CROMATOGRAFIA

LIQUIDA DE ALTA
PERFORMANCE
CURSO ANALISIS INSTRUMENTAL
FQIQ - UNMSM.

CAPITULO 1:

INTRODUCCION

INTRODUCION A LA
CROMATOGRAFIA
La cromatografia es una de las
muchas tecnicas de separacion.

Otras tecnicas disponibles son

destilacion,
filtracion, extraccion por
solventes, centrifugacion, etc.

El principal proceso de la
cromatografia es separar y cuantificar
los compuestos en la matriz de la

BREVE HISTORIA DE LA
CROMATOGRAFIA

1906 -- M.S. Tswett publico el primer repor

cromatografia. La separacion de c
sobre absorbente de carbonato de
eter de petroleo como eluyente.

1931 -- Kuhn et al. aislo - y -caroteno de

carotenos empleando el mismo me
Tswett.

BREVE HISTORIA DE LA
CROMATOGRAFIA
1940s -- Martin and Synge trabajo el tratamiento teorico
de cromatografia el cual hizo posible definir
metodos de mejorar la eficiencia de la separacion
cromatografica.
Esto permitio la aceptacion de la cromatografia.
1950s -- Estos metodos fueron aplicados a la cromatografias
de gases.
1957

-- Golay propuso el uso de columnas capilares en GC.

BREVE HISTORIA DE LA
CROMATOGRAFIA
1960s -- HPLC nacio.

1975 -- Cromatografia ionica de alta perfo

fue propuesto por Small et al.

1979 -- Sistema sin-supresor para cromat

ionica fue desarrollado por Gjerde

PIEDRAS EN EL RIO
Piedra ligera
Piedra pesada

Flujo de agua

base

VARIOS TIPOS DE
CROMATOGRAFIA

1. Cromatografia de capa fina (TLC)

2. Cromatografia de capa fina de alta perfo
(HPTLC)
3. Cromatografia de Columna.
4. Cromatografia de Gases (GC)
5. Cromatografia Liquida de Alta Performa
6. Cromatografia de Fluidos Supercriticos (
7. Electroforesis Capilar (CE)

VARIOS TIPOS DE
CROMATOGRAFIA
TLC --

usado como instrumento cualitativo para la

separacion de mezclas simples donde la
velocidad, bajo costo y la simplicidad son
requeridas.

2. HPTLC --

para el analisis cuantitativo con alta carga

de muestra.

Equipo :

Placas revestidas de varios tamaos dependien

de la aplicacion.
Tanque de desarrollo.
Accesorios Opcionales para deteccion.

VARIOS TIPOS DE
CROMATOGRAFIA
Ventajas --

requiere minima preparacion

minima limitacion (no necesi
volatilidad de muestra y ni d
de solventes

An Automatic Plate-Coater

VARIOS TIPOS DE
CROMATOGRAFIA
3.

Cromatografia de Columna
-- normalmente se corre muestras que eluyen
bajo gravedad.
-- proceso lento que requiere grandes cantidades de
solventes.
-- Tiempo y esfuerzo se gasta para empacar la
columna.

packing
cotton wool/sintered glass

VARIOS TIPOS DE
CROMATOGRAFIA

4. Cromatografia de Gases
-- Usado para compuestos volatiles o
que pueden ser vaporizados sin
decomposicion.
-- Fase Movil es gaseosa (normalment

VARIOS TIPOS DE
CROMATOGRAFIA

5. Cromatografia Liquida de Alta Perform

-- De nuestro interes.

VARIOS TIPOS DE
CROMATOGRAFIA

6. Cromatografia de Fluidos Supercriticos

-- Usa un fluido supercritico como eluy
-- La fase movil mas comun es dioxido
-- La gradiente de elucion es controlad
cambio de presion de la fase movil.
solid

liquid

Area sombreada :
Rango Supercritico.

gas

Diagrama de Fase de un compuesto puro

VARIOS TIPOS DE
CROMATOGRAFIA

7. Electroforesis Capilar (CE)

-- la muestra eluye usando un alto po
traves de los extremos de tubo cap
(20-30 kV para una longitud de 50
-- puede usar los mismos detectores
-- flujo electroosmotica tiene un su m
perfil de flujo plano y eso no contr
ensanchamiento de las bandas.

