INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA

DE BIOTECNOLOGA
TECNOLOGAS DE LA RECOMBINACIN
GNETICA
ESTRATEGIAS DE CLONACIN DE ADN
ALUMNA: DULCE LILIANA MEDINA BUENO
DOCENTE: ERICK EMMANUEL PERZ SOLS
10 DE MAYO DE 2015

CLONACIN MOLECULAR

CARACTERSTICAS DE LOS
VECTORES

Vectores: son secuencias de ADN que sirven para transferir

nuevas secuencias de ADN a clulas husped.
Componentes:
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Marcadores de seleccin: Tet, Amp, Cm, Kan

Sitios de clonacin
Origen de replicacin
Promotores
Identificacin histoqumica
Tamao determinado

 El tamao de los insertos que se pueden clonar puede ser considerable; sin
embargo, si son mayores de 10 kb, el plsmido se hace generalmente inestable.
Genes de resistencia a los antibiticos que actan como marcadores seleccionables
facilita la deteccin y seleccin de los clones que los contienen.
Existen mltiples copias en la clula, dependiendo del plsmido y de la especie
hospedadora, puede haber de varias a numerosas copias
Su replicacin transcurre independientemente del ADN nuclear en la clula
bacteriana.
Son circulares, lo que hace que el ADN sea ms estable durante su aislamiento
qumico
Pequeo tamao que permite mayor f acilidad de aislamiento y manipulacin.

6
5
4
3
2
1

Son molculas de ADN circular, de doble cadena,

extra cromosmicas, presentes en las bacterias
Caractersticas:

PLSMIDOS

PBR322

Francisco Bolivar
Zapata . (1977)

Mapa de estriccin
del pBR322

BACTERIFAGOS

Molcula de ADN lineal cuyas secciones pueden remplazarse

con ADN extrao sin interrumpir su ciclo de vida.

Fago Lambda:
Los extremos de su material gentico son cohesivos y ello hace
que tras la infeccin su genoma se haga circular
El tercio genes que son requeridos para la lisogenia pero no
para el ciclo ltico. Esa parte central (de aproximadamente 15
kb) del cromosoma puede ser cortada con enzimas de restriccin
y substituida por un fragmento de ADN forneo
Insertar mayor cantidad de ADN que la mayora de los
plsmidos (entre 10 y 20 kb)
El ADN puede ser eficientemente empaquetado in vitro dentro
de las partculas del fago y son ms eficientes en la infeccin de
las clulas hospedadoras (transfeccin) que la transformacin.

Ciclo lisognico y Ciclo ltico de un bacterifago

FAGO M13

Estructura filamentosa
Contiene ADN monocatenario y se replica sin matar a su hospedador.

Para poder utilizarlo como vector de clonacin es necesario disponer de

una forma bicatenaria, ya que las enzimas de restriccin slo trabajan
sobre ADN de doble cadena. El ADN bicatenario de M13 puede obtenerse
de clulas infectadas, donde se encuentra en forma replicativa
bicatenaria.
Secuencia intergnica que puede ser utilizada como sitio de clonacin.
Es posible clonar ADN de longitudes variables (hasta 5kb), sin afectar la
viabilidad del fago.
Gen marcador. lacZ
Sitio mltiple de clonacin. Por lo tanto, los fragmentos de ADN clonados
en el polylinker interrumpen el gen lacZ y anulan la actividad de la galactosidasa.

Mapa de estriccin de M13

FSMIDOS
Son vectores que combinan las caractersticas de un fago
filamentoso (M13) y un plsmido (pBR323) y contienen
tanto el origen de replicacin del fago como del plsmido.
Normalmente la replicacin depende del plsmido, pero
cuando una clula que contiene un fsmido se infecta con
un fago de tipo silvestre, el origen del fago es responsable
de la replicacin y se generan copias monocatenarias.
Este ADN monocatenario es empaquetado en viriones y
puede aislarse fcilmente y ser utilizado para secuenciar.
Habitualmente, los fsmidos pueden transportar de
forma estable un fragmento de ADN clonado mayor que
un vector tpico derivado de M13.

VECTORES CHARON
Son un hibrido de plsmidos y fagos
Son vectores de reemplazo, pueden colocar el ADN en partes
eliminadas de la regin de relleno (entre los genes J y N, ver el
diagrama en fago lambda).
Hay un gran nmero de vectores de Charon con algo diferentes
caractersticas.
Generar bibliotecas genmicas eucariticas.
En la regin de reemplazo hay E.coRI de 6,9 kb y 7,8 kb que contiene
la -galactosidasa (Lac Z) y los (bio) genes de biotina, respectivamente.

Ejemplos:
Charon 4 A
Charon 32
Charon 40

CSMIDOS

Son vectores hbridos, combinan ventajas de los plsmidos

bacterianos y del fago .

El sitio cos es reconocido por el sistema de empaquetamiento de

ADN de , que hace cortes escalonados que originan los extremos
cohesivos complementarios en el cromosoma maduro del fago.

Poseen la habilidad del plsmido para replicarse autnomamente en

las clulas de E. coli y la capacidad de empaquetamiento in vitro del
cromosoma de .

Contienen el origen de replicacin y los genes de resistencia a los

antibiticos de su plsmido parental.

Habilidad para insertar fragmentos de ADN de 35 a 45 kb.

Mapa de estriccin del pJB8

CROMOSOMAS ARTIFICIALES

Estos vectores se desarrollaron con el objetivo de

clonar grandes segmentos de cromosomas
eucariticos.
En la preparacin de mapas fsicos de genomas se
utilizan vectores como los csmidos, los YAC los
BAC y los PAC.

