
PERC
Cinticas de cultivo celular fed-batch en placas REG
Comparacin de la cintica de cultivo del 24 y un
frasco agitado




Para todas las frecuencias de agitacin se indujo deformacin de la superficie del
lquido
Hidrodinmica de la fase lquida y tiempos de
mezclado

PERC
REG
Nmero de fase (Ph)
Rgimen de flujo en fase: mayora del lquido circula
alrededor del borde del pozo
Rgimen de flujo desfasado: solo una pequea porcin del
fluido circula alrededor de las paredes del pozo
Hidrodinmica de la fase lquida y tiempos de
mezclado


Ph>1,26 En fase
Ph<1,26 Desfasado

En placa PERC el tubo de rociado central parece retardar el mezclado a bajas
frecuencias, a mayores frecuencias las diferencias entre los diseos no es
significativa.

STR convencionales la presencia de una fase de gas dispersa es conocida para
disminuir tiempos de mezclado.

En placa REG, las burbujas aaden componente axial adicional al flujo de fluido
disminuyendo hasta casi 20 veces el tiempo de mezclado.


Hidrodinmica de la fase lquida y tiempos de
mezclado

Frecuencia
de agitacin
Volumen de
llenado
Tiempo de mezclado
Temas abordados en la investigacin
Hidrodinmica de la fase lquida y tiempos de
mezclado
Determinacin k
L
a

y rea interfacial gas-lquido
Estudios de evaporacin
Realizacin de un rendimiento consistente
Cinticas de cultivo celular fed-batch en placas
PERC
Cinticas de cultivo celular fed-batch en placas REG
Comparacin de la cintica de cultivo del 24 y un
frasco agitado





Determinacin k
L
a y rea interfacial
gas-lquido

Inconveniente
A altas frecuencias para la placa REG,
los valores parecen disminuir en vez
de aumentar
Razn
Vrtex de fluido que disminuyen la
altura de lquido por encima del
rociador, reduciendo el tiempo de
residencia de la burbuja
Aadir plurnico al agua, estabiliza la formacin de
burbujas

Las burbujas se separan,
aumentando el rea
superficial y por tanto k
L
a


Determinacin k
L
a y rea interfacial
gas-lquido

Valores de k
L
a PERC REG
Agua 4 - 22 h
-1
4 - 53 h
-1

Solucin Agua-Plurnico 4 - 24 h
-1
4 - 46 h
-1

Determinacin k
L
a y rea interfacial
gas-lquido

Segn los investigadores los valores de k
L
a

satisfacen la demanda
de oxigeno transferido para un cultivo de clulas animales

El aumento de la frecuencia de agitacin, aumenta el rea
disponible de transferencia y por tanto k
L
a

La transferencia de oxgeno se debe principalmente al aumento del
rea, mientras que la hidrodinmica del fluido tiene poca influencia



Determinacin k
L
a y rea interfacial
gas-lquido

Placa PERC (a y b)
Placa REG (c y d)
Temas abordados en la investigacin
Hidrodinmica de la fase lquida y tiempos de
mezclado
Determinacin k
L
a

y rea interfacial gas-lquido
Estudios de evaporacin
Realizacin de un rendimiento consistente
Cinticas de cultivo celular fed-batch en placas
PERC
Cinticas de cultivo celular fed-batch en placas REG
Comparacin de la cintica de cultivo del 24 y un
frasco agitado




En sistemas de pequea escala con bajos
volmenes de trabajo, la evaporacin puede
ser problemtica ya que conduce a cambios
incontrolables en los niveles de metabolitos

Se observ que el volumen de cultivo
evaporado fue de 0,6 % por da sobre toda la
placa, por lo que no fue un impedimento en
este estudio
Estudios de evaporacin
Temas abordados en la investigacin
Hidrodinmica de la fase lquida y tiempos de
mezclado
Determinacin k
L
a

y rea interfacial gas-lquido
Estudios de evaporacin
Realizacin de un rendimiento consistente
Cinticas de cultivo celular fed-batch en placas
PERC
Cinticas de cultivo celular fed-batch en placas REG
Comparacin de la cintica de cultivo del 24 y un
frasco agitado




Realizacin de un rendimiento consistente
PROBLEMA Las placas PERC mostraron una variacin de clulas
considerable entre pozos (88% entre mximo y
mnimo de VCD)
Se realiz un cultivo discontinuo de la lnea CHO en los 24 pozos
SOLUCIONES
Variacin en el inculo agregado
Sedimentacin de clulas mientras se realizaba el
muestreo
CAUSAS
Agitador de microplacas
Pipeta electrnica automatizada para inocular los
pozos en paralelo (14 % entre mximo y mnimo de
VCD)
Temas abordados en la investigacin
Hidrodinmica de la fase lquida y tiempos de
mezclado
Determinacin k
L
a

y rea interfacial gas-lquido
Estudios de evaporacin
Realizacin de un rendimiento consistente
Cinticas de cultivo celular fed-batch en placas
PERC
Cinticas de cultivo celular fed-batch en placas REG
Comparacin de la cintica de cultivo del 24 y un
frasco agitado




Las clulas se sembraron a 8x10
5
clulas/mL en
un medio suplementado con metotrexato
(C
20
H
22
N
8
O
5