VARIOS TIPOS DE
CROMATOGRAFIA
Capillary
Plexiglas box

Detector

High-voltage
power supply

Solvent
reservoirs
Esquema de un sistema de electroforesis
capilar
(a)

(b)

Perfiles de flujo para liquidos bajo (a) presion electroosmotica

y (b) presion hidrodinamica.

VENTAJAS DE LA
CROMATOGRAFIA
1. Analisis simultaneo
2. Alta resolucion
3. Alta sensibilidad (ppm - ppb)

4. Volumen de inyeccion pequeo (1- 10

VENTAJAS DEL HPLC

EN PARTICULAR

Condiciones moderada de analisis

-- solo cerca 20% de compuestos organ
conocidos pueden ser analizados por
tratamiento previo.
Facil de fraccionar la muestra y purific
Buena repetibilidad (C.V. < 1%).

CAPITULO 2:

INSTRUMENTAL

INSTRUMENTATION
LC-10A
Series

INSTRUMENTACION

Tres tipos de configuracion son posible

SISTEMA ISOCRATICO
SISTEMA GRADIENTE BAJA PRESION
SISTEMA GRADIENTE ALTA PRESION

SISTEMA ISOCRATICO
detector
columna
inyector
bomba

horno

Sistema simple con 1 bomba y un

data
reservorio de 1 solvente.

processor

Si mas de un solvente es usado, los so

son premezclados.

SISTEMA ISOCRATICO

Sin embargo, el sistema isocratico alguna v

buena separacion y en estos casos, los siste
gradientes son requeridos.
MeOH / H2O = 6Long
/ 4 Analysis T

Bad Separation
MeOH / H2O = 8 / 2
( column : ODS type )

SISTEMA DE GRADIENTE
Sistema Isocratico
Razon de Mezclado Fijo (no cambia)
durante el analisis

Sistema de Gradiente
Razon de Mezclado Cambiante durante
el analisis
HPGE (Gradiente Alta Presion)
LPGE (Gradiente Baja Presion)

Objetivo de la Gradiente
- Problemas en modo
isocratico En modo isocratico
Metanol / agua = 6 / 4
Largo tiempo analisis

Metanol / agua = 8 / 2
Pobre separacion

(Columna : tipo ODS)

OBJETIVO DE LA GRADIENTE
- SOLUCION Cambio Gradual de la razon de mezclado
durante el analisis
95%
Concentracion de Metanol
en fase movil

30%
Corto tiempo analisis
&
Excelente separacion

SISTEMA GRADIENTE
DE BAJA PRESION
Valvula de gradiente
Baja presion

detector

inyector
bomba

columna
Horno

Una bomba es usada

para controlar 4
Procesador
reservorios; mezclado
De datos
es hecho antes de la
bomba.

MODULO GRADIENTE LPGE

SISTEMA GRADIENTE
DE ALTA PRESION
Procesador
datos
bomba

mezclador
columna
bomba

bomba

inyector

horno

detector

QUE OCURRE CUANDO SE

MEZCLAN DOS SOLVENTES?

H2O

Se formara
burbuja!!

30
140 Mezcla 50

140-50=90

EtOH 250
( 30 + 250 ) / 2 = 140

DIAGRAMA DE UN HPLC
Inyector

Horno
Columna

Degasificad
or

Detector

Bomba
Reservorio

Waste
Procesador de
Datos

Desgasificador En linea
(DGU-10B / DGU-12A / DGU-14A)
Regulador

Camara de Vacio

Helio

A Bomba

A Bomba

Valvula de Drenaje

Tipo Camara de Vacio

Tipo purga de Helio

(tipo membrana)
Fase Movil

DGU-10B

DGU-12A / DGU-14A

Manual injector
(Rheodyne 7725 / 7725i)
Desde bomba

A la Columna

Desde bomba

A la Columna

CARGA
Desde bomba

A la Columna

INJECTAR

Desde bomba

A la Columna

INYECTOR MANUAL

Rheodyne Manual Injector

Horno de Columna
(CTO-10AVP / CTO-10ACVP /
CTO-10ASVP)
Tipos de Horno de Columna:
Calentamiento con Circulacion de
Aire
Bloque de Calentamiento
Bloque calentador deAluminio

