Pruebas Bioqumicas

Laboratorio de Microbiologa

Introduccin
Con frecuencia,la identidad de una
especie requiere que se conozca de
manera detallada su actividad bioqumica,
porque otras caractersticas no son
suficientemente distintivas o diferenciales.

Agar Hierro Kligler

Medio de cultivo
frecuentemente usado
en microbiologa de
alimentos para la
diferenciacin de
enterobacterias, en
base a la fermentacin
de glucosa y lactosa, y
a la produccin de
cido sulfhdrico.

Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona de carne y
latriptena,aportan los nutrientes adecuados para el
desarrollo bacteriano.
La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono
fermentables.
El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la
produccin de cido sulfhdrico,el citrato de hierro y
amonio, es la fuente de iones Fe3+, los cuales se combinan
con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de
color negro.
Elrojodefenoleselindicadordeph,yelclorurodesodiomantiene
elbalanceosmtico.Elagareselagentesolidificante.
Porfermentacindeazcares,seproducencidos,quesedetect
anpormediodelindicadorrojodefenol,elcualviraalcoloramarill
oenmediocido.
Eltiosulfatodesodiosereduceasulfurodehidrgenoelquereacci
onaluegoconunasaldehierroproporcionandoeltpicosulfurode
hierrodecolornro.

 Resultados1Picoalcalino/fondocido(picorojo/fondoamarillo):elmicroorga
nismosolamentefermentalaglucosa.
2Picocido/fondocido(picoamarillo/fondoamarillo):elmicroor
ganismofermentaglucosa,ylactosa.
3Picoalcalino/fondoalcalino(picorojo/fondorojo):elmicroorgani
smoesnofermentadordeazcares.
4Lapresenciadeburbujas,orupturadelmediodecultivo,indicaqu
eelmicroorganismoproducegas.
5Elennegrecimientodelmedioindicaqueelmicroorganismoprod
ucecidosulfhdrico.

 Caractersticas del medio

Medio preparado: rojo

TSI Agar
Medio universalmente empleado para la
diferenciacin de enterobacterias, en base
a la fermentacin de glucosa, lactosa,
sacarosa y a la produccin de cido
sulfhdrico

Extracto de carne
3.0
Pluripeptona 20.0
Cloruro de sodio
5.0
Lactosa 10.0
Sacarosa 10.0
Glucosa 1.0
Sulfato de hierro y amonio 0.2
Tiosulfato de sodio 0.2
Rojo de fenol 0.025
Agar
13.0
pH final: 7.3 0.2

 Fundamento
Enelmediodecultivo,elextractodecarneylapluripeptona,aportanl
osnutrientesadecuadosparaeldesarrollobacteriano.
Lalactosa,sacarosayglucosasonloshidratosdecarbonofermentab
les.
Eltiosulfatodesodioeselsustratonecesarioparalaproduccindeci
dosulfhdrico,elsulfatodehierroyamonio,eslafuentedeionesFe3+,
loscualessecombinanconelcidosulfhdricoyproducensulfurodeh
ierro,decolornegro.
ElrojodefenoleselindicadordepH,yelclorurodesodiomantieneelba
lanceosmtico.
Porfermentacindeazcares,seproducencidos,quesedetectanp
ormediodelindicadorrojodefenol,elcualviraalcoloramarilloenmed
iocido.
Eltiosulfatodesodiosereduceasulfurodehidrgenoelquereaccion
aluegoconunasaldehierroproporcionandoeltpicosulfurodehierro
decolornro.

LisinaHierroAgar
Mediodecultivoutilizadoparadiferenciarmicro
organismos,especialmenteSalmonellaspp.,
basadoenladecarboxilacin/desaminacind
elalisinayenlaproduccindecidosulfhdrico
.

Peptona de gelatina
5.0
Extracto de levadura 3.0
Glucosa 1.0
Lisina 10.0
Citrato de hierro y amonio 0.5
Tiosulfato de sodio
0.04
Prpura de bromocresol
0.02
Agar
15.0
pH final: 6.7 0.2

 Fundamento
Enelmediodecultivo,lapeptonayelextractodelevaduraaporta
nlosnutrientesparaeldesarrollobacteriano.
Laglucosaeselhidratodecarbonofermentable,ylalisinaeselsus
tratoutilizadoparadetectarlapresenciadelasenzimasdecarbo
xilasaydeaminasa.
Elcitratodehierroyamonio,yeltiosulfatodesodio,sonlosindicad
oresdelaproduccindecidosulfhdrico.
Elpurpuradebromocresol,eselindicadordepH,elcualesdecolor
amarilloapHigualomenora5.2,ydecolorvioletaapHigualomay
ora6.8.
Pordecarboxilacindelalisina,seproducelaaminacadaverina,q
uealcalinizaelmedioyestoproduceelvirajedelindicadoralcolor
violeta.
Ladecarboxilacindelalisina,tienelugarenmediocido,m