) y una solucin de aminocidos
Temperatura: 37C
Temperatura ambiente: 35C
pH: 6,95
DO: 57 %
Se realiz para placa PERC en flujo constante y
para placa REG en flujo constante y variable
Cinticas de cultivo celular fed-batch
Cinticas de cultivo celular fed-batch en placas
PERC
DO : 57 + 12 %
pH : 6,95 + 0,3
Sistema capaz de mantener
puntos de ajuste
Pick de densidad celular:
20,4x10
6
clulas ml
-1
Viabilidad >60%
Rendimiento reproducible
Flujo constante
Cinticas de cultivo celular fed-batch en placas
PERC
1,6 g/L mximo Datos consistentes a travs
de los pozos
Flujo constante
Temas abordados en la investigacin
Hidrodinmica de la fase lquida y tiempos de
mezclado
Determinacin k
L
a

y rea interfacial gas-lquido
Estudios de evaporacin
Realizacin de un rendimiento consistente
Cinticas de cultivo celular fed-batch en placas
PERC
Cinticas de cultivo celular fed-batch en placas REG
Comparacin de la cintica de cultivo del 24 y un
frasco agitado




Cinticas de cultivo celular fed-batch en placas
REG
Pick de densidad celular:
12,9x10
6
clulas ml
-1
Viabilidad >70%
Rendimiento reproducible
Flujo Constante
Pick de densidad celular: 15,5x10
6
clulas ml
-1
Viabilidad <60%
Mayor grado de variabilidad en los perfiles
Crecimiento exponencial visible
Flujo Variable
Cinticas de cultivo celular fed-batch en placas
REG
Flujo Constante
Flujo Variable
DO : 57 + 32 %
pH : 6,95 + 0,4
Burbujeo activo de gases

DO : 57 + 24 %
pH : 6,95 + 0,2
Cinticas de cultivo celular fed-batch en placas
REG
Flujo Constante Flujo Variable
Concentraciones de sustrato y
lactato consistentes en todos los
experimentos
Misma condicin para las
clulas (viabilidad constante)
Aumento de la utilizacin de
sustrato
Estrs ambiental (utilizan energa en
reparacin celular)
Cinticas de cultivo celular fed-batch en placas
REG
Flujo Constante Flujo Variable
1,15 g/L mximo
1,40 g/L mximo
Gasificacin a flujo constante parece retardar el
crecimiento celular en la fase exponencial
(condiciona a las clulas -> viabilidad constante)
Gasificacin a flujo variable tiene una disminucin
de la viabilidad al da 11 como resultado del
aumento de la frecuencia de gas (estrs
ambiental)

Cinticas de cultivo celular fed-batch en placas
REG
Baja VCD y producto
en flujo constante
PROBLEMA
POSIBLES CAUSAS
Aumento de la frecuencia de
burbujeo de gas para controlar
pH (CO
2
) y DO (O
2
40 %)
Toxicidad CO
2

(presin hidrosttica)

Temas abordados en la investigacin
Hidrodinmica de la fase lquida y tiempos de
mezclado
Determinacin k
L
a

y rea interfacial gas-lquido
Estudios de evaporacin
Realizacin de un rendimiento consistente
Cinticas de cultivo celular fed-batch en placas
PERC
Cinticas de cultivo celular fed-batch en placas REG
Comparacin de la cintica de cultivo del 24 y un
frasco agitado




Nomenclatura:
Placa PERC
Placa REG flujo constante
Placa REG flujo variable
Frasco agitado

Comparacin de la cintica de cultivo del 24 y
un frasco agitado
Cintica de crecimiento en
placas de PERC superan a los
medidos en frasco agitado
Existe un mejor control de los
parmetros del cultivo

Bajo ndice de VCD en placa
REG debido al burbujeo de gas
Comparacin de la cintica de cultivo del 24 y
un frasco agitado
Nomenclatura:
Placa PERC
Placa REG flujo constante
Placa REG flujo variable
Frasco agitado

Frasco agitado ms alta
concentracin de producto
(viabilidad ms baja lo cual libera
anticuerpos incompletos)

Se predice que resultados frasco
agitado PERC

Resultados placa REG menores
debido a estrs celular por
burbujeo de gas
Comparacin de la cintica de cultivo del 24 y
un frasco agitado
Placa PERC IVC mximo ms alto Soporta el mayor nmero de clulas viables

Placa PERC ms productividad celular por da Sistema capaz de soportar un alto
nmero de clulas y por tanto producto

Tasa de crecimiento placa REG < placa PERC Impacto negativo por dao celular
debido a las burbujas
Placa PERC ms adecuado para
identificacin de alta VCD /
mayor produccin de clulas
Placa REG cultivo no muy bueno pero se
espera que el diseo es ms similar a un
biorreactor convencional (preferible para
disear a baja escala)
A travs de la caracterizacin del sistema 24 se vi
como biorreactores en miniatura impactan sobre la
cintica celular
Tanto diseos PERC y REG mostraron un buen
mezclado y control de parmetros
Los valores de kLa proporcionaron una adecuada
transferencia de O
2

Resultados de la placa REG fueron reproducibles, pero
mostr el impacto que puede tener una fase de gas
dispersa en el rendimiento del cultivo



Conclusiones

El biorreactor 24 puede tener un gran nmero de aplicaciones
en el desarrollo de procesos de cultivo industrial

Placa PERC parece ms adecuado para estudios de seleccin de
lnea celular bajo condiciones de cultivo en suspensin

Placa REG hace ms representativo un biorreactor agitado a
escalas mayores y parece el ms adecuado para disear a baja
escala

El trabajo actual est examinando la escalabilidad del
rendimiento de cultivo 24

Conclusiones