Chaqueta de Calentamiento

Detectores
Detector

(UV/VIS)
Detector
Detector
Detector
Detector
Detector
Detector
Detector

Ultravioleta / Visible
de Arreglo de Diodos (PDA)
de Fluorescencia (RF)
de Conductividad (CDD)
de Indice de Refraccion (RID)
Electroquimico (ECD)
Espectrometro de Masas
Evaporative Light Scattering

UV/UV-VIS detector
(SPD-10AVP / SPD-10AVVP)
C : Concentracion

Celda

D2 / W Lamps

Eout
l

Ein

A Cl= log (Eout / Ein)

(A : Absorbancia)

DETECTOR UV VISIBLE
Celda de Muestra

Grating

Ein

Eout

Fotodiodo

Ein

Ein

Fotodiodo

Celda de Referencia
Lampara D2 / W

BAJO NIVEL RUIDO

4

A=-log(2/4)=0.3

A=-log(1/2)=0.3

dA=0.021AU
A1=-log(2/(4+0.1))=0.311
A2=-log(2/(4-0.1))=0.290
dA=A1-A2=0.021

dA=0.044AU
A1=-log(1/(2+0.1))=0.322
A2=-log(1/(2-0.1))=0.278
dA=A1-A2=0.044

DETECTOR UV VISIBLE
Seleccion de longitud de onda
275 nm

208 nm

275 nm

208 nm

DETECTOR UV VISIBLE
Wavelength Scan Mode

Detector PDA (SPDM10AVP)

Celda

Grating

D2 / W Lamparas

1 nm / elemento

512 fotodiodos

Datos obtenidos PDA

Espectro

Lo
ng
itu
d

de

On
da

Absorbancia

Cromatograma

Tiempo de Retencion

Detector Fluorescencia (RF10AXL)

Long. De Onda de Excitacion

+ h

h +
Long. De Onda de Emision
Estado Excitado

Estado de Quasi-excitacion

Fluorescencia
Ground state

Detector Fluorescencia (RFDiseo de Celda de un

detector de Fluorescencia

Detector Fluorescencia (RF-1

Reactivos de Derivatizacion

OPA reactivo para aminas primarias

A
CHO

+ R-NH2
CHO
A
o-phthalaldhyde
(OPA)

N-R

ADAM reactivo para acidos grasos

+

R-COOH

CHN2
9-anthryldiazomethane
(ADAM)

CH2OCOR

Detector Indice
Refraccion
(RID-10A)
Fotodiodo
Referencia

Lampara W
Muestra

Detector Indice Refraccion

(RID-10A)
Sistema Optico

DETECTOR DE CONDUCTIVIDA
Detector de Conductividad
V
I

A
L

K (conductividad) = I [A] / E [V]

=A [cm2] / L [cm] * k
(k : conductividad especifica)

k= (I/E)*(L/A)
electrodo

DETECTOR ELECTROQUIMICO

Electrodo
referencia

Electrodo AUX

Electrodo
de trabajo

DETECTORES
Comparacion de cada detector

LOD
GC

UV/ VIS RF
RID
CDD
ECD
10 ppb 10 ppt 100 ppb 10 ppb 100 ppt
Yes
Yes
No
No
No

LOD : Limite de deteccion

(S/N=3)
GC : Compatibilidad de
Gradiente

Sistema de Procesamiento de
Datos

CAPITULO 3:

BASE DE LA
SEPARACION

PIEDRAS EN EL RIO
Piedra ligera
Piedra pesada

Flujo de agua

base

EL CROMATOGRAMA
Y SUS USOS

Los compuestos eluidos pasan a traves

detectores donde ellos son registrados
y todo eso se llama cromatograma.
Compuesto 1

Seal

Compuesto 2

tR2
tR1

t0
tR1
Inyeccion de Muestra

w1

w2
tR2

COMO MEJORAR LA SEPARACIO

EN CROMATOGRAFIA

Dos fases estan involucradas en un pro

cromatografo :

Fase Estacionaria

-- solido, poroso, material surperficie

en forma de particula pequea o una
solido con una pelicula de liquido d

Fase Movil -- gas o liquido.

COMO MEJORAR LA SEPARACIO

EN CROMATOGRAFIA
m = fase movil
s = fase estacionaria

Ref. V.R. Meyer

Practical HighPerformance Liquid
Chromatography

Representacion de una separacion cromatografica

COMO MEJORAR LA SEPARACIO

EN CROMATOGRAFIA

-- La separacion es mejorada como result

diferencias de las interacciones entre
compuestos con la fase estacionaria.