CROMOSOMA ARTIFICIAL DE
LEVADURA
Fueron descritos por primera vez en 1983 por Murray y Szostack.
Es un vector que pretende imitar las caractersticas de un cromosoma normal de
unalevadura(eucariota), portando uncentrmeroytelmerosterminales. Esto permite clonar
en levaduras (microorganismoseucariotas) secuencias de ADN de hasta un milln de pares
debaseso ms, al comportarse como un cromosoma propio de la levadura.
Capacidad (200 kb - 3.000 kb).
Son utilizados en construccin degenotecasgenmicas,
Son ms inestables que otros vectores como BACs.
Los YAC tienen un origen de replicacin relajado enprocariotas, estricto en levaduras

Un YAC tpico tiene:

ARS1:secuencia de replicacin autnoma
CEN4:centrmerodelcromosomaIV, permite la segregacin delplsmidodurante ladivisin
celular
TELs:secuencias telomricas.
HIS3,
TRP1,
URA3:marcadores
de
seleccin
enlevaduraconfierenprototrofaparahistidina,triptfanoyuracilo
SUP4:cambia lamutacinsin sentido mbar (UAG) por la incorporacin detirosina. Identifica
las clulas que incorporan el vector, ya que las clulas husped que portan esta mutacin mbar,
de color rosado, pasan a tener unfenotipoblanco. (Prototrofo para ade).

CROMOSOMA ARTIFICIAL
BACTERIANO
Insertos de 100 - 300 kb, aunque el promedio es de 100
kb
Contienen menos insertos hbridos
Simplifican el proceso de secuenciacin

Un BAC tpico consta de:

OriS: origen de replicacin delfactor F
repE: control de la replicacin delplsmido
parA, B, C: control de lareplicacin
CMr: cloranfenicol acetil-transferasa (CAT) (gen de
resistencia acloranfenicol)
LacZ: con unpolilinkeren su interior. Se usa para el
ensayo dealfa-complementacin.

MACS: CROMOSOMAS ARTIFICIALES

DE MAMFEROS

Integracin de ADN exgeno desnudo en un sitio aleatorio dentro del genoma del
hospedador.

Caractersticas:
Transportar grandes molculas de ADN
La posibilidad de replicarse paralelamente al genoma del hospedador, pero sin integrarse
en l.
Se transmiten a travs de la lnea germinal.
Produccin de protenas celulares
X Efectos de posicin indeseables as como mutaciones perjudiciales.

Los cromosomas artificiales basados en ADN satlite (SATAC) contienen:

Orgenes de replicacin no virales
Telmeros
Centrmero
Todo ello para permanecer estables en el cromosoma de la clula husped. 60 Mb son el
prototipo de un SATAC e incluyen secuencias de heterocromatina no codificante
entremezcladas con genes marcadores como lac Z (- galactosidasa) y hph (higromicina
fosfotransferasa).

HACS: CROMOSOMAS ARTIFICIALES

DE HUMANOS
Se comportan y se construyen como los
cromosomas humanos normales
Se replican, segregan de manera estable y usan
los componentes funcionales de la clula humana
Imitan fielmente el patrn normal de la expresin
gnica, ya que pueden contener loci genmicos
completos, incluyendo elementos de regulacin.
Insercin de genes de gran tamao (6 y 10Mb)
Anlisis de la expresin espacial y temporal
adecuada del HAC en ratones transgnicos
indican la capacidad de estos vectores para su uso
en terapia gnica somtica.

Sntesisde novo:
Introduccin en clulas humanas de DNA de cadena alfa, marcador
gentico (guanosina trifosfato ciclohidrolasa I), secuencias telomricas, y
un transportador de DNA humano, mediante lipofeccin(el DNA va
introducido en unliposomacatinico que entra en la clula por
endocitosis).

Sntesis mediante YACs modificados:

Tenemos YACs, con 90 Kb de DNA de cadena alfa del centrmero del
cromosoma 21, que por recombinacin homologa en levaduras tienen
secuencias telomricas humanas y un marcador de resistencia.
Introducimos en clulas humanas mediante lipofeccin omicroinyeccin.

Fragmentacin telmero-dirigida:
-Obtenemos minicromosomas(menor de 10Mb, el menor conseguido, de
2,5Mb)construidos
por
fragmentacin
telmero-dirigidade
cromosomas humanos.
-Introduccin en clulas linfoides de pollo hiperrecombinognicas,
lneaDT40, donde introducimos un sitio dianaloxPpara la
recombinasacredelbacterifago P1.
-Recombinacin con unBACcon unloxP
-Translocacin mediada porcrede un fragmento subterminal.

REFERENCIAS
McLennan, Alexander., et.al.. (2013). Molecular Biology. New
York: Garland Science, Taylor and Francis Group.
Kumar,Anil., Garg,Neha.. (2005). Genetic Engineering. New
York: Nova Science Publishers, Inc..
Esther Lederberg, "Lysogenicity inEscherichia colistrain K12,Microbial Genetics Bulletin, v.1, pp. 5-8 (Jan. 1950);
seguido por "Lysogenicity inE. coliK-12",Genetics, v.36, p.
560 (1951)
Murray AW, Szostak JW (1983):Construction of artificial
chromosomes in yeast, Nature305, 2049-2054 (abstract).
Generation of trnsgenic mice and germline transmission of a
mammalian artificial chromosome introduced into embryos by
pronuclear microinjection. Chromosome Research 8:183191,200. Kluwer Academic Publishers.