Losmicroorganismosquenoproducenlisinadecarboxilasa,peroques
onfermentadoresdelaglucosa,producenunvirajedelatotalidaddelme
diodecultivoalamarillo,peroalas24hsdeincubacinseobservaelpico
decolorvioletadebidoalconsumodelaspeptonas,yelfondoamarillo.
Laproduccindesulfurodehidrgeno,sevisualizaporelennegrecimie
ntodelmediodebidoalaformacindesulfurodehierro.
LascepasdelosgnerosProteus,ProvidenciayalgunascepasdeMor
ganella,desaminanlalisina,estoproduceuncidoalfa-cetocarbnico,elcual,conlasaldehierroybajolainfluenciadeloxgenoform
auncolorrojizoenlasuperficiedelmedio.

Resultados1Decarboxilacindelalisina:
-PruebaPositiva:Picovioleta/fondovioleta.
-PruebaNegativa:Picovioleta/fondoamarillo.
2-Desaminacindelalisina:
Picorojizo/fondoamarillo.Estosucedeconcepasdelg
neroProteus,ProvidenciayalgunacepasdeMorgane
llaspp.
3-Produccindecidosulfhdrico:
Pruebapositiva:Ennegrecimientodelmedio(especial
menteenellmitedelpicoyfondo)

MIO Medio
MediousadoparalaidentificacindeEnterobac
teriaceaeenbaseasumovilidad,actividadde
Dextrosa1.0
.
ornitinadecarboxilasayproduccindeindol.
Extracto de levadura
Peptona 10.0
Triptena10.0
Clorhidrato de L-ornitina
Agar
2.0
Prpura de bromocresol
pH final: 6.5 0.2

3.0
5.0

0.02

 Fundamento
Mediodecultivosemislido,altamentenutritivodebidoal
apresenciadeextractodelevadura,peptonaytriptena.
Adems,latriptenaaportagrandescantidadesdetriptof
ano,sustratodelaenzimatriptofanasa,paralarealizacin
delapruebadelindol.
Ladextrosaeselhidratodecarbonofermentable,laornitin
aeselsustratoparaladeteccindelaenzimaornitinadeca
rboxilasa,elprpuradebromocresoleselindicadordepH,
queenmedioalcalinoesdecolorprpurayenmediocido
esamarillo.
Porsucomposicin,esposibledetectar3reaccionesenun
mismotubo:movilidad,presenciadeornitinadecarboxila
saeindol.

 Lamovilidadsedemuestraporunenturbiamientodelmedioopor
crecimientoquedifundemasalldelalneadeinoculacin.
Lareaccinpositivaalaornitinaestdadaporuncolorprpuradel
medio.DebidoalafermentacindelaglucosasereduceelpHpro
duciendounacondicincidayoriginandoqueelindicadordepH
prpuradebromocresolvirealarillo.
Lapresenciadeacidez,otorgacondicionesptimasparalaactivi
daddelaenzimaornitinadecarboxilasa,lacualdecarboxilalaorn
itinapresente.
Pordecarboxilacin,sealcalinizaelmedio,conelconsecuentevi
rajedelindicadorhaciaelcolorprpura.
Elindol,esproducidoapartirdeltriptofanoporlosmicroorganism
osquecontienenlaenzimatriptofanasa.Eldesarrollodeuncolorr
ojoluegodeagregarunasgotasdereactivodeKovac
sodeErlich,indicaunresultadopositivo.

 Resultados
1-Movilidad:-Resultado positivo: presencia de turbidez o
crecimiento mas all de la lnea de siembra.-Resultado
negativo: crecimiento solamente en la lnea de siembra.
2-Ornitina decarboxilasa:-Resultado positivo: color
prpura.-Resultado negativo: color amarillo. A veces se
puede desarrollar un color violceo en la superficie del
medio.
3-Prueba del indol: La prueba de indol se realiza una vez
que se ha determinado la movilidad y la prueba de ornitina.
-Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo
revelador.-Resultado negativo: el color del reactivo
revelador permanece incoloro-amarillento.
Caractersticas del medioMedio preparado: prpura
transparente a ligeramente opalescente.

SIMMedio

Es un medio semislido destinado a verificar la

movilidad,produccin de indol y de sulfuro de
hidrgeno en un mismo tubo.Es til para
diferenciar miembros de la familia
Enterobacteriaceae.