-- Para una buena forma de pico, un num

factores deben ser controlados, de otr
un ensanchamiento de la banda podria

Nomenclatura
Factor de Capacidad
Selectividad
Numero de Platos Teoricos
Altura Equivalente de Platos
Teoricos
Selectividad
Resolucion

FACTORES DE CAPACIDAD (k)

Vr
V0

Vr V0
k'
V0
Vr = volumen de retencion de un
pico de soluto
V0 = volumen muerto
pico solvente (pico no retenido)

Tiempos de
Retencion pueden ser
usados en vez de
volumen.

FACTORES DE CAPACIDAD (k)

El tiempo de retencion es dependiente d

y las dimensiones de la columna, por
es adecuado comparar los cromatogra

Factores de Capacidad es independiente

factores y por lo tanto es preferido.

Valores de k entre 1 y 5 son preferidos.

FACTORES DE CAPACIDAD (k)

4.6 mmID x 250 mmL. (1.2 mL/min)
6 min (t1)

k' = 2

2 min (t0)

4.6 mmID x 250 mmL. (0.6 mL/min)

12 min (t1)
4 min (t0)

k' = 2

FACTORES DE CAPACIDAD (k)

6.0 mmID x 150 mmL. (1 mL/min)
6 min (t1)

k' = 2

2 min (t0)

6.0 mmID x 300 mmL. (1 mL/min)

12 min (t1)
4 min (t0)

k' = 2

FACTORES DE CAPACIDAD (k)

6.0 mmID x 150 mmL. (1.0 mL/min)
10 min (t1)

k' = 4

2 min (t0)

4.6 mmID x 250 mmL. (0.6 mL/min)

12 min (t1)
4 min (t0)

k' = 2

SELECTIVIDAD,

V0
V1
V2

La Selectividad es una
indicacion del grado
de separacion entre
dos picos.

k'2 V2 V0
Selectivity =
k'1 V1 V0

SELECTIVIDAD,

Dos compuestos no pueden ser separa

es exactamente el mismo.
Debe existir diferencia de selectivida
ninguna separacion es posible ( =1)
Es afectada por la seleccin fase estac
fase movil.

NUMERO DE PLATOS
TEORICOS, N
Ecuacion :
N = 16 x ( Rt / W )2

Rt
Area
H
W1/2
W

H1/2

Ecuacion Modificada p
mediciones actuales :
N = 5.54 x ( Rt / W 1/2 )

Ecuacion Modificada p
integrador :
N = 6.28 x (Rt x H / Ar

NUMERO DE PLATOS
TEORICOS, N

Las tres ecuaciones son adecuadas sol

pico es de forma Gaussiana.
Para picos asimetricos :
(tR/W0.1)2
N = 41.7
T + 1.25

donde W0.1 = ancho de pico a 10% de

y T = factor de cola

NUMERO DE PLATOS
TEORICOS, N
N

indica eficiencia de columna.

N=15000

N=3000

Columna con buena eficiencia Columna con mala eficiencia

ALTURA EQUIVALENTE A
PLATO TEORICO, HETP
HETP

= Longitud de Columna /

HETP

Ecuacion de Van Deemter

Flujo optimo

Velocidad Lineal

Cada columna ti
Un flujo optimo.

ALTURA EQUIVALENTE A
PLATO TEORICO, HETP
Para

obtener una buena

eficiencia de columna,
Estos ajustes son
preferibles :
4.0 mmID
4.6 mmID
6.0 mmID

0.6
0.8
1.0

mL/min
mL/min
mL/min

RESOLUCION

La calidad de una separacion es medida por l

RESOLUCION

Cuando los picos se superponen, la determi

ancho de la base no es facil, por lo que la ec
modifica usando el ancho de pico a la mitad

(w2)1/2

(w1)1/2

v2-v1

Rs = 1.18
(w1)1/2 +(w )
2 1/2

H1/2

RESOLUCION

1
1

R 4

k'

N
k'1

N : promedio de N1 y N2
k' : promedio de k'1 y k'2

RESOLUCION

La resolucion minima requerida para

cuantificacion es 1.25.
Separacion de linea base es mejorada con
1:1
R = 0.8
R = 1.0
R = 1.25

1:4

1:16

razon Pico

RESOLUCION
es una funcion de
Selectividad
Eficiencia de
Columna
Factor de
Capacidad

RESOLUCION

RESOLUCION

Rs = 0.8

Rs = 1.0??

Rs = 1.25

Si los picos son triangulos, entonces pueden separarse a u

Pero son de forma de distribucion Gausea

RESOLUCION
Relacion Pico area
Rs

1:1

1:3

1:10

1:30

1:100

0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2

5.9%
2.3
0.83
0.26
0.069
0.016
0.003
0.001

5.0%
2.6
1.1
0.41
0.1
0.022
0.005
0.001

(*)%
22.7
1.4
0.49
0.16
0.032
0.009
0.001

(*)%
2.9
1.6
0.71
0.22
0.050
0.013
0.003

(*)%
(*)
1.8
0.92
0.33
0.086
0.021
0.003

(*) un pequeo pico aparede solo como

un hombro

RESOLUCION
Initial

Uso de una columna mas

larga o de mejor performance.
aumento N

aumento k*

cambio

Disminuir contenido de solVente organico para columna

ODS column.
Cambiar contenido organico,
pH, temperatura de la
columna.

RESOLUCION

Una mejora en resolucion puede ser rea

ajustando el nivel optimo de flujo;

O por ajuste de temperatura pero acort

de la columna.

FACTORES QUE CAUSAN

ENSANCHAMIENTO DE BANDA
1. Difusion de Eddy
-- causa ensanchamiento de
banda.

2. Distribucion de Flujo
-- el flujo es mas rapido en el canal
central que en el area de la
particula.

Difusion de Eddy

Para reducir el ensanchamiento de

Banda estos dos factores, empaque
de columna,debe tener una estrecha
distribucion como sea posible.
Distribucion de Flujo en lecho
cromatografico

FACTORES QUE CAUSAN

ENSANCHAMIENTO DE BANDA

3. Difusion Molecular de la Muestra en la F

Es importante si :
a. Fase estacionaria pequea ( < 10 m
b. Velocidad lenta de la fase movil

-- La velocidad de flujo de la fase movil de

seleccionado de forma que la difusion l
sea evitado.

FACTORES QUE CAUSAN

ENSANCHAMIENTO DE BANDA
Esto ocurre cuando u > 2Dm/dp
donde u = velocidad lineal
dp = diametro de particula
Dm = coeficiente
MT de difusion
x Vxs0.6
= 7.4
10-12

MODOS DE HPLC
Modo

Fase Normal
Modo Fase Reversa
Modo Fase Reversa Apariamiento
Ionico
Modo Intercambio Ionico
Modo SEC ( GPC / GFC )
Modo separacion Quiral

MODO FASE NORMAL

Eter Petroleo

Clorofila

Cromatogra
ma
Color

CaCO3
Desarrollado por
M.S. Tswett.

MODO FASE NORMAL

Se

uso la primera vez

CaCO3 para

Columna de

Separacion
Eter de Petroleo como Solvente
Esta

combinacion se define
como

Modo Fase Normal

Columna :

propiedad polar

COLUMNAS DE HPLC
DE FASE NORMAL
Tipo

Silica gel : uso general

Tipo Ciano
: uso general
Tipo Amino : analisis de azucar
Tipo Diol
: analisis de
proteina
Si
Silica gel

Si

-Si-CH2CH2CH2CN
-Si-CH2CH2CH2NH2
-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)

Si Modificado

QUE INTERACCION?
Enlace
Hidrogeno

Silica gel (polar)

No-polar

ENLACE PUENTE
HIDROGENO
Si

la muestra tiene

-COOH
-NH2
-OH

: grupo carboxyl
: grupo Amino
: grupo Hidroxyl

Enlace puente hidrogeno

llega ser fuerte.
Si

la muestra tiene grupos

voluminosos,

debido a impedimento
esterico

TIEMPO DE RETENCION Y
ENLACE PUENTE HIDROGENO
Fuerte
HO

SiOH
SiOH

Debil
OH

AUMENTO DE
POLARIDAD DEL SOLVENTE
0%

1 : Dioctyl phthalate
2 : Dibutyl
phthalate
3 : Diethyl

2%

Solvente:Hexano

5%

COLUMNAS HPLC
DE FASE REVERSA
Tipo
Tipo
Tipo
Tipo
Tipo
Tipo

C18 (ODS)
C8 (octyl) Propiedad No-po
No-p
C4 (butyl)
-Si-C18H35
Fenil
TMS
Si
Ciano