Triptena 20.0
Peptona 6.1
Sulfato de hierro y amonio 0.2
Tiosulfato de sodio 0.2
Agar
3.5
pH final: 7.3 0.2

 Fundamento
Eltriptfanoesunaminocidoconstituyentedemuchaspe
ptonas,yparticularmentedelatriptena,quepuedeseroxid
adoporalgunasbacteriasparaformarindol.
Enelprocesointervieneunconjuntodeenzimasllamadastr
iptofanasa.
Elindolproducidosecombinaconelaldehidodelreactivode
KovacsodeErlich,paraoriginaruncompuestodecolorrojo.
Lascepasmvilespuedenapreciarseenestemedio,porlat
urbidezqueproducenalrededordelapuncindesiembra,
mientrasqueaquellascepasproductorasdesulfhdricosed
istinguenporlaformacindeunprecipitadonegrodesulfur
odehierroapartirdeltiosulatosiemprequeelmediosemant
engaaunpHmayora7.2.

 ResultadosCepasmviles:producenturbidezdel
medio,queseextiendemasalldelalneadesiembra.
Cepasinmviles:elcrecimientoseobservasolame
nteenlalneadesiembra.
CepasSH2positivas:ennegrecimientoalolargodel
alneadesiembraoentodoelmedio.
CepasSH2negativas:elmediopermanecesincam
biodecolor.
Cepasindolpositivas:desarrollodecolorrojoluego
deagregarelreactivodeKovacsodeErlich.
Cepasindolnegativas:sincambiodecolor.

Urea
Medioutilizadoparalaidentificacindemicroor
ganismos,enbasealaactividaduresica.Esp
articularmentetilparadiferenciarProteussp
p.deotrosmiembrosdelafamiliaEnterobacte
riaceae.

Urea
20.0
Fosfato monopotsico 9.1
Fosfato disdico 9.5
Extracto de levadura 0.1
Rojo fenol
0.01
pH final: 6.8 0.2

 Fundamento
Estemediodecultivo,formuladoporRustigianyStuart,pre
sentabajocontenidodenutrientesyaltacapacidadbuffer.
Elextractodelevaduraeslanicafuentedecarbono,nitrg
eno,vitaminasycofactores,yaportalosnutrientesesenci
alesparaeldesarrollobacteriano.Lassalesdefosfatoscon
stituyenelsistemabuffer,elrojodefenoleselindicadordep
Hylaureaeselsustratodelaenzimaureasa.
Aquellasbacteriasqueposeenlaenzimaureasa,puedenut
ilizarelnitrogenoprovenientedelaurea,lahidrolizan,liber
andoamonacoydixidodecarbono.Estosproductosmet
ablicosalcalinizanelmedio,haciendovirarelindicadorroj
ofenoldelamarilloalrojo.Suuso,serecomiendaparadifere
nciarProteusspp.deotrosgneros

Caractersticas del medioMedio

preparado: anaranjado.

Urea1 Uninoculated Control,

2 Proteus Vulgaris,
3 E. coli

SimmonsCitratoAgar
Medioutilizadoparaladiferenciacindeenter
obacterias,enbasealacapacidaddeusarcitra
tocomonicafuentedecarbonoyenerga.
Citrato de sodio 2.0 Cloruro de sodio
5.0
Fosfato dipotsico 1.0
Fosfato monoamnico 1.0
Sulfato de magnesio
0.2
Azul de bromotimol
0.08
Agar
15.0
pH final: 6.9 0.2

 Fundamento
Enelmediodecultivo,elfosfatomonoamnicoeslanic
afuentedenitrgenoyelcitratodesodioeslanicafuent
edecarbono.Amboscomponentessonnecesariospara
eldesarrollobacteriano.
Lassalesdefosfatoformanunsistemabuffer,elmagnes
ioescofactorenzimtico.
Elclorurodesodiomantieneelbalanceosmtico,yelazu
ldebromotimoleselindicadordepH,queviraalcolorazul
enmedioalcalino.
Elmediodecultivoesdiferencialenbaseaquelosmicroo
rganismoscapacesdeutilizarcitratocomonicafuente
decarbono,usansalesdeamoniocomonicafuenteden
itrgeno,conlaconsiguienteproduccindealcalinidad

 Elmetabolismodelcitratoserealiza,enaquellasbacterias
poseedorasdecitratopermeasa,atravsdelciclodelcid
otricarboxlico.Eldesdoblamientodelcitratodaprogresiv
amente,oxalacetatoypiruvato.Esteltimo,enpresencia
deunmedioalcalino,daorigenacidosorgnicosque,als
erutilizadoscomofuentedecarbono,producencarbonat
osybicarbonatosalcalinos.Elmedioentoncesviraalazuly
estoesindicativodelaproduccindecitratopermeasa.
ResultadosPositivo:crecimientoycolorazulenelpico,alcalinidad.
Negativo:elmediopermanecedecolorverdedebidoaqu
enohaydesarrollobacterianoynohaycambiodecolor