MODO FASE
REVERSA
Columna
No-polar
Solvente :
Polar

Propiedad

Propiedad

Agua / Metanol /

QUE INTERACCION?
Interaccion
Hidrofobica

No-polar

Solvente pola

HIDROFOBICIDAD
Si

la muestra tiene

CH3CH2CH2--- : Cadena carbonada

: Grupo Aromatico

Si

la muestra tiene

-COOH
-NH2
-OH

: grupo Carboxyl
: grupo Amino
: grupo Hydroxyl

Hidrofobici
dad es
fuerte.
Hidrofobici
dad es
debil.

TIEMPO DE RETENCION Y
HIDROFOBICIDAD
OH

C18 (ODS)

Strong
OH

Weak

AUMENTANDO LA
POLARIDAD DEL SOLVENTE
20 %

1
2
3
4

:
:
:
:

30 %

p-Hydoxymethylbenzoate
p-Hydoxyethylbenzoate Solvente
p-Hydoxypropylbenzoate
p-Hydoxybutylbenzoate

40% / H2

: MeOH

EFECTO DE LA
FASE ESTACIONARIA
C8
Mediana

C18 (ODS)

muestra
Fuerte

C4

muestra
Debil
muestra

EFECTO DE LA
FASE ESTACIONARIA
ODS

C8 TMS

Condiciones analiticas
Columna : Shim-pack CLC-ODS
Fase mobil : MeOH : H2O = 7 :
3
Flujo : 1.0 mL/min
Temperatura : 40 C
Volumen de Injeccion : 10 uL
Deteccion : UV-254 nm
Picos
1. Methyl benzoate
2. Ethyl benzoate
3. n-Propyl benzoate
4. n- Butyl benzoate

FASE NORMAL VS REVERSA

Parametro

Fase Normal

Fase Reversa

Polaridad de Columna

Alta

Baja

Polaridad de Solvente

Baja

Alta

Secuencia de Elucion

1ero baja polaridad

1ero alta polaridad

Aumento Polaridad Solvente

Elucion rapida

Elucion lenta

FASE NORMAL VS REVERSA

Fase

Normal

Buena

separacion de estereo isomeros

(Vitamina E etc..)
Tiempo de retencion cambiante
Fase

Reversa

Buena

repetibilidad del tiempo

retencion
Fase estacionaria robusta

CROMAT. DE FASE REVERSA DE

APAREAMIENTO IONICO
Ion-Pair Reagent

REACTIVOS DE
APAREAMIENTO IONICO
Compuestos

Anionicos

Tetra-n-butylammonium

Compuestos

hydroxide (TBA)

Cationicos

Butanesulfonic

acid sodium salt (C4)

Pentanesulfonic acid sodium salt
(C5)
Hexanesulfonic acid sodium salt
(C6)
Heptanesulfonic acid sodium salt
(C7)
Octanesulfonic acid sodium salt (C8)
Decanesulfonic acid sodium salt
(C10)

SEPARACION POR APAREAMIENTO

IONICO DE ACIDOS CARBOXILICOS

Column: Bonded C18

Mobile Phase: H2O/MeOH
1:1 with TetrabutylAmmonium Hydroxide

SEPARACION POR APAREAMIENTO

IONICO DE AMINO COMPUESTOS

Condiciones Analiticas

Columna : Shim-pack CLC-ODS

Fase Mobil phase : [A] : [B] = 9 : 1
Peaks
[A]
1. Nicotinic acid
6. Thiamine
100 mM phosphate buffer
2. Nicotinamide 7. Caffeine
(pH=2.1)
3. Pantothenate
8. Folic acid
0.8 mM sodium octane
4. Pyridoxine
9. Biotin
sulfonate
5. Riboflavin
10. Riboflavin
[B] acetonitrilo
Phosphate
Flujo : 1.5 mL/min
Temperatura : 40 C
Volumen de Injeccion : 10 uL

CONSIDERACIONES IMPORTANTES
DE APAREAMIENTO DE IONES
Tipo

de reactivos Ion-Pair
Concentracion de reactivos IonPair
Solvente de pH
RCOO- +

R-COOH
H+

(pKa=4.5)
R-NH2 + H+
NH3+

R-

TIPO DE REACTIVOS ION-PAIR

Sulfonato de Hexano

Mobile Phase: H2O/MeOH

1:1,with 0.005M ion pairing
reagent and 1% HOAc
1 Maleic Acid
2 Phenylephrine
3 Phenylpropanolamine
4 Naphazoline
5 Phenacetin
6 Pyrilamine

Sulfonato de Pentano

CONCENTRACION DE
REACTIVOS ION-PAIR

MODO INTERCAMBIO IONICO

Fuerza de Atraccion Ionica

N+R
R

SO3

Muestra
++++
+
+
Muestra +
+
++ ++ +

MODO INTERCAMBIO IONICO

Campo

Biologico
(analisis de proteina, peptidos,
aminoacidos)
Cromatografia Ionica
Intercambiadores

Cationicos

Intercamb Cationico Fuerte(SCX) (R-SO3-)

Intercamb Cationico Debil(WCX) (R-COO-)

Intercambiadores

Anionicos

Intercamb Anionico Fuerte(SAX) (R4N+)

Intercamb Anionico Debil (WAX) (DEAE)

ANALISIS DE PROTEINAS
USANDO COLUMNA WCX
Condiciones
Columna

Analiticas

: Shim-pack WCX-1
Fase Movil :
[A] 20 mM phosphate buffer (pH=
[B] A+0.25M sulfato de sodio
[A] - [B] 30 min gradiente lineal
Flujo : 1.0 mL/min
Temperatura : ambiente
Detector : UV-280 nm
Volumen de Injeccion : 10 uL
Picos
1. albumin
2. myoglobin
3. -chymotrypsinogen A
4. liponuclease A
5. lisozyme

CONSIDERACIONES IMPORTANTES DE
INTERCAMBIO DE IONES

pH

de la solucion Buffer
Concentracion de la solucion
Buffer
Metodo de Elucion
Isocratico
Gradiente

pH
Gradiente aumento de fuerza
ionico

QUE ES SEC ?
Size

Exclusion
Chromatography
(SEC)
GPC

(Cromatografia de
Permeacion Gel)
En el campo polimeros
GFC (Cromatografia de
Filtracion Gel)

PRINCIPIO DE SEC
Ninguna

Fuerza de
Interaccion
Diferencia de Tiempo de
Viaje

Peso Molecular (LogMW)

RELACION ENTRE MW Y RT
Limite de Exclusion

Limite Permeacion
GPC
Columna

Tiempo

PRINCIPALES TIPOS DE
COLUMNAS DE GPC

PROPOSITO DE GPC / GFC

GPC
Peso

Molecular:medicion
de polimeros.

GFC
Separation

de proteina.

COMO MEDIR EL PESO

MOLECULAR DE UN POLIMERO
Metodo

Absoluto

Presion

osmotica
(for Mn)
Dispersion
(for Mw)
Viscosidad
(for Mw)
Super centrifuga
(for Mz)
Metodo
GPC

Relativo

(para Mn, Mw and Mz)

QUE SON MN, MW AND MZ ?

Mn

: numero promedio de peso

molecular
Esfuerzo

Mw

de tension, resistencia impacto

: peso promedio de peso molecular

brittleness

Mz

: promedio Z de peso molecular

flexibilidad

Mn < Mw < Mz

CURVA DE CALIBRACION
Inyectar

las muestras estandars de

los polimeros una por una para
conocer la relacion entre peso
molecular y tiempo de retencion.
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

time(min)
22.0
22.6
23.4
25.0
27.4
31.0
33.8
38.4
39.8
42.8
46.8

mol. wet.
5500000
1800000
860000
400000
160000
50000
20000
4000
2000
600
80

INYECCION DE MUESTRA
ACTUAL
Para

calcular el MW, software

GPC es requirida.

SEPARACION DE PROTEINAS
USANDO COLUMNA GFC
Condiciones
Columna

Analiticas

: Asahipak GFA-50
Fase Movil :
0.1 M sodium phosphate
0.1 M NaCl (pH=7.0)
Flujo : 0.5 mL/min
Temperatura : ambient
Detector : UV-280 nm
Volumen de Inyeccion : 10 uL
Picos
1. glutamate dehydrogena
2. lactate dehydrogenase
3. enolase
4. adenylate kinase
5. cytochrome C

MODO DE SEPARACION
QUIRAL

C*
NH2

ej
o

Es
p

*C
COOH

HOOC

*Centro Quiral

NH2

(L)
(D)
Propiedades fisicas son las
mismas excepto rotacion
optica.

SEPARACION DE COMPUESTOS
QUIRALES
Separacion

Directa usando
Columna Quiral
Derivatizacion diastereomerica
Adicion de constituyentes
(L)a +
(L)quirales
la(R)
fase movil.

Enantiomero

(R)

Diastereomero

(R) + (R)
(R)Diastereomer
o puede ser separado
(R)

de fase reversa / normal.

SEPARACION DE COMPUESTOS
QUIRALES

La derivatizacion Directa para formar dias

es el mas exitoso, pero el mas incovenien
aplicacin de rutina, los ensayos puede s
precisos y puede existir racemizacion.

El uso de una columna quiral es el mas pop

debido a la conveniencia y el amplio rang
diferentes columnas quirales disponibles

SEPARACION DIRECTA
USANDO COLUMNA QUIRAL
Fase

estacionaria tiene medio quiral.

(R)
(R)

(L)

Fuerte interaccion

Debil interaccion

(R)

SEPARACION DE COMPUESTO
QUIRAL

Los cambios en fase movil tiene solo un

en la separacion.

Mayormente, se pueden cambiar difere

de columnas quirales.

SEPARACION DE COMPUESTOS
QUIRALES

Columnas quirales contienen materiales d

de :
polisacaridos
poliacrilamida
proteina inmovilizada
selectores de enlace quiral tales
complejos metalicoss
eteres corona
ciclodextrinas
etc, etc.

SEPARACION DE COMPUESTOS
QUIRALES

El menos usado es el de aadir complejos

a la fase movil.

Un reactivo quiral es usualmente caro y p

interferir con la deteccion

Reactivos quirales comunes contienen in

algunos complejos metalicos como tam
puestos quirales como 10-camphor-sul

CAPITULO 5:

CUANTIFICACION

METODOS CALIBRACION

Calibracion con Estandar

Externo
Calibracion con Estandar
Interno
Adicion Estandar
Normalizacion Corregida

CALIBRACION CON ESTANDAR

EXTERNO
Compuestos

Dilucion

Dilucion

Dilucion

Dilucion

CALIBRACION CON ESTANDAR

EXTERNO

CALIBRACION CON ESTANDAR

EXTERNO
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
0

1000

2000

Peak Area

3000

4000

[Concentraction]

CALCULO CON METODO DE

ESTANDAR EXTERNO
Y = aX + b
a : Pendiente
b : Y intercepto

125 ppm

2500
[Area de Pico]

2500

CALIBRACION CON ESTANDAR

INTERNO
PREPARACION DE ESTANDARES
Estandar
Interno

Compuestos

Dilucion

Dilucion

Dilucion Dilucion

CALIBRACION ESTANDAR
INTERNO ANALISIS DE VAINILLA

CALIBRACION ESTANDAR
INTERNO
ANALISIS DE VAINILLA
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0

[Tergat Area / IS Area]

10

12

[Conc. Comp. / Conc. EI]

CALIBRACION DE ESTANDAR
INTERNO
CALCULO DE RESULTADOS
Y = aX + b
a : Pendiente
b : Y intercepto

1.67

5.0
[Area Comp / Area EI]

Y = Conc.Comp. / Conc. EI
1.67 = Conc. Comp./ 100 ppm
Conc. Comp. = 167 ppm

C 2500
500
ES

VENTAJA DE LA CALIBRACION DE
ESTANDAR EXTERNO
Solo los compuestos a analizar son
separados.
Target

Target

DESVENTAJA DE LA CALIBRACION
DE ESTANDAR EXTERNO
Los errores en la inyeccion de muestra influyen
directamente en el analisis cuantitativo.

Inyeccion de 10 uL

100 ppm

Inyeccion de

110 ppm

VENTAJA DE LA CALIBRACION
DE ESTANDAR INTERNO
Los erroes de inyeccion pueden ser eliminados.

Inyeccion de 10 uL
1000

2000

IS

2000 / 1000 = 2

Inyeccion de 1
1100

2200

IS

2200 / 1100 = 2